PL239536B1 - Sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi - Google Patents
Sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi Download PDFInfo
- Publication number
- PL239536B1 PL239536B1 PL425116A PL42511618A PL239536B1 PL 239536 B1 PL239536 B1 PL 239536B1 PL 425116 A PL425116 A PL 425116A PL 42511618 A PL42511618 A PL 42511618A PL 239536 B1 PL239536 B1 PL 239536B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- starch
- amylase
- liquefaction
- native starch
- enzyme
- Prior art date
Links
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 title claims abstract description 64
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 title claims abstract description 64
- 239000008107 starch Substances 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims abstract description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 14
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019759 Maize starch Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 241001468259 Anoxybacillus flavithermus Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241000205192 Pyrococcus woesei Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000204074 Thermococcus hydrothermalis Species 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002897 organic nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020374 simple syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020985 whole grains Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi z wykorzystaniem α-amylazy. Sposób ten charakteryzuje się tym, że jako enzym stosuje się α-amylazę pochodzącą od szczepu Bacillus amyloliquefaciens KU12, którą dodaje się w ilości od 0.012 do 0,1 U/mg natywnej skrobi do 1 - 40% roztworu natywnej skrobi i upłynnianie prowadzi się przy pH roztworu wynoszącym od 4,5 do 6,5, mieszając z szybkością ścinającą wynoszącą od 100 do 200 s-1 i w przedziale temperatur od 70°C do 90°C, przy czym powyżej temperatury 82°C, stosuje się dodatek jonów wapnia Ca2+.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi różnego pochodzenia z pominięciem wstępnej konwencjonalnej metody kiełkowania skrobi w temperaturze 105-140°C, α-Amylaza (endo-a-1,4-glukanaza lub glukanohydrolaza a-1,4 glukanu; EC-3.2.11) jest aktywnym polipeptydem katalizującym hydrolizę skrobi, w tym jej dwie frakcje (amyloza i amylopektyna). Rozszczepia wewnętrzne wiązanie a-1,4-glikozydowe tych substratów od redukującego końca w sposób przypadkowy z powolnym uwolnieniem oligosacharydów o różnym stopniu polimeryzacji (DP), dekstryn i nieznacznych ilości glukozy. Stężenie produktów hydrolizy i ich stopnie depolimeryzacji zależą od rodzaju enzymu, masy substratu, warunków oraz czasu hydrolizy (Ezeji i Bahl, J. Biotechnol, 125, 27-38, 2006). Dotychczas konwencjonalny proces upłynniania skrobi w przemysłach biotechnologicznych odbywa się głównie w dwóch etapach: kiełkowanie i upłynnianie. W tych etapach zawiesinę skrobi natywnej, mąki lub biomas skrobiowych (15-30%) poddaje się najpierw procesowi kiełkowania pod ciśnieniem (jet-cooking) w wysokiej temperaturze powyżej 105°C (5-10 min) z udziałem termofilnej α-amylazy, (Atrim, Patent US 5180669; 1991; Thisted et al., US 7713723 B1,2000; Udeh i Targoński, Patent PL 199207 B1, 2008; Udeh et al., Patent PL 211354 B1, 2012; Anderson i Poulsen, Patent US 9139822 B1, 2015). Na tym etapie skrobia jest na ogół częściowo upłynniana przez wstępnie dodaną termofilną α-amylazę z B. licheniformis do 10 -15 stopnia polimeryzacji (DP) (Crab i Mitchinson, TIBTECH, 15, 349-352, 1997; Anderson i Poulsen, Patent US 9139822 B1,2015). Firma Dupont produkująca komercyjną a-amylazę (Spezyme Alpha - 13775 AAU/g) rekomenduje zastosowanie jej do tego procesu w ilości 0,2-0,3 kg /tonę skrobi, co odpowiada po przeliczeniu około 3,7 - 5,5 U/mg skrobi (www.dupont.com). Natomiast na etapie właściwego upłynniania, kleik poddaje się dalszej hydrolizie, w trakcie której zachodzi wtórne upłynnianie w czasie 1,5 do 2 h w temperaturze 90°C z dodatkiem drugiej porcji określonego stężenia α-amylazy (Veit et al., WO 2002038787 A2, 2001; Anderson i Poulsen, Patent US 9139822 B1,2015). Opisane powyżej czynności technologiczne zwiększają koszty obróbki substratu przeznaczonego do procesu fermentacji, ponieważ na etapie kiełkowania następuje utrudnianie przepływu kleiku, ze względu na jego wysoką lepkość (Veit et al, WO 2002038787 A2, 2001; Udeh i Targoński, Patent PL 199207 B1,2008; Anderson i Poulsen, Patent US 9139822 B1, 2015) co wymaga dodatkowych czynności i nakładów energetycznych.
Opracowano rozwiązania dotyczące wytwarzania wysokotermostabilnych α-amylaz przez szczepy (Pyrococcus woesei., P, furiosus, Thermococcus hydrothermalis) wyizolowane z ekstremalnych środowisk (Koch et al., Arch. Microbiol., 155, 572-578, 1991; Dong et al., Appl. Environ. Microbiol., 63, 3669-3576, 1997; Bertoldo i Aniranikan, Curr, Opinion Chem. Biol., 6, 151-160, 2002). a-Amylazy te nie są powszechnie stosowane w przemyśle skrobiowym ze względu na wysokie koszty produkcji (wzrost i synteza od 70-90°C). Ich synteza jest nieopłacalna na skalę przemysłową ze względu na matą wydajność (Crab i Mitchinson, TIBTECH, 15, 349-352, 1997). Ponadto tego rodzaju α-amylazy mają ograniczoną możliwość hydrolizy skrobi nawet w niższych temperaturach po jej skiełkowaniu (Bertoldo i Antranikan, Curr. Opinion Chem. Biol., 6, 151-160, 2002; Anderson i Poulsen, Patent US 9139822 B1, 2015). Znanych jest również wiele potencjalnych mezofilnych i termofilnych, mikroorganizmów wytwarzających na drodze hodowli wgłębnej lub powierzchniowej; α-amylazy hydrolizujące natywną skrobię (Ozdermir et at., Ann. Microbiol., 62, 1367-1375, 2012; Udeh i Targoński, Patent PL 199207 B1,2008; Anderson i Poulsen, Patent US 9139822 B1,2015; Tang et al., zgłoszenie patentowe US 2016/0208230 A1). Większość z nich nie znalazła przemysłowego zastosowania, ponieważ nie są aktywne w wysokich temperaturach.
Pojęcie „kiełkowanie skrobi” oznacza rozpuszczanie cząsteczek skrobi zawieszonych w wodzie (zawiesina skrobi) pod wpływem temperatury, która przekracza jej temperaturę kiełkowania celem niszczenia jej struktur amorficznych i krystalicznych oraz tworzenia hydrożelu.
Przez pojęcie „temperatura kiełkowania” rozumie się najmniejszą wartość temperatury, w którejzaczyna się kiełkowanie skrobi. Dokładną wartość temperatury kiełkowania skrobi ustala się znanymi metodami i zależy ona od rodzaju skrobi, jej pochodzenia, odmiany i warunków uprawy. Wartości te różnią się w zależności od pochodzenia skrobi.
Pojęcie „konwencjonalne kiełkowanie skrobi” oznacza ogrzewanie zawiesiny skrobi powyżej 105°C (105-140°C) w ciągu 5 do 15 minut z dodatkiem określonego stężenia termostabilnej a-amylazy.
Przez pojęcie „biomasy skrobiowe” rozumie się zarówno cale ziarno pochodzące z roślin zbożowych i innych podobnych jak i bulwy z roślin bulwiastych oraz korzennych, zawierające skrobię jako
PL 239 536 B1 materiał zapasowy. Mogą być one wstępnie przygotowane przez zmielenie świeżego materiału lub/i wysuszone, i zmielone. Następnie poddane działaniu różnych enzymów np.: rozkładających ścianę komórkową (celulaza, ksylanaza), rozgałęziających (celubioza, β-glukozydaza itp.) i proteolitycznych (proteaza) w etapie wstępnej obróbki substratu do jednostopniowej hydrolizy bądź upłynniania skrobi.
Z publikacji patentu PL 217670B1 znany jest sposób jednoetapowej enzymatycznej hydrolizy skrobi instantyzowanej, o zawartości skrobi w suchej substancji nie mniejszej niż 95%, charakteryzującej się wartością równoważnika glukozowego (DE) nie wyższą niż 2, w celu otrzymania hydrolizatu maltozowego lub glukozowego. W sposobie tym do roztworu skrobi instantyzowanej, o pH od 5,0 do 5,5 dla otrzymania hydrolizatu maltozowego lub o pH - od 4,8 do 5,2 dla otrzymania hydrolizatu glukozowego, dodaje się, wspólnym lub oddzielnymi strumieniami, enzym rozkładający wiązania glikozydowe typu α-1,4 od środka łańcucha skrobiowego (enzym upłynniający) oraz rozkładający wiązania typu α-1,4 i α-1,6 makrocząsteczki skrobi (enzym scukrzający) lub enzym rozkładający tylko wiązanie α-1,4 kolejno od końca łańcucha makrocząsteczki (enzym scukrzający), po czym jednoetapowe prowadzi się proces hydrolizy skrobi instantyzowanej poprzez jednoczesne upłynnianie i scukrzanie przez odpowiedni czas, zależny od oczekiwanego, końcowego stopnia scukrzania, dla hydrolizatu maltozowego w temperaturze powyżej 70°C, a dla hydrolizatu glukozowego w temperaturze poniżej 70°C.
Znany jest szczep bakterii Bacillus amyloliuefaciens, który wyizolowany został z próbki ziemi pochodzącej z Abudży w Nigerii. Sekwencję nukleotydową genu kodującego 16S rRNA tego szczepu zdeponowano w bazie bioinformatycznej GenBanku, NCBI, USA pod nr. KX870880 i oznaczono symbolem KU12.
Nieoczekiwanie okazało się, że szczep ten wytwarza α-amylazę, która umożliwia upłynnienie natywnej skrobi w dynamicznym procesie z jednoczesnym kiełkowaniem i jej upłynnianiem w jednym etapie.
Istota sposobu jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi z wykorzystaniem α-amylazy polega na tym, że jako enzym stosuje się α-amylazę pochodzącą od szczepu Bacillus amyloliquefaciens KU12, którą dodaje się w ilości od 0,012 do 0,1 U/mg natywnej skrobi do 1 - 40% roztworu natywnej skrobi. Upłynnianie prowadzi się przy pH roztworu wynoszącym od 4,5 do 6,5, mieszając z szybkością ścinającą wynoszącą od 100 do 200 s-1 i w przedziale temperatur od 70°C do 90°C w zależności od pochodzenia skrobi. Powyżej temperatury 82°C, stosuje się dodatek jonów wapnia Ca2+.
Korzystnie, temperaturę procesu uzyskuje się w czasie nie dłuższym niż 2 minuty.
Sposób według wynalazku wykorzystujący α-amylazę pochodzącą od szczepu Bacillus amyloqiucfackns KU12 umożliwia prowadzenie procesu w zakresie temperatur od 70°C do 90°C przy niskim stężeniu enzymu, redukując szybko lepkość natywnej skrobi poddawanej upłynnianiu. Rozwiązanie to pozwala skrócić czas upłynniania, zmniejszyć nakład energetyczny i stężenie enzymu. Ma to wpływ na redukcję całkowitych kosztów w porównaniu do metody konwencjonalnej upłynniania. W ten sposób uzyskuje się hydrolizat o lepkości umożliwiającej łatwe jego przetransportowanie i dalszy przerób procesie cukrzenia. Produkt ten w swoim składzie zawiera od 1 do 9 DP (stopień polimeryzacji) oraz inne malto-oligosacharydy. Hydrolizat ten może być bezpośrednio wykorzystany do produkcji syropu cukrowego dla różnych procesów technologicznych oraz w metodzie jednoczesnej fermentacji i scukrzania (SSF-VHG - simultaneous saccharification and fermentation under high gravity) ((Nguyen et al., Ind. Crops Products, 56, 160-165; 2014) skrobi o wysokiej rozpuszczalnej masie.
Sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi według wynalazku przedstawiono szczegółowo poniżej w przykładach realizacji.
P r z y k ł a d 1
Proces wytwarzania α-amylazy hydrolizującej natywną skrobię przez szczep Bacillus amyloliquefaciens KU12
Szczep przechowywano w 20%, glicerolu w temperaturze minus 80°C, następnie namnażano w bulionie odżywczym agarowym przygotowanym zgodnie zaleceniem, producenta (BTL-Polska) przez 48 h w temperaturze 37°C. Przygotowano skosy agarowe o następującym składzie w 100 cm3 (w/v): 1 g skrobi rozpuszczalnej (POCH), 1,5 g bulionu zwykłego (BTL-Polska), 2 g agaru. Namnożone wcześniej komórki przeszczepiono na agar, i zostawiono w termostacie w temperaturze 37°C przez 24 h.
Wyrosłe komórki zaszczepiono na wysterylizowaną i ostudzoną pożywkę posiewową w objętości 50 ml o pH 6,5 w stożkowej kolbie o poj. 300 ml. Pożywka posiewowa miała następujący skład w 100 cm3 (w/v):1 g skrobi rozpuszczalnej. (POCH), 1,5 g bulionu zwykłego (BTL-Polska). Hodowlę posiewową prowadzono na wytrząsarce obrotowej w temperaturze 37°C przez 24 h. Uzyskane komórki użyto do zaszczepienia pożywki produkcyjnej.
PL 239 536 B1
Pożywka produkcyjna zawierała następujący skład w 100 cm3 (w/v); 1 g skrobi; 0,2 g, KH4PO4; 0,05 g (NH4)SO4; 0,05 g NaCl; 0,02 g CaCl2.4H2O, 0,01 g MgSO4.7H2O; 0,5 g ekstrakt drożdżowy (BIOCORP). Przed sterylizacją korygowano pH pożywki do 6,5. Po sterylizacji, ostudzono pożywkę sterylnie zaszczepiono komórkami z hodowli posiewowej w ilości 1% w stosunku objętości pożywki produkcyjnej. Hodowlę produkcyjną prowadzono na wytrząsarce obrotowej w temperaturze 37°C przez 72 h.
Skrobie do wytwarzania tego enzymu mogą być w formie natywnej, zmodyfikowanej albo w formie biomasy skrobiowej, w postaci zmielonej, suszonej, hydrolizowanej albo niehydrolizowanej. Stężenie suszonych biomas skrobiowych w pożywce może wynosić od 5% do 10% a innych źródeł oczyszczonych skrobi od 1 do 2%. Pożywka produkcyjna zawiera łącznie związki azotu organicznego w stężeniu od 0,2% do 2% oraz nieorganicznego w stężeniu od 0,05% do 2%, zaś hodowla produkcyjna może być prowadzona w przedziale temperatur od 28°C do 45°C i przy pH 5,5 do 7,5 (korzystnie przy pH 6,5) i czasie od 24 do 96 h.
Po zakończeni hodowli odwirowano uzyskany płyn pohodowany przy 6000 x g w czasie 15 minut w temperaturze 4°C. Filtrat pozbawiony biomas mikrobiologicznych użyto do oznaczania ogólnej aktywności enzymatycznej, stosując 1% buforowany roztwór skrobi o pH 5,5. Analizę ilości wydzielonych cukrów redukujących prowadzono zgodnie z metodą DNS (Miller, Anal. Chem., 31,426-428, 1959). Na podstawie analizy ilości wydzielonych cukrów redukujących po reakcji enzymatycznej obliczono i określono aktywność α-amylazy. Aktywność tą wyrażono w IU/ml. Jedna jednostka określa ilość wydzielonych cukrów redukujących przez enzym wyrażony w μmol glukozy w jednostce czasu (1 minut) zależnej od warunków reakcji enzymatycznej. Analizę ogólnej zawartości białka oznaczono metodą Lowry’ego (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 1, 265-275; 1951).
Aktywności ogólna i specyficzna po oczyszczeniu znanymi metodami wg wynalazku wynosiły odpowiednio 68,0 U/mL i 1746 U/mg białka (po filtracji żelowej) w temperaturze 60°C. Enzym ten wykazuje aktywność w przedziale pH od 3,0 do 9,0, a optymalnie przy pH 5,5. Zakres temperatury działania; mieści się w przedziale od 30°C do 100°C, przy czym optymalna aktywność przybiera wartość od 60°C do 80°C. W zakresie temperatur 60°C do 80°C wykazuje aktywność bez dodatku lub/i z dodatkiem jonów Ca2+, natomiast przy temperaturze powyżej 82°C, jony Ca2+ są wskazane a powyżej 90°C koniecznie wymagane.
Jako-a-amylazę rozumie się zarówno preparat enzymatyczny uzyskany metodą hodowli wgłębnej, zawierający a-amylazę wraz z pozostałymi zanieczyszczeniami pochodzącymi ze składników pożywek hodowlanych jak i wstępnie oczyszczoną α-amylazę uzyskaną w procesach wstępnego oczyszczania, stosując znaną metodę wytrącania (aceton, etanol, (NH4)2SO4) oraz oczyszczoną do homogenności α-amylazę znanymi metodami (chromatografia jonowa wymienna, chromatografia hydrofobowa, sączenie molekularne).
P r z y k ł a d 2
Jednostopniowe upłynnianie natywnej skrobi kukurydzianej
Przygotowano 30% wodny roztwór natywnej skrobi kukurydzianej o pH wynoszącym 5,5. Do badań użyto α-amylazę otrzymaną według sposobu opisanego w przykładzie 1. w dawce 0.06 U/mg natywnej skrobi. Enzym dodano do zawiesiny skrobi w dwóch kombinacjach: bez dodatku jonów Ca2+ i z dodatkiem Ca2+ w ilości 5 mM. Następnie każdą z próbek w dwóch kombinacjach mieszano z naprężeniem stycznym, czyli szybkością ścinającą wynoszącą 150 s-1, a jednocześnie ogrzewano, do dwóch założonych temperatur pomiaru, wynoszących odpowiednio 80°C i 90°C. Badanie przeprowadzono zatem dla czterech wariantów próbek. Dla każdej z próbek temperaturę danego pomiaru osiągnięto w ciągu 2 minut. Zaprogramowana temperatura była stała w czasie całego procesu upłynniania, który trwał 30 minut. Dodatkowo wykonano próby, kontrolne, analogicznie do właściwych pomiarów, w których nie dodano enzymu. Do przeprowadzenia pomiaru zmiany lepkości zachodzącej podczas jednostopniowego upłynniania 30% natywnej skrobi kukurydzianej w dwóch różnych temperaturach (80°C i 90°C) użyto reometru (rheometer Kinexus pro+ Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK) zintegrowanego z mikroprocesorem z możliwością analizy w jednostce czasu (realtime measurement). Wykres przedstawiający wyniki pomiaru zmian lepkości podczas jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi przedstawiono na Fig. 1.
Zastosowane na wykresie opisy mają następujące znaczenie:
- (D) 30% 80°C oraz (A) 30% 90°C - oznaczają próby kontrolne z 30% wodnego roztworu natywnej skrobi kukurydzianej bez dodatku enzymu α-amylazy, przeprowadzone odpowiednio w temp. 80°C i 90°C;
PL 239 536 BI
- (B) 30% E 90°C oraz (C) 30% E + Ca 90°C - oznaczają próbki z 30% wodnego roztworu natywnej skrobi kukurydzianej z dodatkiem enzymu α-amylazy, przeprowadzone, w temp. 90°C odpowiednio bez dodatku i z dodatkiem jonów Ca2+;
- (E) 30% E 80°C oraz (F) 30% E + Ca 80°C - oznaczają próbki z 30% wodnego roztworu natywnej skrobi kukurydzianej z dodatkiem enzymu α-amylazy, przeprowadzone w temp. 80°C odpowiednio bez dodatku i z dodatkiem jonów Ca2+.
Otrzymane wyniki wykazują, że lepkości spadały we wszystkich pomiarach z początkowej wartości wynoszącej ponad 1000 Pa s (kontrola) do końcowej wartości wynoszącej poniżej 0.01 Pas. Wyjątkiem byt pomiar w temperaturze 90°C bez dodatku jonów Ca2+, w którym lepkość wynosiła około 0,01 Pa s Przeprowadzone badania dowodzą przydatności zastosowanego enzymu enzymu a-amylazy otrzymanego ze szczepu Bacillus amyloliquefaciens KU 12. Istotne jest ponadto, iż proces upłynniania nie ogranicza się do użycia wyłącznie tej wykazanej, skrobi.
Przykład 3
Procentowa zawartość cukrów redukujących wytworzonych, przez α-amylazę hydrolizującą natywną skrobię w czasie upłynniania w różnych temperaturach
Tabela 1. przedstawia procent hydrolizy 30% natywnej, skrobi kukurydzianej w temperaturze 80°C i 90°C z dodatkiem 5 mM Ca2+ w czasie 30 minut, stosując enzym w dawce 0,06 U/mg skrobi. W temperaturze 90°C stwierdzono około 42,8% końcowego stopnia hydrolizy w obecności Ca2+, natomiast w 80°C wartość ta wynosiła 43,2%. Warunki przeprowadzenia badań były analogiczne do przykładu nr. 3. Wartości te obliczono zgodnie ze znaną metodyką (Sujka et al., Ital. Food Sc 4, 4, 433-439, 2006).
| Czas (min) | Temperatura ( | °C) . |
| 80 | 90 | |
| 5 | 27,4 ±0,2j | 27,3 ±0,37 |
| 10 | 30,6 ±0,1' | 33,0 ±0,6h |
| 15 | 34.6 ±0,3s | 37,5 ±0,2f |
| 20 | 40,0 ±0,4d | 38,5 ±0,4e |
| 25 | 41,1 ±0.1c | 41,1 ±0,0c |
| 30 | 43,2 ±0,5ab | 42,8 ±0,3a___ |
Tab. 1. Procent hydrolizy po jednostopniowym upłynnianiu 30% skrobi kukurydzianej w czasie 30 minut w temperaturze 80°C i 90°C w obecności 5 mM Ca2+ przy pH 5.5. Wartości są średnim ± odchyleniem standardowym. Średnie z różnymi literami różnią się istotnie, p < 0.05.
Przykład 4
Chromatogram hydrolizatu wytworzonego przez α-amylazę hydrolizującą natywną skrobię
Chromatogram hydrolizatu wytworzonego przez α-amylazę hydrolizującą natywną skrobię przedstawiono na, Fig. 2. Analiza metodą, wysokosprawnej chromatografii cieczowej hydrolizatu po jednostopniowym upłynnianiu natywnej skrobi kukurydzianej w warunkach opisanych w przykładzie 2. wykazała, że produkt hydrolizy składa się z różnych stopni polimeryzacji od DPI do DP 9 i tak na przykład DPI na przedstawionym chromatogramie stanowi glukozę (pierwszy pik od prawej strony) itp. i ponadto zawiera inne nieidentyfikowalne malto-oligosacharydy. Do tych analiz użyto kolumnę (Benson Carbohydrate column BP-200 Ag+- Benson Polymeric Inc., Nevada, USA) przeznaczoną do rozdziału węglowodanów zgodnie z zaleceniem producenta.
Literatura
1. BERTOLDO ANTRANIKAN.G., (2002) Starch hydrolysing enzymes from thermophilicarchaea and bacteria. CURR. OPINION CHEM. BIOL, 6, 151-160.
2. GRABB D. W., MITCHINSON (1997) Enzymes involved in the Processing of starch to sugars. TIBTECH, 15, 349-352:
3. DONG G , VIEILLE C., SAVCHENKO A., ZEIKUS GREGORY J„ (1997) Cloning, sequencing and expression of the gene encoding extracellular α-amylase from Pyrococcus
PL 239 536 B1 furiosus and biochemical characterization of the recombinant enzyme. APPL. ENVIRON. MICROBIOL., 63, 3569-3576.
4. EZEJI C.T., BAHL H., (200)6 Purification, characterization and synergistic action of phytate-resistani α-amylase and α-glucosidase from Geobacillus ihermacienitrificans HRO10. J. BIOTECHNOL., 125, 27-38.
5. KOCH R., SPREINAT A., LEMKE K., ANTRAIK1AN G., (1991) Purification and properties of a hyperthermoactive α-amylase from the archeabacterium Pyrococcus woesei. ARCH. MICROBIOL., 155, 572-578.
6. KY-CHU 5., PHAM T, BUI T.K, NGUYEN T., PHAM K, NGUYEN T., HO P., LE T. (2016)
Simultaneous liquefaction, saccharification and fermentation at a very high gravity of rice at pilot scale for potable ethanol production and distillers dried grains composition., FOOD AND BIOPRODUCTS PROCESSING, 98, 79-85.
7. LOWRY O.H., ROSEBROUGH N.J., FARR A.L., RANDAL RJ., (1951) Protein measurement with the Folin-Phenol reagents. J. BIOL. CHEM., 193, 265-267.
8. MILLER G.L., (1959) Use of dintrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. ANAL. CHEM., 31,426-428.
9. NGUYEN C., LE T., KY-CHU. S., (2014) Pilot scale simultaneous saccharification and fermentation at very high gravity of cassava flour for ethanol production. IND. CROPS PRODUCTS., 56, 160-165.
10. OZDERMIR S., MATPAN F., OKUMUS V., DUNDAR A., ULUTUSM.S., KUMURU M., 11(2012) Isolation of a thermophilic Anoxybacillus flavithermus sp.nov. and production of thermostable α-amylase under solid state fermentation (SSF). ANN. MICROBIOL., 62, 1367-1375.
11. SCRICHUWONG S., ORIKASA T„ MATSUKIJ., SHIINA T. KOBAYASHI T., TOKUYASU K., (2012) Sweet potato having a low temperaturę-gelatinizing starch as a promising feedstock for bioelhanol production. BIOMASS AND BIOENERGY, 39, 120-127.
12. SONI K.S., GOYAL N„ GUPTA K.J., SONI R., (2012) Enhanced production of α-amylase from Bacillus subtilis subsp. spizizenii in solid state fermentation by response surface methodology and its evaluation in hydrolysis of raw potato starch. STARCH/STARKE, 64, 64-77.
13. SUJK.A M. UDEH K.O., JAMROZ J., (2006) α-Amylolysis of native com, potato, wheat and rice granules. ITAL. j. FOOD SC., 4, 18, 433-439.
14. TAWIL G., NIESON-VIKS0 A., SABATE-ROLLAND A., COLONNA P., BULEON A., (2012) Hydrolysis of concentrated raw starch: A new very efficient α-amylase from Anoxybacillus flavothermus. CARBOHYDR. POLY., 87, 46-52.
Zastrzeżenia patentowe
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi z wykorzystaniem α-amylazy znamienny tym, że jako enzym stosuje się α-amylazę pochodzącą od szczepu Bacillus amyloliquefaciens KU12, którą dodaje się w ilości od 0,012 do 0,1 U/mg natywnej skrobi do 1-40% roztworu natywnej skrobi i upłynnianie prowadzi się przy pH roztworu wynoszącym od 4,5 do 6,5, mieszając z szybkością ścinającą wynoszącą od 100 do 200 s-1 i w przedziale temperatur od 70°C do 90°C, przy czym powyżej temperatury 82°C, stosuje się dodatek jonów wapnia Ca2+.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperaturę procesu uzyskuje się w czasie nie dłuższym niż 2 minuty.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL425116A PL239536B1 (pl) | 2018-04-06 | 2018-04-06 | Sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL425116A PL239536B1 (pl) | 2018-04-06 | 2018-04-06 | Sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL425116A1 PL425116A1 (pl) | 2019-10-07 |
| PL239536B1 true PL239536B1 (pl) | 2021-12-13 |
Family
ID=68099335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL425116A PL239536B1 (pl) | 2018-04-06 | 2018-04-06 | Sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL239536B1 (pl) |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR19980702782A (ko) * | 1995-03-09 | 1998-08-05 | 혼 마가렛 에이. | 녹말 액화 방법 |
| US5652127A (en) * | 1995-06-02 | 1997-07-29 | Genencor International, Inc. | Method for liquefying starch |
| US7968318B2 (en) * | 2006-06-06 | 2011-06-28 | Genencor International, Inc. | Process for conversion of granular starch to ethanol |
| BRPI0820503A2 (pt) * | 2007-11-05 | 2015-06-16 | Danisco Us Inc | Variantes da alfa amilase de bacillus licheniformis com termoestabilidade aumentada e/ou dependência de cálcio diminuída |
| WO2011080353A1 (en) * | 2010-01-04 | 2011-07-07 | Novozymes A/S | Stabilization of alpha-amylases towards calcium depletion and acidic ph |
| CA2861678C (en) * | 2011-10-11 | 2021-02-16 | Novozymes North America, Inc. | Processes for producing fermentation products |
| RU2705243C2 (ru) * | 2013-04-10 | 2019-11-06 | Новозимс А/С | Способ получения сахаров и сиропов |
-
2018
- 2018-04-06 PL PL425116A patent/PL239536B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL425116A1 (pl) | 2019-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0171218B1 (en) | Enzymatic hydrolysis of granular starch directly to glucose | |
| Norouzian et al. | Fungal glucoamylases | |
| Crabb et al. | Commodity scale production of sugars from starches | |
| Satyanarayana et al. | Development of an ideal starch saccharification process using amylolytic enzymes from thermophiles | |
| Suriya et al. | Marine microbial amylases: properties and applications | |
| Ominyi Matthias | Optimization of α-amylase and glucoamylase production from three fungal strains isolated from Abakaliki, Ebonyi State | |
| RU2008152789A (ru) | Способ преобразования гранулированного крахмала в этанол | |
| Sindhu et al. | α-Amylases | |
| John | Amylases-bioprocess and potential applications: a review | |
| Tonkova | Microbial starch converting enzymes of the α-amylase family | |
| Moradi et al. | Screening and isolation of powerful amylolytic bacterial strains | |
| Martgrita et al. | Amylase production by Rhizopus oryzae using solid state fermentation with cassava solid waste as substrate | |
| PL239536B1 (pl) | Sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi | |
| Onofre et al. | Characterization of [alpha]-amylase produced by the endophytic strain of Penicillium digitatum in solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SMF) | |
| Eshra et al. | Performance of starch hydrolysis and production of corn syrup using some commercial enzymes. | |
| CN108699544B (zh) | α淀粉酶变体及其应用 | |
| Lal et al. | Optimization of carbon sources for the amylase production and growth of Bacillus licheniformis JAR-26 under submerged fermentation | |
| US20060160189A1 (en) | High-temperature enzyme starch-to-sugar conversion | |
| Bal et al. | Immobilization of α-amylase from Bacillus subtilis SDP1 isolated from the Rhizosphere of Acacia cyanophlla Lindey | |
| Zafar et al. | Purification and characterization of a novel pullulanase enzyme from Bacillus thuringiensis for detergent industry | |
| Lorenci Woiciechowski et al. | Enzymatic hydrolysis of feedstocks for 1G bioethanol production | |
| Doss et al. | Purification and characterization of extracellular amylolytic enzyme from Aspergillus species | |
| Butler et al. | Starch-acting enzymes | |
| Marwati et al. | The effect of alpha amylase enzyme on quality of sweet sorghum juice for chrystal sugar | |
| Yasmin et al. | Solid state fermentation: a cost effective approach for production of starch liquefying fungal amylase using agro industrial wastes |