PL238467B1 - 1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu, sposób jej otrzymywania i jej zastosowanie medyczne - Google Patents
1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu, sposób jej otrzymywania i jej zastosowanie medyczne Download PDFInfo
- Publication number
- PL238467B1 PL238467B1 PL428850A PL42885019A PL238467B1 PL 238467 B1 PL238467 B1 PL 238467B1 PL 428850 A PL428850 A PL 428850A PL 42885019 A PL42885019 A PL 42885019A PL 238467 B1 PL238467 B1 PL 238467B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- thiosemicarbazide
- dimethylaminophenyl
- ylcarbonyl
- compound
- tuberculosis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- -1 1,4-disubstituted thiosemicarbazide Chemical class 0.000 title claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- QWVFZDCYNCSIRM-UHFFFAOYSA-N CC1=C(C(NNC(NC(C=C2)=CC=C2N(C)C)=S)=O)NC=N1 Chemical compound CC1=C(C(NNC(NC(C=C2)=CC=C2N(C)C)=S)=O)NC=N1 QWVFZDCYNCSIRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims abstract description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 4
- 150000003583 thiosemicarbazides Chemical class 0.000 abstract description 14
- BRWIZMBXBAOCCF-UHFFFAOYSA-N hydrazinecarbothioamide Chemical compound NNC(N)=S BRWIZMBXBAOCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 abstract 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 43
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 5
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 5
- 230000001355 anti-mycobacterial effect Effects 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 4
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 3
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 2
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 150000001719 carbohydrate derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 2
- 230000003406 mycobactericidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- PYRFHJUXDGQZPM-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazole-3-thione Chemical class S=C1N=CN=N1 PYRFHJUXDGQZPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000000178 1,2,4-triazoles Chemical class 0.000 description 1
- WGDYVTXYOPYPJO-UHFFFAOYSA-N 1-(1h-indole-2-carbonylamino)-3-(4-nitrophenyl)thiourea Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1NC(=S)NNC(=O)C1=CC2=CC=CC=C2N1 WGDYVTXYOPYPJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXHSSIGRWJENBH-UHFFFAOYSA-N 1-isothiocyanato-4-nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(N=C=S)C=C1 NXHSSIGRWJENBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZLFRQHFFVRYEE-UHFFFAOYSA-N 1h-indole-2-carbohydrazide Chemical compound C1=CC=C2NC(C(=O)NN)=CC2=C1 DZLFRQHFFVRYEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004215 2,4-difluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(F)C([H])=C1F 0.000 description 1
- 125000006276 2-bromophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(Br)=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- QOFLBLIBEIXRNE-UHFFFAOYSA-N 2-ethylsulfanylbenzohydrazide Chemical compound CCSC1=CC=CC=C1C(=O)NN QOFLBLIBEIXRNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001255 4-fluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1F 0.000 description 1
- IAKVIQFJPPCNGU-UHFFFAOYSA-N 4-isothiocyanato-N-methylaniline Chemical compound CNc1ccc(cc1)N=C=S IAKVIQFJPPCNGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKIGUVBJOHCXSP-UHFFFAOYSA-N 4-phenylthiosemicarbazide Chemical class NNC(=S)NC1=CC=CC=C1 KKIGUVBJOHCXSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NSPMIYGKQJPBQR-UHFFFAOYSA-N 4H-1,2,4-triazole Chemical class C=1N=CNN=1 NSPMIYGKQJPBQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OVONGUQMFYYZPS-UHFFFAOYSA-N C1C(C2)CC(C3)CC2CC13C1=CC(=O)NC2=CC=CC=C21 Chemical class C1C(C2)CC(C3)CC2CC13C1=CC(=O)NC2=CC=CC=C21 OVONGUQMFYYZPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical group C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 241001045770 Trichophyton mentagrophytes Species 0.000 description 1
- KGTSLTYUUFWZNW-PPJQWWMSSA-N [(7S,9E,11S,12R,13S,14R,15R,16R,17S,18S,19E,21Z)-2,15,17,27,29-pentahydroxy-11-methoxy-3,7,12,14,16,18,22-heptamethyl-26-[(E)-(4-methylpiperazin-1-yl)iminomethyl]-6,23-dioxo-8,30-dioxa-24-azatetracyclo[23.3.1.14,7.05,28]triaconta-1(29),2,4,9,19,21,25,27-octaen-13-yl] acetate pyridine-4-carbohydrazide Chemical compound NNC(=O)c1ccncc1.CO[C@H]1\C=C\O[C@@]2(C)Oc3c(C2=O)c2c(O)c(\C=N\N4CCN(C)CC4)c(NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@H]1C)c(O)c2c(O)c3C KGTSLTYUUFWZNW-PPJQWWMSSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000005100 aryl amino carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N carbonyl dihydrazine Chemical compound NNC(=O)NN XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical class 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003261 o-tolyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 125000002294 quinazolinyl group Chemical class N1=C(N=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N semicarbazide Chemical compound NNC(N)=O DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest 1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu, którą stanowi 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazolo-5 -ylkarbonylo)tiosemikarbazyd o wzorze 1. Ponadto, zgłoszenie obejmuje także sposób otrzymywania 1,4-dipodstawionej pochodnej tiosemikarbazydu, który charakteryzuje się tym, że hydrazyd kwasu 4-metylo-5-imidazolo-5-karboksylowego poddaje się reakcji z izotiocyjanianem w stosunku molowym 1:1, a reakcję prowadzi się w środowisku bezwodnego etanolu w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika w czasie około 30 minut, przy czym postęp reakcji monitoruje się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, zaś po utworzeniu produktu zawartość naczynia, w którym zachodzi reakcja chłodzi się, wytrącony osad odsącza, a po wysuszeniu krystalizuje z 96% etanolu. Przedmiotem zgłoszenia jest także zastosowanie 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazolo-5-ylkarbonylo) tiosemikarbazydu o wzorze 1 w leczeniu gruźlicy.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest 1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu oraz sposób jej otrzymywania.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie medyczne 1,4-dipodstawionej pochodnej tiosemikarbazydu w leczeniu gruźlicy.
Gruźlica, będąca potencjalnie śmiertelną chorobą m.in. układu oddechowego, wywoływana jest przez wewnątrzkomórkowy patogen prątek gruźlicy Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Choroba ta jest nadal poważnym problemem stanowiąc drugą, pod względem śmiertelności, chorobę zakaźną na świecie. Jako drobnoustrój charakteryzujący się wysokim sukcesem ewolucyjnym, Mtb rozprzestrzenił się na całej kuli ziemskiej infekując 1/3 populacji człowieka. Według danych WHO, rocznie diagnozowanych jest około 10 mln. nowych przypadków gruźlicy zaś około 2 mln. osób umiera z jej powodu [WHO Global Tuberculosis Report 2016]. Jedną z przyczyn pogarszającej się sytuacji epidemiologicznej gruźlicy na świecie jest rosnąca lekooporność wywołujących ją szczepów Mtb. Oprócz szczepów o oporności typu MDR (Multi-Drug Resistance), definiowanej jako oporność na co najmniej dwa kluczowe w leczeniu gruźlicy leki izoniazyd i rifampicynę, pojawiają się również przypadki osób zakażonych szczepami prątka gruźlicy o rozszerzonej lekooporności XDR (Extesively-Drug Resistance) oraz TDR (Totally-Drug Resistance ) opornych na prawie wszystkie stosowane w terapii tuberkulostatyki [Zager EM, et ah, Infect Dis. 2008;10:1-5; Fronseca JD, et al., Int J Infect Dis. 2015;32:94-100; Velayati AA, et al., Int J Clin Exp Med. 2013;6:307-309].
Ze względu na fakt, iż przeciwgruźlicza terapia jest czasochłonna i wymaga zastosowania kilku leków jednocześnie, spośród których większość wykazuje wiele szkodliwych dla zdrowia skutków ubocznych, opracowanie nowych strategii leczenia gruźlicy jest jednym z najważniejszych nurtów badawczych i wyzwań nowoczesnej mikrobiologii. Ponadto jedyną z dróg eliminacji pojawiających się zakażeń wielolekoopornymi szczepami Mtb stało się opracowywanie efektywniejszych leków przeciwprątkowych poprzez modyfikacje aktualnie stosowanych. Całkowicie nowatorskim podejściem zmierzającym do opracowywania nowych farmaceutyków jest synteza nowych związków o działaniu przeciwprątkowym [Tiberi S i in. New drugs and perspectives for new anti-tuberculosis regimens. Pulmonology. 2018 Mar-Apr;24(2):86-98.; WHO Drug-resistant Tb-surveillance and Response, 2017].
Tiosemikarbazydy to biologicznie aktywne, nietoksyczne związki organiczne, o aktywności przeciwnowotworowej, przeciwwirusowej, przeciwgrzybicznej oraz anty oksydacyjnej [Yamaguchi MU i in. Effects of a thiosemicarbazide camphene derivative on Trichophyton mentagrophytes. Molecules. 2009 May 13; 14(5): 1796-807.; He J i in. Synthesis and antitumor activity of novel quinazoline derivatives containing thiosemicarbazide moiety. Eur J Med Chem. 2012 Aug; 54:925-30.; Śarkanj B i in. 4-Methyl-7-hydroxycoumarin antifungal and antioxidant activity enhancement by substitution with thiosemicarbazide and thiazolidinone moieties. Food Chem. 2013 Aug 15;139(1-4):488-95], Ponadto, wykazano również silne działanie przeciwbakteryjne różnych pochodnych tiosemikarbazydów [Nazarbahjat N i in. New thiosemicarbazides and 1,2,4-triazolethiones derived from 2-(ethylsulfanyl) benzohydrazide as potent antioxidants. Molecules. 2014 Aug 4; 19(8): 11520-37].
Poprzez zastosowanie wielu metod laboratoryjnych oraz różnorodnych modyfikacji związków jakimi są tiosemikarbazydy wykazano, iż posiadają one potencjalne działanie przeciwmykobakteryjne. Flieger J. i wsp. poprzez wykorzystanie chromatografii ocenili działanie przeciwprątkowe tiosemikarbazydów oraz produktów cyklizacji tych związków, czyli 1,2,4-triazoli. Analiza wykazała, iż niektóre związki hamują wzrost tych bakterii w takich samych stężeniach (MIC=512 μg/ml dla 19B), bądź niższych (MIC=256 μg/ml dla 21B) w porównaniu do działania streptomycyny (MIC=512 μg/ml). Wykazano również, iż brak podstawnika w pozycji C5 pierścienia tiazolowego badanych pochodnych może być związany z ich aktywnością przeciwbakteryjną [Flieger J i in. RP-HPLC analysis and in vitro identification of antimycobacterial activity of novel thiosemicarbazides and 1,2,4-triazole derivatives. J Pharm Biomed Anal. 2015 Mar 25; 107:501-11].
Sardari S. i wsp. poprzez kondensację 4-fenylotiosemikarbazydów lub tiosemikarbazydów z aldehydami bądź ketonami zsyntetyzowali nowe związki, których aktywność przeciwprątkową zbadali wykorzystując jako model badawczy gatunek Mycobacterium bovis z racji dużego podobieństwa genetycznego do chorobotwórczych prątków Mycobacterium tuberculosis oraz możliwości pracy w laboratorium bez restrykcyjnych zabezpieczeń. Zastosowanie testu Alamar Blue, opartego na redukcji resazuryny, pozwoliło wykazać obiecujące działanie przeciwprątkowe niektórych związków, których minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii było niższe o prawie połowę (0,39 μg/ml) w porównaniu do etambutolu
PL 238 467 B1 (0,75 μg/ml) [Sardari S i in. Synthesis and Biological Evaluation of Thiosemicarbazide Derivatives Endowed with High Activity toward Mycobacterium Bovis. Iran J Pharm Res. 2017 Summer; 16(3): 1128-1140].
Skuteczne działanie hamujące wzrost M tuberculosis wykazano również dla pochodnych 4-(adamantan-1-yl)quinolonu, których MIC90 wynosi 3,125 μg/ml [Patel SR, et ah, European J Med. Chem, 2014;85:255-267] oraz dla pochodnych 2-(N-(arylaminocarbonyl)-hydrazinocarbonyl)-4-nitro-1H-pyrrolu i 2-(N-(arylaminothiocarbonyl)-hydrazinocarbonyl)-4-nitro-1H-pyrrolu, których działanie jest porównywalne do stosowanego z powodzeniem w leczeniu izoniazydu [Rane RA i in. Synthesis of novel 4-nitropyrrole-based semicarbazide and thiosemicarbazide hybrids with antimicrobial and anti-tubercular activity. Bioorg Med Chem Lett. 2014 Jul 15;24(14):3079-83].
Z polskiego opisu patentowego 212639 znany jest sposób otrzymywania nowej pochodnej 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu o działaniu przeciwbakteryjnym, polegający na tym, że hydrazyd kwasu indolo-2-karboksylowego poddaje się reakcji z 4-nitrofenyloizotiocyjanianem, przy czym reakcję prowadzi się w stosunku molowym 1:1 w rozpuszczalnikach, korzystnie w eterze dietylowym, w temperaturze pokojowej, a następnie powstały produkt reakcji 1-(indol-2-ylokarbonylo)-4-(4-nitrofenylo)tiosemikarbazyd odsącza się, przemywa rozpuszczalnikiem niepolarnym, korzystnie eterem dietylowym lub chloroformem, suszy i krystalizuje z rozpuszczalnika polarnego, korzystnie z etanolu.
Z polskiego opisu patentowego 221181 znane jest zastosowanie pochodnych 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu o wzorze o ogólnym 1, gdzie R1 oznacza 4-metylo-1,2,3-tiadiazol-5-yl, 2-metylofuran-3-yl lub tiofen-2-yl, zaś
R2 oznacza 2-bromofenyl, 2,4-difluorofenyl, etyl, 2-metylofenyl lub 4-fluorofenyl do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia toksoplazmozy.
Wyżej przedstawione doniesienia literaturowe o przeciwpasożytniczej aktywności pochodnych tiosemikarbazydów oraz rosnąca lekooporność Mycobacterium tuberculosis wobec obecnie stosowanych leków pierwszego i drugiego rzutu były inspiracją do podjęcia badań w celu otrzymania skutecznych związków o aktywności przeciwprątkowej, należących do tej grupy chemicznej.
Obecnie opracowano nowy związek, który doskonale spełnia to zapotrzebowanie, a jest to nowa 1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu, którą stanowi 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazyd o wzorze 1.
4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazyd o wzorze 1 otrzymuje się sposobem według wynalazku, który polega na tym, że hydrazyd kwasu 4-metylo-5-imidazolo-5-karboksylowego poddaje się reakcji z izotiocyjanianem w stosunku molowym 1:1. Reakcję prowadzi się w środowisku bezwodnego etanolu w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika w czasie około 30 minut. Postęp reakcji monitoruje się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Po utworzeniu produktu zawartość naczynia, w którym zachodzi reakcja chłodzi się, wytrącony osad odsącza, a po wysuszeniu krystalizuje z 96% etanolu.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie medyczne 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu o wzorze 1 w leczeniu gruźlicy.
Związek według wynalazku wykazuje silne hamowanie namnażania się prątka Mycobacterium tuberculosis in vitro oraz brak znaczącej cytotoksyczności względem ludzkich komórek immunokompetentnych. Tak więc, otrzymany według wynalazku związek może znaleźć zastosowanie do wytwarzania nowych leków w terapii gruźlicy.
Wynalazek został przedstawiony w przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia wykres obrazujący wyznaczenie wartości MIC50 oraz MIC90 dla pochodnej 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu, a fig. 2 - badanie wpływu na wewnątrzkomórkowe namnażanie się Mtb w ludzkich makrofagach pochodzenia monocytarnego nowej pochodnej 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu.
P r z y k ł a d I. Sposób otrzymywania 1,4-dipodstawionej pochodnej tiosemikarbazydu.
Mieszaninę hydrazydu (0,01 mola; 1,40 g) i 4-metyloaminofenyloizotiocyjanianu (0,01 mola; 1,78 g) ogrzewano w kolbce okrągłodennej zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Czas reakcji wynosił 30 min. Po utworzeniu produktu zawartość kolbki ochłodzono, wytrącony osad odsączono, a po wysuszeniu przekrystalizowano z 96% etanolu. Otrzymano 2,99 g (94,1% wydajności teoretycznej, (Tab. 1) 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu o temperaturze topnienia 215-217°C (Tab. 3). Właściwą budowę związku oraz jego czystość potwierdzono na podstawie analizy widm 1HNMR (Tab. 2).
PL 238 467 Β1
Tab. 1. Czas i wydajność reakcji otrzymywania 1,4-dipodstawionej pochodnej tiosemikarbazydu
| I nazwa związku | czas reakcji [minj | l wydajność [g = %] > |
| | 4-(4-dimctyloaminofcnylo)-1 -(4- | i | |
| i metyloiinidazol-5-ilokarbonylo)tiosemi- | 30 | 2.99 g- 94,02% i |
| karbazyd | ! i i 1 ! ] : i |
Tab. 2. Parametry fizykochemiczne 1,4-dipodstawionej pochodnej tiosemikarbazydu
| parametry fizykochemiczne | temp. top. । | |
| nazwa związku | lH NMR (DMSO<4) 5 (ppm): | r°ci | |
| 4-(4-dimety loaminofeny lo) -1-(4metyloimidazol-5-i lokarbo nylojtio semikarbazyd ........................................................................................................ | 2.449 (s, 3H); 2.870 (s, 6H); 6.651- 6.697 (m, 2H); 7.164-7.220 (m, 2H); 7.607 (s, 1H); 9.148 (s, 1H); 9.324 (s, 1H); 9.639 (s, 1H); 12,382 (s. 1H) | 1 1 215-217 | I |
Przykład II. Wyznaczenie wartość MIC - test redukcji resazuryny
Zasada testu
Do wyznaczenia wartości MIC (ang. minimum inhibitory concentration), czyli najmniejszego stężenie związku hamującego wzrost Mtb wykorzystano test redukcji resazuryny (7-hydroksy-3H-fenoksyazyno-3-on-10-tlenku soli sodowej). Test opiera się na reakcji kolorymetrycznej, gdzie resazuryna w formie niezredukowanej ma barwę niebieską, a przy udziale bakteryjnej dehydrogenazy komórkowej ulega redukcji do różowej rezorufiny. Związki o działaniu bakteriostatycznym lub bakteriobójczym, poprzez zahamowanie procesów metabolicznych bakterii, wpływają na szybkość redukcji resazuryny. Konwersja niebieskiej resazuryny do różowego produktu jest wprost proporcjonalna do liczby aktywnych metabolicznie prątków w próbie i może być mierzona spektrofotometrycznie.
Część doświadczalna
Przygotowano zawiesinę bakteryjną Mycobacterium tuberculosis szczepu H37Rv (ATCC® 27294™) w podłożu 7H9 (BD - Becton Dickinson) z dodatkiem 0,05% Tween80 (Sigma) i 10% OADC (BD) i hodowano do uzyskania gęstości optycznej, mierzonej w spektrofotometrze przy długości fali 600 nm względem podłoża do wartości 0,8-1,2. Do testu używano hodowli bakteryjnych będących najwcześniej z II pasażu i nie później niż z V pasażu. Pomiar zmętnienia hodowli określono metodą nefelometryczną z określeniem wartości w skali McFarlanda. Następnie przygotowano rozcieńczenie hodowli do wartości 1 McFarlanda w pełnym podłożu 7H9 z dodatkiem 0,1% kazeiny (Sigma). Do testu przygotowywano 10-krotne rozcieńczenie zawiesiny bakterii o wartości 1 McFarlanda, tak jak jest zalecane w testach dla antybiotyków z drugiej linii. Przygotowaną zawiesinę bakterii używano nie później niż w przeciągu 30 minut.
Przygotowano seryjne rozcieńczenia związku na płytce 96-dołkowej (NuncTC) w pełnym podłożu 7H9 z dodatkiem 0,1% kazeiny (Sigma) w objętości 100 μΙ, a następnie dodano po 100 μΙ hodowli bakteryjnej przygotowanej do doświadczenia. Najwyższe stężenie końcowe wynosiło 125 μg/ml. Do testu zastosowano następujące kontrole:
a) kontrola jałowości związku - 200 μΙ badanego związku
b) kontrola jałowości podłoża (0% redukcji resazuryny) - 200 μΙ pełnego podłoża 7H9 z dodatkiem kazeiny
PL 238 467 Β1
c) kontrola jałowości szczepów bakteryjnych (100% redukcji resazuryny) -100 μΙ pełnego podłoża 7H9 + 100 μΙ hodowli Mtb
d) kontrola jałowości resazuryny - 30 μΙ 0,02% roztworu resazuryny
Tak przygotowaną płytkę owinięto parafilmem i inkubowano w atmosferze wilgotnej w temperaturze 37°C przez 7 dni. Po inkubacji do wszystkich dołków testowych oraz kontrolnych dodano po 30 μΙ roztworu 0,02% resazuryny, przygotowanego tuż przed dodaniem poprzez rozpuszczenie naważki odczynnika w jałowej wodzie destylowanej i przefiltrowanie przez filtr o wielkości porów 0,22 μm. Płytkę po 24 godzinnej inkubacji w 37°C, odczytano wizualnie. Zmiana niebieskiej barwy resazuryny na różową świadczyła o wzroście bakterii.
Wyniki
Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że pochodna 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu o wzorze 1 nieoczekiwanie wykazuje aktywność anty-Mtb. Wartości MIC, najniższe stężenie związku przy którym zaobserwowano zahamowanie wzrostu wynosiło > 15,625 μg/ml.
Przykład III. Wpływ na żywotność komórek linii L929 - test MTT.
Zasada testu MTT
Oznaczenie cytotoksyczności związku z wykorzystaniem komórek linii L929 wykonano przy użyciu testu MTT, zgodnie z Normą Europejską: ISO 10993-5:2009(E). Test MTT oparty jest na przekształceniu żółtej soli MTT (bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego) do fioletowego, nierozpuszczalnego formazanu. Za tę konwersję odpowiedzialne są NADPH lub NADH, produkowane przez enzym dehydrogenazę mitochondrialną obecną w aktywnych metabolicznie komórkach. Natężenie barwy fioletowego produktu jest wprost proporcjonalne do liczby żywych komórek w próbce i może być mierzone spektrofotometrycznie.
Część doświadczalna
Na płytkę 96-dołkową (NuncTC), nanoszono komórki L929 (ATTC CCL-1 ™) o gęstości 1x105/ml po 100 μΙ/dołek, zawieszone w pełnym podłożu hodowlanym RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej (Biowest) z dodatkiem 10% surowicy płodów bydlęcych (Cytogen), 2 mM/ml L-glutaminy (Sigma), 100 μg/ml streptomycyny (Sigma), 100 U/ml penicyliny (Sigma) i inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Związek rozpuszczono w DMSO (Sigma), a następnie seryjnie rozcieńczono w pełnym podłożu hodowlanym RPMI, najwyższe stężenie końcowe wynosiło 500 μg/ml. Końcowe stężenie DMSO nie było wyższe niż 1%. Po inkubacji usuwano podłoże znad komórek i dodawano po 100 μΙ związku. Dodatkową kontrolę stanowił rozpuszczalnik DMSO, kontrolę negatywną stanowiły komórki hodowane w pełnym podłożu hodowlanym RPMI.
Po dodaniu wyżej wymienionego związku komórki inkubowano 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po obejrzeniu hodowli pod mikroskopem podłoże wraz z badanymi związkami ściągano, a następnie do dołków naniesiono po 50 μΙ roztworu MTT o stężeniu 1 mg/ml w podłożu RPMI 1640 i inkubowano w standardowych warunkach (37°C i 5% CO2). Po 2 godzinach, zbierano supernatant znad komórek, a kryształy formazanu rozpuszczano dodając po 150 μΙ DMSO/studzienkę. Barwę produktu stabilizowano dodając po 25 μΙ buforu glicynowego. Poziom absorbancji mierzono od razu za pomocą czytnika ELISA (Multiskan EX, Labsystems, Vienna, VA, USA), przy długości fali λ = 570 nm.
Wyniki
W doświadczeniu oceniano wpływ testowanego związku na żywotność komórek linii L929 przy pomocy testu MTT. Za kontrolę przyjęto hodowle komórkowe inkubowane w pełnym podłożu RPMI, bez dodatku badanych substancji i rozpuszczalnika (DMSO). Żywotność komórek obliczono według wzoru:
Wartość absorbancji próby badanej
Żywotność = ------r---77—:—r X 100%
Wartość absorbancji próby kontrolnej
Dla badanego związku i tuberkulostatyków wyznaczono stężenie CC30 -stężenie cytotoksyczne związków dla 30% komórek (Tab. 3).
PL 238 467 Β1
Tab. 3. Cytotoksyczność pochodnej tiosemikarbazydu o wzorze 1 (stężenie wyjściowe 50 mg/ml DMSO), rozcieńczonych seryjnie w pełnym podłożu hodowlanym RPMI. Procent żywych komórek (%) ± SD
| 4-(4- I | Stężenia Lμg/lnlJ | i ccM ! [gg/m 111 | |||||||
| i dimetyloaminofenyl 0)-1-(4- | 500 | 250 | 125 | 62,50 | 1 31,25 ; | 15,63 | 1 7,81 i i | 3,91 | |
| metyloimidazol-5- | i ! 1 77,71 | 80,54 | __________ _ 91,28 | 84,91 | J 93,04 | 102,83 | i 100,80 | 97,71 | Ϊ |
| i ilokarbonylo)tiosemi -karbazyd | 1 i i j 1 2,47 | 2,22 | 1,47 | 3,70 | ί ί | 1,12 | ( 0,53 | j 1,16 j | 2,90 | ; >500 ! |
Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że pochodna 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu wykazuje niską cytotoksyczność. Stężenie cytotoksyczne CC30 dla linii komórek L929 wynosiło: >500 μg/ml.
Przykład IV. Wyznaczenie wartość MIC50 oraz MIC90
Zasada testu
Do wyznaczenia wartość MIC50 oraz MIC90 (najmniejszego stężenia związku hamującego wzrost Mtb w 50% i 90%) zastosowano metodę płytkową, oceniającą liczbę jednostek koloniotwórczych. Wtym celu hodowle Mtb traktowano pochodną tiosemikarbazydu przez 48 godzin, a następnie wysiewano na podłoże 7H10 (BD). Po trzech tygodniach zliczono kolonie, zaś zahamowanie wzrostu wyrażono jako procent względem kontroli negatywnej.
Część doświadczalna
Przygotowano zawiesinę bakteryjną Mycobacterium tuberculosis szczepu H37Rvw podłożu 7H9 z dodatkiem 0,05% Tween80 i 10% OADC hodowano do uzyskania gęstości optycznej, mierzonej w spektrofotometrze przy długości fali 600 nm względem podłoża do wartości 0,8-1,2. Przygotowaną zawiesinę rozcieńczono w pełnym podłożu 7H9 do ODeoo 0,1, a następnie dodano badany związek do końcowego stężenia 125, 62,5, 31,25, 15,63, 7,81 μg/ml. Hodowle inkubowano 48 godzin. Kontrolę negatywną stanowiła hodowla prątków gruźlicy nietraktowana pochodną tiosemikarbazydu. Po inkubacji przygotowywano szereg rozcieńczeń zawiesin i wysiewano na płytki z podłożem 7H10. Tak przygotowane płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 tygodnie. Następnie policzono kolonie i wyrażono jako procent względem kontroli negatywnej.
Wyniki
Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że pochodna 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu o wzorze 1 nieoczekiwanie wykazuje aktywność anty-Mtb. Wartości MIC50, najniższe stężenie związku które hamuje wzrostu 50% Mtb wynosiło 13,86 μg/ml, a wartości MIC90, najniższe stężenie związku które hamuje wzrostu 90% Mtb wynosiło 32,60 μg/ml.
Przykład V. Ocena wpływu pochodnych tiosemikarbazydu na żywotność ludzkich makrofagów pochodzenia monocytarnego - test MTT (zmodyfikowany)
Zasada testu MTT - jw.
Część doświadczalna
Izolacja monocytów ludzkich z kożuszka lekocytarno-płytkowego została przeprowadzona na podstawie metody opisanej w publikacji (Korycka-Machała, M., Brzostek, A., Dziadek, B., Kawka, M., Popławski, T., Witczak, Z. J., & Dziadek, J. (2017). Evaluation of the Mycobactericidal Effect of Thiofunctionalized Carbohydrate Derivatives. Molecules, 22(5), 812.). Na płytkę 96-dołkową, naniesiono monocyty ludzkie po 1x105 komórek na studzienkę w objętości 150 μΙ, zawieszone w podłożu hodowlanym IMDM (Biowest) z dodatkiem 10% surowicy ludzkiej (Sigma), 100 μg/ml streptomycyny (Sigma), 100 U/ml penicyliny (Sigma) oraz 10 μg/ml M-CSF (Gibco) i inkubowano przez 5 dni, 37°C, 10% CO2. Po 72 godzinach komórki dożywiono podłożem IMDM z dodatkiem 10 μg/ml M-CSF i dalej inkubowano w wcześniej wspomnianych warunkach.
PL 238 467 Β1
Związek rozpuszczono w DMSO, a następnie seryjnie rozcieńczono w pełnym podłożu hodowlanym IMDM. Najwyższe stężenie związku wynosiło 500 μg/ml. Końcowe stężenie DMSO nie było wyższe niż 1%. Po inkubacji, studzienki przepłukano dwukrotnie w celu usunięcia komórek, nieadherentnych, a następnie usuwano podłoże znad komórek i dodawano po 100 μΙ związku w badanym zakresie stężeń. Dodatkową kontrolę stanowił rozpuszczalnik DMSO, kontrolę negatywną stanowiły komórki hodowane w pełnym podłożu hodowlanym IMDM.
Hodowle inkubowano z badanymi związkami przez 48 godzin w 37°C, 10% CO2. Po obejrzeniu hodowli pod mikroskopem podłoże wraz z badanymi związkami ściągano, a następnie do dołków naniesiono po 50 μΙ roztworu MTT o stężeniu 1 mg/ml PBS bez jonów Ca i Mg, (Sigma) i inkubowano (37°C i 5% CO2). Po 4 godzinach płytki wirowano 2500 rpm przez 10 min, zbierano supernatant znad komórek, a kryształy formazanu rozpuszczano dodając po 150 μΙ DMSO/studzienkę. Barwę produktu stabilizowano dodając po 25 μΙ buforu glicynowego. Poziom absorbancji mierzono od razu za pomocą czytnika ELISA, przy długości fali λ =570 nm.
Wyniki
W doświadczeniu oceniano wpływ testowanego związku na żywotność ludzkich makrofagów pochodzenia monocytarnego metodą MTT. Za kontrolę przyjęto hodowle komórkowe inkubowane w pełnym podłożu IMDM, bez dodatku badanych substancji i rozpuszczalnika (DMSO). Żywotność komórek obliczono według wzoru:
Wartość absorbancji próby badanej
Żywotność = —---rr--------7--η—:----:—r X 100%
Wartość absorbancji próby kontrolnej
Dla badanego związku wyznaczono stężenie CC30 - stężenie cytotoksyczne związków dla 30% komórek. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że nowa pochodna 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu wykazuje niską cytotoksyczność. Stężenie cytotoksyczne CC30 w kierunku ludzkich makrofagów pochodzenia monocytarnego wynosiło: 41,98 μg/ml dla 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu.
Przykład VI. Badanie wpływu 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu na wewnątrzkomórkowe namnażanie się Mtb w ludzkich makrofagach pochodzenia monocytarnego.
Zasada testu
Do wyizolowanych dojrzałych makrofagów, wyróżnicowanych z obwodowych monocytów ludzkich, dodano zawiesinę prątków gruźlicy w celu ich fagocytozy przez makrofagi. Zewnątrzkomórkowo zlokalizowane bakterie eliminowano stosując gentamycynę i kolejno dodano podłoże ze stężeniem MIC50 oraz MIC90 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu i inkubowano 48 godzin. Po inkubacji lizowano makrofagi, otrzymane lizaty wirowano, a pozostały osad zawieszono, rozcieńczono i wysiewano na płytki z podłożem 7H10. Następnie policzono kolonie (CFU) i wyrażono ich liczbę jako wartość procentową w odniesieniu do kontroli negatywnej (hodowle bez związku).
Część doświadczalna
Izolacja ludzkich monocytów obwodowych z kożuszka lekocytarno-płytkowego została przeprowadzona na podstawie metody opisanej w publikacji (Korycka-Machała, M., Brzostek, A., Dziadek, B., Kawka, M., Popławski, T., Witczak, Z. J., & Dziadek, J. (2017). Evaluation ofthe Mycobactericidal Effect of Thio-functionalized Carbohydrate Derivatives. Molecules, 22(5), 812.). Do studzienek płytki 24-dołkową (Nunc), naniesiono 5x105 obwodowych monocytów ludzkich w objętości 1 ml, zawieszone w pełnym podłożu hodowlanym IMDM zawierającym 10% surowicy ludzkiej, 100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny oraz 10 μg/ml M-CSF. Hodowle monocytów inkubowano przez 5 dni, 37°C, 10% CO2. Po 72 godzinach komórki dożywiono pełnym podłożem z IMDM z dodatkiem 10 μg/ml M-CSF i dalej inkubowano w tych samych warunkach. Po 5 dniach hodowli (różnicowanie monocytów do stadium dojrzałych makrofagów) usuwano nieadherentne komórki poprzez trzykrotne płukanie podłożem hodowlanym IMDM bez dodatku antybiotyków.
Przygotowano zawiesinę komórek Mycobacterium tuberculosis szczepu H37Rv w podłożu 7H9 z dodatkiem 0,05% Tween80 i 10% OADC, które hodowano do uzyskania gęstości optycznej, mierzonej w spektrofotometrze przy długości fali 600 nm względem podłoża, do wartości 0,8-1,2. Do testu używano hodowli prątków gruźlicy używanych najwcześniej z II pasażu i nie później niż z V pasażu. Wartość
PL 238 467 Β1
1,0 ODeoo odpowiada gęstości zawiesiny komórek Mtb 1,0-1,5x108/ml. Przygotowano zawiesinę komórek prątków gruźlicy w podłożu hodowlanym IMDM z dodatkiem 10% surowicy ludzkiej o gęstości 5x107/ml, które dodano w objętości 100 μΙ do wcześniej przygotowanych hodowli makrofagów. Następnie płytki odwirowano 10 min. 3000 rpm w temperaturze 37°C. Proces fagocytozy prątków prowadzono przez 2 godziny w 37°C, 10% CO2. Po inkubacji usuwano położone zewnątrzkomórkowo bakterie poprzez trzykrotne płukanie. Następnie dodano po 1 ml podłoża hodowlanego IMDM jedynie z dodatkiem 10% surowicy ludzkiej oraz 1 mg/ml gentamycyny (Sigma) i inkubowano przez 2 godziny w 37°C, 10% CO2 w celu zabicia zewnątrzkomórkowych prątków przylegających do powierzchni makrofagów. Po inkubacji, poprzez trzykrotne płukanie, usuwano antybiotyk, a następnie dodano po 1 ml podłoża hodowlanego IMDM z dodatkiem 10% surowicy ludzkiej oraz z nowym związkiem 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydem o stężeniu końcowym MIC50 i MIC90 i inkubowano 48 godzin. Po inkubacji makrofagi lizowano przy użyciu 0,1% SDS (Sigma) w czasie 10 min, wirowano, a powstały osad zawieszono, rozcieńczono, i wysiewano na płytki z podłożem 7H10. Tak przygotowane hodowle prątków gruźlicy inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 tygodnie. Następnie policzono kolonie (CFU), których liczbę wyrażono jako wartość procentową w odniesieniu do kontroli negatywnej (hodowle bez związku).
Wyniki
Na podstawie przeprowadzonych badań nieoczekiwanie okazuje się, że nowy związek 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazyd ma zdolność istotnego zahamowania wewnątrzkomórkowego namnażania się prątków gruźlicy in vitro przy stężeniach wyrażonych jako MIC50 (13,86 μg/ml) oraz MIC90 (32,60 μg/ml) odpowiednio o 35% (p = 0,025) oraz 60% (p< 0,0001) w porównaniu do kontroli - test U Manna-Whitneya.
Podsumowanie
| Dawka związku nie wywołująca efektu cyto toksycznego [pg/ml] | Dawka związku hamująca namnażanie Mtb lpg/ml] | Zahamowanie zewnątrzkomórkowego namnażanie Mtb | Zahamowanie wewnątrzkomórkowego namnażania Mtb (efekt terapeutyczny) | |
| ludzkie makrofagi pochodzenia monocy taniego | do 41,98 | MICso 13,86 | spadek 0 50% | spadek 0 35% |
| MIC90 32,60 | spadek 0 90% | spadek 0 60% |
MIC50 - najniższe stężenie związku które hamuje wzrostu 50% Mtb, MIC90 - najniższe stężenie związku które hamuje wzrostu 90% Mtb.
Claims (3)
1. 1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu, którą stanowi 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1-(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazyd o wzorze 1.
2. Sposób otrzymywania 1,4-dipodstawionej pochodnej tiosemikarbazydu, znamienny tym, że hydrazyd kwasu 4-metylo-5-imidazolo-5-karboksylowego poddaje się reakcji z izotiocyjanianem w stosunku molowym 1:1, a reakcję prowadzi się w środowisku bezwodnego etanolu w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika w czasie około 30 minut, przy czym postęp reakcji
PL 238 467 Β1 monitoruje się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, zaś po utworzeniu produktu zawartość naczynia, w którym zachodzi reakcja chłodzi się, wytrącony osad odsącza, a po wysuszeniu krystalizuje z 96% etanolu.
3. Zastosowanie 4-(4-dimetyloaminofenylo)-1 -(4-metyloimidazol-5-ilokarbonylo)tiosemikarbazydu o wzorze 1 w leczeniu gruźlicy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL428850A PL238467B1 (pl) | 2019-02-08 | 2019-02-08 | 1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu, sposób jej otrzymywania i jej zastosowanie medyczne |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL428850A PL238467B1 (pl) | 2019-02-08 | 2019-02-08 | 1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu, sposób jej otrzymywania i jej zastosowanie medyczne |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL428850A1 PL428850A1 (pl) | 2020-08-10 |
| PL238467B1 true PL238467B1 (pl) | 2021-08-23 |
Family
ID=71943754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL428850A PL238467B1 (pl) | 2019-02-08 | 2019-02-08 | 1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu, sposób jej otrzymywania i jej zastosowanie medyczne |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL238467B1 (pl) |
-
2019
- 2019-02-08 PL PL428850A patent/PL238467B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL428850A1 (pl) | 2020-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Koparir et al. | Synthesis and biological activities of some novel aminomethyl derivatives of 4-substituted-5-(2-thienyl)-2, 4-dihydro-3H-1, 2, 4-triazole-3-thiones | |
| KR101318189B1 (ko) | 결핵에 대한 병용 요법 | |
| US6699989B1 (en) | Antiviral and antimicrobial guanidine or biguanidine derivatives | |
| Shruthi et al. | Novel benzimidazole–oxadiazole hybrid molecules as promising antimicrobial agents | |
| US20140073631A1 (en) | Antiviral and antimicrobial compounds | |
| Mutlaq et al. | Antioxidant and antimicrobial activities of some novel 2-thiohydantoin derivatives | |
| CN115768517B (zh) | 非人类动物用抗菌剂 | |
| C Desai et al. | Synthesis and characterization of some new thiazole based thiazolidinone derivatives as potent antimicrobial and antimycobacterial agents | |
| JP4773975B2 (ja) | 置換されたキノリン類およびマイコバクテリア抑制剤としてのそれらの使用 | |
| US20140235863A1 (en) | Substituted 4-arylthiazoles and process of preparation thereof | |
| Fadda et al. | Synthesis, antimicrobial evaluation and molecular modeling of some novel phenothiazine derivatives | |
| Chitra et al. | A facile synthesis of carbocycle-fused mono and bis-1, 2, 3-selenadiazoles and their antimicrobial and antimycobacterial studies | |
| MXPA05003022A (es) | Nuevos compuestos antimicobacterianos. | |
| PL238467B1 (pl) | 1,4-dipodstawiona pochodna tiosemikarbazydu, sposób jej otrzymywania i jej zastosowanie medyczne | |
| CN118574811A (zh) | 5-氯-4-（3-氯-4-甲基苯基）-1h-咪唑-2-甲腈的水合物晶体 | |
| US6846933B1 (en) | Antimycobacterial compounds and method for making the same | |
| Deepthi et al. | Antimicrobial and antitubercular activity of novel pyrazole-4-carboxamide derivatives: synthesis and characterization | |
| Kavitha et al. | Synthesis and biological evaluation of sulfonamide-based 1, 3, 4-oxadiazole derivatives | |
| EP3301096A1 (en) | Bis-indole derivatives for use in the treatment of bacterial infections | |
| Rajasekaran et al. | Synthesis, antitubercular, antibacterial and antioxidant activity of some 2-phenyl-3-substituted quinazolin-4 (3H)-ones | |
| Sim et al. | Synthesis, characterization, antibacterial and free radical scavenging activities of some new 1, 2, 4-triazole Schiff bases and Mannich bases | |
| US6153645A (en) | Heterocycles as antimicrobial agents | |
| Ibrahima et al. | Antibacterial activity of benzoyl and halobenzoyl thiourea bearing Α-and Β-alanine | |
| US11932640B1 (en) | Pyrrolo[3,4-b]quinoline compounds as antibacterial agents | |
| CN108530448A (zh) | 含有碱性氮杂螺环片段的苯并噻嗪-4-酮类化合物及其制备方法 |