PL238589B1 - Szczep bakterii mlekowych Lactobacillus rhamnosus - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest Szczep bakterii mlekowych Lactobacillus rhamnosus ŁOCK 1146 zdeponowany Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00217, o właściwościach probiotycznych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczep bakterii mlekowych Lactobacillus rhamnosus ŁOCK 1146 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów, w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda PAN we Wrocławiu pod numerem B/00217, o właściwościach probiotycznych. Dotychczas znane są szczepy bakterii z gatunku Lactobacillus rhamnosus, jak Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus Lc705, Lactobacillus rhamnosus ATCC 8530, Lactobacillus rhamnosus CASL, a także szczepy Lactobacillus rhamnosus BioPL1 z opisu patentowego PL 226294 oraz Lactobacillus rhamnosus ŁOCK 1087 ze zgłoszenia patentowego P.422602.

Wiadomo jest, iż probiotyki zapewniają równowagę mikrobioty jelitowej i wywierają korzystny efekt na zdrowie ludzi i zwierząt. Określenie probiotyk jest zastrzeżone dla preparatów lub produktów, które spełniają następujące kryteria: zawierają żywe komórki w odpowiedniej ilości, poprawiają stan zdrowia gospodarza, korzystny efekt wywierają w przewodzie pokarmowym (podawane jako dodatki do żywności lub pasz). Skuteczność korzystnego oddziaływania probiotycznych szczepów mikroorganizmów, w tym głównie bakterii fermentacji mlekowej (LAB) na organizm ludzi i zwierząt jest uwarunkowana wieloma czynnikami, dlatego ważna jest właściwa selekcja i dobór szczepów oraz systematyczne dostarczanie organizmowi dużej liczby żywych komórek tych mikroorganizmów. Zgodnie z propozycjami Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), Organizacji Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa (FAO) oraz Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) szczepy probiotyczne w procesie selekcji muszą spełniać zarówno kryteria bezpieczeństwa, funkcjonalności, j ak i przydatności technologicznej. Bezpieczeństwo szczepu jest zdefiniowane poprzez jego pochodzenie oraz profil oporności na antybiotyki. Aspekty funkcjonalne określają ich zdolność przeżycia w przewodzie pokarmowym (m.in. odporność na niskie pH i sole żółci). Właściwości technologiczne obejmują natomiast zdolność przeżycia probiotyków i zachowania swoich uzdolnień podczas przechowywania i dystrybucji. Produkty probiotyczne są znane już od dawna, ale obecnie, z powodu zwiększonej świadomości żywieniowej społeczeństw, stają się bardzo popularne. Na zwiększenie popytu mają również wpływ choroby cywilizacyjne związane z niewłaściwym żywieniem, stresujący tryb życia i polepszacze stosowane do żywności. Produkcja żywności probiotycznej, dodatków paszowych oraz produktów farmaceutycznych wymaga jednak pozyskiwaniem nowych szczepów oraz doboru szczepów o odpowiednich właściwościach.

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych z gatunku Lactobacillus rhamnosus , który oznaczono symbolem ŁOCK 1146 i który został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00217.

Szczep bakterii ŁOCK 1146 wyizolowano z kału dorosłego człowieka.

Szczep ŁOCK 1146 jest to Gram-dodatnia pałeczka, nieruchliwa, nie przetrwalnikująca. Jest szczepem o właściwościach probiotycznych, stanowiącym homolog bakterii z gatunku Lactobacillus rhamnosus o sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA przedstawionej na końcu opisu.

W celu określenia przynależności gatunkowej nowego szczepu ŁOCK 1146 zsekwencjonowano region DNA kodujący gen 16S rRNA o długości 1432. Otrzymaną sekwencję nukleotydową genu 16S rRNA porównano za pomocą programu BLASTN 2.6.0+ z sekwencjami dostępnymi w bazie National Center of Biotechnology Information (NCBI) oraz programu CLC Main Workbench 8. Na podstawie porównania sekwencji nukleotydowych genów 16S rRNA bakterii z gatunku Lactobacillus rhamnosus KY348290.1 stwierdzono podobieństwo nowego szczepu bakterii do gatunku Lactobacillus rhamnosus z prawdopodobieństwem 99,16%.

Nowy szczep ŁOCK 1146 hoduje się na podłożu Rogosa przeznaczonym do hodowli bakterii z rodzaju Lactobacillus sp., przejrzystym, o barwie żółto-brązowej, o składzie w g/l: pepton kazeinowy - 10,0, ekstrakt drożdżowy - 5,0, D(+)glukoza - 20,0, fosforan potasu - 6,0, cytrynian amonu - 2,0, Tween 80 - 1,0, octan sodu - 15,0, siarczan magnezu - 0,575, siarczan żelaza II - 0,034, siarczan manganu - 0,12, agar - 15,0, o pH 5-6, w temperaturze 15-45°C, korzystnie 37°C w czasie 48 godzin. Na podłożu Rogosa szczep rośnie w postaci biało-kremowych, okrągłych kolonii, o gładkiej powierzchni i regularnych brzegach, o średnicy około 2-3 mm.

Szczep ŁOCK 1146 hoduje się także w podłożu płynnym MRS, stanowiącym modyfikację podłoża Rogosa, zawierającym jako źródło glukozę, o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy - 4,0, ekstrakt mięsny

PL 238 589 B1

- 10,0, pepton z kazeiny - 10,0, D(+)glukoza - 20,0, Tween 80 - 1,0, wodorocytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 7-wodny - 0,20, siarczan magnezu 4-wodny - 0,05, o pH 5-6, w temperaturze 15-45°C, korzystnie 37°C w czasie 48 godzin. W podłożu tym szczep rośnie tworząc jednorodne zmętnienie pożywki.

Do wzrostu szczep preferuje atmosferę wzbogaconą w CO2 wprowadzony w ilości 5% (v/v). Rośnie jednak zarówno w warunkach tlenowych, jak i względnie beztlenowych.

Cechy morfologiczne szczepu ŁOCK 1146

W obrazie mikroskopowym bakterie mają kształt krótkiej długości pałeczek, prostych, o długości 4-5 μm i do 1 μm szerokości. Pałeczki nie wytwarzają przetrwalników.

Cechy fizjologiczne i biochemiczne szczepu ŁOCK 1146

Szczep nie wytwarza katalazy oraz oksydazy cytochromowej. Wybarwia się na Gram (+).

Badanie metabolizmu glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych na pożywce Hugh-Leifsona w wysokich słupach wykazało, że szczep ŁOCK 1146 jest zdolny do rozkładu glukozy zarówno w obecności tlenu, jak i w warunkach beztlenowych, czyli na drodze fermentacji.

Test API 50 CHL wykazał, że szczep ŁOCK 1146 jest zdolny do fermentacji następujących sacharydów i ich pochodnych: rybozy, galaktozy, glukozy, fruktozy, mannozy, sorbozy, ramnozy, inozytolu, mannitolu, sorbitolu, N-acetyloglukozaminy, Metylo-a,D-glukopiranozydu, amygdaliny, arbutyny, esculiny, salicyny, celobiozy, maltozy, laktozy, sacharozy, trehalozy, melecytozy, gencjobiozy, D-turanozy, tagatozy, glukonianu.

Szczep ŁOCK 1146 charakteryzuje się metabolizmem względnie heterofermentatywnym. Laktozę fermentuje z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 3,5 g/l, przy czym udział kwasu L(+) mlekowego wynosu 97%, kwasu octowego (1,5 g/l), aldehydu octowego (1,0 mg/l) i etanolu (5,0 mg/l).

Test API ZYM wykazał, że szczep ŁOCK 1146 wykazuje aktywność następujących enzymów: arylamidazy leucyny, arylamidazy waliny, arylamidazy cysteiny, fusfohydrolazy naftylo-AS-BI.

Szczep ŁOCK 1146 nie wytwarza siarkowodoru, ani amoniaku z argininy, nie wykazuje zdolności rozkładu H2O2.

Cechy probiotyczne szczepu ŁOCK 1146

Szczep ŁOCK 1146 spełnia kryteria stawiane bakteriom probiotycznym, co stwierdzono w wyniku badań in vitro wykonanych według procedur zalecanych przez FAO/WHO.

Nowy szczep wykazuje wysoką odporność na niskie pH (kwasowość soku żołądkowego) w zakresie od 2,0 do 3,0.

Szczep ŁOCK 1146 wykazuje również wysoką odporność na sole żółci w stężeniach 1% i 2%.

Szczep ŁOCK 1146 wykazuje oporność w stosunku do antybiotyków i chemioterapeutyków o działaniu przeciwbakteryjnym tj.: penicylina, kanamycyna, wankomycyna, amoksycylina, doksycyklina, streptomycyna, erytromycyna, tetracyklina, cefalotyna, ceftazydym, aztreonam, amikacyna, klotrimazol.

Wykazuje aktywność antagonistyczną w stosunku do patogenów przenoszonych drogą pokarmową tj. Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Choleraesuis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Listeria innocua.

Posiada niską aktywność fekalną. Spośród trzech enzymów: β-glukozydazy, β-glukuronidazy i ureazy aktywna jest tylko β-glukozydaza.

Szczep ŁOCK 1146 charakteryzuje się dobrym przyleganiem do komórek nabłonka jelitowego Caco-2, a więc wykazuje właściwości adhezyjne.

Wykazuje zdolności detoksyfikacyjne mykotoksyn (aflatoksyny Bi, ochratoksyny A, fumonizyny, toksyny T-2, zearalenonu, deoksyniwalenolu), które najczęściej mogą stanowić zanieczyszczenie żywności i pasz.

Cechy biotechnologiczne szczepu ŁOCK 1146

Właściwości biotechnologiczne szczepu ŁOCK 1146, ze względu na możliwość zastosowania w żywności i w paszach określono zarówno w mleku, jak i w mieszance paszowej.

W mleku o 3,2% zawartości tłuszczu szczep ŁOCK 1146 fazę stacjonarną osiągnął po 19 godzinach hodowli, zaś plon komórek wynosił 2,10x109 jtk/ml. Czas trwania fazy adaptacyjnej bakterii wyniósł 2 godziny. Właściwa szybkość wzrostu szczepu wynosiła 0,42 h^-1, a produktywność hodowli była równa 0,45x10⁸.

PL 238 589 B1

W mieszance paszowej (zmielone ziarna: pszenicy 40%, jęczmienia 30%, kukurydzy 20% i żyta 10%) szczep ŁOCK 1146 fazę stacjonarną osiągnął po 18 godzinach hodowli, zaś plon komórek wynosił 2,35x10⁹ jtk/ml. Czas trwania fazy adaptacyjnej bakterii wyniósł 2 godziny. Właściwa szybkość wzrostu szczepu wynosiła 0,17 h^-1, a produktywność hodowli była równa 0,50x108.

Szczep ŁOCK 1146 znajduje zastosowanie jako dodatek do żywności i pasz.

Przedmiot wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d I

Szczep ŁOCK 1146 hodowano w podłożu płynnym MRS (firmy Merck), o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy - 4,0, ekstrakt mięsny - 10,0, pepton z kazeiny - 10,0, D(+)glukoza - 20,0, Tween 80 - 1,0, wodorocytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 7-wodny - 0,20, siarczan magnezu 4-wodny - 0,05, o pH 5-6, w obecności CO2 wprowadzonego w ilości 5% (v/v), w temperaturze 37°C.

Po 48 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 2,5x10⁹ komórek/ml.

P r z y k ł a d II

Szczep ŁOCK 1146 hodowano w podłożu płynnym Rogosa (firmy Difco) o składzie w g/l: pepton kazeinowy - 10,0, ekstrakt drożdżowy - 5,0, D(+)glukoza - 20,0, fosforan potasu - 6,0, cytrynian amonu - 2,0, Tween 80 - 1,0, octan sodu - 15,0, siarczan magnezu - 0,575, siarczan żelaza II - 0,034, siarczan manganu - 0,12, agar - 15,0, o pH 5-6, w obecności CO2 wprowadzonego w ilości 5% (v/v), w temperaturze 37°C.

Po 48 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 1,5x10⁹ komórek/ml.

P r z y k ł a d III

Bakterie otrzymane jak w przykładzie I umieszczono w środowisku o pH 2,0 i 3,0. W środowisku o pH 2,0 po 180 minutach przeżyło 3,5x10⁸ jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 5,0x10⁸ jtk/ml. W środowisku o pH 3,0 po 180 minutach przeżyło 2,5x10⁸ jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 4,0x10⁸ jtk/ml.

P r z y k ł a d IV

Bakterie otrzymane jak w przykładzie I poddano działaniu żółci o stężeniach 1% i 2% w czasie do 4 godzin. Po 4 godzinach inkubacji przy stężeniu żółci 2% przeżywalność komórek wynosiła 92%, a przy stężeniu żółci 1% przeżyło 95% komórek bakterii.

P r z y k ł a d V

Liofilizat bakterii otrzymanych jak w przykładzie I przechowywano w temperaturze 4-5°C oraz w temperaturze pokojowej 25°C w ciągu 4 miesięcy. Po tym czasie nastąpiło obniżenie liczby żywych komórek o 5% dla temperatury chłodniczej i o 14% dla temperatury pokojowej. Temperatura chłodnicza zapewniła większą stabilność i trwałość.

PL 238 589 Β1

Wykaz sekwencji

CTGATTTATTGAAAGGTGCTTGCATTCCTTGATTTAGATTTTGAACGAGTGGCGGA

CGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAA

CAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGG

CGTAAGCTATCG CTTTTGG ATGGACCCG CGG CGTATTAGCTAGTTGGTG AG GTAA

CGGCTCACCAAGG CAATG ATACGTAG CCG AACTG AG AGGTTG ATCG GCCACATT

GGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCA

CAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGG

TCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGT

GACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT

ACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGG

TTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAAC

TGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAAT

GCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACT

GACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC

CATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTTGGAAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCC

GCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAAC

TCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAACATGTGGGTTTAATTCG

AAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATC

AGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT

GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGC

CAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT

GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACA

ATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCC

ATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAG

TAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG

CCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGGAAAGCCGGTGGCGTAAACCCTT

TAGGGAGCGAGCCGTC w której: A - oznacza adeninę, G - guaninę, C - cytozynę, T - tyminę.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   1. Szczep bakterii mlekowych Lactobacillus rhamnosus LOCK 1146 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00217, o właściwościach probiotycznych.