PL238186B1 - Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGFβ2 lub TGFβ3) do zastosowania w leczeniu pacjentów z glejakami wielopostaciowymi, w przypadku których to glejaków ponad 5% komórek nowotworowych jest EG FRvIII-pozytywna - Google Patents
Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGFβ2 lub TGFβ3) do zastosowania w leczeniu pacjentów z glejakami wielopostaciowymi, w przypadku których to glejaków ponad 5% komórek nowotworowych jest EG FRvIII-pozytywna Download PDFInfo
- Publication number
- PL238186B1 PL238186B1 PL427358A PL42735818A PL238186B1 PL 238186 B1 PL238186 B1 PL 238186B1 PL 427358 A PL427358 A PL 427358A PL 42735818 A PL42735818 A PL 42735818A PL 238186 B1 PL238186 B1 PL 238186B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- growth factor
- tgf32
- egfrviii
- transforming growth
- Prior art date
Links
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 title claims description 36
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title description 4
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 title description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 title 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 123
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 12
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 claims description 9
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 claims description 9
- 229940072041 transforming growth factor beta 2 Drugs 0.000 claims description 9
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 claims description 8
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 claims description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 14
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 14
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 14
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 12
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100233118 Mus musculus Insc gene Proteins 0.000 description 1
- 206010034719 Personality change Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 229960001686 afatinib Drugs 0.000 description 1
- ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N afatinib Chemical compound N1=CN=C2C=C(O[C@@H]3COCC3)C(NC(=O)/C=C/CN(C)C)=CC2=C1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000235 effect on cancer Effects 0.000 description 1
- 108700021358 erbB-1 Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- -1 small molecule chemical compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
W przypadku wielu nowotworów obserwujemy mutację prowadzącą do powstawania tzw. EGFRvIII. Aktualnie obowiązuje pogląd stwierdzający, że działania przeciwnowotworowe w odniesieniu do komórek nowotworowych z EGFRvIII mogą polegać na wywołaniu ich śmierci komórkowej dzięki blokowaniu aktywności kinazowej tego receptora. Stosowano też ogólnie dostępne formy terapii: chemioterapia, radioterapia, chirurgia. Próbowano również bez powodzenia stosować terapie immunologiczne.
Nikt nie proponował do tej pory zastosowania TGF32 lub TGF33 w terapii pacjentów z nowotworami, których komórki wykazują ekspresję EGFRvIII.
EGFRvIII powstaje w wyniku delecji fragmentu genu EGFR zawierającego eksony 2-7 [Wikstrand 1998]. Mutant ten nie występuje w komórkach prawidłowych. Ekspresja EGFRvIII w wielu typach nowotworów tłumaczy olbrzymie zapotrzebowanie na terapię eliminującą komórki nowotworowe wykazujące ekspresję EGFRvIII.
Komórki nowotworowe wykazujące ekspresję EGFRvIII wykazują dużą lekoopomość na terapie związkami drobnocząsteczkowymi [Liu 2013, Learn 2004, Schulte 2013, Ji 2006, Zanca 2017] i terapie immunologiczne [Brand 2011, Yang 2008, Patel 2007].
Komórki EGFRvIII pozytywne mogą odgrywać rolę nowotworowych komórek macierzystych, ewentualnie komórki EGFRvIII negatywne mogą być zależne od komórek EGFRvIII pozytywnych [Zanca 2017, Pęciak 2017].
Popyt na poszukiwany lek działający specyficzne na komórki, które wykazują ekspresję EGFRvIII, jest bardzo duży. W tej chwili nie ma na rynku substancji, które powodują śmierć komórek nowotworowych wykazujących ekspresję EGFRvIII, ale względnie nieszkodliwych dla komórek prawidłowych. Stosowane obecnie substancje lecznicze wykazują bardzo poważne efekty uboczne ponieważ zazwyczaj, molekuły na które oddziałują, znajdują się zarówno w komórkach prawidłowych jak i nowotworowych [Dudek 2006, Perez-Soler 2004, Petty 2003, Nguyen 2009].
Komórki nowotworowe wykazujące wysokie stężenie EGFRvIII to przede wszystkim komórki glejaka wielopostaciowego [Pęciak 2017]. Wiele innych nowotworów charakteryzuje się obecnością komórek EGFRvIII pozytywnych. Natomiast w przypadku glejaka wielopostaciowego mediana czasu przeżycia to jedynie 15-18 miesięcy. Najbardziej optymistyczne dane wskazują, że tylko kilka procent pacjentów z glejakiem wielopostaciowym przeżyje więcej niż pięć lat od momentu postawienia diagnozy w USA. Dla porównania tylko 10% kobiet z rakiem piersi w USA nie przeżyje pięciu lat od momentu postawienia diagnozy. W przypadku glejaka wielopostaciowego najdłużej przeżywają pacjenci, u których stosuje się połączenie radioterapii, temozolomidu (chemioterapia) i chirurgii. Terapii towarzyszy najczęściej ekstremalne pogorszenie stanu pacjentów i dramatyczne zmiany osobowości. Blisko połowa pacjentów z glejakiem wielopostaciowym to osoby starsze (około 70-letnie), które bardzo źle znoszą obecnie stosowane rodzaje terapii. Nie ma zgody co do tego jakie powinny być w ich przypadku standardy terapeutyczne. W przypadku tych pacjentów mediana przeżycia wynosi około dziesięciu miesięcy. Nie jest znana terapia prowadząca do śmierci komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego, która jest nieszkodliwa dla komórek prawidłowych co poprawiłoby sytuację pacjentów z glejakiem wielopostaciowym. Takie terapie przeciwnowotworowe nie zostały jeszcze odkryte lub stanowią absolutną rzadkość. U pacjentów z glejakiem wielopostaciowym próbowano stosować terapie immunologiczne, które mogłyby spełnić kryterium ewidentnej nieszkodliwości ale bez powodzenia [Hopper-Borge 2009, Grisanti 2008, Rades 2010].
TGF3 (TGF32 lub TGF33) generalnie znane są z innego wpływu na komórki nowotworowe niż ten opisany w zgłoszeniu. Dotychczas próbowano stosować w terapii onkologicznej blokery receptora dla TGF3 [Han 2015]. Nie są znane skuteczne próby zastosowania TGF32 lub TGF33 jako substancji przeciwnowotworowych, tym bardziej w terapii nowotworów, w których występują komórki EGFRvIII pozytywne. Powszechnie wiadomo, że czynnik wzrostu TGF32 lub TGF33 nie może być szkodliwy wobec komórek prawidłowych w takim sensie jak np. erlotynib, afatynib czy temozolomid. TGF3 jest substancją
PL 238 186 B1 produkowaną w organizmie człowieka w warunkach fizjologicznych. Jego szkodliwość jest więc relatywnie znikoma.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGF32 lub TGF33) do zastosowania w leczeniu pacjentów z glejakami wielopostaciowymi, w przypadku których to glejaków ponad 5% komórek nowotworowych jest EGFRvIII-pozytywna.
Korzystnie komórki nowotworowe EGFRvIII-negatywne są biologicznie zależne od komórek EGFRvIII-pozytywnych. Korzystnie komórką nowotworową podatną na efekt cytotoksyczny i cytostatyczny jest macierzysta komórka nowotworowa EGFRvIII-pozytywna. Korzystnie komórka jest ludzką komórką nowotworową.
Korzystne skutki wynalazku
Korzystnie transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 2 (TGF32 lub TGF33) jest:
- minimalnie toksyczny w stężeniach fizjologicznych i terapeutycznych wobec komórek prawidłowych;
- nietoksyczny w stężeniach fizjologicznych i terapeutycznych wobec komórek prawidłowych;
- nieszkodliwy dla komórek prawidłowych w stężeniach fizjologicznych i terapeutycznych;
- wykazuje nieznaczną toksyczność w porównaniu z drobnocząsteczkowymi blokerami kinaz EGFR;
- wykazuje nieznaczną toksyczność w porównaniu z drobnocząsteczkowymi związkami chemicznymi stosowanymi w terapii onkologicznej.
Korzystnie efektem działania transformującego czynnika wzrostu beta 2 lub transformującego czynnika wzrostu beta 3 (TGF32 lub TGF33) jest:
- zatrzymanie podziałów komórkowych komórek nowotworowych;
- śmierć komórek nowotworowych.
Korzystnie efekt taki obserwuje się w przypadku komórek nowotworowych EGFRvIII-negatywnych, jeśli są biologicznie zależne od komórek EGFRvIII-pozytywnych.
Korzystnie komórka jest komórką nowotworową glejaka wielopostaciowego, w którym ponad 5% komórek nowotworowych jest EGFRvIII-pozytywna.
Korzystnie komórka jest komórką innego nowotworu niż glejak wielopostaciowy, w którym ponad 5% komórek nowotworowych jest EGFRvIII-pozytywna.
Objaśnienie figur rysunku
Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest uwidoczniony na rysunkach:
Figura 1. Struktura TGF32.
Figura 2. Struktura TGF33.
Figura 3. Wyniki obserwacji w czasie rzeczywistym komórek podlinii DK-MG high z wykorzystaniem urządzenia BioStation CT. Cząsteczka oznaczona jako TGF32 jest skuteczna przeciwnowotworowo wobec komórek DK-MG high już w stężeniu 1 ng/ml - hamuje ich proliferację i wywołuje śmierć. Wpływ TGF32 jest znamienny.
Figura 4. Wyniki obserwacji w czasie rzeczywistym komórek podlinii DK-MG Iow z wykorzystaniem urządzenia BioStation CT. Cząsteczka oznaczona jako TGF32 jest nieskuteczna przeciwnowotworowo wobec komórek DK-MG Iow w stężeniu 1 ng/ml.
Figura 5. Wyniki obserwacji w czasie rzeczywistym komórek podlinii DK-MG high z wykorzystaniem urządzenia BioStation CT. Cząsteczka oznaczona jako TGF33 jest skuteczna przeciwnowotworowo wobec komórek DK-MG high już w stężeniu 1 ng/ml - hamuje ich proliferację i wywołuje śmierć. Wpływ TGF33 jest znamienny.
Figura 6. Wyniki obserwacji w czasie rzeczywistym komórek podlinii DK-MG Iow z wykorzystaniem urządzenia BioStation CT. Cząsteczka oznaczona jako TGF33 jest nieskuteczna przeciwnowotworowo wobec komórek DK-MG Iow w stężeniu 1 ng/ml.
Figura 7. Przykładowa analiza cytotoksyczności TGF32 na indukowane prawidłowe neuralne komórki macierzyste z wykorzystaniem urządzenia BioStation CT. Wpływ TGF32 jest statystycznie nieznamienny.
Figura 8. Przykładowa analiza cytotoksyczności TGF33 na prawidłowe ludzki perycyty z wykorzystaniem urządzenia BioStation CT. Wpływ TGF33 jest statystycznie nieznamienny.
Szczegółowy opis przedmiotu wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest TGF3 (TGF32 lub TGF33, transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3), opisane w bazie danych białek HPRD pod identyfikatorem
PL238 186 Β1
01828 (TGF32) i 01829 (ΤΟΡβ3), do zastosowania w leczeniu pacjentów ze zmianami nowotworowymi, w których komórki nowotworowe wykazują ekspresję EGFRvlll (charakteryzującego się brakiem regionu kodowanego przez eksony 2-7). TGF32 został dostarczony przez Sigma-Aldrich, TGFB3 został dostarczony przez Gibco™ (Thermo Fisher Scientific).
Subrodzina czynników TGF3, dla których receptorem jest TGF3R, składa się z trzech czynników: β1, β2 i β3. Każdy z nich w formie aktywnej składa się ze 112 aminokwasów.
Τ0Ρβ2 składa się wyjściowo z 414 aminokwasów, z których otrzymywana jest sekwencja Τ0Ρβ2 w formie aktywnej składająca się ze 112 aminokwasów. Są to aminokwasy 303 do 414 całkowitej sekwencji aminokwasowej Τ0Ρβ2. To właśnie forma aktywna Τ0Ρβ2 była testowana w analizach. Należy pamiętać, że białko Τ0Ρβ2 podlega glikozylacji w pozycjach 72, 140 i 241. W obrębie struktury występują mostki dwusiarczkowe (Fig. 1).
ALDAAYCF RNVQDNCCLR PLYIDFKRDL GWKWIHEPKG YNANFCAGAC PYLWSSDTQH SRVLSLYNTI NPEASASPCC VSQDLEPLTI LYYIGKTPKI EQLSNMIVKS CKCS
Wzór I. Sekwencja aminokwasów formy aktywnej czynnika wzrostu zwanego dalej jakoTGFp2.
TGFp3 składa się wyjściowo z 412 aminokwasów, z których otrzymywana jest sekwencja TGFp3 w formie aktywnej składająca się, tak samo jak pozostałych czynników z podrodziny TGFp ze 112 aminokwasów. Są to aminokwasy 301 do 412 całkowitej sekwencji aminokwasowej TGFp3. To właśnie forma aktywna TGFp3 była testowana w analizach. Należy pamiętać, że białko TGFp3 podlega glikozylacji w pozycjach 74, 135 i 142. W obrębie struktury występują mostki dwusiarczkowe (Fig. 2).
ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST YLGLYNTLNP EASASPCCVP ODLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMWKSCK CS
Wzór 2. Sekwencja aminokwasów formy aktywnej czynnika wzrostu zwanego dalej jako TGFp3.
Wyniki badań in vitro zostały ujęte w przykładach. Do badań wykorzystano komercyjnie dostępną linię komórkową DK-MG, z której wyprowadzono dwie podlinie komórkowe. Pierwsza podlinia tzw. DKMG high wykazywała od 40% do 70% komórek EGFRvlll pozytywnych. Druga podlinia DK-MG Iow wykazywała nie więcej niż 5% komórek EGFRvlll-pozytywnych. Podlinie te opisano w artykule Stec i wsp. [Oncotarget 2017],
Do oceny toksyczności badanego związku na komórki prawidłowe wykorzystano ludzkie perycyty oraz ludzkie indukowane neuralne komórki macierzyste.
W badaniach wykazano ekstremalną toksyczność TGFp, wobec komórek nowotworowych wykazujących ekspresję EGFRvlll i brak toksyczności TGFp wobec komórek prawidłowych (BALB 3T3). W przypadku komórek prawidłowych zaobserwowano korzystny wpływ ΤΟΡβ na ich proliferację. Badano komórki prawidłowe pomimo, że wiadomo że ΤΟΡβ nie może być wobec nich toksyczny w takim stopniu jak stosowane drobnocząsteczkowe substancje lecznicze (np. erlotynib czy temozolomid). Stosowano czynnik Τ0Ρβ2 (cat. No. SRP3170-5UG; Sigma-Aldrich) oraz Τ0Ρβ3 (cat. No. PHG9305; Gibco™; Thermo Fisher Scientific). Stosowano aktywne formy ΤΟΡβ składające się z 112 aminokwasów.
Przykłady
Przykład 1. Analiza wpływu ΤΘΡβ2 na komórki linii DK-MG high w oparciu o metody obrazowe (BioStation CT).
Przykład ilustruje efekt Τ0Ρβ2 na przeżywalność i proliferację komórek linii DK-MG high. W tym celu wykonano badanie na komórkach linii, wykazującej nie mniej niż 40% komórek EGFRvlll pozytywnych (DK-MG high). Podlinię tę opisano w artykule Stec i wsp. Oncotarget 2017.
PL 238 186 B1
Dzień 1
1. Komórki linii DK-MG high w konfluencji do 90% przepłukano buforowaną solą fizjologiczną (PBS) bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto PBS.
2. Komórki odklejono od naczynia używając Trypsyny-EDTA (0,05%, 1x) w czasie 1-3 min w 37°C.
3. Komórki przeniesiono do probówki o objętości 15 ml, zwirować (200xg, 4 min) i zawieszono w pożywce RPMI1640 z 10% surowicą bydlęcą i antybiotykami,
4. Zliczono komórki.
5. Dodano 4x104 komórek na dołek płytki 6-dołkowej do hodowli adherentnej.
6. Uzupełniono w/w pożywką i pozostawić na ok. 24 godziny w 37°C.
Dzień 2
7. Komórki przemyto 2-3 razy buforowaną solą fizjologiczną bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto dokładnie PBS każdorazowo.
8. Dodano 2 ml pożywki RPM]1640 z antybiotykami i bez surowicy i pozostawiono na ok. 24 godziny w 37°C.
Dzień 3
9. Komórki przemyto 2-3 razy buforowaną solą fizjologiczną bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto dokładnie PBS każdorazowo.
10. Dodano 2 ml pożywki RPMI1640 z antybiotykami i bez surowicy z odpowiednimi związkami (DMSO; objętościowo równą maksymalnej objętości testowanych związków); pojedynczo lub w kombinacjach z EGF (20 ng/ml (Sigma, Cat. no. E9644)), erlotynib (10 μM Molecula; Cat. No. 89983631), TGF32 (1; 2,5; 5 ng/ml numer katalog. SRP3170-5UG; Sigma-Aldrich).
11. Wstawiono naczynie z komórkami do BioStation CT. Opisano płytkę i każdy dołek.
12. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych.
Kolejne dni
13. Co 48 godzin zmieniano pożywkę pamiętając o dodawaniu DMSO/ EGF/erlotynibu/TGF32 pojedynczo lub w kombinacjach do odpowiednich naczyń hodowlanych.
14. Wstawiono komórki do urządzenia BioStation CT.
15. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych. Oprogramowanie BioStation CT pozwala na automatyczne zliczanie komórek i pola powierzchni zajmowanego przez te komórki.
16. Analogiczne obserwacje z mniejszą dokładnością mogą zostać wykonane dzięki zastosowaniu mikroskopu JULI czy zwykłego mikroskopu świetlnego. Należy jednak pamiętać, że BioStation CT umożliwia zachowanie warunków środowiska w czasie eksperymentu i obserwację wielu naczyń hodowlanych równocześnie.
Wyniki: TGF32 jest skuteczny wobec komórek nowotworowych DK-MG wykazujących ekspresję EGFRvIII i komórek od nich zależnych - hamuje ich proliferację i wywołuje śmierć komórkową (Fig. 3). Wartości IC50 TGF32 wobec tych komórek wahały się w zakresie kilku nanogramów na mililitr.
P r z y k ł a d 2. Analiza wpływu TGFp2 na komórki linii DK-MG Iow w oparciu o metody obrazowe (BioStation CT).
Przykład ilustruje efekt TGF32 na przeżywalność i proliferację komórek linii DK-MG Iow. W tym celu wykonano badanie na komórkach linii, wykazującej nie więcej niż 5% komórek EGFRvIII pozytywnych (DK-MG Iow). Podlinię tę opisano w artykule Stec i wsp. Oncotarget 2017.
Dzień 1
1. Komórki linii DK-MG Iow w konfluencji do 90% przepłukano buforowaną solą fizjologiczną (PBS) bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto PBS.
2. Komórki odklejono od naczynia używając Trypsyny-EDTA (0,05%, 1x) w czasie 1-3 min w 37°C.
3. Komórki przeniesiono do probówki o objętości 15 ml, żwirowano (200xg, 4 min) i zawieszono w pożywce RPMI1640 z 10% surowicą bydlęcą i antybiotykami.
4. Zliczono komórki.
5. Dodano 4x104 komórek na dołek płytki 6-dołkowej do hodowli adherentnej.
6. Uzupełniono w/w pożywką i pozostawiono na ok. 24 godziny w 37°C.
PL 238 186 B1
Dzień 2
7. Komórki przemyto 2-3 razy buforowaną solą fizjologiczną bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto dokładnie PBS każdorazowo.
8. Dodano 2 ml pożywki RPMI1640 z antybiotykami i bez surowicy i pozostawiono na ok. 24 godziny w 37°C.
Dzień 3
9. Komórki przemyto 2-3 razy buforowaną solą fizjologiczną bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto dokładnie PBS każdorazowo.
10. Dodano 2 ml pożywki RPMI1640 z antybiotykami i bez surowicy z odpowiednimi związkami (DMSO; objętościowo równą maksymalnej objętości testowanych związków); pojedynczo lub w kombinacjach z EGF (20 ng/ml (Sigma, Cat. no. E9644)), erlotynib(10 μM Molecula; Cat. No. 89983631), TGF32 (1; 2,5; 5 ng/ml numer katalog. SRP3170-5UG; Sigma-Aldrich).
11. Wstawiono naczynie z komórkami do BioStation CT. Opisać płytkę i każdy dołek.
12. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych.
Kolejne dni
13. Co 48 godzin zmieniono pożywkę pamiętając o dodawaniu DMSO/EGF/erlotynibu/TGF32 pojedynczo lub w kombinacjach do odpowiednich naczyń hodowlanych.
14. Wstawiono komórki do urządzenia BioStation CT.
15. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych. Oprogramowanie BioStation CT pozwala na automatyczne zliczanie komórek i pola powierzchni zajmowanego przez te komórki.
16. Analogiczne obserwacje z mniejszą dokładnością mogą zostać wykonane dzięki zastosowaniu mikroskopu JULI czy zwykłego mikroskopu świetlnego. Należy jednak pamiętać, że BioStation CT umożliwia zachowanie warunków środowiska w czasie eksperymentu i obserwację wielu naczyń hodowlanych równocześnie.
Wyniki: TGF32 jest nieskuteczny wobec komórek nowotworowych DK-MG i niewykazujących EGFRvIII (Fig. 4). Przedstawiony wynik wskazuje na brak toksyczności cząsteczki TGF32 wobec komórek linii DK-MG Iow w analizowanych warunkach.
P r z y k ł a d 3. Analiza wpływu TGF-3 na komórki linii DK-MG high w oparcia o metody obrazowe (BioStation CT).
Przykład ilustruje efekt TGF33 na przeżywalność i proliferację komórek linii DK-MG high. W tym celu wykonano badanie na komórkach linii, wykazującej nie mniej niż 40% komórek EGFRvIII pozytywnych (DK-MG high). Podlinię tę opisano w artykule Stec i wsp. Oncotarget 2017.
Dzień 1
1. Komórki linii DK-MG high w konfluencji do 90% przepłukano buforowaną solą fizjologiczną (PBS) bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto PBS.
2. Komórki odklejono od naczynia używając Trypsyny-EDTA (0,05%, 1x) w czasie 1-3 min w 37°C.
3. Komórki przeniesiono do probówki o objętości 15 ml, żwirowano (200xg, 4 min) i zawieszono w pożywce RPMI1640 z 10% surowicą bydlęcą i antybiotykami.
4. Zliczono komórki.
5. Dodano 4x104 komórek na dołek płytki 6-dołkowej do hodowli adherentnej.
6. Uzupełniono w/w pożywką i pozostawiono na ok. 24 godziny w 37°C.
Dzień 2
7. Komórki przemyto 2-3 razy buforowaną solą fizjologiczną bez jonów Mg2+ i Ca2+ Usunięto dokładnie PBS każdorazowo.
8. Dodano 2 ml pożywki RPMI1640 z antybiotykami i bez surowicy i pozostawiono na ok. 24 godziny w 37°C.
Dzień 3
9. Komórki przemyto 2-3 razy buforowaną solą fizjologiczną bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto dokładnie PBS każdorazowo.
10. Dodano 2 ml pożywki RPMI1640 z antybiotykami i bez surowicy z odpowiednimi związkami (DMSO; objętościowo równą maksymalnej objętości testowanych związków); pojedynczo lub
PL 238 186 B1 w kombinacjach z EGF (20 ng/ml (Sigma, Cat. no. E9644)), erlotynib(10 μΜ Molecula; Cat. No. 89983631), TGF33 (1; 2,5; 5 ng/ml numer katalog. PHG9305; Gibco™; Thermo Fisher Scientific).
11. Wstawiono naczynie z komórkami do BioStation CT. Opisano płytkę i każdy dołek.
12. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych.
Kolejne dni
13. Co 48 godzin zmieniano pożywkę pamiętając o dodawaniu DMSO/EGF/erlotynibu/TGF32 pojedynczo lub w kombinacjach do odpowiednich naczyń hodowlanych.
14. Wstawiono komórki do urządzenia BioStation CT.
15. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych. Oprogramowanie BioStation CT pozwala na automatyczne zliczanie komórek i pola powierzchni zajmowanego przez te komórki.
16. Analogiczne obserwacje z mniejszą dokładnością mogą zostać wykonane dzięki zastosowaniu mikroskopu JULI czy zwykłego mikroskopu świetlnego. Należy jednak pamiętać, że BioStation CT umożliwia zachowanie warunków środowiska w czasie eksperymentu i obserwację wielu naczyń hodowlanych równocześnie.
Wyniki: TGF33 jest skuteczny wobec komórek nowotworowych DK-MG wykazujących ekspresję EGFRvIII i komórek od nich zależnych - hamuje ich proliferację i wywołuje śmierć komórkową (Fig. 5). Wartości IC50 TGF33 wobec tych komórek wahały się w zakresie kilku ng na mililitr.
P r z y k ł a d 4. Analiza wpływu TGFp3 na komórki linii DK-MG Iow w oparciu o metody obrazowe (BioStation CT).
Przykład ilustruje efekt TGF33 na przeżywalność i proliferację komórek linii DK-MG Iow. W tym celu wykonano badanie na komórkach linii, wykazującej nie więcej niż 5% komórek EGFRvIII pozytywnych (DK-MG Iow). Podlinię tę opisano w artykule Stec i wsp. Oncotarget 2017.
Dzień 1
1. Komórki linii DK-MG Iow w konfluencji do 90% przepłukano buforowaną solą fizjologiczną (PBS) bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto PBS.
2. Komórki odklejono od naczynia używając Trypsyny-EDTA (0,05%, 1x) w czasie 1-3 min w 37°C.
3. Komórki przeniesiono do probówki o objętości 15 ml, żwirowano (200xg, 4 min) i zawieszono w pożywce RPMI1640 z 10% surowicą bydlęcą i antybiotykami.
4. Zliczono komórki.
5. Dodano 4x104 komórek na dołek płytki 6-dołkowej do hodowli adherentnej.
6. Uzupełniono w/w pożywką i pozostawiono na ok. 24 godziny w 37°C.
Dzień 2
7. Komórki przemyto 2-3 razy buforowaną solą fizjologiczną bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto dokładnie PBS każdorazowo.
8. Dodano 2 ml pożywki RPMI1640 z antybiotykami i bez surowicy i pozostawiono na ok. 24 godziny w 37°C.
Dzień 3
9. Komórki przemyto 2-3 razy buforowaną solą fizjologiczną bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto dokładnie PBS każdorazowo.
10. Dodano 2 ml pożywki RPMI1640 z antybiotykami i bez surowicy z odpowiednimi związkami (DMSO; objętościowo równą maksymalnej objętości testowanych związków); pojedynczo lub w kombinacjach z EGF (20 ng/ml (Sigma, Cat. no. E9644)), erlotynib (10 μM Molecula; Cat. No. 89983631), TGF33 (1; 2,5; 5 ng/ml numer katalog. PHG9305; Gibco™; Thermo Fisher Scientific).
11. Wstawiono naczynie z komórkami do BioStation CT. Opisać płytkę i każdy dołek.
12. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych.
Kolejne dni
13. Co 48 godzin zmieniano pożywkę pamiętając o dodawaniu DMSO/ EGF/erlotynibu/TGF32 pojedynczo lub w kombinacjach do odpowiednich naczyń hodowlanych.
14. Wstawiono komórki do urządzenia BioStation CT.
PL 238 186 B1
15. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych. Oprogramowanie BioStation CT pozwala na automatyczne zliczanie komórek i pola powierzchni zajmowanego przez te komórki.
16. Analogiczne obserwacje z mniejszą dokładnością mogą zostać wykonane dzięki zastosowaniu mikroskopu JULI czy zwykłego mikroskopu świetlnego. Należy jednak pamiętać, że BioStation CT umożliwia zachowanie warunków środowiska w czasie eksperymentu i obserwację wielu naczyń hodowlanych równocześnie.
Wyniki: TGF33 jest nieskuteczny wobec komórek nowotworowych DK-MG i niewykazujących EGFRvIII (Fig. 6). Przedstawiony wynik wskazuje na brak toksyczności cząsteczki TGF33 wobec komórek linii DK-MG Iow w analizowanych warunkach.
P r z y k ł a d 5. Analiza toksyczności TGFp2 i znanych inhibitorów kinazy EGFR wobec indukowanych prawidłowych neuralnych komórek macierzystych z wykorzystaniem urządzenia BioStation CT.
Dzień 1
1. Komórki linii iNSc (Neural Induction Stem Cells) w konfluencji do 80% przepłukano buforowaną solą fizjologiczną (PBS) bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunięto PBS.
2. Komórki odklejono od naczynia używając StemPro Accutase (ThermoFisher Scientific, Cat. No. Al 110501) w czasie 5 min w temperaturze pokojowej.
3. Komórki przeniesiono do probówki o objętości 15 ml, żwirowano (200xg, 4 min) i zawieszono w pożywce PSC Neural Induction Medium (ThermoFisher Scentific, Cat. No. A1647801) z antybiotykami.
4. Zliczono komórki.
5. Dodano 1x105 komórek na dołek płytki 6-dołkowej do hodowli adherentnej.
6. Uzupełniono w/w pożywką i pozostawić na ok. 24 godziny w 37°C.
Dzień 2
7. Komórki przemyto 2-3 razy buforowaną solą fizjologiczną bez jonów Mg2+ i Ca2+. Usunęto dokładnie PBS każdorazowo.
8. Dodano 1,5 ml pożywki PSC Neural Induction Medium z antybiotykami z odpowiednimi związkami (DMSO; objętościowo równą maksymalnej objętości testowanych związków); pojedynczo lub w kombinacjach z EGF (20 ng/ml (Sigma, Cat. no. E9644)), erlotynib (10 pM Molecula; Cat. No. 89983631), TGF32 (; 2,5 i 5 ng/ml; numer katalog. SRP3170-5UG; SigmaAldrich).
9. Wstawiono naczynie z komórkami do BioStation CT. Opisano płytkę i każdy dołek.
10. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych.
Kolejne dni
11. Co 48 godziny zmieniano pożywkę pamiętając o dodawaniu DMSO/EGF/erlotynibu/TGF32 pojedynczo lub w kombinacjach do odpowiednich naczyń hodowlanych.
12. Wstawiono komórki do urządzenia BioStation CT.
13. Dokonano automatycznej obserwacji mikroskopowej w odstępach 6-godzinnych. Oprogramowanie BioStation CT pozwala na automatyczne zliczanie komórek i pola powierzchni zajmowanego przez te komórki.
14. Analogiczne obserwacje z mniejszą dokładnością mogą zostać wykonane dzięki zastosowaniu mikroskopu JULI czy zwykłego mikroskopu świetlnego. Należy jednak pamiętać, że BioStation CT umożliwia zachowanie warunków środowiska w czasie eksperymentu i obserwację wielu naczyń hodowlanych równocześnie.
Wyniki: Przedstawiony wynik wskazuje na brak cytotoksyczności cząsteczki TGF32 wobec indukowanych prawidłowych neuralnych komórek macierzystych w analizowanych warunkach w sposób istotny statystycznie (Fig. 7). Wartości IC50 TGF32 wobec tych komórek były niemierzalne i wynosiły więcej niż kilkaset nanogramów na minilitr.
Claims (4)
1. Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGFp2 lub TGFp3) do zastosowania wleczeniu pacjentów z glejakami wielopostaciowymi, w przypadku których to glejaków ponad 5% komórek nowotworowych jest EGFRvIII-pozytywna.
PL238 186 Β1
2. Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGF32 lub TGF33) do zastosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że komórki nowotworowe EGFRvlll-negatywne są biologicznie zależne od komórek EGFRvlll-pozytywnych.
3. Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGF32 lub TGF33) do zastosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że komórką nowotworową podatną na efekt cytotoksyczny i cytostatyczny jest macierzysta komórka nowotworowa EGFRvlll-pozytywna.
4. Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGF32 lub TGF33) do zastosowania wedlugzastrz.1. znamienny tym, że komórka jest ludzką komórką nowotworową.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL427358A PL238186B1 (pl) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGFβ2 lub TGFβ3) do zastosowania w leczeniu pacjentów z glejakami wielopostaciowymi, w przypadku których to glejaków ponad 5% komórek nowotworowych jest EG FRvIII-pozytywna |
| EP18867689.4A EP3735261B1 (en) | 2017-10-19 | 2018-10-11 | Growth factor tgfbeta1 or tgfbeta2 or tgfbeta3 for the use in anticancer therapy for patients with tumors, in which at least part of cells express egfrviii |
| PL18867689.4T PL3735261T3 (pl) | 2017-10-19 | 2018-10-11 | Aktywna forma transformującego czynnika wzrostu beta 1 (TGFβ1) do zastosowania w leczeniu pacjentów z glejakami wielopostaciowymi, w przypadku których to glejaków ponad 5% komórek nowotworowych jest EGFRvIII- pozytywna |
| PCT/PL2018/000097 WO2019078745A1 (en) | 2017-10-19 | 2018-10-11 | TGFβ1 OR TGFβ2 OR TGFβ3 GROWTH FACTOR FOR ITS USE IN ANTICANCER THERAPY FOR PATIENTS WITH TUMORS WHERE AT LEAST ONE PART OF THE CELLS EXPRESS EGFR VIII |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL427358A PL238186B1 (pl) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGFβ2 lub TGFβ3) do zastosowania w leczeniu pacjentów z glejakami wielopostaciowymi, w przypadku których to glejaków ponad 5% komórek nowotworowych jest EG FRvIII-pozytywna |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL427358A1 PL427358A1 (pl) | 2020-04-20 |
| PL238186B1 true PL238186B1 (pl) | 2021-07-19 |
Family
ID=70281474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL427358A PL238186B1 (pl) | 2017-10-19 | 2018-10-09 | Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGFβ2 lub TGFβ3) do zastosowania w leczeniu pacjentów z glejakami wielopostaciowymi, w przypadku których to glejaków ponad 5% komórek nowotworowych jest EG FRvIII-pozytywna |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL238186B1 (pl) |
-
2018
- 2018-10-09 PL PL427358A patent/PL238186B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL427358A1 (pl) | 2020-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Uhl et al. | SD-208, a novel transforming growth factor β receptor I kinase inhibitor, inhibits growth and invasiveness and enhances immunogenicity of murine and human glioma cells in vitro and in vivo | |
| Hilton et al. | Schwannomas and their pathogenesis | |
| EP2340040B1 (en) | Modulation of axon degeneration | |
| US20110223177A1 (en) | Treatment of fibrotic eye disorders | |
| JP2016510999A (ja) | 上皮幹細胞の増殖および培養のための組成物および方法 | |
| AU2011310109B2 (en) | Eph receptor expression in tumor stem cells | |
| Zhang et al. | Crocetin inhibits PDGF-BB-induced proliferation and migration of retinal pigment epithelial cells | |
| Kawaguchi et al. | Combination therapy of tumor-targeting Salmonella typhimurium A1-R and oral recombinant methioninase regresses a BRAF-V600E-negative melanoma | |
| Lin et al. | Inhibition of Kinesin‐5, a microtubule‐based motor protein, as a strategy for enhancing regeneration of adult axons | |
| JP2021143195A (ja) | がんにおけるマクロピノサイトーシス | |
| CN109073634A (zh) | 用于诱导神经干细胞的分化和保护的组合物及使用该组合物诱导神经再生的方法 | |
| Croslan et al. | Neuroprotective effects of neuregulin-1 on B35 neuronal cells following ischemia | |
| JP2025024030A (ja) | ミトコンドリア標的化及び抗癌治療のためのアルキルｔｐｐ化合物 | |
| Joly et al. | Sphingosine 1‐Phosphate Receptor 1 Modulates CNTF‐Induced Axonal Growth and Neuroprotection in the Mouse Visual System | |
| Yin et al. | Nintedanib inhibits normal human vitreous-induced epithelial-mesenchymal transition in human retinal pigment epithelial cells | |
| Shen et al. | Temporal–spatial expressions of p27kip1 and its phosphorylation on Serine-10 after acute spinal cord injury in adult rat: Implications for post-traumatic glial proliferation | |
| Hossain et al. | N-Myc knockdown and apigenin treatment controlled growth of malignant neuroblastoma cells having N-Myc amplification | |
| Fang et al. | Enhanced cell growth and tumorigenicity of rat glioma cells by stable expression of human CD133 through multiple molecular actions | |
| KR101815080B1 (ko) | 췌장소도세포 및 엘라스틴 유사 인공 세포외 기질을 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물 | |
| Badalamenti et al. | Soft tissue sarcomas in the precision medicine era: new advances in clinical practice and future perspectives | |
| PL238186B1 (pl) | Transformujący czynnik wzrostu beta 2 lub transformujący czynnik wzrostu beta 3 (TGFβ2 lub TGFβ3) do zastosowania w leczeniu pacjentów z glejakami wielopostaciowymi, w przypadku których to glejaków ponad 5% komórek nowotworowych jest EG FRvIII-pozytywna | |
| Hussein et al. | Breast cancer cells inhibit spontaneous and bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis | |
| de Paiva Roda et al. | Inhibition of Rho kinase (ROCK) impairs cytoskeletal contractility in human Müller glial cells without effects on cell viability, migration, and extracellular matrix production | |
| Li et al. | BMP7 alleviates trigeminal neuralgia by suppressing oxidative stress and activation of satellite glial cells via the NRF2/HO-1 pathway | |
| RU2810558C1 (ru) | Способ подбора лекарственных средств для реализации фармакологической индукции митохондриальной дисфункции в макрофагах для противоопухолевой терапии |