PL238142B1

PL238142B1 - Sposób diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów, sposób różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów oraz zastosowania lizofosfatydyloetanoloaminy jako biomarkera

Info

Publication number: PL238142B1
Application number: PL426138A
Authority: PL
Inventors: Wojciech ŁUCZAJ; Wojciech Łuczaj; Anna MONIUSZKO-MALINOWSKA; Anna Moniuszko-Malinowska; Pedro Miguel Dimas Neves DOMINGUES; Pedro Miguel Dimas Neves Domingues; Maria do Rosário Gonçalves dos Reis Marques DOMINGES; Maria Do Rosário Gonçalves Dos Reis Marques Dominges; Ewa GIŃDZIENSKA-SIEŚKIEWICZ; Ewa Gińdzienska-Sieśkiewicz; Elżbieta SKRZYDLEWSKA; Elżbieta Skrzydlewska
Original assignee: Univ Aveiro; Univ Medyczny W Bialymstoku
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2021-07-12
Also published as: EP3814777A1; EP3814777C0; US20210255209A1; CA3105034A1; WO2020005085A1; EP3814777B1; CA3105034C; PL426138A1

Description

Opis wynalazku

Sposób diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów, sposób różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów oraz zastosowania lizofosfatydyloetanoloaminy jako biomarkera.

Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów, sposób różnicowego diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów oraz zastosowanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy jako biomarkera do diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów, a także jako biomarkera do różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny medycyny, dokładniej diagnostyki boreliozy, jeszcze dokładniej boreliozowego zapalenia stawów i różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów, z zastosowaniem specyficznego markera biologicznego, tj. lizofosfolipidu zawierającego kwas mirystynowy, jako biomarkera do diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów, a także jako biomarkera do różnicowego diagnozowania boreliozowego (kleszczowego) zapalenia stawów.

Stan techniki

Borelioza, zwana także chorobą z Lyme lub krętkowicą kleszczową, jest chorobą zakaźną, będącą wynikiem infekcji wywołanej przez bakterię Borrelia burgdorferi przenoszonej do organizmu w wyniku pokłucia przez zainfekowanego kleszcza. Na boreliozę zapadają ludzie, w szczególności z obszarów dotkniętych problemem boreliozy, albo osoby narażone na ryzyko pokłucia przez kleszcza, na przykład leśnicy i drwale.

W ostatnich latach zaobserwowano znaczący wzrost zachorowań na boreliozę u ludzi. Obecnie choroba ma zasięg globalny, dlatego w USA odnotowuje się 250000 przypadków zachorowań rocznie, podczas gdy w Europie liczba ta wynosi 200000 przypadków, z czego około 15000 zachorowań odnotowuje się w Polsce. U człowieka choroba ta wywoływana jest przez kilka gatunków krętka Borrelia burgdorferi sensu lato, co obejmuje Borrelia burgdorferi sensu stricto, B.garinii i B.afzelii.

Problem zachorowań na boreliozę dotyczy także zwierząt domowych i hodowlanych, co może przyczyniać się do znacznych strat ekonomicznych w tych sektorach.

Borelioza rozwija się przechodząc przez trzy odrębne stadia, od wczesnego stadium zakażenia do stadium późnego. We wczesnym stadium (stadium I) choroba może być bezobjawowa lub dawać objawy grypopodobne. W 50-80% przypadków obserwuje się pojawienie się na skórze rumienia wędrującego (EM) kilka dni po pokłuciu przez kleszcza. Przy braku leczenia choroba ta wywołuje różne objawy patologiczne, w tym stawowe, neurologiczne, dermatologiczne i sercowe. Po paru tygodniach od zakażenia choroba przechodzi w stadium II, w którym pojawia się m.in. zapalenie stawów (ang. Lyme arthritis, LA) i zaburzenia neurologiczne (neuroborelioza). Po kilku miesiącach lub latach od zakażenia, choroba ewoluuje do formy przewlekłej zanikowej, tak zwanego stadium III, w którym może dojść do rozwoju np. encefalopatii i/lub zapalenia mózgu i rdzenia. Podobieństwo objawów klinicznych pomiędzy boreliozą i innymi niespokrewnionymi chorobami, jak i zmienność tych objawów sprawiają, że postawienie rozpoznania klinicznego jest trudne. Wczesne stadium choroby może być bezobjawowe, aż do czasu gdy choroba osiągnie bardzo zaawansowane stadia kliniczne, takie jak boreliozowe zapalenie stawów. W późnych stadiach choroby mogą pojawiać się dodatkowe, inne, nieswoiste objawy, które stwarzają trudności diagnostyczne przy użyciu obecnie dostępnych metod diagnostycznych.

Obecnie diagnozowanie boreliozy oparte jest na testach immunologicznych wykrywających obecność we krwi przeciwciał przeciwko bakterii Borrelia burgdorferi. Testy te wykonywane są zazwyczaj techniką ELISA i potwierdzane później techniką western blott. Borrelia burgdorferi sensu lato wyraża jednak różne białka powierzchniowe przez przystosowanie do różnych środowisk, co skutkuje zróżnicowaniem genetycznym i zróżnicowaną ekspresją genów Borrelia burgdorferi. Sytuacja ta istotnie wpływa na możliwość opracowania swoistych i czułych zestawów do diagnozowania boreliozy. Przeciwciała w klasie IgM przeciwko Borrelia burgdorferi pojawiają się zwykle w ciągu kilku dni lub tygodni od wystąpienia infekcji i mogą utrzymywać się w trakcie przebiegu choroby. Przeciwciała w klasie IgG pojawiają się później, u większości pacjentów około jednego miesiąca od pojawienia się aktywnego zakażenia, i mogą utrzymywać się w organizmie przez wiele lat od zakażenia i ustąpienia objawów. Ocena odpowiedzi serologicznej jest skomplikowana z uwagi na wiele gatunków wywołujących chorobę oraz z powodu zmienności międzygatunkowej dla głównych immunodominujących antygenów, jak również zmienności genetycznej. Wyniki oznaczeń serologicznych z tymi antygenami pod kątem swoistości

PL 238 142 B1 i czułości są bardzo zmienne. Tak więc tego rodzaju testy cechują się niewystarczającą swoistością z powodu możliwości wystąpienia reakcji krzyżowych z przeciwciałami związanymi z różnymi patogenami, takimi jak Treponema pallidum, inne krętki, riketsje lub Helicobacter pylori. Z tego powodu konieczne jest przeprowadzanie dodatkowych analiz western blott w przypadku próbek dodatnich w testach immunologicznych, aby potwierdzić wstępne wyniki uzyskane techniką ELISA. Faktycznie uważa się, że podwyższony poziom przeciwciał u osób chorych jest niewystarczającym czynnikiem diagnostycznym, zatem istnieje potrzeba opracowania jednoznacznego biomarkera boreliozowego zapalenia stawów. Ponadto wciąż także odnotowywane są przypadki zachorowań mimo negatywnych wyników testów serologicznych.

Diagnozowanie boreliozowego zapalenia stawów dodatkowo komplikuje istnienie choroby o praktycznie identycznych objawach klinicznych jaką jest reumatoidalne zapalenie stawów (ang. rheumatoid arthritis, RA). Obie choroby, mimo niemal identycznych objawów związanych m. in. z bólami stawowymi, wymagają zupełnie innego leczenia dającego prognozę na pozytywne efekty leczenia. Zate m istnieje zapotrzebowanie na swoiste i czułe środki do różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów, co pozwoli na wdrożenie adekwatnego leczenia i wyleczenie choroby.

Podobnie diagnozowanie neuroboreliozy komplikuje występowanie innej jednostki chorobowej dającej bardzo zbliżone objawy, mianowicie kleszczowego zapalenia mózgu (KZM). W przeciwieństwie do neuroboreliozy kleszczowe zapalenie mózgu jest wywoływane przez wirusa a nie przez bakterię. Zatem obie choroby, mimo niemal identycznych objawów, wymagają zupełnie innego leczenia. Potrzebne są zatem swoiste środki i sposoby diagnostyczne pozwalające na jednoznacznie rozpoznawanie kliniczne tych chorób, co pozwoli na wdrożenie adekwatnego leczenia i wyleczenie choroby.

Obecnie dostępne środki i sposoby diagnostyczne są zatem niewystarczające. Istnieje zatem zapotrzebowanie na swoiste i czułe sposoby diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów oraz różnicowego diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów. Istnieje ponadto pilna potrzeba dostarczenia swoistych środków, w tym biomarkerów diagnostycznych, do swoistego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów i różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów względem innych jednostek chorobowych.

Celem wynalazku jest zatem dostarczenie sposobów i środków do swoistej i czułej diagnostyki boreliozowego zapalenia stawów i różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów.

Krótki opis wynalazku

Powyższe cele zostały osiągnięte dzięki rozwiązaniom zastrzeganym w załączonych zastrzeżeniach patentowych. Korzystne warianty wynalazku zostały zdefiniowane w zastrzeżeniach zależnych.

Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów u osobnika, polegający na tym, że:

a) w próbce od osobnika oznacza się poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy (LysoPE (14:0)), przy czym próbka wybrana jest spośród krwi pełnej, surowicy i osocza, i

b) porównuje się poziom lizofosfatydyloetanoloaminy oznaczony w a) z poziomem lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w próbce referencyjnej; przy czym próbkę referencyjną stanowi próbka od zdrowego osobnika kontrolnego, i przy czym poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy wyższy niż we wspominanej próbce referencyjnej wskazuje, że osobnik cierpi na boreliozę.

Korzystnie w sposobie diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów według wynalazku jako próbkę od osobnika stosuje się próbkę wybraną z grupy obejmującej osocze i surowicę.

Korzystniej jako próbkę od osobnika stosuje się osocze krwi.

Korzystnie w sposobie diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów według wynalazku osobnikiem jest człowiek.

Korzystnie w sposobie diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów według wynalazku poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy oznacza się metodą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS), zwłaszcza metodą LC-MS/MS.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób różnicowego diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów, polegający na tym, że:

w próbce od osobnika oznacza się poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy (LysoPE(14: 0)), przy czym próbka ta wybrana jest spośród krwi pełnej, surowicy i osocza,

PL 238 142 B1 i porównuje się poziom lizofosfatydyloetanoloaminy oznaczony w a) z poziomem w próbce referencyjnej; przy czym próbkę referencyjną stanowi próbka od zdrowego osobnika kontrolnego, i przy czym poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy wyższy niż we wspominanej próbce referencyjnej wskazuje, że osobnik cierpi na boreliozowe zapalenie stawów.

Korzystnie w takim sposobie diagnozowania różnicowego in vitro według wynalazku jako próbkę od osobnika stosuje się próbkę wybraną z grupy obejmującej osocze i surowicę.

Korzystniej w takim sposobie różnicowego diagnozowania in vitro według wynalazku jako próbkę od osobnika stosuje się osocze krwi.

Korzystnie w takim sposobie różnicowego diagnozowania in vitro według wynalazku osobnikiem jest człowiek.

Korzystnie w takim sposobie diagnozowania różnicowego in vitro według wynalazku poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy mierzy się metodą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS), zwłaszcza metodą LC-MS/MS.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy jako biomarkera do diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy jako biomarkera do różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów.

Szczegółowy opis wynalazku

Biomarker, inaczej marker biologiczny lub bioindykator, to wskaźnik biologiczny, który pozwala na jakościową i/lub ilościową ocenę różnych stanów medycznych, patologicznych, chorobowych i/lub zjawisk czy cech biologicznych. W nowoczesnej medycynie biomarkery odgrywają nieocenioną rolę, pozwalając między innymi na szybką, precyzyjną, swoistą i czułą diagnostykę różnych chorób lub zaburzeń. Biomarkery takie definiuje się jako czynniki molekularne, genetyczne lub biochemiczne, służące do precyzyjnej i łatwej diagnostyki chorób, na przykład przewlekłych, genetycznych, nowotworowych, jak również oceny progresji takiego rodzaju chorób lub też monitorowania ich leczenia, czy też oceny prawdopodobieństwa wystąpienia takiego rodzaju chorób u badanego osobnika.

W ostatnim dziesięcioleciu poczyniono znaczny postęp w zakresie badań dotyczących zmian w metabolizmie lipidów. Dlatego analiza profilu fosfolipidów sugerowana była w celu wczesnego rozpoznania klinicznego wielu schorzeń, np. w celu scharakteryzowania nowotworów lub innych chorób zobacz, np., publikacje autorstwa Wymann M. P., and Schneiter R. 2008. Lipid signalling in disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: 162-176 oraz Fernandis A. Z., and Wenk M. R. 2009. Lipid-based biomarkers for cancer. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877: 2830-2835. Jednakże jak dotąd analiza profilu fosfolipidów nie była wykorzystywana do diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów.

Twórcy niniejszego wynalazku zidentyfikowali i opracowali nowy biomarker, który pozwala na swoiste i czułe diagnozowanie boreliozy, dokładniej boreliozowego zapalenia stawów, a także różnicowe diagnozowanie boreliozowego zapalenia stawów względem innych chorób, takich jak, odpowiednio, reumatoidalne zapalenie stawów (RA).

Zidentyfikowanym przez twórców niniejszego wynalazku biomarkerem jest lizofosfatydyloetanoloamina zawierająca kwas mirystynowy LysoPE(14:0) (LPE(14:0)). Jest to związek chemiczn y o masie molekularnej wynoszącej 425,497 g/mol; masie monoizotopowej wynoszącej 425,254 g/mol; wzorze sumarycznym: C19H40NO7P i wzorze strukturalnym przedstawionym na Figurze 1.

Przedmiotem wynalazku jest więc zastosowanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy jako biomarkera do diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów, a także zastosowanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy jako biomarkera do różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów.

Fosfatydyloetanoloamina zawierająca kwas mirystynowy jest związkiem egzogennym syntetyzowanym w organizmach bakterii, grzybów czy roślin, natomiast związek ten nie jest syntetyzowany w organizmie zwierząt, w tym człowieka. W związku z powyższym obecność w organizmie zwierzęcia, w tym człowieka, śladowych ilości związków zawierających ten kwas, włączając w to fosfolipidy, a zwłaszcza fosfatydyloetanoloaminę, jest spowodowana czynnikiem egzogennym, np. dietą zawierającą duże ilości tłuszczy pochodzenia roślinnego. Fosfolipidy stanowią podstawowy element budulcowy każdej błony komórkowej. Wśród wszystkich zidentyfikowanych fosfolipidów wyizolowanych z komórek Borrelia burgdorferi stwierdzono znaczny udział lizofosfolipidów zawierających zidentyfikowany specyficzny kwas, to znaczy kwas mirystynowy. Lizofosfolipidy (LPL) należą do grupy fosfolipidów powstających w wyniku

PL 238 142 B1 hydrolizy fosfolipidów (PL) z udziałem enzymu fosfolipazy A2 (PLA2). Stwierdzono, że enzym ten odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej organizmu na infekcję bakteryjną. Potwierdzono także podwyższoną aktywność PLA2 w osoczu pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów. Dodatkowo wykazano, że bakterie posiadają specyficzne białko będące przenośnikiem LPL wewnątrz ich ściany komórkowej, w wyniku czego dochodzi do ich kumulacji po wewnętrznej stronie błony. Zobacz, np. następujące publikacje: Belisle, J. T., Brandt, M. E., Radolf, J. D., & Norgard, M. V. (1994). Fatty acids of Treponema pallidum and Borrelia burgdorferi lipoproteins. Journal of bacteriology, 176(8), 2151-2157; Ben-Menachem, G. , Kubler-Kielb, J., Coxon, B., Yergey, A., & Schneerson, R. (2003). A newly discovered cholesteryl galactoside from Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(13), 7913-7918; Fraser, C. M., Casjens, S., Huang, W. M., Sutton, G. G., Clayton, R., Lathigra, R., & Gwinn, M. (1997). Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature, 390(6660), 580-586.

Jednakże do tej pory lizofosfatydyloetanoloamina zawierająca kwas mirystynowy nie była kojarzona ani z występowaniem żadnej jednostki chorobowej, ani nie była stosowana jako biomarker do diagnozowania żadnej jednostki chorobowej.

W wyniku przeprowadzonych badań dotyczących oceny zmian w profilu fosfolipidowym (dane nieopublikowane) twórcy wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili kilkunastokrotnie większe stężenie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w płynach ustrojowych, takich jak osocze, od pacjentów z boreliozą, dokładniej borelizowym zapaleniem stawów, względem osób zdrowych, jak również względem pacjentów z RA i KZM, którzy nie są jednak dotknięci boreliozą, borelizowym zapaleniem stawów. Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili obecność lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w osoczu pacjentów z reaumatoidalnym zapaleniem stawów (RA), aczkolwiek zawartość tego związku nie różniła się statystycznie od zawartości u osób zdrowych. Zbliżone wyniki uzyskano w przypadku pacjentów z neuroboreliozą.

Zatem niniejszy wynalazek dostarcza zastosowanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy jako biomarkera do diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów, a także do różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów. Niniejszy wynalazek dostarcza również odpowiednich sposobów diagnostycznych in vitro polegających na oznaczaniu tego biomarkera w próbce od osobnika, przy czym podwyższony poziom lub stężenie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w takiej próbce wskazuje na występowanie u badanego osobnika boreliozowego zapalenia stawów . Osobnikiem badanym jest korzystnie człowiek, ale może to być także zwierzę, u którego potrzebna jest diagnostyka boreliozowego zapalenia stawów. Próbkę referencyjną zgodnie z wynalazkiem stanowi próbka pochodząca od osobnika kontrolnego, to znaczy osobnika zdrowego bez boreliozy, bez neuroboreliozy, bez RA i bez KZM. Taką próbkę referencyjną może stanowić także próbka od osobnika z RA lub KZM, ale który jednocześnie nie ma ani boreliozy, ani boreliozowego zapalenia stawów, ani neuroboreliozy.

Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili wysoce specyficzne powiązanie diagnostyczne lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy z boreliozowym zapaleniem stawów. Do tej pory lizofosfatydyloetanoloamina zawierająca kwas mirystynowy nie była stosowana jako biomarker diagnostyczny i nie była kojarzona z żadną jednostką chorobową, nie była także stosowana w celach diagnostycznych. Twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że lizofosfatydyloetanoloamina zawierająca kwas mirystynowy jest swoistym i czułym biomarkerem boreliozowego zapalenia stawów.

Oznaczanie poziomu lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w sposobach według wynalazku można przeprowadzić standardowymi sposobami znanymi w tej dziedzinie. Korzystnie poziom ten oznacza się z zastosowaniem wysoce wyspecjalizowanej techniki analitycznej jaką jest chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS), lub korzystniej metodą LC-MS/MS, które jako takie są znane w tej dziedzinie. Możliwe jest oznaczanie poziomu tego związku także innymi metodami analitycznymi znanymi w tej dziedzinie. W tym celu mogą być przykładowo wykorzystane przeciwciała antyfosfolipidowe (APA, ang. antiphospholipid antibodies), które są skierowane przeciwko fosfolipidom i białkom osocza wiążącym fosfolipidy. Taka metoda analityczna upraszcza procedurę oznaczania poziomu lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w próbce od osobnika, wykazując przy tym wysoką specyficzność oznaczenia.

Opisane tu zestawy diagnostyczne do diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów a także do różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów zawierające środek do oznaczania lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy mogą być stosowane do precyzyjnego dia

PL 238 142 B1 gnozowania boreliozowego zapalenia stawów u osobników wykazujących wstępne objawy choroby potwierdzone stosowanymi obecnie metodami immunologicznymi. Ponadto takie zestawy diagnostyczne umożliwiają proste i szybkie stwierdzenie obecności lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy i jej ilościową ocenę w badanej próbce od osobnika, np. w osoczu, dzięki czemu mogą być użytecznymi narzędziami diagnostycznymi pozwalającymi na diagnozowanie boreliozowego zapalenia stawów i różnicowe diagnozowanie boreliozowego zapalenia stawów względem RA. Środkiem do oznaczania lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w takich zestawach może być dowolny środek nadający się do oznaczania lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w próbce od osobnika, takiej jak próbka płynu ustrojowego od osobnika, korzystnie osocza. Przykładowo mogą to być przeciwciała antyfosfolipidowe wiążące ten biomarker, tj. LysoPE(14:0).

W wyniku przeprowadzonych przez twórców niniejszego wynalazku badań dotyczących oceny zmian w profilu fosfolipidowym osób z boreliozowym zapaleniem stawów względem osób zdrowych (dane nieopublikowane) i względem osób cierpiących na RA nieoczekiwanie stwierdzone zostało kilkunastokrotnie wyższe stężenie lizofosfolipidu zawierającego specyficzny kwas, to znaczy lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy, w osoczu pacjentów z borelizowym zapaleniem stawów względem osób zdrowych. Wykazano zatem, że obecność lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w płynach ustrojowych, takich jak osocze krwi, jest użytecznym biomarkerem boreliozy, dokładniej boreliozowego zapalenia stawów.

Lizofosfatydyloetanoloamina zawierająca kwas mirystynowy występuje w osoczu ludzi zdrowych jedynie w śladowych ilościach, co dotyczy również innych fosfolipidów zawierających kwas mirystynowy. Podobnie sytuacja wygląda w przypadku pacjentów z RA. Wynika to z faktu, że kwas mirystynowy zawarty w zidentyfikowanym lizofosfolipidzie jest związkiem egzogennym, syntetyzowanym w organizmach bakterii, grzybów czy roślin, nie jest natomiast syntetyzowany w takim organizmie zwierzęcym, w tym w organizmie człowieka. W związku z powyższym obecność w organizmie człowieka śladowych ilości związków zawierających kwas mirystynowy, włączając w to fosfolipidy, jest spowodowana dietą zawierającą duże ilości tłuszczy pochodzenia roślinnego. Fosfolipidy stanowią podstawowy element budulcowy każdej błony komórkowej. Wśród wszystkich zidentyfikowanych fosfolipidów wyizolowanych z komórek Borrelia burgdorferi stwierdzono znaczny udział fosfolipidów zawierających zidentyfikowany specyficzny kwas. Lizofosfolipidy (LPL, LysoPL) należą do grupy fosfolipidów powstających w wyniku hydrolizy fosfolipidów (PL) z udziałem enzymu fosfolipazy A2 (PLA2). Stwierdzono, że enzym ten odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej organizmu na infekcję bakteryjną. Podwyższona aktywność PLA2 w osoczu pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów również została potwierdzona. Dodatkowo wykazano, że bakterie posiadają specyficzne białko będące przenośnikiem LysoPL wewnątrz ich ściany komórkowej, w wyniku czego dochodzi do ich kumulacji po wewnętrznej stronie błony.

Powyższe informacje razem wzięte stanowią podstawę stwierdzenia, że podwyższona zawartość lizofosfolipidu zawierającego kwas mirystynowy w próbkach od pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów jest wynikiem obecności w organizmie osobnika bakterii Borrelia burgdorferi, co wskazuje jednocześnie na to, że badany osobnik jest chory na boreliozowe zapalenie stawów i potwierdza użyteczność tego związku jako biomarkera tej choroby, jak również jego użyteczność w sposobach diagnozowania tych chorób in vitro.

Dodatkowo, w przypadku boreliozowego zapalenia stawów, którego rozpoznanie kliniczne dodatkowo komplikuje istnienie choroby o praktycznie identycznych objawach klinicznych jaką jest reumatoidalne zapalenie stawów (RA), wynalazek pozwala na różnicowe diagnozowanie boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów. Obie te choroby, mimo niemal identycznych objawów, wymagają zupełnie innego leczenia. W wyniku przeprowadzonych przez twórców niniejszego wynalazku badań dotyczących oceny zmian w profilu fosfolipidowym osób z reumatoidalnym zapaleniem stawów względem osób zdrowych (dane nieopublikowane) obecność lizofosfolipidu zawierającego kwas mirystynowy została stwierdzona w osoczu pacjentów z RA, aczkolwiek zawartość tego związku nie różniła się statystycznie od zawartości u osób zdrowych. Zatem niniejszy wynalazek dostarcza zastosowanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy jako biomarkera boreliozowego zapalenia stawów, a ponadto dostarcza sposobu diagnozowania tej choroby in vitro pozwalającego na uniknięcie błędów diagnostycznych wskazujących na RA. Korzystnie płynem ustrojowym stosowanym w sposobie diagnostycznym według wynalazku jest osocze.

PL 238 142 B1

Zbliżone wyniki twórcy wynalazku uzyskali w przypadku neuroboreliozy. LysoPE(14:0) może być więc użytecznym biomarkerem boreliozy i neuroboreliozy, który może być stosowany do swoistego diagnozowania tych chorób, zwłaszcza różnicowego diagnozowania neuroboreliozy względem boreliozowego zapalenia stawów (KZM).

Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany w poniższym przykładzie, który jednak nie ma na celu ograniczenia w żaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach patentowych. O ile nie wskazano inaczej wszelkie metody i parametry są takie, jakie powszechnie stosuje się w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek, a stosowane urządzenia oraz odczynniki stosowane są w sposób zalecany przez ich wytwórców.

Opis figur

Figura 1 - przedstawia wzór strukturalny lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy.

Figura 2 - Fig. 2A przedstawia reprezentatywny chromatogram wszystkich jonów (TIC, ang. Total lon Chroamtogram) w trybie jonizacji negatywnej dla osocza krwi pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA) (górny chromatogram); chromatogram pojedynczego jonu dla m/z 424,6424 (EIC, ang. Extracted Ion Chroamtogram) w trybie jonizacji negatywnej (dolny chromatogram); Fig. 2B - przedstawia reprezentatywne widmo masowe MS dla piku o RT = 12,06 min (górne widmo); widmo masowe fragmentacyjne MS/MS dla jonu o stosunku m/z 424,2442 odpowiadającemu jonowi molekularnemu LysoPE(14:0) (dolne widmo) - sygnał dla m/z 227,2016 potwierdza obecność kwasu mirystynowego (14:0) w strukturze sfragmentowanego związku.

Figura 3 - przedstawia wykres skrzynkowy (Box-and-whisker) pokazujący graficzne zmiany względnej zawartości LysoPE(14:0) u osób zdrowych, pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów oraz pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów. (p<0,0001****). LA - boreliozowe zapalenie stawów; RA - reumatoidalne zapalenie stawów; C - kontrola.

Figura 4 - przedstawia reprezentatywne chromatogramy wszystkich jonów (TIC - Total Ion Chroamtogram), jako profil fosfolipidowy w trybie jonizacji negatywnej: osocze od pacjenta z boreliozowym zapaleniem stawów - panel A; osocze od osoby zdrowej - panel B; osocze od pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów - panel C.

Figura 5 - przedstawia reprezentatywne chromatogramy pojedynczego jonu (EIC - Extracted Ion Chroamtogram) w trybie jonizacji negatywnej dla m/z 424,6424 odpowiadającemu jonowi molekularnemu LysoPE(14:0), czas retencji RT = 12 min.: osocze od pacjenta z boreliozowym zapaleniem stawów - panel A; osocze od osoby zdrowej - panel B; osocze od pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów - panel C.

Figura 6 - przedstawia widmo masowe MS dla piku o RT=12,06 min (górny panel); widmo masowe fragmentacyjne MS/MS dla jonu o stosunku m/z 424,2442 odpowiadającemu jonowi molekularnemu LysoPE(14:0) (dolny panel) - sygnał dla m/z 227,2016 potwierdza obecność kwasu mirystynowego (14:0) w strukturze sfragmentowanego związku.

Figura 7 - przedstawia reprezentatywne chromatogramy w trybie nakładania (overlaid mode) pojedynczego jonu (EIC - Extracted Ion Chroamtogram) w trybie jonizacji negatywnej dla m/z 424,6424 odpowiadającemu jonowi molekularnemu LysoPE (14:0), czas retencji RT=12 min.: LA - osocze od pacjenta z boreliozowym zapaleniem stawów; C - osocze od osoby zdrowej; RA - osocze od pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów.

Przykład - Oznaczanie poziomu LysoPE(14:0)

Materiał do badań

Materiałem biologicznym wykorzystanym do analiz było osocze uzyskane z krwi żylnej osób chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RA), osób chorych na boreliozowe zapalenie stawów (LA) oraz osób zdrowych. Grupę LA stanowiło 9 pacjentów ze zdiagnozowanym boreliozowym zapaleniem stawów (2 kobiety i 7 mężczyzn), w wieku od 22 do 81 lat (średni wiek to 49 lat) hospitalizowanych w Klinice Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji UM w Białymstoku. Schorzenie zostało zdiagnozowane na podstawie obecności swoistych przeciwciał w klasie IgM i/lub IgG przeciw Borrelia burgdorferi w surowicy krwi, wykrytych metodą ELISA. Grupę RA stanowiło 9 pacjentów z aktywnym RA (2 kobiety i 7 mężczyzn), w wieku od 23 do 79 lat (średni wiek to 48 lat). Ocena aktywności choroby została oparta na czterowskaźnikowym parametrze jakim jest DAS28-CRP. Grupę kontrolną stanowiło 9 zdrowych osób (2 kobiety i 7 mężczyzn) w wieku od 24 do 71 lat (średni wiek to 47 lat). Od pacjentów jak i osób zdrowych pobrano krew żylną do heparynizowanych probówek. Próbki zostały odwirowane z prędkością 2000 x g, w 4°C przez 20 minut celem uzyskania osocza. Po dodaniu butylohydroksytoluenu (BHT),

PL 238 142 B1 pełniącego rolę przeciwutleniacza, próbki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy. Badanie rozpoczęło się po uzyskaniu zgody Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku oraz pisemnej zgody każdego uczestnika badania.

Związek został zidentyfikowany w osoczu od pacjentów, jak i w osoczu od osób zdrowych wysoce wyspecjalizowaną techniką analityczną LC-MS wykorzystującą chromatografię oddziaływań hydrofilowych (HILIC), po uprzedniej izolacji frakcji lipidów metodą ekstrakcji rozpuszczalnik-rozpuszczalnik szczegółowo opisanych poniżej.

Ekstrakcja lipidów z osocza krwi

Ekstrakcję prowadzono w szklanych probówkach, przemytych wcześniej chloroformem (CHCI3) w celu usunięcia jakichkolwiek zanieczyszczeń. Do każdej z probówek wprowadzano 200 μl osocza i 1,5 ml schłodzonego do temperatury -20°C metanolu (MeOH). Otrzymaną mieszaninę wytrząsano na Vortexie przez 10 minut. Następnie dodano 3 ml CHCI3 schłodzonego do temperatury -20°C i wytrząsano ponownie na Vortexie przez 3 minuty. W kolejnym etapie przeprowadzono inkubację ekstrahowanych próbek w lodzie trwającą jedną godzinę. W trakcie trwania inkubacji od czasu do czasu zawartość probówek wytrząsano przez chwilę na Vortexie. Po inkubacji w celu zainicjowania rozdziału faz dodano 1,25 ml wody ultraczystej (miliQ) i próbki pozostawiono ponownie w lodzie na 10 minut od czasu do czasu mieszając ich zawartość na Vortexie. Następnie próbki odwirowano przy 2500 x g przez 10 minut. Po odwirowaniu dolną fazę organiczną przeniesiono do nowej szklanej probówki i przeprowadzono ponowną ekstrakcję poprzez dodanie 2 ml schłodzonej do temperatury -20°C mieszaniny CHCh/MeOH (2:1, obj./obj.). Otrzymaną kolejną porcję warstwy chloroformu połączono z porcją zebraną uprzednio i odparowano do suchej pozostałości w atmosferze azotu. Uzyskane ekstrakty przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy

Oznaczenie profilu fosfolipidów w osoczu krwi przy użyciu systemu LC-MS-QTOF.

W celu otrzymania profilu fosfolipidów, otrzymane ekstrakty lipidów osocza krwi od pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów, pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów oraz osób zdrowych zostały poddane analizie z użyciem systemu LC-MS-QT0F w trybie „data dependent” MS/MS (auto MS/MS). Rozdział fosfolipidów na klasy prowadzono przy wykorzystaniu chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC) stosując kolumnę Ascentis Si HPLC Pore 15 cm x 1,0 mm, 3 mm; (Sigma-Aldrich) oraz elucję gradientową kombinacją dwóch faz ruchomych A i B. Faza ruchoma A zawierała 25% wody, 50% acetonitrilu, oraz 25% obj./obj. metanolu oraz dodatek 10 mM soli w postaci octanu amonu. Faza ruchoma B zawierała z kolei 60% acetonitrylu, 40% metanolu oraz dodatek 10 mM octanu amonu. Zastosowany gradient przy przepływie fazy ruchomej 40 ml/min, wykorzystywał mieszaninę o następującym składzie:

0% fazy ruchomej A i	100%	fazy	ruchomej	B	[0 min.]
100% fazy ruchomej A	i 0%	fazy	ruchomej	B	[20 min.]
100% fazy ruchomej A	i 0%	fazy	ruchomej	B	[35 min.]
0% fazy ruchomej A i	100%	fazy	ruchomej	B	[45 min.]

Faza ruchoma B posłużyła jako rozpuszczalnik dla próbek ekstraktów zawierających 20 μg fosfolipidów. 5 μl tak przygotowanych próbek wstrzykiwane było na kolumnę chromatograficzną.

Próbki ekstraktów analizowane były w trybie jonizacji negatywnej przy wykorzystaniu źródła jonizacji typu elektrorozpylania (ESI).

Do diagnostyki sposobem według wynalazku wykorzystano ultrasprawny chromatograf cieczowy (UPLC) firmy Agilent Technologies, serii 1290; detektor masowy typu QTOF - model 6540 firmy Agilent Technologies, wyposażony w źródło jonizacji elektrospray (ESI); generator azotu firmy Peak Scientific, model LC-MS 20; kolumnę chromatograficzną Ascentis Si HPLC Pore 15 cm x 1,0 mm, 3 μm - SigmaAldrich. Do realizacji sposobów według wynalazku zastosować można jednak dowolne inne urządzenia, systemy i zestawy analityczne powalające na ilościowe oznaczanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy.

Analiza statystyczna

Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej w następujący sposób. Analizowano krotność zmiany względnej zawartości LysoPE(14:0) u osób zdrowych, pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów oraz pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów. Analizę statystyczną przeprowadzono w oparciu o jednoczynnikową analizę ANOVA (One-way ANOVA). Względną ilość LysoPE(14:0) obliczono dzieląc pole powierzchni piku LysoPE(14:0), uzyskane na podstawie chromatogramów wybranych jonów (Extracted Ion Chromatogam - EIC), przez pole powierzchni piku PC (28:0) będącego stan

PL238 142 Β1 dardem wewnętrznym (ISTD). Wyniki wyrażono w postaci średnich arytmetycznych oraz średnich błędów standardowych. Porównania pomiędzy grupą kontrolną a osobami chorymi na reumatoidalne i boreliozowe zapalenie stawów dokonano stosując jednoczynnikową analizę ANOVA (One-way ANOVA) oraz test post hock (Tukey's HSD test) przy użyciu pakietu statystycznego GraphPad Prism v.7.0, GraphPad Software, USA. Różnice przy p < 0,05 uznano za istotne statystycznie.

Uzyskane wyniki podano w Tabeli 1 poniżej oraz na Figurach 2 do 7.

T a b e I a 1. Krotność zmiany względnej zawartości LysoPE(14:0) u osób zdrowych, pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów i pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów. Skróty: LA boreliozowe zapalenie stawów; RA - reumatoidalne zapalenie stawów; LPE - lizofosfatydyloetanoloamina; RT - czas retencji; ID - skrócona nazwa związku; C - kontrola.

m/z	RT	ID	Log2 (krotność zmiany)
LA wzgl. C	Wartość P	RA wzgl. C	Wartość P	LA wzgl. RA	Wartość P
424,2464	12,38	LysoPE (14:0)	3,937	<0,0001	0,691	ns	-3,246	<0,0001

Na Figurze 3 przedstawiono wykres skrzynkowy (Βοχ-and-whisker) przedstawiający graficzne zmiany względnej zawartości LysoPE(14:0) u osób zdrowych (C), pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA) i pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów (LA). (p<0,0001 ****). Wykazano, że względna zawartość LysoPE(14:0) u pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów jest statystycznie istotnie wyższa zarówno w porównaniu do osób zdrowych (kontrola) jak i w porównaniu do pacjentów z RA.

Na Figurze 4 przedstawiono reprezentatywne, przykładowe chromatogramy wszystkich jonów (TIC - Total lon Chroamtogram), jako profil fosfolipidowy w trybie jonizacji negatywnej: osocze od pacjenta z boreliozowym zapaleniem stawów - panel A; osocze od osoby zdrowej - panel B; osocze od pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów - panel C.

Na Figurze 5 przedstawiono reprezentatywne, przykładowe chromatogramy pojedynczego jonu (EIC - Extracted lon Chroamtogram) w trybie jonizacji negatywnej dla m/z 424,6424 odpowiadającemu jonowi molekularnemu LysoPE(14:0), czas retencji RT=12 min.: osocze od pacjenta z boreliozowym zapaleniem stawów - panel A; osocze od osoby zdrowej - panel B; osocze od pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów - panel C. Wyraźnie widać różnicę uzyskanego profilu chromatogramu dla pacjenta z boreliozowym zapaleniem stawów (panel A) wskazującą na obecność LysoPE(14:0) i jednocześnie pozwalającą na diagnozowanie boreliozy. Zaobserwować można wyraźnie większy pik lizofosfolipidu zawierającego kwas mirystynowy, tj. LysoPE(14:0), na panelu A w przeciwieństwie do paneli B i C.

Na Figurze 6 przedstawiono widmo masowe MS dla piku o RT=12,06 min (górny panel); widmo masowe fragmentacyjne MS/MS dla jonu o stosunku m/z 424,2442 odpowiadającemu jonowi molekularnemu LysoPE(14:0) (dolny panel) - sygnał dla m/z 227,2016 potwierdza obecność kwasu mirystynowego (14:0) w strukturze sfragmentowanego związku.

Na Figurze 7 przedstawiono reprezentatywne chromatogramy w trybie nakładania (overlaid modę) pojedynczego jonu (EIC - Extracted lon Chroamtogram) w trybie jonizacji negatywnej dla m/z 424,6424 odpowiadającemu jonowi molekularnemu LysoPE(14:0), czas retencji RT=12 min.: osocze od pacjenta z boreliozowym zapaleniem stawów - LA; osocze od osoby zdrowej - C; osocze od pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów - RA. Wyraźnie widać, że największy pik uzyskano dla pacjenta z boreliozowym zapaleniem stawów, co wykazuje, że sposób według wynalazku wykorzystujący biomarker w postaci lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy pozwala na swoiste diagnozowanie boreliozowego zapalenia stawów względem osoby zdrowej i różnicowe diagnozowanie względem chorego cierpiącego na RA (ale który to chory nie cierpi jednak na boreliozę czy boreliozowe zapalenie stawów lub neuroboreliozę).

PL 238 142 B1

Przedstawione dane potwierdzają, że sposoby według wynalazku pozwalają na precyzyjne, czułe i swoiste rozróżnienie osobnika chorego na boreliozowe zapalenie stawów, zarówno od osobnika zdrowego, jak i od osobnika cierpiącego na RA (ale który to osobnik nie cierpi jednak na boreliozę czy boreliozowe zapalenie stawów lub neuroboreliozę).

Podsumowując, jak widać w powyższej Tabeli 1 i na przedstawionych Figurach uzyskano statystycznie istotne różnice w zawartości LysoPE(14:0) w badanych próbkach od osób chorych na bore liozowe zapalenie stawów względem próbek od osób zdrowych, jak i osób cierpiących na RA (ale bez boreliozy czy boreliozowego zapalenia stawów lab neuroboreliozy). W próbkach osocza pochodzących od pacjentów z boreliozowym zapaleniom stawów względna zawartość LysoPE(14:0) była istotnie wyższa niż w próbkach osocza od osób zdrowych i osób z RA niechorujących na boreliozę/boreliozowe zapalenie stawów. Uzyskane wyniki wykazują, że LysoPE (14:0) może być skutecznie stosowana jako biomarker boreliozy, a w szczególności jako biomarker boreliozowego zapalenia stawów, pozwalający na swoistą diagnostykę boreliozowego zapalenia stawów oraz na różnicowe diagnozowanie boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów u osobnika, znamienny tym, że:

a) w próbce od osobnika oznacza się poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy LysoPE(14:0), przy czym próbka wybrana jest spośród krwi pełnej, surowicy i osocza, i

b) porównuje się poziom lizofosfatydyloetanoloaminy oznaczony w a) z poziomem lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy w próbce referencyjnej; przy czym próbkę referencyjną stanowi próbka od zdrowego osobnika kontrolnego, i przy czym poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy wyższy niż we wspominanej próbce referencyjnej wskazuje, że osobnik cierpi na boreliozowe zapalenie stawów
2. Sposób diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów według zastrz. 1, znamienny tym, że jako próbkę od osobnika stosuje się próbkę wybraną z grupy obejmującej osocze i surowicę.
3. Sposób diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów według zastrz. 2, znamienny tym, że próbkę stanowi osocze krwi.
4. Sposób diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że osobnikiem jest człowiek.
5. Sposób diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy oznacza się metodą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS), zwłaszcza metodą LC-MS/MS.
6. Sposób różnicowego diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów, znamienny tym, że:

a) w próbce od osobnika oznacza się poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy LysoPE(14:0), przy czym próbka ta wybrana jest spośród krwi pełnej, surowicy i osocza, i

b) porównuje się poziom lizofosfatydyloetanoloaminy oznaczony w a) z poziomem w próbce referencyjnej; przy czym próbkę referencyjną stanowi próbka od zdrowego osobnika kontrolnego, i przy czym poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy wyższy niż we wspominanej próbce referencyjnej wskazuje, że osobnik cierpi na boreliozowe zapalenie stawów.
7. Sposób diagnozowania różnicowego in vitro według zastrzeżenia 6, znamienny tym, że jako próbkę od osobnika stosuje się próbkę wybraną z grupy obejmującej osocze i surowicę.
8. Sposób diagnozowania różnicowego in vitro zastrz. 7, znamienny tym, że próbkę stanowi osocze krwi.
9. Sposób diagnozowania różnicowego in vitro według jednego z zastrz. 6 do 8, znamienny tym, że osobnikiem jest człowiek.

PL238 142 Β1
10. Sposób diagnozowania in vitro według jednego z zastrz. 6 do 9, znamienny tym, że poziom lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy mierzy się metodą chromatografii cieczowej - chromatografii masowej (LC-MS), zwłaszcza metodą LC-MS/MS.
11. Zastosowanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowyjako biomarkera do diagnozowania in vitro boreliozowego zapalenia stawów.
12. Zastosowanie lizofosfatydyloetanoloaminy zawierającej kwas mirystynowy jako biomarkera do różnicowego diagnozowania boreliozowego zapalenia stawów względem reumatoidalnego zapalenia stawów.