PL239601B1 - Mikrosystem przepływowy do trójwymiarowej hodowli komórek - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest mikrosystem przepływowy typu Lab-on-a-chip do przestrzennej hodowli komórek. Tego typu mikrosystemy znajdują zastosowanie głównie w bioanalityce i są wykorzystywane jako narzędzia analityczne w badaniach przedklinicznych nad nowymi lekami i procedurami terapeutycznymi.

Badania przesiewowe nowych leków oraz badania in vitro nad skutecznością nowych procedur terapeutycznych przeprowadzane są zazwyczaj z wykorzystaniem standardowych metod hodowli komórkowej i klasycznych testów toksyczności. Związane jest to z pewnymi ograniczeniami. Tradycyjne hodowle komórkowe in vitro, opierają się na wzroście komórek w monowarstwie (2D), przez co nie odzwierciedlają w pełni warunków panujących w środowisku in vivo. Ponadto, w organizmach żywych komórki otoczone są skomplikowaną siecią włókien białkowych, zwaną macierzą zewnątrzkomórkową ECM (ang. Extracellular Matrix), która zespala komórki ze sobą, umożliwiając im tworzenie trójwymiarowych struktur. Istnieje zatem potrzeba opracowania nowych modeli doświadczalnych in vitro, które lepiej odzwierciedlają środowisko komórek wzrastających in vivo, niż standardowe modele dwuwymiarowe. Odpowiedzią na te potrzeby może być zastosowanie mikrosystemów przepływowych. Badania z wykorzystaniem tradycyjnych metod hodowli wymagają także zużycia dużej ilości drogich odczynników. Mikrosystemy typu Lab-on-a-chip pełnią funkcję zintegrowanego mikrolaboratorium, umożliwiającego przeprowadzenie kompleksowej analizy próbek o objętościach rzędu kilkuset mikrolitrów, co znacznie obniża koszty analizy.

W stanie techniki znane są rozwiązania z wykorzystaniem mikrostruktur.

W dokumencie WO2014008358 ujawniono trójwymiarową porowatą membranę wytwarzaną z warstwy materiału fotolitograficznego formowaną w urządzeniu mikroprzepływowym. Do usieciowania warstwy materiału fotorezystu dochodzi wskutek działania promieniowania i w ten sposób tworzy się porowata membrana, przy czym fotorezystem jest SU-8. Dokument ujawnia także urządzenie mikroprzepływowe zawierające mikroporowatą membranę otrzymaną sposobem jak opisano powyżej.

Rozwiązania zaprezentowane w wynalazku WO2014008358 nie umożliwiają prowadzenia trójwymiarowej hodowli komórkowej, gdyż zasadniczą funkcją membrany tu opisanej jest naśladowanie tkanki barierowej w ludzkim ciele, a nie funkcja rusztowania dla komórek. Dodatkowo, membrana przedstawiona w tym wynalazku jest trwale i szczelnie mocowana wewnątrz systemu lub formowana in situ. Takie rozwiązanie uniemożliwia dokonywanie analiz komórek poza systemem.

W dokumencie US8101037 ujawniono sposób formowania kapilar w podłożu do urządzenia mikroprzepływowego, gdzie mikrokanaliki są nadrukowywane, formowane, wytrawiane lub w inny sposób formowane w podłożu z odpowiedniego polimeru a następnie wypełniane cieczą, która po zestaleniu tworzy warstwę protektorową, którą usuwa się po uformowaniu kanalików. Według ujawnienia materiał polimerowy jednego lub obu substratu i pokrywy górnej zawiera tworzywo termoplastyczne, którym jest materiał polimerowy zawierający polimetakrylan metylu) lub poliwęglan lub glikol poli(tereftalan etylenu); materiał protektorowy zawiera wosk parafinowy lub wosk sojowy. Rozwiązanie wg ujawnienia dotyczy zatem separacji cząstek, a nie mikrosystemu przepływowego przeznaczonego do hodowli komórek. Zarówno budowa, geometria, funkcje, zastosowanie jak i wykorzystane materiały są różne, niż te stosowane w mikrosystemach do prowadzenia hodowli komórkowych.

W dokumencie US2006263242 ujawniono mikrochip do analizy próbek ciekłych, charakteryzujący się tym, że ma strukturę pomiarową do odważania i pobierania zadanej ilości cieczy wzorcowej, przy czym strukturami pomiarowymi jest membrana z porowatego materiału zdolna do pomieszczenia danej ilości próbki cieczy. Mikrochip według ujawnienia ma wlot i wylot dla próbki, oraz element analityczny stosowany do wykrywania składnika testowego w próbce znajdujący się w środku kanału, zaś membrana z porowatego materiału absorbuje określoną ilość próbki cieczy w kontakcie z nadmierną ilością próbki cieczy. Rozwiązanie służy do analizy składników testowych zawartych w próbkach takich jak krew, płyn ustrojowy, mocz lub próbki płynne, a nie jest przeznaczony do hodowli komórek. Rozwiązanie wg ujawnienia nie dotyczy mikrosystemu przepływowego z membraną, gdyż mikrochip zawiera organiczny materiał porowaty, a nie membranę porowatą.

W dokumencie US2011253629 ujawniono urządzenie do oczyszczania, rozdzielania i syntezy płynów w mikroskali, w szczególności urządzeń posiadających membrany polimerowe do filtrowania płynów takich jak dializator. Dializator według ujawnienia składa się z półprzepuszczalnej membrany połączonej ze zbiorem mikrokanalików w formie trójkątnych słupków do dostarczania krwi i dializatu oraz wymiennika ciepła. Membrany wykorzystane w przedstawionym mikrosystemie nie mogłyby pełnić

PL 239 601 B1 funkcji podporowej dla komórek, ponieważ są membranami półprzepuszczalnymi. Taki rodzaj membrany nie może zostać wykorzystany do hodowli komórkowej.

Celem wynalazku jest zapewnienie mikrosystemu dedykowanego do hodowli komórek.

Mikrosystem według wynalazku stanowi hybrydowy układ składający się z dwóch hydrofobowych płytek polimerowych z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), który jest materiałem przezroczystym, przepuszczalnym dla gazów, nieprzepuszczalnym dla wody i biokompatybilnym, oraz znajdującej się między nimi porowatej membrany polimerowej, korzystnie wykonanej z poli(tereftalanu etylenu) (PET). Wszystkie elementy układu są ze sobą trwale połączone za pomocą plazmy tlenowej. Górna płytka i dolna płytka z PDMS wyposażone są w analogiczne mikrostruktury przy czym mikrostruktury obrócone są wobec siebie o 180° w poziomie. Każda z mikrostruktur składa się z sześciu podłużnych mikrokomór połączonych siecią symetrycznych, sinusoidalnych mikrokanałów z dwoma kanałami doprowadzającymi i jednym kanałem odprowadzającym. Proces łączenia płytek polimerowych wyposażonych w symetryczne mikrostruktury odbywa się w ten sposób, że wzór mikrostruktury znajdujący się na jednej z płytek ułożony jest naprzemianlegle w stosunku do wzoru mikrostruktury znajdującego się na drugiej płytce. W wyniku takiego łączenia symetryczne mikrostruktury na obu płytkach nakładają się tylko częściowo. Miejsca nałożenia mikrostruktur z obu płytek stanowią miejsca analizy komórek wprowadzanych do układu. Otwory wlotowe połączone z mikrokanałami doprowadzającymi i otwory wylotowe, połączone z mikrokanałami odprowadzającymi zawiesiny komórkowe, medium hodowlane, reagenty oraz produkty przemiany materii wywiercone są tylko w górnej płytce polimerowej, co ułatwia obserwacje mikroskopowe komórek hodowanych w mikrosystemie za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego lub fluorescencyjnego.

Korzystnie wszystkie mikrostruktury: mikrokanały oraz mikrokomory mają wysokość 50 μm.

Korzystnie porowata membrana PET jest okrągłego kształtu, o średnicy 25 mm, wyposażona w pory o średnicy 0.4 μm, rozmieszczone na membranie z gęstością 2 x 106 cm^-2.

Mikrosystem według wynalazku charakteryzuje się tym, że w prosty sposób umożliwia wytworzenie zaawansowanej trójwymiarowej hodowli komórek różnych linii komórkowych, dzięki wykorzystaniu dodatkowego elementu konstrukcyjnego w postaci porowatej membrany polimerowej. Hodowla komórek w tym mikrosystemie daje możliwość wykorzystania wynalazku jako narzędzia do szybkiej wstępnej oceny skuteczności nowych leków oraz procedur terapeutycznych w warunkach in vitro, które lepiej odzwierciedlają warunki in vivo niż standardowe techniki hodowli komórkowej.

Mikrosystem według wynalazku został zaprojektowany w taki sposób, że umożliwia jednoczesną hodowlę dwóch adherentnych linii komórkowych po dwóch różnych stronach porowatej membrany polimerowej. W żadnym z opisywanych w stanie techniki rozwiązań nie jest możliwym prowadzenie takiej hodowli. Zgodnie z wynalazkiem, w pierwszym etapie komórki pierwszej linii wprowadzane są dwoma kanałami doprowadzającymi do przestrzeni znajdujących się nad membraną polimerową. Po 24 godzinach od wprowadzenia komórki ulegają adhezji do membrany. Po tym czasie komórki drugiej linii komórkowej wprowadzane są dwoma innymi kanałami doprowadzającymi, znajdującymi się po przeciwnej stronie układu. Po wprowadzeniu komórek mikrosystem jest odwracany o 180° i utrzymywany w ten sposób przez kolejne 24 godziny (do momentu adhezji komórek drugiej linii komórkowej do drugiej strony membrany). Mikrosystem daje także możliwość hodowli tej samej linii komórkowej po dwóch różnych stronach membrany.

Mikrosystem według wynalazku daje możliwość tworzenia trójwymiarowej (3D) hodowli komórkowej. Struktura przestrzenna otrzymywana jest dzięki nałożeniu dwóch monowarstw komórkowych rosnących po dwóch różnych stronach membrany, które pozostają ze sobą w bezpośrednim kontakcie dzięki obecności porów w membranie. Porowatość membrany umożliwia tworzenie się połączeń międzykomórkowych występujących naturalnie w strukturach tkankowych, tworzenie wspólnej dla obu hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej oraz zachowanie aktywności szlaków sygnałowych komórka-komórka i komórkaECM charakterystycznych dla przestrzennych struktur komórkowych. Mikrosystem według wynalazku został zaprojektowany w celu tworzenie modelu komórkowego użytecznego w analizie skuteczności kombinacji różnych procedur terapii przeciwnowotworowych oraz do analizy migracji komórkowej.

Mikrosystem według wynalazku został zilustrowany w przykładzie wykonania na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia schemat mikrostruktury układu w widoku z góry, Fig. 2 przedstawia przekrój poprzeczny mikrokomór hodowlanych i membrany porowatej wzdłuż linii A-A, Fig. 3 przedstawia warstwy mikrosystemu, a Fig. 4 przedstawia mikroukład w rzucie ukośnym.

Mikrosystem według wynalazku wykonano z górnej płytki polimerowej 1 wykonanej z PDMS, porowatej membrany PET 2 oraz z górnej płytki polimerowej 3 wykonanej z PDMS. Górna płytka 1 i dolna

PL 239 601 B1 płytka 3 z PDMS wyposażone są w analogiczne mikrostruktury przy czym mikrostruktury obrócone są wobec siebie o 180° w poziomie. Każda z mikrostruktur składa się z sześciu podłużnych mikrokomór 4 połączonych siecią symetrycznych, sinusoidalnych mikrokanałów z dwoma kanałami doprowadzającymi 5 i jednym kanałem odprowadzającym 6. W górnej płytce polimerowej 1 znajdują się otwory doprowadzające 7 i otwory odprowadzające 8 do odprowadzania zawiesin komórkowych, mediów hodowlanych oraz reagentów. Wszystkie mikrostruktury: mikrokanały oraz mikrokomory mają wysokość 50 μm. Porowata membrana PET jest okrągłego kształtu, o średnicy 25 mm, wyposażona w pory o średnicy 0.4 μm, rozmieszczone na membranie z gęstością 2 x 10⁶ cm^-2.

W pierwszym etapie geometrię mikrosystemu zaprojektowano w programie AutoCAD, a następnie wzór odzwierciedlający geometrię naświetlono na foli, w wysokiej rozdzielczości 3600 dpi, tworząc maskę. Maskę wykorzystano do wytworzenia pieczątki, czyli wypukłej mikrostruktury ze światłoczułego materiału, korzystnie filmu kapilarnego, za pomocą metody fotolitografii. Metoda fotolitografii polega na naświetleniu i utwardzeniu filmu kapilarnego światłem UV w wybranych miejscach oraz odmyciu filmu kapilarnego z miejsc nienaświetlonych. W kolejnym etapie na pieczątkę z wypukłą strukturą, umieszczoną w formie, wylano płynny PDMS, czyli odgazowaną mieszaninę prepolimeru i czynnika sieciującego w stosunku 10 : 1, a następnie PDMS sieciowano w temperaturze 70°C przez 90 minut. Usieciowaną górną płytkę polimerową 1 zamrożono w ciekłym azocie, a następnie wywiercono otwory 7 doprowadzające i otwory odprowadzające 8 zawiesiny komórkowe, medium hodowlane oraz reagenty. Obie płytki polimerowe 1 i 3 oraz membranę polimerową 2 połączono ze sobą za pomocą plazmy tlenowej, tak, aby membrana PET znajdowała się miedzy płytkami z PDMS, dokładnie w miejscu nakładania się mikrokomór hodowlanych 4. W wykonanych otworach umieszczono wężyki. W procesie łączenia elementów mikrosystemu naprzemianlegle ułożone mikrostruktury utworzyły nienakładające się sieci mikrokanałów doprowadzających 5 i odprowadzających 6.

Mikrosystem według wynalazku został wykorzystany do hodowli komórek prawidłowych i nowotworowych jajnika w ułożeniu przestrzennym. Do wysterylizowanego mikroukładu wprowadzono medium hodowlane. Następnie, przez kanały doprowadzające do przestrzeni mikrokomór hodowlanych znajdujących się nad membraną wprowadzono zawiesinę prawidłowych komórek jajnika o gęstości około 105 komórek mL-¹. Mikrosystem z komórkami inkubowano przez 24 h w inkubatorze (T = 37°C, CO2 = 5%) do momentu, kiedy komórki uległy adhezji do membrany. Po 24 h do przestrzeni mikrokomór znajdujących się pod membraną wprowadzono zawiesinę komórek nowotworowych jajnika o gęstości około 105 komórek mL^-1. Mikrosystem odwrócono o 180° i inkubowano w inkubatorze (T = 37°C, C02 = 5%) przez kolejne 24 h, do momentu adhezji komórek nowotworowych do drugiej strony membrany. Tak otrzymaną hodowlę przestrzenną monitorowano za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, a następnie wykorzystano do przeprowadzenia procedury chemioterapii. Do hodowanych komórek wprowadzano roztwory doksorubicyny w różnych stężeniach, zawiązek inkubowano z komórkami 24 h, a następnie oceniano niezależnie żywotność komórek prawidłowych i nowotworowych, wykorzystując różnicowe barwienie komórek barwnikami fluorescencyjnymi: kaleceiną-AM i jodkiem propidyny.

Zastrzeżenia patentowe

Claims (3)

Zastrzeżenia patentowe

1. Mikrosystem przepływowy do trójwymiarowej hodowli komórek, zawierający dwie płytki polimerowe z poli(dimetylosiloksanu), zaopatrzone w sieć mikrokanałów, komory hodowlane oraz otwory wlotowe i wylotowe, znamienny tym, że pomiędzy płytką górną (1) a płytką dolną (2) znajduje się porowata membrana polimerowa a górna płytka (1) i dolna płytka (3) wyposażone są w analogiczne mikrostruktury, przy czym mikrostruktury obrócone są wobec siebie o 180° w poziomie i każda z mikrostruktur składa się z sześciu podłużnych mikrokomór (4) połączonych siecią symetrycznych, sinusoidalnych mikrokanałów z dwoma kanałami doprowadzającymi (5) i jednym kanałem odprowadzającym (6), a ponadto otwory doprowadzające (7) i otwory odprowadzające (8) znajdują się w górnej płytce polimerowej (1), przy czym porowata membrana polimerowa (2) ma kształt okrągły i śred nicę 25 mm oraz wykonana jest z poli(tereftalanu etylenu).

2. Mikrosystem według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie mikrokanały oraz mikrokomory mają wysokość 50 μm.

3. Mikrosystem według zastrz. 1, znamienny tym, że pory w membranie (2) mają średnicę 0.4 μm i gęstość 2 x 10⁶ cm^-2.