PL238555B1 - Sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 - Google Patents
Sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 Download PDFInfo
- Publication number
- PL238555B1 PL238555B1 PL406631A PL40663113A PL238555B1 PL 238555 B1 PL238555 B1 PL 238555B1 PL 406631 A PL406631 A PL 406631A PL 40663113 A PL40663113 A PL 40663113A PL 238555 B1 PL238555 B1 PL 238555B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- virus
- protein
- antigen
- strain
- influenza
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 37
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 title claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 2
- 108010029566 avian influenza A virus hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 38
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 38
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 8
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 abstract description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 5
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 5
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 101100223920 Caenorhabditis elegans rha-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 101100004044 Vigna radiata var. radiata AUX22B gene Proteins 0.000 description 2
- UYCAGRPOUWSBIQ-WOYAITHZSA-N [(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino)butyl]azanium;(2s)-5-oxopyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N UYCAGRPOUWSBIQ-WOYAITHZSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 210000003956 transport vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Ujawniono antygen, szczepionkę przeciwko grypie, układ do wytwarzania szczepionki, sposób wytwarzania antygenu oraz zastosowanie antygenu do wytwarzania szczepionki przeciwko grypie. Wynalazek dotyczy nowego sposobu wytwarzania antygenu szczepionkowego oraz nowego antygenu. Proponowane rozwiązanie prowadzi do uzyskania wysoko immunogennego antygenu co nie wymaga kontaktu z wirusem, a jedynie z genem hemaglutyniny. Szczepionka przeciw grypie nie zawiera wirusa ani jego fragmentów, nie zawiera komórek innych organizmów ani ich fragmentów, a jedynie oczyszczony antygen.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hydrofitowej domeny hemaglutyniny wirusa H5. Wynalazek dotyczy nowego sposobu wytwarzania antygenu szczepionkowego. Rozwiązanie według wynalazku prowadzi do uzyskania wysoko immunogennego antygenu co nie wymaga kontaktu z wirusem, a jedynie z genem hemaglutyniny, zaś otrzymana sposobem według wynalazku szczepionka nie zawiera wirusa ani jego fragmentów, nie zawiera komórek innych organizmów ani ich fragmentów, a jedynie oczyszczony antygen.
Grypa jest wirusową chorobą zakaźną występującą na całym świecie zarówno u ludzi, jak i u zwierząt. Epidemie grypy zdarzają się corocznie powodując wysoką zachorowalność i śmiertelność. Grypę wywołuje wielopostaciowy wirus RNA należący do rodziny Orthomyxoviridae, którego cząstki mają średnicę ok. 125 nm. Wyróżnia się trzy główne typy wirusa grypy oznaczone kolejno literami A, B i C. Wirusy grypy typu A dzielą się na podtypy ze względu na dwie powierzchniowe glikoproteiny: hemaglutyninę (HA) i neuraminidazę (NA). Jak dotąd zidentyfikowano 16 podtypów HA (H1 - H16) oraz 9 podtypów NA (N1 - N9). Naturalnym rezerwuarem wszystkich podtypów wirusa grypy są stada dzikiego ptactwa wodnego. Od 1918 roku jedynie trzy podtypy HA (H1, H2 i H3) oraz dwa podtypy NA (N1 i N2) są stale spotykane w populacji ludzkiej. Należy jednak podkreślić, że wirus H5N1, wirus 'ptasiej grypy', który pojawił się w latach 90-tych XX wieku zaraża również ludzi. Istotną cechą wirusa grypy jest zdolność do ciągłej zmiany, której źródłem są mutacje w genach kodujących białka HA i NA [Wiley D. i Skehel J. 1987]. Do zmian tych dochodzi zazwyczaj na skutek działania dwóch mechanizmów: przesunięcia antygenowego i skoku antygenowego. Brak dokładności polimerazy RNA skutkuje wysokim wskaźnikiem błędów transkrypcyjnych co prowadzi do zamiany aminokwasów w sekwencji HA. Ten mechanizm określamy jako przesunięcie antygenowe. Jeśli natomiast podczas jednoczesnego zakażenia organizmu dwoma różnymi wirusami grypy dojdzie między nimi do wymiany segmentów RNA wówczas dochodzi do skoku antygenowego co zwykle wiąże się z powstaniem nowego typu wirusa. Te zmiany genetyczne, zarówno przesunięcie, jak i skok antygenowy, są niemożliwe do przewidzenia i mogą spowodować pojawienie się wysoce patogennego wirusa. Szczepienie jest wciąż najbardziej skuteczną metodą ochrony przeciwko zakażeniom wirusem grypy oraz sposobem na zmniejszenie ryzyka wystąpienia epidemii czy pandemii. Substancją czynną w szczepionce przeciw grypie jest cały inaktywowany i oczyszczony wirion lub jego fragmenty. Dostępne na rynku tego typu szczepionki chronią w 60 - 90% osoby dorosłe i 23 - 72% osoby starsze. Proces otrzymywania szczepionki przeciw grypie obejmuje następujące etapy: (1) izolacja wirusa grypy, (2) genetyczna i antygenowa charakterystyka wyizolowanego wirusa, (3) wytypowanie szczepu wirusa do wykorzystania w nadchodzącym sezonie, (4) przygotowanie wysoko siewnego szczepu wirusa poprzez reasortację, (5) oddanie wysokosiewnego szczepu wirusa producentom szczepionek, (6) ocena przez producentów przydatności otrzymanego szczepu do produkcji szczepionek (7) produkcja szczepionki. Czas potrzebny na wyprodukowanie szczepionki to 7 - 8 miesięcy. Etap (4) tj. przygotowanie wysokosiewnego wirusa przez reasortację wymaga wykorzystania segmentów genomu pochodzącego ze szczepu wirusa wydajnie namnażającego się w zarodkach kurzych. Najczęściej jest to szczep A/PR/8/34. W ten sposób otrzymany szczep szczepionkowy różni się od szczepu wirusa grypy wyizolowanego w danym sezonie. Znanym jest fakt, iż wyizolowane z zakażonych organizmów wirusy grypy słabo namnażają się zarówno w zarodkach kurzych, jak i w liniach komórkowych. Należy zaznaczyć, że produkcja szczepionki przeciw grypie oparta na tradycyjnym namnażaniu wirusa w zarodkach kurzych choć bardzo dobrze opracowana posiada istotne wady i ograniczenia. Poza wspomnianym wyżej brakiem pełnej homologii między wirusem wyizolowanym ze środowiska a tym oddanym do produkcji, istotną wadą tej metody otrzymywania szczepionki jest długi i wieloetapowy proces produkcji oraz wysokie koszty produkcji związane z utrzymaniem wielu tysięcy zapłodnionych jaj kurzych. Warto zaznaczyć, że dla wyprodukowania jednej dawki szczepionki potrzeba średnio dwóch jaj. Jednak najważniejszym aspektem w produkcji szczepionek jest ich bezpieczeństwo. Obecnie obserwuje się stały wzrost liczby osób reagujących silną alergią na zanieczyszczenia białkowe w szczepionkach uzyskanych metodą tradycyjną. Poszukuje się zatem alternatywnych rozwiązań. Jednym z nich jest produkcja szczepionki z wykorzystaniem linii komórkowych. Mimo prowadzenia intensywnych badań rozwijających tę metodę nie znalazła ona szerokiego zastosowania. FDA dopuściła kilka linii komórkowych do wykorzystania w produkcji szczepionki, np. komórki Vero czy MDCK. Jednak z uwagi na możliwą obecność czynników nowotworowych oraz zanieczyszczeń białkowych szczepionki otrzymywane w liniach komórkowych nie wyszły poza etap badań. Ponie
PL 238 555 B1 waż przeciwciała neutralizujące wirusa grypy są skierowane głównie przeciwko białku HA obecnie obserwuje się dynamiczny rozwój badań nad szczepionką podjednostkową. Tego typu szczepionka zawiera rekombinowane białko HA, uzyskane metodami inżynierii genetycznej z wykorzystaniem różnych systemów ekspresyjnych. Hemaglutynina jest białkiem najliczniej występującym na powierzchni wirusa. Pełni dwie ważne funkcje w procesie infekcji: umożliwia przyłączenie się wirusa do komórek gospodarza oraz w trakcie endocytozy wirusa pośredniczy w jego fuzji z błoną pęcherzyka endocytarnego. Hemaglutynina na powierzchni wirusa występuje w formie trymerycznej. Każdy monomer składa się z dwóch podjednostek HA1 i HA2 połączonych przez mostek dwusiarczkowy, co stanowi domenę hydrofilową. Cząsteczka monomeru syntetyzowana jest w formie nieaktywnego prekursora HA0. Białko ulega N-glikozylacji a jego końcowa masa cząsteczkowa wynosi ok. 80 kDa. Warunkiem wstępnym dla infekcyjności wirusa jest przecięcie białka prekursorowego (HA0) na dwie podjednostki. Hemaglutynina nisko patogennych wirusów grypy w specyficznym miejscu cięcia posiada pojedynczą resztę argininy i jest aktywowana przez proteazy trypsynowe. U wysoko patogennych wirusów dochodzi do zwielokrotnienia aminokwasów zasadowych w miejscu cięcia białka HA0 tak, że miejsce to jest rozpoznawane przez szereg proteaz gospodarza. Dzięki tej zmianie wirus może się szybko rozprzestrzeniać i replikować niemal w każdym organie powodując ogólnoustrojową infekcję. Hemaglutynina jest najważniejszym antygenem przy definiowaniu serologicznej specyficzności szczepów wirusa. Białko to zawiera wiele miejsc antygenowych rozmieszczonych głównie w obrębie podjednostki HA1. Obecność neutralizujących przeciwciał IgG oraz IgA, specyficznych wobec hemaglutyniny wirusa grypy, jest związana z odpornością organizmu na infekcję i chorobę [Clements, 1992]. Jednym z układów stosowanych do produkcji rekombinowanej szczepionki przeciw grypie jest system ekspresyjny bakulowirusa oparty na komórkach owadzich. Metoda otrzymywania hemaglutyniny w systemie bakulowirusa jest przedmiotem patentu US 5858368. Rozwiązanie to wiąże się jednak z wysokimi kosztami produkcji wynikającymi z konieczności zatrudnienia wysoko wykwalifikowanego personelu i drogich odczynników. Wciąż zatem poszukuje się nowych, niedrogich i bezpiecznych sposobów otrzymywania antygenów szczepionkowych. Systemem ekspresyjnym wzbudzającym duże nadzieje na uzyskanie wysoko immunogennych antygenów jest system oparty o komórki drożdżowe. Patent US4752473 dotyczy metody ekspresji hemaglutyniny w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. System ten umożliwia wydajną produkcję HA jednak nadmierna glikozylacja białka jest znaczną przeszkodą stosowania tej strategii badawczej. Hemaglutyninę wirusa grypy H10N7 otrzymano w komórkach Schizosaccharomyces pombe (Wu et al., 2009) oraz typu H5N2 w drożdżach Kluyveromyces lactis (Su-Ming Tsai i wsp., 2011). W 1999 r. Saelens i wsp. otrzymali HA wirusa H3N2 w komórkach Pichia szczepu GS115. cDNA HA pozbawione C-terminalnej domeny transmembranowej wklonowane było do wektora pPIG9 zawierającego sekwencję α-faktora. Białko produkowane zewnątrzkomórkowo występowało w formie monomeru. Brak było danych wskazujących na obecność form trymerycznych. Białko nie było cięte na podjednostki. Xu Ym i wsp. (2006), w pracy opublikowanej w czasopiśmie chińskim, donosili o ekspresji HA wirusów H5, H7 i H9 w komórkach Pichia szczepu GS115. Użyty wektor - pPIG9. Chi Y. Wang i wsp. (2007) otrzymali w komórkach P. pastoris szczepu GS115 hemaglutyninę wirusa szczepu H5N2, która podlegała cięciu na podjednostki. Pełnej długości gen HA wklonowano do wektora pPICZaA. Uzyskano białko częściowo wydzielane do podłoża hodowlanego a w większości pozostające w komórce. Subatha i wsp. otrzymali pełnej długości białko HA wirusa H5N1 w systemie P. pastoris, ale jedynie wewnątrzkomórkowo. Użyty wektor - pPICZ C. Yang K. i wsp. otrzymali w komórkach P. pastoris jedynie domenę rHA1 wirusa grypy H5N1. Również Shehata i wsp. otrzymali jedynie podjednostkę HA1 wirusa grypy H5N1 w komórkach Pichia szczepu GS115 i SMDI168H stosując wektor p GAPZaC zawierający znacznik his -tag. Athmaram TN.i wsp. (2011) oraz Athmaram i wsp. (2012) otrzymali pełnej długości HA (HAO) wirusa grypy H1N1 w szczepie GS115 P. pastoris. Użyty wektor - pPICK9K z α-faktorem. Produkowana zewnątrzkomórkowo HAO (80 kDa) nie była cięta i występowała również w formie trimerów (ok. 240 kDa).
Pomimo istniejących do tej pory rozwiązań istnieje ciągła potrzeba opracowania nowego sposobu produkcji antygenu szczepionkowego oraz nowego antygenu. W odniesieniu do istniejących do tej pory rozwiązań opartych na namnażaniu wirusa w zarodkach kurzych istnieje konieczność pracy z wirusem. Poza wieloetapową produkcją konieczne są wysokie koszty produkcji związane z utrzymaniem wielu tysięcy zapłodnionych jaj kurzych. Wysokosiewny wirus przygotowuje się przez reasortację, korzystając z segmentów genomu pochodzącego ze szczepu wirusa wydajnie namnażającego się w zarodkach kurzych. Obserwuje się stały wzrost liczby osób reagujących silną alergią na zanieczyszczenia białkowe w szczepionkach uzyskanych metodą tradycyjną. Możliwa jest też obecność w szczepionce nieatenuowanego wirusa. W przypadku systemu opartego na liniach komórkowych istnieje możliwa obecność
PL 238 555 B1 czynników nowotworowych oraz zanieczyszczeń białkowych szczepionki, przy czym system ten jest nadal na etapie badań. W odniesieniu do systemu opartego na systemie bakulowirusowym odczynniki są drogie, konieczne jest zatrudnienie wysoko wykwalifikowanego personelu i należy się liczyć z wysokimi kosztami produkcji.
Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie nowego sposobu produkcji antygenu szczepionkowego. Choć istnieją doniesienia literaturowe na temat produkcji białka HA w komórkach Pichia niniejsze zgłoszenie patentowe dotyczy rozwiązania, które różni się od opublikowanych w kilku aspektach. Cechą charakterystyczną sposobu produkcji antygenu jest to, że antygen produkowany jest zewnątrzkomórkowo przez komórki Pichia pastoris szczepu KM 71 (his4, aox1::ARG4, arg4), który jest stosowany do selekcji wektorów ekspresyjnych zawierających HIS4 do wygenerowania szczepów z fenotypem Muts.
Nieoczekiwanie okazało się, że rozwiązanie według wynalazku prowadzi do uzyskania wysoko immunogennego antygenu co nie wymaga kontaktu z wirusem, a jedynie z genem hemaglutyniny. Szczepionka nie zawiera wirusa ani jego fragmentów, nie zawiera komórek innych organizmów ani ich fragmentów, a jedynie oczyszczony antygen. Sposób jej wytwarzania jest prosty i tani w porównaniu do już istniejących rozwiązań. Ponadto w szczepionce według wynalazku brak jest zanieczyszczeń białkowych. W kontekście szybko mutującego wirusa uzyskuje się szczepionkę homologiczną do szczepu wirusa grypy wyizolowanego w danym sezonie, przy jednoczesnym zapewnieniu szybkiego jej wyprodukowania w odpowiedzi na zaistniałe zapotrzebowanie.
Niniejsze zgłoszenie dotyczy nowego sposobu wytwarzania antygenu szczepionkowego. Cechą charakterystyczną sposobu wytwarzania antygenu jest to, że (1) antygen produkowany jest zewnątrzkomórkowo przez komórki Pichia pastoris szczepu KM 71. Cechą charakterystyczną otrzymanego antygenu jest to, że (1) jest on białkiem przeciętym przynajmniej w jednym miejscu, przy czym jedno z tych miejsc jest miejscem cięcia rozpoznawanym przez proteazy, łączącym domenę HA1 z domeną HA2, (2) białkiem połączonym 'trwale' mostkiem dwusiarczkowym, (3) białkiem glikozylowanym, (4) występującym w formie trimerów i oligomerów, (5) występującym jednocześnie jako mieszanina dwóch domen HA1 i HA2, białka połączonego mostkiem dwusiarczkowym i białka w formie trimerów i oligomerów, (6) białkiem posiadającym etykietę powinowactwa np. His-tag lub nie posiadającym etykiety powinowactwa.
W sposobie według wynalazku, nieoczekiwanie okazało się, że komórki Pichia pastoris szczepu KM 71 produkują do medium hodowlanego białko HA przecięte przynajmniej w jednym miejscu na domeny HA1 i HA2, występujące w formie pełnego białka połączonego mostkiem dwusiarczkowym i jednocześnie występującym w formie oligomerów, które wykazuje silne zdolności immunogenne.
Sposób wg wynalazku pozwala uzyskać antygen stosowany w różnorakich zastosowaniach, w tym jako antygen do WB, ELISA, korzystnie do przygotowania szczepionek przeciw grypie, ale nie ograniczających się do nich. Niniejszy wynalazek nie nakłada ograniczeń na szczep wirusa grypy. Na przykładzie hemaglutyniny wirusa H5 biegli w dziedzinie stwierdzą, że możliwe jest uzyskanie wysoko immunogennego antygenu wirusa grypy H1N1, H3N1 itp.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 obejmującej aminokwasy 17-531 charakteryzujący się tym, że obejmuje:
a) wprowadzenie sekwencji kodującej białko hemaglutyniny wirusa grypy typu H5, do drożdżowego wektora ekspresyjnego, zawierającego sekwencję kierującą białko na drogę sekrecji, pod kontrolą promotora genu oksydazy alkoholowej I (AOXI)
b) wprowadzenie wektora określonego w pkt. a) do komórek Pichia pastoris szczepu KM 71 na drodze elektroporacji;
c) hodowlę transformantów Pichia pastoris szczepu KM 71 otrzymanego w pkt. b), gdzie promotor AOXI jest indukowany metanolem,
d) izolację hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa grypy typu H5, obejmującej aminokwasy 17-531 z medium pohodowlanego.
W celu lepszego zobrazowania wynalazku przedstawiono rysunek, na którym:
Figura 1 przedstawia identyfikację rekombinowanego białka HA w supernatantach hodowlanych szczepu KM 71 i SMD 1168. Figura 1A przedstawia analizę Western Blot przeciwciała anty - HisTag, zaś Figura 1B analizę Western Blot przeciwciała anty-HA1;
Figura 2 przedstawia analizę frakcji elucyjnych uzyskanych przy oczyszczaniu His6-HA na złożu Ni-NTA agaroza (12% SDS-PAGE, zabarwiono Coomassie), przy czym Figura 2A - szczep KM 71 i Figura 2B - szczep SMD 1168;
PL 238 555 Β1
Figura 3 przedstawia wydajność nadekspresji białka HA w komórkach P. pastoris szczepu KM 71; (przykład 3);
Figura 4 przedstawia analizę frakcji elucyjnych uzyskanych przy oczyszczaniu Hise-HA na złożu Ni-NTA agaroza (12% SDS-PAGE, zabarwiono Coomassie) - przy czym Figura 4A przedstawia szczep SMD 1168, hodowla prowadzona w 28°C, Figura 4B przedstawia szczep KM 71, hodowla prowadzona w 30°C, Figura 4C przedstawia szczep KM 71, hodowla prowadzona w 30°C w obecności kwasu kazaminowego; (przykład 3);
Figura 5 przedstawia analizę stopnia N-glikozylacji podjednostki Hise-HA1 po reakcji z EndoH. Figura 5A przedstawia analizę Western Blott, przeciwciała anty - HisTag, a Figura 5B przedstawia analizę SDS-PAGE;
Figura 6 przedstawia żel natywny z przykładu 5;
Figura 7 przedstawia miano przeciwciał klasy IgG przeciwko H5 w surowicach mysz po podaniu antygenu rHA otrzymanego w komórkach Pichia pastoris. Figura 7A przedstawia różne dawki antygenu, a Figura 7B przedstawia różne drogi podania antygenu w dawce 25 μg (przykład 6);
Figura 8 przedstawia (przykład 7).
Poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania według wynalazku.
Przykład 1. Klonowanie i nadprodukcja/ekspresja rekombinowanego białka HA
Do konstrukcji wektora ekspresyjnego pPICZaC/HAHise wykorzystano plazmid pPICZaC (lnvitrogen) oraz plazmid pGEM-Easy/HA niosący gen hemaglutyniny wirusa grypy H5N1 szczepu (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)). Plazmid pPICZaC posiada promotor genu oksydazy alkoholowej I (ΑΟΧΙ) indukowany metanolem. Plazmid ten posiada również sekwencję czynnika a pochodzącego z Saccharomyces cerevisiae zapewniającą sekrecję rekombinowanego białka do medium. Fragment cDNA o wielkości 1545 pz kodujący domenę hydrofitową (17-531 aa) hemaglutyniny wirusa grypy H5N1 szczepu (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)) powielono w dwuetapowej reakcji POR z wykorzystaniem następujących starterów: 5’CATCATCATCATGATCAGATTTGCATTGGTTAC-3' oraz 3'CCTTGGATGGTTACTCGCCGGCGATAGCG-5'. w drugim etapie wykorzystano parę starterów: 5'GCĄęGATCGATGCATCATCATCATCATCATGATCAGA-3' oraz 3,CCTrGGAlGGTTACTCGCęGGCGATAGCG-5'.ge|ęWencja kodująca znacznik His-Tag została dodana do sekwencji cDNA poprzez odpowiednio zaprojektowane startery. Produkt POR został wklonowany do wektora ekspresyjnego pPICZaC pod kontrolę promotora ΑΟΧ. Komórki Pichia pastoris szczepu KM 71 (his4, aox1::ARG4, arg4) oraz SMD 1168 (his4, pep4) (lnvitrogen) transformowano plazmidem pPICZaC/HAHise wykorzystując technikę elektroporacji. Integracja cDNA hemaglutyniny do genomu P. pastoris została potwierdzona za pomocą reakcji POR. Selekcję transformantów szczepu KM 71 oraz SMD 1168 prowadzono na podłożu zawierającym antybiotyk Zeocynę (kilkakrotne pasażowanie). Podłoże pełne BMGY (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton, 100 mM fosforan potasu pH 6,0, 1,34% YNB 0,00004% biotyna, 0,5% glicerol) zaszczepiono pojedynczą kolonią szczepu P. pastoris transformowanego plazmidem pPICZaC/HAHise. Hodowlę prowadzono w temperaturze 28°C z wytrząsaniem (160 obr/min) do osiągnięcia wysokiej gęstości optycznej ODeoo > 3. Po żwirowaniu komórki zawieszono w podłożu BMMY (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton, 100 mM fosforan potasu pH 6,0, 1,34% YNB 0,00004% biotyna, 5% metanol). Obecność rekombinowanego białka, zarówno w medium pohodowlanym, jak również w komórkach (kontrola), badana była za pomocą SDS-PAGE i Western blotting (z użyciem przeciwciała anty-HisTag i anty-HA). Identyfikacja rekombinowanego białka HA w supernatantach hodowlanych szczepu KM 71 i SMD 1168 została przedstawiona na fig. 1.
Przykład 2. Oczyszczanie rekombinowanego białka HA
Rekombinowana hemaglutynina została oczyszczana z podłoża hodowlanego drogą chromatografii powinowactwa z użyciem złoża Ni-NTA agarozowego. Etap wiązania białka do złoża był przeprowadzony w obecności buforu PBS pH 7,4 i 450 mM NaCI. Wiązanie prowadzono w temperaturze 4°C przez 3 godz. przy ciągłym mieszaniu. Złoże przemyto buforem PBS pH 7,4 zawierającym 25 mM imidazol. Białko HA wymywano z kolumny buforem elucyjnym zawierającym 250 mM imidazol w buforze PBS pH 7,4. Odpowiednią ilość roztworu elucyjnego z każdej zebranej próbki przeznaczono do oznaczenia stężenia białka oraz analizy typu SDS-PAGE. Stężenie białka oznaczano spektrofotometrycznie przez pomiar absorbancji przy długości fali 595 nm wg metody Bradford. Następnie białko dializowano w obecności buforu PBS pH 7,4. Po dializie białko liofilizowano i przechowywano w temperaturze -20°C.
PL 238 555 B1
Na fig. 2 przedstawiono analizę frakcji elucyjnych uzyskanych przy oczyszczaniu Hise-HA na złożu Ni-NTA agaroza szczepu KM 71 i szczepu SMD 1168.
P r z y k ł a d 3. Optymalizacja warunków hodowli
Hodowle na etapie indukcji prowadzono przez 1 - 7 dni z codziennym pobieraniem prób. Obecność rekombinowanego białka badana była za pomocą SDS-PAGE i Western blotting (z użyciem przeciwciała anty-HisTag). Przeprowadzono optymalizację warunków hodowli, która dotyczyła zarówno temperatury, składu pożywki (np. użycie różnych inhibitorów proteaz), pH czy też stężenia metanolu. Najwyższą wydajność ekspresji uzyskano przy indukcji 5% metanolem. Fig. 3 przedstawia analizę wydajności nadekspresji białka HA w komórkach P. pastoris szczepu KM 71. W temperaturze 28°C i wyższej zaobserwowano degradację białka. Hodowla prowadzona w temperaturze > 28°C prowadziła do uzyskania rHA w formie zdegradowanej pomimo stosowania inhibitorów proteaz, czy też kwasu kazaminowego. Na fig. 4 przedstawiono analizę frakcji elucyjnych uzyskanych przy oczyszczaniu Hise-HA na złożu Ni-NTA agaroza (12% SDS-PAGE, zabarwiono Coomassie) - dla szczepu SMD 1168, szczepu KM 71, szczepu KM 71 w obecności kwasu kazaminowego.
P r z y k ł a d 4. Analiza glikozylacji rekombinowanego białka HA metodą enzymatyczną oraz za pomocą MS/MS
4,7 μg białka rHA inkubowano z 750 U endoglikozydazy H (New England BioLabs) w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Próbki po reakcji analizowano na żelu (Western Blot, SDS-PAGE) (Fig. 5). Prążek odpowiadający formie deglikozylowanej białka rHA wycięto z żelu w celu wykonania analizy MS/MS. Prążek poddano trawieniu trypsyną. Mieszaninę peptydów (bez redukcji i alkilacji) naniesiono na prekolumnę RP-18 (Waters nanoAcquity 20 mm x 180 μm) w obecności wody i 0,1% kwasu trifluorooctowego a następnie na kolumnę HPLC RP-18 (Waters nanoAcquity UPLC Column 250 mm x 75 μm), wykorzystując liniowy gradient acetonitrylu (0-50% w 30 min.) z dodatkiem 0,1% kwasu mrówkowego. Frakcja elucyjna z kolumny HPLC kierowana została bezpośrednio do komory jonowej spektormetru mas (LTQ-FTICR, Thermo Electron). Otrzymane widma masowe analizowano z wykorzystaniem białkowej bazy danych - National Center of Biotechnology Information (NCBI no. version 20080624) przy pomocy programu Mascot (www.matrixscience.com). Wiadomo, że w sekwencji HA (Qinghai) znajduje się 6 potencjalnych miejsc N-glikozylacji (5 miejsc w domenie HA1 i 1 miejsce w domenie HA2). Nasze badania wskazują, że wszystkie potencjalne miejsca N-glikozylacji ulegają glikozylacji. N-glikozylacja podjednostki rHA1 została potwierdzona za pomocą MS/MS preparatu rHA uprzednio traktowanego EndoH. Wykazano również, za pomocą MS/MS, obecność łańcuchów cukrowych w jedynym miejscu N-glikozylacji w domenie HA2.
P r z y k ł a d 5. Ocena stopnia oligomeryzacji białka rHA
Dokonano oceny stopnia oligomeryzacji białka rHA. Żel natywny został przedstawiony na Fig. 6.
P r z y k ł a d 6. Ocena immunogenności białka rHA
Immunogenność uzyskanego preparatu rHA sprawdzono na modelu mysim. W pierwszym eksperymencie grupy badane zawierały po 5 sztuk 7-tygodniowych myszy Balb/c. Uwzględniono grupę kontrolną (10 sztuk), której podawany był jedynie adiuwant. Zwierzęta utrzymywano w środowisku o stałej temperaturze 22-24°C. Myszy immunizowano trzykrotnie. Antygen zawieszony w roztworze soli fizjologicznej podawano w trzech dawkach: 1, 5 oraz 25 μg. Preparaty w objętości 100 μl podawano śródskórnie (s.c.) w podeszwową część tylnej łapy. Surowice kontrolne zostały pobrane od wszystkich grup na tydzień przed podaniem pierwszej dawki. Wykonano trzy nastrzyki (pierwsze podanie antygenu i/lub adiuwanta + dwie dawki przypominające) w odstępie trzech tygodni w celu monitorowania odpowiedzi immunologicznej. W pierwszej immunizacji zastosowano Sigma Adiuvant System w dawce 25 μg. Dwie dawki przypominające zawierały monofosforyl lipidu A oraz dwupeptyd muramylowy w dawce po 25 μg każdy. Grupom kontrolnym podano jedynie odpowiedni adiuwant. Dwa tygodnie po każdym szczepieniu pobierana była krew w celu oznaczenia poziomu przeciwciał. Surowice przechowywano w temperaturze -20°C. W drugim eksperymencie grupy badane zawierały po 7 sztuk 7-tygodniowych myszy Balb/c. Kontrolę stanowiła grupa zawierająca 5 sztuk myszy. Antygen zawieszony w roztworze soli fizjologicznej podawano jedynie w dawce 25 μg natomiast sprawdzono dwie drogi podania: podanie śródskórne (s.c.) w podeszwową część tylnej łapy oraz podskórne (i.d.) w fałd skórny na karku. Zastosowano harmonogram immunizacji opisany wyżej. Objętość podawanego preparatu wynosiła 100 μl. W pierwszej immunizacji zastosowano Sigma Adiuvant System w dawce 25 μg. Dwie dawki przypominające zawierały monofosforyl lipidu A oraz dwupeptyd muramylowy w dawce po 25 μg każdy. Grupie kontrolnej podano podskórnie jedynie odpowiedni adiuwant. Podobnie jak w pierwszym eksperymencie, dwa tygodnie po każdym szczepieniu pobierana była krew w celu oznaczenia poziomu
PL 238 555 B1 przeciwciał. Surowice przechowywano w temperaturze -20°C. W próbach surowicy pobranych od badanych zwierząt został oznaczony poziom specyficznych przeciwciał klasy IgG skierowanych przeciwko hemaglutyninie wirusa grypy H5N1. Poziom przeciwciał został oznaczony z wykorzystaniem testu ELISA. W celu wykonania testu H5-ELISA, płytki MediSorp (NUNC) opłaszczano rH5 (17-530 aa, ARRRKKR, 6 x His) szczepu (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)) z bakulowirusowego systemu ekspresji (Oxford Expression Technologies) w stężeniu 6 gg/ml PBS albo napełniano PBS (kontrola niespecyficznego wiązania). Płytki inkubowano w temperaturze 2-8°C w ciągu nocy, po czym blokowano 2% BSA w buforze PBS przez 1,5 godziny, w temperaturze 37°C. Przygotowano serię rozcieńczeń surowic mysich w zakresie 1:2000 1:2000000. Surowice rozcieńczano przy użyciu 2% BSA/PBS. Płytki z próbami surowicy i próbami kontrolnymi - BLK (2% BSA/PBS) inkubowano w temperaturze 2-8°C w ciągu nocy. Wywoływanie płytek obejmowało 1-godzinną inkubację w 37°C z wyznakowanymi HRP przeciwciałami przeciwko przeciwciałom klasy IgG mysz, specyficznymi wobec łańcucha γ (SigmaAldrich), które rozcieńczano 1:1 000. Płytki płukano buforem PBS zawierającym Tween 20 w stężeniu 0,05% (PBST). Po opłaszczeniu stosowano 4, po blokowaniu 2 a między pozostałymi etapami procedury 5 cykli płukania. Reakcję barwną peroksydazy chrzanowej wywoływano przy użyciu TMB (Sigma). Płytkę inkubowano z substratem w ciągu 30 min., po czym dodawano 0,5 M roztwór H2SO4 w celu zahamowania reakcji HRP. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm. Wartości A450 uzyskane dla prób BLK odejmowano od wartości A450 odczytanych dla prób surowicy. Wyniki oznaczeń surowic na płytkach nie opłaszczonych rH5 stanowiły kontrolę poziomu niespecyficznego wiązania surowic (tło). Próby surowicy uznawano za H5-dodatnie, jeśli wartość A450 dla tych prób była wyższa niż średnia wartość A450 dla prób grupy kontrolnej powiększona o 2 wartości odchylenia standardowego (cut off). Miano punktu końcowego zdefiniowano jako największe rozcieńczenie surowicy immunizowanych kurcząt dające wartość absorpcji 4-krotnie wyższą niż średnia wartość absorpcji prób kontrolnych.
Na fig. 7 przedstawiono miano przeciwciał klasy IgG przeciwko H5 w surowicach mysz po podaniu antygenu rHA otrzymanego w komórkach Pichia pastoris przy różnych dawkach antygenu oraz przy różnych drogach podania antygenu w dawce 25 gg.
P r z y k ł a d 7. Charakterystyka / Immunogenność antygenów rHA
Immunogenność białek rH5 oznaczono z wykorzystaniem testu ELISA. Płytki MediSorp (NUNC) opłaszczano trzema wariantami białka rH5 szczepu (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)):
1. rH5 OET (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis) z bakulowirusowego systemu ekspresji (Oxford Expression Technologies),
2. rH5 (17-531,6xHis) z komórek P. pastoris szczepu KM 71
3. rH5 (17-531,6xHis) z komórek P. pastoris szczepu SMD 1168 w stężeniu 6 gg/ml PBS albo napełniano PBS (kontrola niespecyficznego wiązania). Płytki inkubowano w temperaturze 4°C przez noc. Następnie płytki przepłukano buforem PBST (PBS + 0,05% Tween 20) i blokowano 2% BSA w buforze PBS przez 1,5 godziny w temperaturze 37°C. Surowice badane uzyskane od zaszczepionych kur (AS-169, AS-184, EK-23.7) oraz myszy (EK-1.3, EK-1.4) rozcieńczono w stosunku 1:200 przy użyciu buforu 2% BSA/PBSS (bufor fosforanowy zawierający 0,3 M NaCl + KCl). Płytki z próbami surowicy i próbami kontrolnymi - PBS 2-8°C przez noc. Wywoływanie płytek obejmowało 1-godzinną inkubację w 37°C z wyznakowanymi HRP przeciwciałami przeciwko orzeciwciałom klasy IgY kurcząt, specyficznymi wobec łańcucha γ (próby As-169, As-184, EK-23.7) (Thermo Scientific) oraz wyznakowanymi HRP przeciwciałami przeciwko przeciwciałom klasy IgG mysz, specyficznymi wobec łańcucha γ )próby EK-1,3, EK-1,4) (Sigma Aldrich). Płytki płukano buforem PBS zawierającym Tween 20 w stężeniu 0,05% (PBST). Reakcję barwną peroksydazy chrzanowej wywoływano przy użyciu TMB (Sigma). Płytkę inkubowano z substratem w ciągu 30 min., po czym dodawano 0,5 M roztwór H2SO4 w celu zahamowania reakcji HRP. Absorbcję prób odczytywano przy λ = 450 nm wykorzystując czytnik do mikropłytek (Synergy 2; BioTek Instruments, USA) [fig. 8].
Claims (1)
- Zastrzeżenie patentowe1. Sposób wytwarzania hydrofilowej domem hemaglutyniny wirusa H5 obejmującej aminokwasy 17-531, znamienny tym, że obejmuje:a) wprowadzenie sekwencji kodującej białko hemaglutyniny wirusa grypy typu H5, do drożdżowego wektora ekspresyjnego, zawierającego sekwencje kierującą białko na drogę sekrecji, pod kontrolą promotora genu oksydazy alkoholowej I (AOXI);PL 238 555 Β1b) wprowadzenie wektora określonego w pkt. A) do komórek Pichia pastoris szczepu KM 71 na drodze elektroporacji;c) hodowlę transformantów Pichia pastoris szczepu KM 71 otrzymanego w pkt. b), gdzie promotor ΑΟΧΙ jest indukowany metanolem;d) izolację hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa grypy typu H5, obejmującej aminokwasy 17-531 z medium pohodowlanego.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL406631A PL238555B1 (pl) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 |
| EP14830896.8A EP3083660B1 (en) | 2013-12-20 | 2014-12-19 | Method of influenza antigen production |
| PCT/PL2014/000148 WO2015093996A1 (en) | 2013-12-20 | 2014-12-19 | Antigen, influenza vaccine, system for vaccine manufacturing, method of antigen production, and use of antigen to produce an influenza vaccine |
| PL14830896.8T PL3083660T3 (pl) | 2013-12-20 | 2014-12-19 | Sposób wytwarzania antygenu przeciwko grypie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL406631A PL238555B1 (pl) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL406631A1 PL406631A1 (pl) | 2015-06-22 |
| PL238555B1 true PL238555B1 (pl) | 2021-09-06 |
Family
ID=52424083
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL406631A PL238555B1 (pl) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 |
| PL14830896.8T PL3083660T3 (pl) | 2013-12-20 | 2014-12-19 | Sposób wytwarzania antygenu przeciwko grypie |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL14830896.8T PL3083660T3 (pl) | 2013-12-20 | 2014-12-19 | Sposób wytwarzania antygenu przeciwko grypie |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3083660B1 (pl) |
| PL (2) | PL238555B1 (pl) |
| WO (1) | WO2015093996A1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL235555B1 (pl) * | 2014-06-24 | 2020-09-07 | Inst Biotechnologii I Antybiotykow | Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA ) wirusa grypy H5N1, kompozycja zawierająca polipeptyd i jej zastosowanie, przeciwciało wiążące się specyficznie z polipeptydem oraz sposób otrzymywania tego polipeptydu |
| PL422982A1 (pl) * | 2017-09-26 | 2019-04-08 | Instytut Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk | Antygen uniwersalny, uniwersalna szczepionka przeciwko grypie, układ do wytwarzania szczepionki, sposób wytwarzania antygenu i zastosowanie antygenu do wytwarzania szczepionki uniwersalnej przeciwko grypie |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1945250A4 (en) * | 2005-08-16 | 2010-05-19 | Hawaii Biotech Inc | RECOMBINANT SUBUNIT VACCINE AGAINST INFLUENZA |
| US20070286873A1 (en) * | 2006-05-23 | 2007-12-13 | Williams John V | Recombinant Influenza H5 Hemagluttinin Protein And Nucleic Acid Coding Therefor |
| CN107281478B (zh) * | 2010-07-23 | 2022-04-01 | 诺瓦瓦克斯公司 | 流感疫苗 |
| PL220281B1 (pl) * | 2011-09-23 | 2015-09-30 | Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk | Szczepionka DNA, sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej, przeciwciała specyficznie rozpoznające białko hemaglutyniny H5 wirusa grypy i zastosowanie szczepionki DNA |
-
2013
- 2013-12-20 PL PL406631A patent/PL238555B1/pl unknown
-
2014
- 2014-12-19 EP EP14830896.8A patent/EP3083660B1/en active Active
- 2014-12-19 WO PCT/PL2014/000148 patent/WO2015093996A1/en not_active Ceased
- 2014-12-19 PL PL14830896.8T patent/PL3083660T3/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL3083660T3 (pl) | 2021-02-22 |
| PL406631A1 (pl) | 2015-06-22 |
| WO2015093996A1 (en) | 2015-06-25 |
| EP3083660A1 (en) | 2016-10-26 |
| EP3083660B1 (en) | 2020-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Weldon et al. | Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin | |
| Wohlbold et al. | Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses | |
| US20220249652A1 (en) | Influenza virus neuraminidase and uses thereof | |
| US20240316179A1 (en) | Chimeric influenza vaccines | |
| US20170189518A1 (en) | Nucleic acid molecules encoding ferritin-hemagglutinin fusion proteins | |
| US20130034578A1 (en) | Recombinant multimeric influenza proteins | |
| ES2832733T3 (es) | Métodos de preparación y uso de complejos de hemaglutinina del virus de la gripe | |
| Athmaram et al. | Yeast expressed recombinant Hemagglutinin protein of novel H1N1 elicits neutralising antibodies in rabbits and mice | |
| Pion et al. | Characterization and immunogenicity in mice of recombinant influenza haemagglutinins produced in Leishmania tarentolae | |
| Chen et al. | Site-specific glycan-masking/unmasking hemagglutinin antigen design to elicit broadly neutralizing and stem-binding antibodies against highly pathogenic avian influenza H5N1 virus infections | |
| US10435462B2 (en) | Hybrid influenza seed viruses, compositions thereof, and use thereof in the diagnosis or therapy of influenza | |
| PL238555B1 (pl) | Sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 | |
| US20250082744A1 (en) | Chimeric influenza vaccines | |
| Baranowska et al. | Targeting of nucleoprotein to chemokine receptors by DNA vaccination results in increased CD8+-mediated cross protection against influenza | |
| Kwak et al. | Influenza chimeric protein (3M2e-3HA2-NP) adjuvanted with PGA/Alum confers cross-protection against heterologous influenza a viruses | |
| Ibañez et al. | Genetic and subunit vaccines based on the stem domain of the equine influenza hemagglutinin provide homosubtypic protection against heterologous strains | |
| Kopera et al. | High‐Titre Neutralizing Antibodies to H1N1 Influenza Virus after Mouse Immunization with Yeast Expressed H1 Antigen: A Promising Influenza Vaccine Candidate | |
| RU2855931C1 (ru) | Химерные вакцины против гриппа | |
| RU2834969C1 (ru) | Химерные вакцины против гриппа | |
| Cargnelutti et al. | Improved immune response to recombinant influenza nucleoprotein formulated with ISCOMATRIX | |
| Chen et al. | Recombinant hemagglutinin proteins formulated in a novel PELC/CpG adjuvant for H7N9 subunit vaccine development | |
| Tsybalova et al. | Cross-protective properties of an influenza vaccine based on HBc4M2e recombinant protein | |
| Kiršteina | The immunoprotective and diagnostic potential of influenza virus haemagglutinin stalk domain for development of novel vaccine prototypes | |
| WO2025111005A1 (en) | Influenza vaccine comprising whole virus, split virus or virus like particles with partially glycosylated surface viral glycoprotein | |
| US20210327533A1 (en) | Methods for generating broadly reactive, pan-epitopic immunogens, compositions and methods of use thereof |