PL238148B1 - Biopreparaty do ochrony roślin przed zakażeniem bakteryjnym - Google Patents
Biopreparaty do ochrony roślin przed zakażeniem bakteryjnym Download PDFInfo
- Publication number
- PL238148B1 PL238148B1 PL431434A PL43143419A PL238148B1 PL 238148 B1 PL238148 B1 PL 238148B1 PL 431434 A PL431434 A PL 431434A PL 43143419 A PL43143419 A PL 43143419A PL 238148 B1 PL238148 B1 PL 238148B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteria
- strain
- polish
- microorganisms
- wrocław
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 32
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 title claims description 6
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 title claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 144
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 92
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 71
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 40
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 claims description 25
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 25
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 claims description 25
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 claims description 24
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 claims description 24
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 229920005552 sodium lignosulfonate Polymers 0.000 claims description 23
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 21
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical class OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 claims description 21
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 claims description 20
- 241000881771 Serratia rubidaea Species 0.000 claims description 20
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 claims description 20
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 16
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 15
- 241001622809 Serratia plymuthica Species 0.000 claims description 14
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 13
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 13
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 241000881808 Lelliottia amnigena Species 0.000 claims description 12
- 241001478271 Rahnella aquatilis Species 0.000 claims description 9
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 9
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 6
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 24
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 23
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 21
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 20
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 13
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 230000002351 pectolytic effect Effects 0.000 description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241001187099 Dickeya Species 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- 241000531155 Pectobacterium Species 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- YDEXUEFDPVHGHE-GGMCWBHBSA-L disodium;(2r)-3-(2-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-[2-methoxy-4-(3-sulfonatopropyl)phenoxy]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].COC1=CC=CC(C[C@H](CS([O-])(=O)=O)OC=2C(=CC(CCCS([O-])(=O)=O)=CC=2)OC)=C1O YDEXUEFDPVHGHE-GGMCWBHBSA-L 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241001187098 Dickeya dianthicola Species 0.000 description 1
- 241001160201 Dickeya solani Species 0.000 description 1
- 101100022434 Homo sapiens MVB12A gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038747 Multivesicular body subunit 12A Human genes 0.000 description 1
- 241001624371 Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 Species 0.000 description 1
- 241000588702 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Species 0.000 description 1
- 241000571844 Pectobacterium parmentieri Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101100445860 Saccharum hybrid CFBP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005337 ground glass Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 231100000824 inhalation exposure Toxicity 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy biopreparatów stanowiących kompozycję mikroorganizmu(ów) - jako substancja czynna oraz substancji dodatkowych w opracowanej formulacji. Wynalazek umożliwia utrzymanie żywotności mikroorganizmów, będących środkami ochrony biologicznej roślin, podczas długotrwałego przechowywania. Wynalazek znajduje zastosowanie do ochrony roślin przed chorobami zwłaszcza bakteryjnymi, np. powodowanymi przez bakteryjne patogeny pektynolityczne z rodzajów Pectobacterium i Dickeya.
Jednym z głównych wyzwań w komercyjnym stosowaniu biologicznych środków ochrony roślin biopestycydów jest ich przygotowanie do aplikacji w warunkach polowych i przemysłowych. Najważniejszym składnikiem każdego środka tego typu jest substancja czynna, którą w biologicznej ochronie roślin, tzw. biokontroli, najczęściej stanowi mikroorganizm lub mikroorganizmy. Jednakże obecność samej substancji czynnej (mikroorganizmu(ów)) jest często niewystarczająca z perspektywy komercyjnego zastosowania, stąd do preparatu dodaje się różne substancje dodatkowe, których zadaniem jest zwiększenie aktywności gotowego biopestycydu i/albo umożliwienie jego przechowywania i/albo zwiększenie łatwości i bezpieczeństwa jego zastosowania. Połączenie substancji czynnej i substancji dodatkowych w procesie technologicznym nosi nazwę formulacji. Preparaty skutecznie poddane formulacji muszą umożliwiać biologicznym środkom kontroli/ochrony utrzymanie żywotności podczas długotrwałego przechowywania. Wybór skutecznej metody formulacji szczepu do biologicznej ochrony roślin nie jest prosty, szczególnie w przypadku nieprzetrwalnikujących bakterii Gram-ujemnych. Ze względu na różnorodność budowy i metabolizmu mikroorganizmów, a także różne mechanizmy ich działania w biologicznej ochronie, nie istnieje jedyna powszechnie stosowana metoda zachowania żywotności szczepów bakteryjnych. Ponadto poddany formulacji produkt musi być zgodny z wymaganiami docelowego systemu uprawy, być bezpieczny w użyciu i być stosunkowo niedrogi w zastosowaniu.
Biopreparaty można wytwarzać jako substancje stałe lub ciecze. Preparaty w stanie stałym obejmują proszki i granule, podczas gdy ciekłe preparaty zawierają komórki mikroorganizmów zawieszone w nośniku na bazie wody lub na bazie oleju. Każdy z rodzajów formulacji oferuje różne korzyści. Na przykład granulki zawierające bakterie kapsułkowane umożliwiają stabilne uwalnianie mikroorganizmów do środowiska, a zatem są korzystne dla zastosowań w glebie, w których krytyczne jest czasowe uwalnianie mikroorganizmów (np. bakterii antagonistycznych). Z kolei proszki, zawierające wysuszone bakterie, zwykle zapewniają najlepszy okres trwałości formulacji, ale wymagają zastosowania odpowiedniej metody suszenia mikroorganizmów np. liofilizacji. Niedogodnością zastosowania formulacji stałej jest często duże pylenie się preparatu co jest niebezpieczne, a zatem wymaga się opracowania rozwiązania aby nie było zbyt pylne z uwagi na bezpieczeństwo zastosowania. W przeciwieństwie do tego, preparaty ciekłe są najprostsze do przygotowania, są kompatybilne z większością sprzętu rolniczego i nadają się również do stosowania jako opryski naliściowe. Jednocześnie preparaty ciekłe nie są tak stabilne jak preparaty stałe i na ogół zapewniają krótszy okres przechowywania i gorszą aktywność formułowanych mikroorganizmów.
Z tego względu poszukuje się gotowych preparatów - biopestycydów o określonej formulacji - do zastosowania w rolnictwie do ochrony roślin przed zakażeniami, które charakteryzowałaby stosunkowa długa żywotność biologicznej substancji aktywnej, łatwość przygotowywania i bezpieczeństwo stosowania.
Nieoczekiwanie problem zapewnienia wysokiej przeżywalności wybranych bakterii Gram-ujemnych o aktywności w biologicznej ochronie roślin, przy jednoczesnej łatwości ich aplikacji oraz skuteczności w ochronie tkanek roślinnych, został rozwiązany w niniejszym wynalazku z wykorzystaniem opracowanych biopreparatów sypkich - formulacji, dalej opisywanych jako WP z ang. wettable powders, zawierających, jako substancję czynną, pojedyncze szczepy mikroorganizmów w formie liofilizatu (Serratia plymuthica A294 lub Enterobacter amnigenus A167 lub Rahnella aquatilis H145 lub Serratia rubidaea H440 lub S. rubidaea H469) lub mieszanin tych szczepów w formie liofilizatu, a także wybrane substancje dodatkowe według opracowanej formulacji, mającej efektywność dla wybranych mikroorganizmów.
Wynalazek stanowi kontynuacje badań doświadczalnych twórców przedmiotowego wynalazku. Ze wcześniejszych badań wiadome było, że szczepy stanowiące substancję czynną biopreparatów według wynalazku, w formie aktywnej metabolicznie (świeże hodowle nie poddane formulacji), wykazują aktywność w biologicznej ochronie bulw ziemniaka przed mokrą zgnilizną powodowaną przez bakterie pektynolityczne z rodzajów Pectobacterium i Dickeya w warunkach przechowywania bulw, co opisano w publikacji badań eksperymentalnych: Krzyżanowska et al., 2018, w czasopiśmie Plant Disease
PL 238 148 B1 (https://doi.org/10.1094/PDIS-10-18-1866-RE), polskim zgłoszeniu patentowym P.423806 z dnia
08.12.2017 i europejskim zgłoszeniu patentowym EP18210901.
Opracowane według obecnego wynalazku biopreparaty zawierają wybrane szczepy z wymienionych poniżej szczepów mikroorganizmów, osobno lub w mieszaninie, w opracowanej formulacji sypkiej umożliwiającej zastosowanie produktu z długą żywotnością biologiczną substancji aktywnej, łatwością przygotowywania i bezpieczeństwem stosowania.
Szczepy użyte w formulacji pojedynczo oraz w mieszaninie pięciu szczepów:
- szczep bakterii antagonistycznej Serratia plymuthica, czyli szczep A294 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00143, w dniu 1 grudnia 2017 roku;
- szczep bakterii antagonistycznej Serratia rubidaea, czyli szczep H469 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00142, w dniu 1 grudnia 2017 roku;
- szczep bakterii antagonistycznej Serratia rubidaea, czyli szczep H440 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00141, w dniu 1 grudnia 2017 roku.
- szczep bakterii antagonistycznej Enterobacter amnigenus, czyli szczep A167 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00145, w dniu 1 grudnia 2017 roku;
- szczep bakterii antagonistycznej Rahnella aquatilis, czyli szczep H145 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00144, w dniu 1 grudnia 2017 roku.
Według wynalazku biopreparat stanowi formulację sypką zawierającą w/w bakterie zaś jako nośnik ziemię okrzemkową oraz dodatki w postaci metylocelulozy, β-cyklodekstryny, lignosulfonianu sodowego, KH2PO4, przy czym ilość bakterii stanowi do 60% wagowych liofilizatu, ziemi okrzemkowej od 28 do 30%, metylocelulozy i lignosulfonianu sodowego do 10% wagowych. Korzystnie, liofilizat bakterii zawiera 1010-1011 jtk * g-1 bakterii. Według wynalazku biopreparat do ochrony roślin przed zakażeniem bakteryjnym zawiera w/w bakterie i stanowi formulację sypką zawierającą jako nośnik kaolin oraz dodatki w postaci metylocelulozy, β-cyklodekstryny, lignosulfonianu sodowego, KH2PO4, przy czym ilość bakterii stanowi do 60% wagowych liofilizatu, kaolinu od 28 do 30%, metylocelulozy i lignosulfonianu sodowego do 10% wagowych. Korzystnie, liofilizat bakterii zawiera 1010-1011 jtk * g-1 bakterii.
Wyboru najbardziej efektywnych biopreparatów dokonano na podstawie badań wielu opracowanych kompozycji - biopreparatów kontrolnych i biopreparatów według wynalazku w danej formulacji i porównaniu ich skuteczności w badaniach eksperymentalnych, co szerzej przedstawiono w przykładach wykonania. Wynalazek stanowi więc opracowanie połączenia opracowanej formulacji sypkiej z zastosowaniem w niej danego, wybranego szczepu bakterii, celem zwiększenia skuteczności środka aktywnego w biopreparacie gotowym do użycia.
W celu sprawdzenia dobrej trwałości (stabilności) półkowej biopreparatów na bazie mikroorganizmów przeprowadzono dodatkowe badania, które potwierdzają wyższość zastosowania biopreparatów sypkich o danym składzie według wynalazku zawierających wybrane szczepy bakterii nad zastosowaniem badanych szczepów bez formulacji, zastosowaniem szczepów poddanych formulacji do postaci biopreparatów płynnych czy też biopreparatów sypkich zawierających określone szczepy, które wykazały się niższą skutecznością. Wykazano również, że opracowane - wybrane kompozycje biopreparatów - umożliwiają zachowanie przez organizmy żywotności oraz zdolności efektywnej ochrony tkanki roślinnej przed chorobami bakteryjnymi, co wykazano w badaniach na bulwach ziemniaka zakażonych bakteriami pektynolitycznymi z rodzajów Pectobacterium i Dickeya.
Sposób otrzymania oraz skuteczność wybranych opracowanych biopreparatów zawierających wybrane szczepy bakterii w opracowanej formulacji przedstawiono w przykładach wykonania oraz na wykresach. Na Fig. 1 przedstawiono miano bakterii w kolejnych punktach czasowych dla różnych formulacji przechowywanych w 8°C przez okres 12 miesięcy. Lot 1 i Lot 2 odnoszą się do różnych partii formulacji badanych w niezależnych eksperymentach. CTRL - kontrola: bakterie bez formulacji zawieszone w % buforze Ringer’s; LQ - formulacja płynna; WP-KAO formulacja sypka z kaolinem; WP-DE formulacja sypka z ziemią okrzemkową. Na fig. 2 przedstawiono wpływ metody formulacji na stabilność półkową szczepów antagonistycznych przechowywanych w 8°C przez okres 12 miesięcy. Analiza została wykonana dla danych zebranych dla wszystkich szczepów. Każda ramka pokazuje nachylenie krzywej przeżywalności (zmiana w log10 jtk na ml formulacji płynnej lub g formulacji sypkiej). Im wyższa
PL 238 148 B1 (bliższa zeru) wartość nachylenia krzywej tym mniejszy spadek liczby żywych komórek, w jtk * g-1 lub jtk * ml-1 na każdy miesiąc przechowywania. CTRL - kontrola: bakterie bez formulacji zawieszone w % buforze Ringer’s; LQ - formulacja płynna; WP-KAO formulacja sypka z kaolinem; WP-DE - formulacja sypka z ziemią okrzemkową. Różniące się litery oznaczają statystycznie istotną różnicę w wartościach nachylenia krzywej (t-test, a=0,05). Na fig. 3 przedstawiono stopień porażenia mokrą zgnilizną (A, B) oraz występowanie choroby (C, D) dla ziemniaków ko-infiltrowanych mieszaniną szczepów antagonistycznych oraz mieszaniną bakterii pektynolitycznych, po okresie przechowywania inokulowanych bulw przez 6 miesięcy w 8°C. Wyniki z dwóch niezależnych eksperymentów (1 i 2). Stopień porażenia został określony w skali symptomów (0-5). NC - kontrola negatywna, ziemniaki infiltrowane wodą; PC - kontrola pozytywna, ziemniaki infiltrowane wodą, a następnie mieszaniną bakterii pektynolitycznych; pozostałe próby były infiltrowane mieszaniną bakterii antagonistycznych, a następnie mieszaniną bakterii pektynolitycznych, gdzie FR to mieszanina bakterii świeżo wyhodowanych (bez formulacji i okresu przechowywania), WP-KAO - biopreparat sypki z kaolinem; WP-DE - biopreparat sypki z ziemią okrzemkową. Różniące się litery oznaczają różnice istotne statystycznie (a=0,05) w teście Dunna (A i B) lub Chi2 (C, D).
P r z y k ł a d 1
Przygotowanie i skład biopreparatów według wynalazku i biopreparatów kontrolnych
Pięć wybranych gram-ujemnych szczepów bakteryjnych o potencjale do zastosowania w biopreparatach: Serratia plymuthica A294, Enterobacter amnigenus A167, Rahnella aquatilis H145, Serratia rubidaea H440 i S. rubidaea H469, osobno i w postaci mieszaniny, zostało poddanych formulacji do biopreparatów o postaci dwóch typów opracowanych według wynalazku kompozycji proszków do sporządzania zawiesin, formulacja dalej opisywana jako WP z ang. wettable powders, WP. Formulacjom proszkowym do sporządzenia zawiesin bakterii nadano nazwy odpowiadające zastosowanym w nich nośnikach: kaolinowi (WP-KAO) lub ziemi okrzemkowej (WP-DE, od ang. diatomaceous earth). Sporządzono również inne formulacje, aby wytypować najlepsze tj. płynną (LQ) oraz, aby zapewnić punkt odniesienia, zawiesinę kontrolną zawierającą bakterie niepoddane formulacji (CTRL, od ang. control).
W zakresie dodatków poprawiających właściwości formulacji zastosowano wybrane komponenty zastosowane dla wszystkich badanych rodzajów formulacji: 5% metyloceluloza, 0,1% β-cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4. Wybrano metylocelulozę w celu roli środka zwilżającego, β-cyklodekstrynę jako związku ograniczającego szkodliwe działanie promieniowania UV, lignosulfonian sodu pełniący w kompozycji rolę dyspergatora, a KH2PO4 jako stabilizatora. Szczegółowy skład trzech formulacji WP-KAO, WP-DE, LQ oraz próby kontrolnej CTRL przedstawiono w Tabeli 1.
Biopreparaty płynne, LQ i CTRL, przygotowano na bazie komórek bakteryjnych z hodowli prowadzonych przez 16-24 godzin w 28°C na pożywce mikrobiologicznej stałej: Bulion Tryptonowo Sojowy z dodatkiem agaru (15 g * 1-1) (TSBA). Zebrane komórki zawieszano w buforze % Ringers’a tak, aby osiągnąć miano bakterii na poziomie ok. 1010-1011 jednostek tworzących kolonie na mililitr (jtk * ml-1). Biopreparaty płynne LQ zawierały ponadto wymienione substancje dodatkowe, w proporcjach wagowoobjętościowych opisanych w Tabeli 1.
W celu przygotowania biopreparatów o postaci proszków według wynalazku, do sporządzenia zawiesin WP-KAO i WP-DE, wysuszono komórki bakterii. W tym celu zastosowano liofilizację. Aby przeprowadzić ten proces, bakterie hodowano przez noc (16-24 godzin) w pożywce płynnej: Bulion Tryptonowo Sojowy (TSB) w temperaturze 28°C. Bakterie osadzono przez wirowanie (6500 ref, 5 min) i zawieszono w odczynniku do liofilizacji: Reagent PS. Odczynnik do liofilizacji zawiera na każde 100 mL objętości odczynnika: 0,75 g TSB, 10 g sacharozy i 0,255 g peptonu pszenicznego jest przygotowywany przez rozpuszczenie w wodzie demineralizowanej wszystkich składników ww. i jałowieniu tak przygotowanego roztworu w temperaturze 121°C przy 0,7 Atm, przez 15 minut. Po jałowieniu i schłodzeniu do temperatury pokojowej odczynnik jest gotowy do użycia. Zastosowanie akurat odczynnika Reagent PS na etapie liofilizacji nie jest jednak obligatoryjne do efektu według wynalazku. Istotnym jest zastosowanie liofilizacji celem wysuszenia bakterii. Liofilizaty bakterii będące składnikami biopreparatów WP-KAO i WP-DE mogą zostać przygotowane także według innej znanej procedury np. z wykorzystaniem buforu do liofilizacji, zawierającym jeden składnik (np. bufor zawierający roztwór 10% odtłuszczonego mleka w wodzie, bufor zawierający 10% roztwór sacharozy w wodzie), albo kilka (np. Reagent 18 rekomendowany przez ATCC - American Type Culture Collection - o składzie na 100 ml roztworu: 1,5 g trypticase soya broth - bulion tryptonowo sojowy, 10 g sacharozy, 5 g BSA - bovine serum albumin - albumina serum bydlęcego).
Następnie, zawiesiny bakterii w Reagent PS zamrożono przez noc w -80°C, a następnie liofilizowano w liofilizatorze w -50°C przez 24 h. W ten sposób otrzymano liofilizaty bakterii (sproszkowane bakterie). Miano bakterii w liofilizatach określono metodą seryjnych rozcieńczeń dla wodnych zawiesin
PL238 148 Β1 naważonych porcji proszku. Seryjne rozcieńczenia zawiesin wysiewano na odpowiednie podłoża wzrostowe zestalone agarem i ostateczne przeliczenie miana bakterii na gram liofilizatu (jtk * g1). W celu otrzymania gotowych sypkich biopreparatów WP-DE i WP-KAO, do liofilizatu bakterii (ok. 1010—1011 jtk * g1) dodawano odpowiednie składniki pomocnicze w proporcjach (% wagowy) jak opisano w Tabeli 1. W przypadku gdy element formulacji stanowił liofilizat zawierający nie pojedynczy szczep, ale mieszaninę szczepów, liofilizat wskazany jako element formulacji stanowił mieszaninę liofilizatów dla pojedynczych szczepów w równych proporcjach wagowych.
Tabela 1. Skład badanych - testowanych formulacji oraz próby kontrolnej (bez formulacji - same mikroorganizmy).
| Nazwa | Typ formulacji | Skład A |
| WP-DE | Proszek do sporządzania zawiesiny | 60% liofilizat bakterii wybranych szczepów pojedynczo lub w mieszaninie jak opisano w tabeli 2 i 3 (ok. 1 □10-1011 jtk * g'1), 29,9% ziemia okrzemkowa, 5% metyloceluloza, 0,1% β cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| WP-KAO | Proszek do sporządzania zawiesiny | 60% liofilizat bakterii (ok. 10w-101Ljtk * g'1), 29,9% kaolin, 5% metyloceluloza, 0,1% β -cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| LQ | Formuł acj a | 89,9% zawiesina komórek (ok. lO10-^11 jtk * ml’1) w |
| płynna | jałowym buforze 1/4 Ringer’s, 5% metyloceluloza, 0,1% β cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 | |
| CTRL kontrola (brak formulacji) | Próba kontrolna | 100% zawiesina komórek (ok. 1010-10L1 jtk * ml'1) w jałowym buforze 1/4 Ringer’s |
A Dla formulacji sypkich WP-KAO i WP-DE podano stosunek wagowy. Dla formulacji płynnej (LQ) podano stosunek wagowoobjętościowy, z zawiesiną bakterii w postaci płynnej oraz pozostałymi składnikami w postaci sypkiej. Dla formulacji zawierających więcej niż jeden szczep bakteryjny, liofilizat wymieniony w Tabeli stanowił mieszaninę tych szczepów w różnych proporcjach (w/w).
Wykazano znaczącą poprawę bezpieczeństwa z zastosowania opracowanej według wynalazku formulacji WP. Ważnym efektem zastosowania nośników w biopreparatach sypkich, kaolinu w przypadku WP-KAO i ziemi okrzemkowej w przypadku WP-DE, było znaczące zmniejszenie się pylenia i elektryzowania liofilizatów stanowiących główny komponent otrzymanych preparatów. Efektywność ta była widoczna w opracowanych według wynalazku biopreparatach. Jest to bardzo istotne z perspektywy wygody, ale przede wszystkim bezpieczeństwa zastosowania badanych biopreparatów, gdyż ogranicza niekorzystną ekspozycję wziewną końcowego użytkownika preparatu w warunkach jego aplikacji. Przykład 2
Przeżywalność bakterii poddanych formulacji podczas przechowywania biopreparatów (stabilność półkowa)
Oceniono stabilność półkową wszystkich analizowanych biopreparatów: sypkich w opracowanej formulacji WP-KAO i WP-DE oraz badanej formulacji płynnej LQ. Proces formulacji do postaci biopreparatów przeprowadzono dla wybranych pięciu pojedynczych szczepów bakteryjnych: A294, A167,
PL 238 148 B1
H145, H440 i H469, wcześniej opisanych oraz dla ich mieszanin. Przygotowane biopreparaty przechowywano przez okres do jednego roku w temperaturach 8 i 22°C. Testowane temperatury odwzorowywały możliwość przechowywania biopreparatów w, odpowiednio, temperaturze pokojowej i w warunkach chłodniczych. Jako kontrolę wykorzystano bakterie bez formulacji (CTRL). Biopreparaty sypkie umieszczono w jałowych, zamykanych probówkach wirowniczych z plastiku, a biopreparaty płynne oraz kontrolę w butelkach szklanych z ciemnego szkła, ze szlifem i szklanymi korkami.
Probówki lub butelki przechowywano zbiorczo w plastikowych pudełkach z silikonowym osuszaczem. Próbki biopreparatów pobrano zaraz po ich przygotowaniu, a następnie po określonych okresach przechowywania. Przygotowywano seryjne rozcieńczenia próbek i wysiewano je na podłoża wzrostowe aby obliczyć miano bakterii (jtk * ml-1 lub g-1) i tym samym określić odsetek komórek, które zachowały żywotność w danym biopreparacie lub kontroli. Próbki biopreparatów przechowywanych w 8°C pobrano po 1,2, 3, 6, 9 i 12 miesiącach. Przygotowano dwie testowane niezależnie partie biopreparatów, oznaczone jako Lot 1 i Lot 2, każda zawierająca po dwa powtórzenia techniczne dla danej kombinacji. Próbki biopreparatów przechowywanych w 22°C pobrano po 1,2, 3 i 6 miesiącach i tylko dla jednej partii (Lot 1). Skrócony czas eksperymentu dla przechowywania w 22°C wynikał z dużego spadku żywotności bakterii w tej temperaturze.
Szczegółowe wyniki dla miana bakterii w każdej z prób przedstawiono w Tabeli 2 (dla 22°C) oraz w Tabeli 3 (dla 8°C). Dodatkowo, dla prób przechowywanych w 8°C, wyznaczono krzywe przeżywalności poszczególnych szczepów w badanych biopreparatach, co przedstawiono na Fig. 1. Otrzymane wyniki pokazują, że przeżywalność szczepów ochronnych w zaproponowanych biopreparatach jest zależna od temperatury ich przechowywania - liczba żywych komórek bakterii szczepów ochronnych jest stabilna w temperaturze 8°C, natomiast w temperaturze 22°C liczba żywych komórek ulega szybkiemu obniżeniu w czasie. Efekt ten jest obserwowany zarówno dla formulacji sypkich jak i płynnych. Z tego względu wyboru biopreparatów stanowiących niniejszy wynalazek opracowano na podstawie porównania wszystkich opracowanych biopreparatów w badaniach w temperaturze 8°C, co przedstawiono w Tabeli 3. Z badań wynika, że w odniesieniu do kontroli bez formulacji (CTRL), zastosowanie formulacji WP-KAO, korzystnie wpływa zarówno na przeżywalność wszystkich testowanych 5 szczepów bakterii antagonistycznych jak i ich mieszaniny zawierającej wszystkie 5 szczepów. Dla wszystkich szczepów przeżywalność w postaci formulacji WP-KAO jest też wyższa niż w formulacji płynnej LQ. Zastosowanie drugiego typu formulacji sypkiej, WP-DE, również wpływa korzystnie na przeżywalność wszystkich 5 szczepów w odniesieniu do kontroli bez formulacji (CTRL). W przypadku odniesienia wyników przeżywalności w postaci WP-DE do formulacji płynnej (LQ), zaobserwowano wzrost przeżywalności w odniesieniu do 4 z 5 szczepów bakterii (oprócz szczepu S. plymuthica A294) i ich 5-cio składnikowej mieszaniny. Niemniej jednak wyniki przeżywalności dla WP-DE i LQ dla szczepu S. plymuthica A294 były na analogicznym, wysokim poziomie, nie wykluczając tym samym przydatności formulacji WP-DE dla tego szczepu i jej dużą aktywność. Na podstawie przeprowadzonych badań wybrano najbardziej skuteczne biopreparaty, stanowiące kompozycję mikroorganizmów i formulacji, których przykładowy skład przedstawiono w Tabeli 4.
PL238 148 Β1
Tabela 2. Miano bakterii (logio jtk * ml·1 lub g1) w badanych formulacjach bakterii przechowywanych w 22°C. Czas przechowywania (miesiące)
| Szczep | Formuł acj a A | 0 | 1 | 2 | 3 | 6 | Nachylenie c |
| 5*5 | CTRL | 10.30B | 8.69 | 8.17 | 8.19 | 7.12 | -0.454 |
| e r- | LQ | 10.31 | 9.09 | 7.82 | 6.88 | 5.96 | -0.708 |
| i | WP-KAO | 11.03 | 10.44 | 9.26 | 8.80 | 8.30 | -0.454 |
| WP-DE | 10.92 | 10.32 | 9.15 | 8.36 | 8.70 | -0.376 | |
| CTRL | 10,31 | 7,57 | 7.20 | 6.88 | 6.50 | -0.504 | |
| Q £ | LQ | 10,16 | 8,46 | 8.28 | 8.11 | 7.08 | -0,433 |
| K | WP-KAO | 10.74 | 8.95 | 6.64 | 6.11 | 6.03 | -0.735 |
| WP-DE | 10.77 | 9.04 | 6.26 | 6.45 | 6.00 | -0.733 | |
| g | CTRL | 10.31 | 8,20 | 7.55 | 7.89 | 7.65 | -0.329 |
| LQ | 10.09 | 8.98 | 9.13 | 7.10 | 7.26 | -0.473 | |
| s o | |||||||
| < | WP-KAO | 10.20 | 8,97 | 8.15 | 8.06 | 7.46 | -0.407 |
| fi. | |||||||
| WP-DE | 10.02 | 8,27 | 8.22 | 7.67 | 7.58 | -0.331 | |
| CTRL | 10.44 | 8.52 | 7.97 | 8.27 | 8.03 | -0.297 | |
| *3 o | |||||||
| a | LQ | 10.50 | 9,17 | 8.72 | 8.29 | 7.19 | -0.504 |
| ε i | |||||||
| WP-KAO | 11.32 | 11.19 | 10.64 | 10.49 | 8.86 | -0.419 | |
| WP-DE | 11.15 | 10.90 | 10.09 | 10.21 | 8.91 | -0.371 | |
| CTRL | 10.37 | 8.51 | 8,52 | 8.41 | 8,11 | -0,282 | |
| !3 | |||||||
| 1 σι | LQ | 10.38 | 9.25 | 9,26 | 8,67 | 7,60 | -0,424 |
| T|g K | WP-KAO | 11.10 | 9.82 | 9,94 | 10,00 | 9,44 | -0,206 |
| WP-DE | 10.98 | 10,29 | 9,70 | 9,82 | 9.68 | -0.183 | |
| CTRL | 10.35 | 8.35 | 8.01 | 8.44 | 7.92 | -0.290 | |
| C £ .5 -o | LQ | 10.34 | 9.10 | 8.84 | 8.37 | 7.08 | -0499 |
| Cl Cl | |||||||
| rt O | |||||||
| N N | WP-KAO | 10.79 | 10.45 | 9.34 | 9.66 | 8.58 | -0.357 |
| ω N | |||||||
| WP-DE | 11.03 | 10.26 | 9.23 | 9.38 | 8.37 | -0.413 |
A Formulacje: CTRL - bakterie bez formulacji; LQ - formulacja płynna. Formulacje sypkie: WP-KAO - formulacja sypka z kaolinem; WP-DE - formulacja sypka z ziemią okrzemkową B Miano bakterii w logio jtk * mL1 dla CTRL i LQ oraz w logio jtk * g1 dla formulacji sypkich (WP-KAO, WP-DE). Każda wartość to średnia z dwóch powtórzeń technicznych.
c Nachylenie krzywej przeżywalności wyrażające średni spadek w mianie bakterii (logio jtk) na miesiąc przechowywania.
PL238 148 Β1
Na podstawie przeprowadzonych wyników badań eksperymentalnych w zakresie skuteczności biopreparatów na bazie wybranych szczepów bakterii opracowano kompozycje przedstawione w Tabeli 4, które charakteryzują się najwyższą skutecznością co do najwyższej przeżywalności użytych szczepów: E. amnigenus A167, R. aquatilis H145, S. plymuthica A294, S. rubidaea H440 i S. rubidaea H469. Wyniki dokładniej przedstawiono poniżej i na Figurach. Istotnym są również dane z tabeli 3. W tabeli 3 przedstawiono miano bakterii (logio jtk * ml·1 lub g1) w badanych formulacjach bakterii przechowywanych w 8°C. Dla każdego szczepu wyróżniono przez pogrubienie dwie formacje o średnim nachyleniu krzywej przeżywalności (AVG) jak najbliższym wartości „0”, co przekłada się na mały spadek liczby żywych komórek w czasie i wysoką trwałość półkową preparatu.
Biopreparaty o formulacji proszkowej (ang. wettable powder, WP), o kompozycji według Tabeli 4, zawierają liofilizat pojedynczych szczepów bakterii o właściwościach w biologicznej ochronie roślin lub ich mieszaniny (substancja czynna) oraz substancje dodatkowe ograniczające pylenie i stabilizatory według opracowanych kompozycji.
Tabela 4. Skład wybranych i opracowanych biopreparatów według wynalazku - formulacje.
| Nazwa biopreparatu | Substancja czynna | Skład A |
| A167 WP-DE | E. amnigenus A167 | 60% liofilizat bakterii E. amnigenus A167 (ok. IOAio11 jtk * g’1), 29,9% ziemia okrzemkowa, 5% metyloceluloza, 0,1% β cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| Al 67 WP-KAO | E. amnigenus A167 | 60% liofilizat bakterii E. amnigenus A167 (ok. IOAjo11 jtk * g1), 29,9% kaolin, 5% metyloceluloza, 0,1% β -cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| H145 WP-DE | R aąuatilis H145 | 60% liofilizat bakterii R. aąuatilis H145 (ok. 1010-10n jtk * g'1), 29,9% ziemia okrzemkowa, 5% metyloceluloza, 0,1% β cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1%KH2PO4 |
| HI45 WP-KAO | R aąuatilis H145 | 60% liofilizat bakterii R. aąuaiilis HI45 (ok. 1θ,ο-1θ jtk * g'1), 29,9% kaolin, 5% metyloceluloza, 0,1% β -cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| A294 WP-DE | S. plymuthica A294 | 60'% liofilizat bakterii S. plymuthica A294 (ok. 10^-1011 jtk * g'1), 29,9% ziemia okrzemkowa, 5% metyloceluloza, 0,1% β cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| A294 WP- KAO | X plymuthica A294 | 60% liofilizat bakterii & plymuthica A294 (ok. 10^-1011 jtk * g'1), 29,9% kaolin, 5% metyloceluloza, 0,1% β -cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| H440 WP-DE | 5. rubidaea H440 | 60% liofilizat bakterii S. rubidaea H440 (ok. 10^-1011 jtk * g'1), 29,9% ziemia okrzemkowa, 5% metyloceluloza, 0,1% β cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
PL238 148 Β1
| H440 WP- KAO | 5. rubidaea H440 | 60% liofilizat bakterii S. rubidaea H440 (ok. 10^-1011 jtk * g4), 29,9% kaolin, 5% metyloceluloza, 0,1% β -cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| H469 WP-DE | S. rubidaea H469 | 60% liofilizat bakterii 5. ntbidaea H469 (ok. 10^-1011 jtk * g4), 29,9% ziemia okrzemkowa, 5% metyloceluloza, 0,1% β cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| H469 WP- KAO | 5. rubidaea H469 | 60% liofilizat bakterii S. rubidaea H469 (ok. 1010-1011 jtk * g'1), 29,9% kaolin, 5% metyloceluloza, 0,1% β -cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| Mieszanina WP- DE | Mieszanina 5 szczepów B | 60% liofilizat mieszaniny 5 szczepów bakterii® (ok. 1010-10L1 jtk * g4), 29,9% ziemia okrzemkowa, 5% metyloceluloza, 0,1% β -cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
| Mieszanina WP- KAO | Mieszanina 5 szczepów B | 60% liofilizat mieszaniny 5 szczepów bakterii® (ok. 1010-10L1 jtk * g4), 29,9% kaolin, 5% metyloceluloza, 0,1% β cyklodekstryna, 4% lignosulfonian sodowy, 1% KH2PO4 |
Α Podano stosunek wagowy.
B Mieszanina 5 szczepów zawiera szczepy: E. amnigenus A167, R. aquatilis H145, S. plymuthica A294, S. rubidaea H440, S. rubidaea H469.
Aby porównać pomiędzy sobą stabilność półkową badanych biopreparatów, porównano nachylenia krzywej przeżywalności (x) wyrażające średni spadek przeżywalności szczepów poddanych formulacji na miesiąc przechowywania. Nachylenie krzywej zostało wyliczone za pomocą poniższego wzoru:
Σ(ίί-Ό(Υί-γ)
X — ------------Σ^- ty
Gdzie y, oznacza liczbę jednostek tworzących kolonie (logio jtk * g1 lub logio jtk * ml·1) w odpowiadającym czasie próbkowania (t, w miesiącach), y oznacza średnią wszystkich wartości y,, a t oznacza średnią wszystkich wartości t,. Im wyższa (bliższa zeru) wartość nachylenia krzywej tym mniejszy spadek liczby żywych komórek, w jtk * g1 lub jtk * ml·1 na każdy miesiąc przechowywania.
Dodatkowo, poza porównaniem przeżywalności dla pojedynczych szczepów w badanych kombinacjach (biopreparatach) porównano także globalną skuteczność zastosowanych metod formulacji. Wykonane w tym celu porównanie średniej przeżywalności bakterii dla danych zgrupowanych dla wszystkich szczepów oraz mieszaniny wykazały statystycznie istotnie mniejszy spadek liczby żywych komórek w formulacjach sypkich WP-KAO i WP-DE w stosunku do kontroli (CTRL), co przedstawiono na fig. 2. W formulacji płynnej LQ wyniki plasowały się pomiędzy kontrolą a formulacjami sypkimi, jednak miano żywych komórek było niższe dla formulacji płynnej niż dla formulacji sypkich według wynalazku, co przedstawiono na Fig. 1 i Fig. 2, spadając do około 1 % wartości początkowej. Biopreparaty sypkie z ziemią okrzemkową (WP-DE) i kaolinem (WP-KAO) charakteryzowały się dobrą przeżywalnością szczepów ochronnych, na poziomie 50%-100% po 6 miesiącach przechowywania, zależnie od badanego szczepu. Przeprowadzona analiza globalna pokazuje ogólną przewagę zastosowania formulacji WP-KAO i WP-DE nad zastosowaniem formulacji LQ lub brakiem formulacji (CTRL). Wybrane kompozycje przedstawione w Tabeli 4 charakteryzowały się zatem najwyższą skutecznością dla wszystkich testowanych szczepów. Wyjątek stanowi kombinacja szczepu S. plymuthica
PL 238 148 B1
A294 i formulacji WP-DE, dla którego przeżywalność w tym biopreparacie była dobra, ale nie wyróżniająco lepsza niż dla kombinacji tego szczepu i formulacji LQ.
P r z y k ł a d 3
Zdolność biopreparatów do zachowania biokontrolnej efektywności szczepów bakteryjnych
W celu określenia wpływu formulacji szczepów do postaci biopreparatów na bazie kaolinu (WP-KAO) i ziemi okrzemkowej (WP-DE) na zdolność do biologicznej ochrony roślin (aktywność biologiczna) przeprowadzono eksperyment na bulwach ziemniaka w warunkach naśladujących komercyjne warunki przechowywania bulw (temp. 8°C i wysoka wilgotność 85%-90% RH - ang. relative humidity). Na potrzeby eksperymentu wykorzystano wysokiej jakości sadzeniaki odmiany Irga (kaliber 30-50 mm) o umiarkowanej odporności na mokrą zgniliznę (4 w 9-cio stopniowej skali http://ziemniak-bonin.pl), zakupione z Pomorsko-Mazurskiej Hodowli Ziemniaka Szydlak (http://www.pmhz.pl/). Ziemniaki zostały wysterylizowane poprzez 20 minutową inkubację w 5% roztworze wybielacza wypłukane 3 krotnie wodą wodociągową, umieszczone w pięciolitrowych zlewkach po 30 bulw. Biopreparaty sypkie według wynalazku WP-KAO i WP-DE przygotowane dla mieszaniny pięciu szczepów antagonistycznych (Serratia plymuthica A294, Enterobacter amnigenus A167, Rahnella aquatilis H145, Serratia rubidaea H440 i S. rubidaea H469) zostały wykorzystane do przygotowania zawiesin roboczych, otrzymanych poprzez dodanie 500 mg proszku na 1 litr wody wodociągowej (ok. 5 x 108 jtk mL-1 bakterii antagonistycznych, na podstawie liczby jtk * g-1 w biopreparatach w dniu wykonywania eksperymentu). Zawiesiny wykorzystano do infiltracji próżniowej bulw ziemniaka bakteriami antagonistycznymi, prowadzonej przez 10 minut przy podciśnieniu -80 Bar i 10-minutową inkubację w tej samej zawiesinie po przywróceniu ciśnienia atmosferycznego. Jako próbę odniesienia przebadano równolegle zawiesinę bakterii antagonistycznych świeżo wyhodowanych przed eksperymentem (również około 5 x 108 jtk * ml-1 dla wszystkich szczepów łącznie) (FR). Próba ta miała umożliwić porównanie skuteczności szczepów poddanych formulacji do postaci biopreparatów ze skutecznością aktywnych metabolicznie komórek bakterii. Następnego dnia po inokulacji bakteriami biokontrolnymi, po wysuszeniu bulw na powietrzu, ziemniaki inokulowano mieszaniną szczepów bakterii patogennych z rodzajów Pectobacterium i Dickeya: P. atrosepticum szczep SCRI 1043, P. carotovorum subsp. carotovorum szczep Ecc71, P. parmentieri szczep 16 SCC3193, D. solani szczep IPO2222 i D. dianthicola szczep CFBP 1200 (IPO1741), reprezentujących gatunki i podgatunki najczęściej powodujące mokrą zgniliznę w Europie. Zastosowano miano patogenów 106 jtk * ml-1 dla wszystkich szczepów łącznie, czyli 2 x 105 jtk * ml-1 każdego szczepu. Po inokulacji patogenami ziemniaki były suszone przez 1,5 h, a następnie zostały umieszczone w nieprzeziernych pojemnikach (26 x 18 x 12 cm) (5 pudełek po 30 ziemniaków = 150 na jedną próbę). Pudełka przechowywano w 8°C przy wilgotności względnej 80% przez 6 miesięcy. Po półrocznej inkubacji w warunkach chłodniczych usunięto kiełki, a ziemniaki przeniesiono na 5 dni do warunków prowokacyjnych dla wystąpienia objawów mokrej zgnilizny (28°C, 85-90% wilgotności względnej). Eksperyment wykonano dwukrotnie. Niezależne powtórzenia oznaczono odpowiednio jako Eksperyment 1 i Eksperyment 2. Stopień porażenia (nasilenie symptomów chorobowych) na każdej badanej bulwie został oceniony z wykorzystaniem sześciostopniowej skali gdzie 0 - brak symptomów, 1 - mokra zgnilizna pod skórką nie więcej niż 25% powierzchni, 2 - mokra zgnilizna pod skórką 25-50% powierzchni ziemniaka, 3 - mokra zgnilizna pod skórka, występuje odwarstwienie perydermy 50-90% powierzchni, 4 - mokra zgnilizna zajmuje większą część powierzchni ziemniaka i sięga do wnętrza, 5 - ziemniak całkowicie zmacerowany. Poza stopniem występowania symptomów chorobowych oznaczono także odsetek bulw symptomatycznych (niezależnie od stopnia porażenia).
Wyniki przeprowadzonych doświadczeń pokazały, że pod względem oceny stopnia porażenia (skali symptomów) zastosowanie świeżo wyhodowanych bakterii antagonistycznych (FR) zmniejszyło średnie nasilenie objawów o 83-94%. Efekty zastosowania biopreparatów sypkich, według wynalazku były bardzo dobre. Uzyskano redukcję symptomów o 69-72% dla zastosowania biopreparatów z ziemią okrzemkową (WP-DE) oraz o 62-64% dla zastosowania biopreparatów z kaolinem (WP-KAO) (Ryc. 3 A, B).
Pod względem częstości występowania symptomów mokrej zgnilizny, niezależnie od stopnia ich nasilenia, aplikacja świeżo wychodowanych bakterii (FR) zmniejszyła tę wartość o 82-96%, a zastosowanie biopreparatów o 57-61% w przypadku formulacji z ziemią okrzemkową (WP-DE) oraz o 48-59% w przypadku biopreparatów z kaolinem (WP-KAO) (Ryc. 3 C, D).
Otrzymane wyniki pokazują, że najlepsze rezultaty można otrzymać przy użyciu świeżo wyhodowanych bakterii, tutaj zastosowanych jako kontrola skuteczności eksperymentu. Wynik ten nie jest z askakujący, gdyż w preparacie tym bakterie są aktywne metabolicznie. Zastosowanie świeżych hodowli bakteryjnych nie jest jednak możliwe z perspektywy zastosowania komercyjnego - bakterie musiałyby zostać wyhodowane przez końcowego odbiorcę i wykorzystane bez okresu przechowywania (natychmiast po wyhodowaniu). Tymczasem zastosowanie biopreparatów sypkich według wynalazku pozwoliło
PL238 148 Β1 nie tylko na zapewnienie długotrwałej żywotności szczepów (dobra trwałość półkowa), ale także na zachowanie nadal wysokiej zdolności tych szczepów do ochrony tkanek roślinnych przed patogenami.
Q
Uh
O ri ©
O N O N
| oo O CS i Ó | o । Ó | w* O | © SC < © |
| cs | © | ||
| 0Φ | Οχ | ||
| o | Ol | ||
| I o | 1 O | 1 O | 1 © |
| Ol | vs | o | © |
| cs | £ J | o | |
| ^· | Ol | ||
| I O | I O | । e | I © |
| © | CS | ||
| QO | Ol | © | |
| O- | 00 | Cs | |
| R | s | ss | 3 |
| QO | Ch | Cs | |
| © | cs | Ol | © Λ |
| oó | σ\ | © | © 00 |
| 3\ | v5 | rs | |
| oó | oó | o | © |
| i^. | © | ||
| CS | 1 | CS | |
| O\ | OS | © | Cs |
| LO | © | ||
| cs | O\ | Ol | |
| σί | oc | Φ | |
| Ol | oc | 90 | |
| © | IS | © ® | © ® |
| Ch | |||
| CS | |||
| C | d | © | |
| d | d | Cs | 00 |
| © | |||
| 'Ό | od | Cs | © |
| d | d | 0© | 90 |
| ,___( | © | 00 | |
| © | cs | 00 | © |
| * | |||
| θ' | oó | Os | © |
| Ol | VI | SC | © |
| 00 | CO | CS | |
| oo | o | © | Cs |
| o | o | sC | |
| ro | V) | CS | |
| 00 | cK | O\ | Cs |
| ,____1 | c<> | © | |
| Ol | QC | © 00 | |
| σχ | σχ | Cs | w |
| ,____1 | o | © | r. |
| co | o | Ol | s |
| ó | o | © | O |
| 1—( | ω | ||
| U | O | Si | Q 01 £ |
SHH sijpimbB y
PL238 148 Β1
' -próbkowania nie przeprowadzono z uwagi na niska przeżywalność w poprzedzającym punkcie czasowym Nachylenie krzywej przeżywał ności wyrażające średni spadek w mianie bakterii (logio jtk) na miesiąc przechowywania. AVG - średnie nachylenie dla eksperymentów Lotl i Lot 2 n.d. - nie testowano
PL238 148 Β1
Ε. amnigenus Α167
R. aguatilis Η145
| Lot 1 | Lot 2 | Lot 1 | Lot 2 | |
| 14 Ί | 14 - | 14 -i | 14 η | |
| w 12 - | 12 i | 12 - | 12 J | |
| •S W ΐ | 10 < | 10 | 10 < | |
| co Ol· | 8 - | 8 - | 8 - | |
| cn 6 - | tr θ _ | 6 - | © - | |
| ° 4 . | 4 - | 4 | 4 - | |
| 2 - | 2 - | 2 | 2 - | |
| Π - | ||||
| { | ) 2 4 6 8 1012 i | ) 2 4 6 8 1012 0 2 4 6 8 1012 0 2 4 6 8 1012 | ||
| Czas [miesiące] | Czas [miesiące] | Czas [miesiące] | Czas [miesiące] |
S. plymuthica Α294 S. rubiaea H440
□ --------------- O J--------------- 0 J--------------- o
2 4 6 8 1012 0 2 4 6 8 1012 0 2 4 6 8 1012 0 2 4 6 8 1012
Czas [miesiące] Czas [miesiące] Czas [miesiące] Czas [miesiące]
S. rubidea H469
Mieszanina 5 szczepów
O 2 4 6 8 1012
Czas [miesiące]
2 4 6 8 1012
Czas [miesiące] ··—♦**«· CTRL LQ WP-KAO
Fig. 1. Miano bakterii w kolejnych punktach czasowych dla różnych formulacji przechowywanych w 8°C przez okres 12 miesięcy. Lot 1 i Lot 2 odnoszą się do różnych partii formulacji badanych w niezależnych eksperymentach. CTRL - kontrola :bakterie bez formulacji zawieszone w % buforze Ringer’s; LQ - formulacja płynna; WP-KAO formulacja sypka z kaolinem; WP-DE - formulacja sypka z ziemią okrzemkową.
PL238 148 Β1
Fig. 2. Wpływ metody formulacji na stabilność półkową szczepów atagoni stycznych przechowywanych w 8 °C przez okres 12 miesięcy. Analiza została wykonana dla danych zebranch (ang. pooled) dla wzystkich szczepów. Każda ramka pokazuje nachylenie krzywej przeżywałności (zmiana w logio jtk na ml formulacji płynnej lub g formulacji sypkiej). Im wyższa (bliższa zeru) wartość nachylenia krzywej tym mniejszy spadek liczby żywych komórek, w jtk * g’ lub jtk * mf na każdy miesiąc przechowywania. CTRL - kontrola: bakterie bez formulacji zawieszone w % buforze Ringer’s; LQ - formulacja płynna; WP-KAO formulacja sypka z kaolinem; WP-DE - formulacja sypka z ziemią okrzemkową. Różniące się litaery oznaczają statystycznie istotną różnicę w wartościach nachylenia krzywej (t-test, a= 0.05).
PL238 148 Β1
EKSPERYMENT 1
EKSPERYMENT 2
Fig. 3 Stopień porażenia mokrą zgnilizną (A, B) oraz występowanie choroby (C, D) dla ziemniaków ko-infiltrowanych mieszniną szczepów antagon i stycznych oraz mieszaniną bakterii pektynolitycznych, po okresie przechowywania inokulowanych bulw przez 6 miesięcy w 8 °C. Wyniki z dwóch niezależnych eksperymentów (1 i 2). Stopień porażenia został określony w skali symptomów (0-5). NC - kontrola negatywna, ziemniaki infiltrowane wodą, PC - kontrola pozytywna, ziemniaki infiltrowane wodą, a następnie mieszniną bakteri pektynolitycznych; pozostałe próby były infiltrowane mieszniną bakterii antagonistycznych, a następnie mieszaniną bakterii pektynolitycznych, gdzie FR to mieszanina bakterii świeżo wyhodowanych (bez formulacji i okresu przechowywania), WP-KAO - biopreparat sypki z kaolinem; WP-DE biopreparat sypki z ziemią okrzemkową. Różniące się litery oznaczają różnice istotne statystycznie (a = 0,05) w teście Dunna (A i B) lub Chi2 (C, D).
Claims (4)
- Zastrzeżenia patentowe1. Biopreparat do ochrony roślin przed zakażeniem bakteryjnym, zawierający jako środek biologicznie aktywny co najmniej jeden szczep bakterii w danej formulacji zawierającej nośnik środka biologicznie aktywnego, znamienny tym, że stanowi formulację sypką zawierającą jako nośnik ziemię okrzemkową oraz dodatki w postaci metylocelulozy, β-cyklodekstryny, lignosulfonianu sodowego, KH2PO4, przy czym ilość bakterii stanowi do 60% wagowych liofilizatu, ziemi okrzemkowej od 28 do 30%, metylocelulozy i lignosulfonianu sodowego do 10% wagowych, zaś jako środek biologicznie aktywny zawiera liofilizat szczepu bakterii antagonistycznej Serratia plymuthica, czyli szczep A294 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00143 lub Serratia rubidaea, czyli szczep H469 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00142 lub Serratia rubidaea, czyli szczep H440 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00141 lub Enterobacter amnigenus , czyli szczep A167 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00145 lub Rahnella aquatilis, czyli szczep H145 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00144 lub mieszaninę pięciu szczepów bakterii antagonistycznych w równych proporcjach w stosunku do siebie i takich jak: A294 i H469 i H440 i A167 i H145.
- 2. Biopreparat według zastrz. 1, znamienny tym, że liofilizat bakterii zawiera 1010-1011 jtk * g-1 bakterii.
- 3. Biopreparat do ochrony roślin przed zakażeniem bakteryjnym, zawierający jako środek biologicznie aktywny co najmniej jeden szczep bakterii w danej formulacji zawierającej nośnik środka biologicznie aktywnego, znamienny tym, że stanowi formulację sypką zawierającą jako nośnik kaolin oraz dodatki w postaci metylocelulozy, β-cyklodekstryny, lignosulfonianu sodowego, KH2PO4 przy czym ilość bakterii stanowi do 60% wagowych liofilizatu, kaolinu od 28 do 30%, metylocelulozy i lignosulfonianu sodowego do 10% wagowych, zaś jako środek biologicznie aktywny zawiera liofilizat szczepu bakterii antagonistycznej Serratia rubidaea, czyli szczep H469 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00142 lub Serratia rubidaea, czyli szczep H440 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00141 lub Enterobacter amnigenus, czyli szczep A167 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00145 lub Rahnella aquatilis, czyli szczep H145 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00144 lub Serratia plymuthica, czyli szczep A294 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00143 lub mieszaninę pięciu szczepów bakterii antagonistycznych w równych proporcjach w stosunku do siebie i takich jak: szczepów bakterii antagonistycznych A294 i H469 i H440 i A167 i H145.
- 4. Biopreparat według zastrz. 3, znamienny tym, że liofilizat bakterii zawiera 1010-1011 jtk * g-1 bakterii.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431434A PL238148B1 (pl) | 2019-10-10 | 2019-10-10 | Biopreparaty do ochrony roślin przed zakażeniem bakteryjnym |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431434A PL238148B1 (pl) | 2019-10-10 | 2019-10-10 | Biopreparaty do ochrony roślin przed zakażeniem bakteryjnym |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL431434A1 PL431434A1 (pl) | 2020-03-23 |
| PL238148B1 true PL238148B1 (pl) | 2021-07-12 |
Family
ID=69845723
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL431434A PL238148B1 (pl) | 2019-10-10 | 2019-10-10 | Biopreparaty do ochrony roślin przed zakażeniem bakteryjnym |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL238148B1 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4311856A2 (en) | 2022-07-25 | 2024-01-31 | Instytut Ogrodnictwa - Panstwowy Instytut Badawczy | Strains of the genus pantoea spp. and the use of strains of the genus pantoea spp. in plant protection |
-
2019
- 2019-10-10 PL PL431434A patent/PL238148B1/pl unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4311856A2 (en) | 2022-07-25 | 2024-01-31 | Instytut Ogrodnictwa - Panstwowy Instytut Badawczy | Strains of the genus pantoea spp. and the use of strains of the genus pantoea spp. in plant protection |
| EP4523534A2 (en) | 2022-07-25 | 2025-03-19 | Intermag Sp. Z O.O | Strain t14/15 of pantoea allii and the application of strain pantoea allii t14/15 in plant protection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL431434A1 (pl) | 2020-03-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110300514B (zh) | 微生物组合物和方法 | |
| JP2022046489A (ja) | 安定した接種組成物およびその製造方法 | |
| Brewer et al. | Efficacy of several potential biocontrol organisms against Rhizoctonia solani on potato | |
| JP2022010176A (ja) | 安定した接種組成物およびその製造方法 | |
| CN115151632A (zh) | 类芽孢杆菌属分离株及其用途 | |
| US9090884B2 (en) | Formulations of viable microorganisms and their methods of production and use | |
| BR112019013748A2 (pt) | cepa de bacillus isolada, cultura de b. megaterium nrrl b-67352 ou b. megaterium nrrl b-67357, composição inoculante, material de propagação de planta revestido, kit, e, métodos para tratar uma semente de planta e para aprimorar o rendimento da plantação. | |
| BR112019013772A2 (pt) | composições microbianas e métodos | |
| ES3054921T3 (en) | Pseudomonas sp. strain, composition comprising the same, and uses thereof | |
| CN111296460A (zh) | 防治番茄和梨树主要病害的复配增效杀菌组合物及其应用 | |
| Rojas-Tapias et al. | Evaluation of three methods for preservation of Azotobacter chroococcum and Azotobacter vinelandii | |
| CN115988961A (zh) | 用于提高大豆产量的方法和组合物 | |
| WO2019217255A1 (en) | Microbacterium isolates and uses thereof | |
| BR112020010080A2 (pt) | composições agroquímicas | |
| Shah-Smith et al. | Shelf-life of a biocontrol Pseudomonas putida applied to sugar beet seeds using commercial coatings | |
| JP2525042B2 (ja) | 生合成農薬生成物含有組成物、その製法およびその使用方法 | |
| JP2011223990A (ja) | 凍結乾燥菌体の製造方法 | |
| PL238148B1 (pl) | Biopreparaty do ochrony roślin przed zakażeniem bakteryjnym | |
| Mahde et al. | Evaluation of biofungicide formulation of Trichoderma longibrachiatum in controlling of tomato seedling damping-off caused by Rhizoctonia solani | |
| O'Callaghan et al. | Effect of soil moisture and temperature on survival of microbial control agents | |
| JP7614648B2 (ja) | バチルス・ハロサッカロボランス株、それを含む組成物、およびその使用 | |
| JP7158725B2 (ja) | 植物病害防除剤 | |
| Sivakumar et al. | Evaluation of bacterial antagonists for the management of rhizome rot of cardamom (Elettaria cardamomum Maton). | |
| Martin et al. | Temperature Effects on the Susceptibility of the Colorado Potato Beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) to Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in Poland, the Czech Republic and the United States2 | |
| CN110089526A (zh) | 植物多糖在促进苏云金芽胞杆菌防治昆虫中的应用及组合物 |