PL240086B1 - Sole estrów arylowych N-podstawionych kwasów akrydynylo- 9-karboksylowych, sposób ich otrzymywania oraz odczynnik immunochemiczny do oznaczeń chemiluminescencyjnych - Google Patents
Sole estrów arylowych N-podstawionych kwasów akrydynylo- 9-karboksylowych, sposób ich otrzymywania oraz odczynnik immunochemiczny do oznaczeń chemiluminescencyjnych Download PDFInfo
- Publication number
- PL240086B1 PL240086B1 PL416813A PL41681316A PL240086B1 PL 240086 B1 PL240086 B1 PL 240086B1 PL 416813 A PL416813 A PL 416813A PL 41681316 A PL41681316 A PL 41681316A PL 240086 B1 PL240086 B1 PL 240086B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- fmoc
- general formula
- amino acid
- resin
- substituted
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 50
- 150000007860 aryl ester derivatives Chemical class 0.000 title claims description 10
- -1 Aryl ester salts Chemical class 0.000 title description 12
- XQZQGXKLCXJLKB-UHFFFAOYSA-N 9,10-dihydroacridine-9-carboxylic acid Chemical class C1=CC=C2C(C(=O)O)C3=CC=CC=C3NC2=C1 XQZQGXKLCXJLKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 53
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims description 46
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 41
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 31
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 27
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 17
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 7
- WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M cetyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 7
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 5
- ZDWSNKPLZUXBPE-UHFFFAOYSA-N 3,5-ditert-butylphenol Chemical compound CC(C)(C)C1=CC(O)=CC(C(C)(C)C)=C1 ZDWSNKPLZUXBPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 229920000361 Poly(styrene)-block-poly(ethylene glycol) Polymers 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- VIHYIVKEECZGOU-UHFFFAOYSA-N N-acetylimidazole Chemical compound CC(=O)N1C=CN=C1 VIHYIVKEECZGOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ISAVYTVYFVQUDY-UHFFFAOYSA-N 4-tert-Octylphenol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 ISAVYTVYFVQUDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 claims description 2
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 claims 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims 2
- SWERXLPCHOPGCH-UHFFFAOYSA-N 1-aminopropane-1-sulfonic acid;sodium Chemical compound [Na].CCC(N)S(O)(=O)=O SWERXLPCHOPGCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001576 beta-amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 claims 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 claims 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 16
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 14
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 9
- HFKOCIWEYMAENQ-YTTGMZPUSA-N (2s)-2,5-bis(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(=O)O)CCCNC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 HFKOCIWEYMAENQ-YTTGMZPUSA-N 0.000 description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 8
- ACUIFAAXWDLLTR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCCCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 ACUIFAAXWDLLTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 7
- NFDRKKHKYOEOLR-UHFFFAOYSA-M [4-[3-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-3-oxopropyl]phenyl] 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate;trifluoromethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC(C=C1)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O NFDRKKHKYOEOLR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M triflate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-FIBGUPNXSA-N acetonitrile-d3 Chemical compound [2H]C([2H])([2H])C#N WEVYAHXRMPXWCK-FIBGUPNXSA-N 0.000 description 6
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 5
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 5
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 5
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,6,7,8,9,10-octahydropyrimido[1,2-a]azepine Chemical compound C1CCCCN2CCCN=C21 GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical class [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 3
- WMSUFWLPZLCIHP-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 9h-fluoren-9-ylmethyl carbonate Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)ON1C(=O)CCC1=O WMSUFWLPZLCIHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SFYDWLYPIXHPML-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1-(2,4,6-trimethylphenyl)sulfonyl-1,2,4-triazole Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)N1N=C([N+]([O-])=O)N=C1 SFYDWLYPIXHPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 2
- ZYASLTYCYTYKFC-UHFFFAOYSA-N 9-methylidenefluorene Chemical compound C1=CC=C2C(=C)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZYASLTYCYTYKFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- VUZCWTUAXNDZSX-UHFFFAOYSA-N acridin-2-ol Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC(O)=CC=C3N=C21 VUZCWTUAXNDZSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- SRVFFFJZQVENJC-IHRRRGAJSA-N aloxistatin Chemical compound CCOC(=O)[C@H]1O[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCCC(C)C SRVFFFJZQVENJC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000005708 carbonyloxy group Chemical group [*:2]OC([*:1])=O 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229920002601 oligoester Polymers 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HBENZIXOGRCSQN-VQWWACLZSA-N (1S,2S,6R,14R,15R,16R)-5-(cyclopropylmethyl)-16-[(2S)-2-hydroxy-3,3-dimethylpentan-2-yl]-15-methoxy-13-oxa-5-azahexacyclo[13.2.2.12,8.01,6.02,14.012,20]icosa-8(20),9,11-trien-11-ol Chemical compound N1([C@@H]2CC=3C4=C(C(=CC=3)O)O[C@H]3[C@@]5(OC)CC[C@@]2([C@@]43CC1)C[C@@H]5[C@](C)(O)C(C)(C)CC)CC1CC1 HBENZIXOGRCSQN-VQWWACLZSA-N 0.000 description 1
- FANCTJAFZSYTIS-IQUVVAJASA-N (1r,3s,5z)-5-[(2e)-2-[(1r,3as,7ar)-7a-methyl-1-[(2r)-4-(phenylsulfonimidoyl)butan-2-yl]-2,3,3a,5,6,7-hexahydro-1h-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylidenecyclohexane-1,3-diol Chemical compound C([C@@H](C)[C@@H]1[C@]2(CCCC(/[C@@H]2CC1)=C\C=C\1C([C@@H](O)C[C@H](O)C/1)=C)C)CS(=N)(=O)C1=CC=CC=C1 FANCTJAFZSYTIS-IQUVVAJASA-N 0.000 description 1
- QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[5-[(3aS,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[1-bis(4-chlorophenoxy)phosphorylbutylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)C(C)C)P(=O)(Oc1ccc(Cl)cc1)Oc1ccc(Cl)cc1 QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWKQJZCTQGMHKD-UHFFFAOYSA-N 2,6-di-tert-butylpyridine Chemical compound CC(C)(C)C1=CC=CC(C(C)(C)C)=N1 UWKQJZCTQGMHKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLIDCXVFHGNTTM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxyphenol Chemical group COC1=CC=CC(OC)=C1O KLIDCXVFHGNTTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRHQDJDRGZFIPO-UHFFFAOYSA-N 4-bromobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCBr GRHQDJDRGZFIPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXWAMZVDSMINML-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O.[Na] Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O.[Na] WXWAMZVDSMINML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038239 Protein Churchill Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- OOGYVVYCCYJADG-UHFFFAOYSA-N acridine-1-carboxylic acid Chemical class C1=CC=C2C=C3C(C(=O)O)=CC=CC3=NC2=C1 OOGYVVYCCYJADG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KUKONHWWHFEDCS-UHFFFAOYSA-N acridine-9-carbonyl chloride;hydrochloride Chemical class Cl.C1=CC=C2C(C(=O)Cl)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 KUKONHWWHFEDCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940027998 antiseptic and disinfectant acridine derivative Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N benzyl chloride Chemical compound ClCC1=CC=CC=C1 KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940073608 benzyl chloride Drugs 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000004106 butoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- CREMABGTGYGIQB-UHFFFAOYSA-N carbon carbon Chemical compound C.C CREMABGTGYGIQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 229920006026 co-polymeric resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 1
- HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N diisononyl phthalate Chemical group CC(C)CCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCCCCC(C)C HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000011984 electrochemiluminescence immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005678 ethenylene group Chemical group [H]C([*:1])=C([H])[*:2] 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- OIRDBPQYVWXNSJ-UHFFFAOYSA-N methyl trifluoromethansulfonate Chemical compound COS(=O)(=O)C(F)(F)F OIRDBPQYVWXNSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005220 pharmaceutical analysis Methods 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical group C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000002572 propoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000005258 radioactive decay Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Pyridine Compounds (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sole estrów arylowych N-podstawionych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych, sposób otrzymywania tych związków, odczynnik immunochemiczny do oznaczeń luminescencyjnych zawierający emiter chemiluminogenny. Związki opisane w wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce medycznej do oznaczeń immunochemicznych, gdzie jako metodę detekcji stosuje się pomiar emisji promieniowania w formie chemiluminescencji (Schulman SG, Schulman J, Rakicioglu Y (2001), Chemiluminescence in Analytical Chemistry, Garcia-Campana AM, Bayenes WRG, Marcel Dekker, New York-Basel).
Immunodiagnostyka medyczna, wykorzystująca zjawisko chemiluminescencji w oznaczeniach typu antygen-przeciwciało (ang. Chemiluminescent Immunoassays, CLIA; Enzymatic Chemiluminescent Immunoassays, ECLIA) jest dynamicznie rozwijającą się dziedziną analityki (Van Dyke Ch, Van Dyke K, Woodfork eds. 2002, Luminescence Biotechnology Instruments and Applications , CRC Press, Boca Raton, London-New York-Washington D.C.). Metody luminescencyjne stanowią dziś atrakcyjną alternatywę w stosunku do typowych metodologii, wykorzystujących absorpcję promieniowania (kolorymetrycznych), na przykład testach typu ELISA - z uwagi na bardzo wysoką czułość, niewielką ilość koniecznych odczynników, prostotę wykonania i względnie niski koszt (Roda A, Guardigli M, Michelini E, Mirasoli M, Pasini P(2003) Anal. Chem. 462-470). Wykrywalność analitu w femtomolowym zakresie stężeń (10-15 M) jest z łatwością dostępna w większości aplikacji, gdzie stosuje się detekcję chemiluminescencyjną (Roda A, Guardigli M, Michelini E, Mirasoli M, Pasini P (2003): Anal. Chem. 462-470). Żadna inna metoda chemiczna nie cechuje się tak wysoką czułością. Metody chemiluminescencyjne pozwalają też wyeliminować problemy związane ze stosowaniem radioaktywnych izotopów (specjalne laboratoria, składowanie odpadów, zanik promieniotwórczy i inne), zachowując podobnie wysoką czułość. W badaniach immunochemicznych z detekcją chemiluminescencyjną najczęściej wykorzystuje się związki organiczne będące pochodnymi luminolu. Znane jest również wykorzystanie w tym celu soli akrydyniowych (Weeks I, Beheshti I, McCapra F, Campbell AK, Woodhead JS (1983) Clin. Chem. 29: 1474-1479). Wśród znanych soli akrydyniowych zdolnych do chemiluminescencji (emiterów chemiluminescencji) znajdują się estry aromatyczne i sulfonamidy N-podstawionego kwasu akrydynylo-9-karboksylowego (Krzymiński K, Ożóg A, Malecha, P. Roshal AD, Wróblewska A, Zadykowicz B, Błażejowski J (2011): J. Org. Chem. 76: 1072-1085; Adamczyk M, Fino JR, Mattingly PG, Moore JA, Pan Y (2004) Bioorg. Med. Chem. Lett. 14: 2313-2317; Natrajan A, Sharpe D, Costello J, Jiang Q (2010) Anal. Biochem. 406: 204-213). Pochodne akrydyny, stosowane jako znaczniki lub indykatory chemiluminescencyjne wykazują szereg zalet w porównaniu z pochodnymi luminolu - cechują się zazwyczaj wyższą wydajnością, korzystną dynamiką emisji typu błyskowego, dobrym zachowaniem zdolności emisyjnej w układach biologicznych oraz brakiem wymogu użycia katalizatora do wywołania chemiluminescencji, co obniża stosunek sygnału do szumu (Zomer B, Stavenuiter JFC, Van den Berg RH, Jansen EHJM (1991) Pract. Spectrosc. 12: 505-521). Względna łatwość modyfikacji chemicznej powyżej wspomnianych związków oraz prostota metod immunochemicznych zdecydowały o dynamicznym rozwoju metod analitycznych z ich udziałem (Browne K, Deheyn DD, El-Hiti GA, Smith K, Weeks I (2011) J. Am. Chem. Soc. 133: 14637-14648; Van Dyke K, Van Dyke Woodfork K, (2002) “Luminescence Biotechnology”, CRC Press, Boca Raton).
Zastosowania chemiluminogennych soli akrydyniowych obejmują szeroki obszar analityki medycznej i środowiskowej, gdzie wykorzystuje się je jako znaczniki luminescencyjne, w formie związanej z analitem biologicznym, jak również jako indykatory luminescencyjne, w stanie niezwiązanym, których zmiany spektralne dotyczące intensywności, względnie kinetyki emisji umożliwiają, po odpowiedniej kalibracji układu, określenie stężenia analitu w układzie. Znane są sposoby wykrywania ilości analitów biologicznych z udziałem chemiluminogennych soli akrydyniowych na poziomie attomoli lub niżs zym. Estry akrydyniowe/akrydanowe były już stosowane wielu tego typu oznaczeniach biomedycznych, między innymi ludzkiej α-fetoproteiny, gonadotropiny, hormonów TSH, wirusów, DNA, nadtlenku wodoru, dioksygeniny i wielu innych (Garcia-Campana AM, Bayenes WRG Ed. (2001) Chemiluminescence in Analytical Chemistry, Marcel Dekker; Krićka LJ (2003) Anal. Chim. Acta 500: 279-286). W badaniach immunochemicznych z udziałem chemiluminogennych soli akrydyniowych jako emiterów chemiluminescencji stosuje się dwa typy połączeń. Z jednej strony są to znaczniki, w których elektronowo wzbudzony produkt odrywa się od analitu w procesie utleniania, emitując promieniowanie z zakresu widzialnego, co wykorzystuje się najczęściej w oznaczeniach immunochemicznych typu antygen-przeciwciało. Z drugiej strony stosuje się znaczniki, w których wzbudzony elektronowo produkt pozostaje przyłączony do
PL 240 086 Β1 analitu po wywołaniu emisji promieniowania. Związki z ostatniej grupy są stosowane, przykładowo, w testach hybrydyzacyjnych kwasów nukleinowych typu HPA (ang. Hybridisation Protection Assays) (Brown RC, Li Z, Rutter AJ, Mu X, Weeks OH, Smith K, Weeks I (2009) Org. Biomol. Chem. 7: 386394). Oba typy układów molekularnych różnią się budową, przy czym modyfikacja chemiczna połączeń z pierwszej grupy jest utrudniona - ze względu na skumulowanie elementów strukturalnych znacznika decydujących o jego przydatności w jednym fragmencie cząsteczki, choć są one zwykle prostsze do otrzymania z punktu widzenia syntezy chemicznej. Niekorzystną cechą znanych związków chemilumingennych na bazie estrów akrydyniowych jest ich podatność na ciemne reakcje uboczne - to jest hydrolizę oraz tworzenie tak zwanych pseudo-zasad w środowisku alkaicznym (Krzymiński K, Roshal AD, Zadykowicz B, Białk-Bielińska A, Sieradzan A. (2010): J. Phys. Chem. >4 114: 10550-10562; Krzymiński K, Ożóg A, Malecha P, Roshal AD, Wróblewska A, Zadykowicz B, Błażejowski J (2011) J. Org. Chem. 7Q: 1072-1085), która stanowi utrudnienie w zastosowaniach praktycznych tego typu połączeń. Wciąż poszukuje się rozwiązań, umożliwiających poprawę własności emisyjnych układów chemiluminogennych korzystnych w analityce - to jest możliwie wysokiej intensywności emisji i kinetyki typu błyskowego i jednocześnie dobrej stabilności w roztworach wodnych.
Przedmiotem wynalazku są sole estrów arylowych podstawionych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 3 zawierające szkielet oligomeru aminokwasowego:
X = CH2-CH2, CH=CH, C=C
R2, R7 = H, CH3, F, Cl, Br, I, OCH3,O(CH2CH2O)nCH3 gdzie n = 1-6 dowolnej kombinacji
R2’, Re’ = H, CH3, F, Cl, Br, I, OCH3 w dowolnej kombinacji
A- = CF3SO3-, FSO3-, I-.
n = 1-8
R2 = H,CH3, F, Cl, Br, I
R2’ - Re’ = H, CH3, F, Cl, Br, I w dowolnej kombinacji A- = CF3SO3-, FSO3-, l·
Sposób otrzymywania soli estrów arylowych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 3 pokazanym wyżej, charakteryzuje się według wynalazku tym, że do rozgałęzionego oligomeru aminokwasowego otrzymanego z diaminokwasów, korzystnie z ornityny lub lizyny oraz ro-aminokwasu, korzystnie kwasu ^aminomasłowego przyłącza się co najmniej dwie cząsteczki związku o wzorze ogólnym 1, określonego w zastrz. 1 lub związku o wzorze ogólnym 2, w ten sposób, że na nośniku
PL 240 086 B1 stałym, stosowanym w syntezie zgodnie ze strategią osłon fluorenylo-9-metoksykarbonylowych Fmoc, dającą wolny kwas po odszczepieniu od nośnika, którym korzystnie jest żywica typu polistyren-glikol polietylenowy PS-PEG z kotwiczką alkoholu p-alkoksybenzylowego lub żywica tritylowej lub żywica 2-chlorotritylowej lub żywica Wanga, osadza się, korzystnie w stopniu 0,1 milirównoważnika aminokwasu na gram żywicy, kwas c-aminokwas chroniony na N-końcu osłoną Fmoc otrzymany według znanych metod. Następnie nadmiar grup hydroksylowych nośnika blokuje się przez acetylowanie według znanych metod, korzystnie za pomocą N-acetyloimidazolu, a następnie usuwa się osłonę grupy aminowej Fmoc z c-aminokwasu przyłączonego do żywicy za pomocą znanych metod. Sprzęga się wolną grupę aminową w c-aminokwasie za pomocą N, N’-chronionego diaminokwasu według znanych metod, korzystnie za pomocą di(fluorenylo-9-metoksykarbonylo)-ornityny Fmoc-Orn-(Fmoc) lub di(fluorenylo9-metoksykarbonylo)-lizyny Fmoc-Lys-(Fmoc), a następnie usuwa się z przyłączonych aminokwasów osłony typu Fmoc według znanych metod. Otrzymany na nośniku stałym produkt ponownie acyluje się jak wyżej za pomocą kolejnej porcji N,N’-chronionego diaminokwasu Fmoc-Orn(Fmoc) lub FmocLys(Fmoc), a następnie usuwa się osłonę Fmoc z grup aminowych powyższego diaminokwasu według znanych metod. Odszczepia się otrzymany oligomer aminokwasowy z żywicy znaną metodą odpowiednią do zastosowanego nośnika stałego, a następnie wytrąca się wolny oligomer aminokwasowy eterem dietylowym i liofilizuje go, po czym sprzęga się wolne grupy aminowe w oligomerze aminokwasowym z solą estrów arylowych podstawionych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 1, określoną w zastrz. 1 lub solą estrów arylowych podstawionych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 2 określoną w zastrz. 2. Oczyszcza się otrzymany produkt końcowy o wzorze ogólnym 3, korzystnie za pomocą chromatografii cieczowej typu HPLC w odwróconych fazach, stosując jako fazę ruchomą mieszaninę acetonitrylu w wodzie w obecności 0,05-0,20% kwasu trifluorooctowego.
Odczynnik immunochemiczny do oznaczeń chemiluminescencyjnych zawierający emiter chemiluminogenny, charakteryzuje się według wynalazku tym, że emiterem są sole N-podstawionych estrów arylowych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 3, który to emiter jest sprzężony jest z dowolnym białkiem zdolnym do reakcji immunochemicznej z antygenem i korzystnie zawiera 1012-krotny nadmiar molowy emitera nad białkiem i który korzystnie można wyizolować się za pomocą techniki filtracji molekularnej i liofilizacji, i których emisję wywołuje się za pomocą znanych odczynników, korzystnie w obecności substancji powierzchniowo czynnych takich jak Triton Χ-100 lub Triton X-705 lub N-dodecylo-N, N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonian sodowy lub chlorek heksadecylotrimetyloamoniowy. Wcześniej wymienione Tritony to etery polimeru glikolu polietylenowego (PEG) i p-t-oktylofenolu C14H22O(C2H4O)n gdzie ilość podjednostek glikolu polietylenowego n = 9-10 lub 55.
Związki według wynalazku umożliwiają uzyskanie korzystnych wyników analitycznych w stosunku do stanu techniki pod względem wydajności emisji - czułości metody oraz zakresu i prostoty ich stosowania. Indykatory chemiluminescencyjne według wynalazku zawierają nowe rozwiązania strukturalne, poprawiające w odpowiednim środowisku ich parametry fizykochemiczne w immunochemicznych oznaczeniach biomedycznych. Do cech tych należy wiązanie wielokrotne typu węgiel-węgiel w bezpośrednim sąsiedztwie ugrupowania estru aromatycznego, korzystnie ułatwiające transfer energii reakcj i na powstający produkt, ulegający wzbudzeniu elektronowemu i będący docelowym emiterem. Z drugiej strony rozdzielone przestrzennie grupy atomów odpowiedzialne za emisję promieniowania od grupy atomów odpowiedzialnych za łączenie znacznika CL z analitem pozwalają na niezależną i bardziej wszechstronną modyfikację chemiczną obu wspomnianych fragmentów. Odpowiednia kombinacja podstawników w cząsteczkach emiterów chemiluminogennych korzystnie zmniejsza szumy pomiarowe (poziom tła) oraz poprawia dynamikę emisji i/lub trwałość odczynników immunochemicznych z ich udziałem. Przyłączenie kilku cząsteczek chemiluminogennych soli akrydyniowych do odpowiednio zaprojektowanych oligomerów aminokwasowych według wynalazku umożliwia uzyskanie złożonego układu molekularnego, zawierającego kilka cząsteczek emitera chemiluminescencji, co winno poprawić jego zdolność emisyjną - a co za tym idzie - wykrywalność analitu (białka reporterowego). Sposób oznaczania ilości analitu według wynalazku umożliwia uzyskanie korzystnych parametrów analitycznych, to jest niższych limitów detekcji/oznaczalności (LOD/LOQ) i lepszej rozpoznawalności analitu białkowego (serospecyficzność). Dzięki wysokiej reaktywności odczynników immunochemicznych według wynalazku uzyskuje się ogólnie lepszą efektywność emisji, dynamiczną chemiluminescencję typu błyskowego oraz zadowalającą trwałość, co poszerza możliwości analityki biomedycznej. Dotyczy to w szczególności badań, gdzie podstawą oznaczenia są specyficzne reakcje typu antygen-przeciwciało w diagnostyce klinicznej, w tym immunoidentyfikacja specyficznych białek np. fuzyjnych, wykrywanie i monitorowanie
PL 240 086 Β1 czynników zakaźnych, badania kwasów nukleinowych. Sposoby określania ilości analitu według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w analizie farmaceutycznej i monitoringu środowiska-wszędzie tam, gdzie konwencjonalne metody bioanalizy wykazują niewystarczającą czułość.
Wynalazek przedstawiono we worze ogólnym 3, zaś związki pośrednie na wzorze ogólnym 1 i 2. Na schemacie 1 i 2 pokazano drogę syntezy związku o wzorze 1 i 2. Wynalazek pokazano w przykładach wykonania na rysunku, gdzie na fig. 1 przedstawiono przykładowe widmo typu 1H NMR (500 MHz, CD3CN, 300 K) zarejestrowane dla związku 1 b, fig. 2 przykładowe widmo masowe typu MALDI-TOF dla związku 2b, jon macierzysty M+ = 527,3, fig. 3 wzór strukturalny przykładowego znacznika akrydyniowego według wzoru ogólnego 3, opartego o rdzeń oligomeru aminokwasowego na bazie ornityny i kwasu γ-aminomasłowego (3a), zaś Acr oznacza w tym przypadku akrydyniowy emiter chemiluminescencji dostępny w handlu (CAS 177332-37-5), fig. 4A wysokorozdzielczą analizę masową typu MALDIQTOF dla oligoestru akrydyniowego 3a, sygnał główny (m/z = 479,6) odpowiada masie molekularnej czterokrotnie naładowanego kationu macierzystego pochodzącego od 3a (M+ = 1918,3276), fig. 4B jony fragmentacyjne emitera chemiluminescencji 3a (fig. 3) z uwidocznionym jonem macierzystym (m/z ~ 480) oraz jonami fragmentacyjnymi charakterystycznymi dla soli akrydyniowych (m/z ~ 193, AcrNCH3+), a fig. 5-12 są przykładami dodatkowymi o związkach pośrednich: fig. 5 porównanie intensywności emisji odczynników immunochemicznych w zależności od metody przyłączania emitera chemiluminescencji do białka anty-ludzkie IgG, 1b- emiter CL o wzorze ogólnym 1 (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = H, R2 = Re = OCH3), C - emiter CL dostępny w handlu (CAS 177332-375), Cay oznacza znaną metodologię sprzęgania emitera z białkiem (http://www.caymanchem.com/pdfs/200201.pdf), II—VI oznaczają warianty metody opisanej w przykładzie 5, różniące się proporcją molową pomiędzy emiterem CL (E) a znakowanym białkiem (B), zastosowaną podczas sprzęgania; II: E/B = 15; III: E/B = 11,3; IV: E/B = 22,6; V: E/B = 33,9; VI: E/B = 41,5, fig. 6 porównanie intensywności emisji integralnej (wartości znormalizowane) pochodzącej od odczynników immunochemicznych zawierających indykatory chemiluminescencyjne o wzorze ogólnym 4 (luminol - stan techniki; 4d: R2 = Br, R2’ = R7’ = F; 4e: R2 = Br, R2’ = R4 = ’R7’ = F; 4f: R2 = Br, R2’ = R7’ = Br), fig. 7 porównanie sumarycznej intensywności emisji przykładowych odczynników immunochemicznych według zastrzeżenia 1,2 w obecności lub przy braku obecności substancji powierzchniowo czynnych w układzie pomiarowym, fig. 8 porównanie stabilności w roztworze alkalicznym emiterów chemiluminescencji 2a i 2b względem pokrewnego produktu handlowego (CAS 177332-375), jednakowe ilości emiterów akrydyniowych inkubowano w temp. 298 K w buforze fosforanowym (pH = 8,0) i po określonym czasie badano pod kątem zachowanej zdolności do emisji promieniowania, fig 9 wykresy kalibracyjne (emisja integralna w jednostkach względnych (RLU) ι/s. stężenie analitu białkowego dla immunologicznej metody bezpośredniej z udziałem odczynników immunochemicznych zawierających emitery chemiluminescencji 1a, 1b, 1c otrzymane wg zastrzeżenia 1 i 2a, 2b wg zastrzeżenia 2, uzyskane zgodnie z opisem wg zastrzeżenia 12, C oznacza zawierającego handlowy emiter chemiluminescencji (CAS 177332-37-5) przygotowany i zastosowany wg załączonego opisu (http://www.caymanchem.com/pdfs/200201.pdf), fig. 10 reaktywność odczynników immunochemicznych (wykresy kalibracyjne) z udziałem emiterów chemiluminescencji 1a, 1b, 2a w oznaczeniach pośrednich z udziałem antygenów Toxoplasma gondii, opisanych w przykładzie 9, C oznacza kontrolny emiter chemiluminescencji (C: CAS 177332-37-5), dostępny w handlowych testach wykorzystujących sole akrydyniowe (http://www.caymanchem.com/pdfs/200201 .pdf). fig. 11 porównanie integralnej intensywności emisji odczynników immunochemicznych (c = 0,05 pg/ml) z udziałem emiterów chemiluminescencji 1a, 1b, 2a otrzymanych według przykładów 1,2 i 5 oraz emitera handlowego (C: CAS 17733237-5) w tych samych warunkach, badania serospecyficzności prowadzono w obecności (serum pozytywne) lub przy braku obecności (serum negatywne) specyficznych przeciwciał typu anty-7. gondii w surowicy pacjentów, fig. 12 porównanie intensywności integralnej emisji pochodzącej od odczynników immunochemicznych zawierających stałą ilość indykatora chemiluminescencyjnego (4f: wzór ogólny 4, R2 = Br, R2’ = R7’ = Br) w obecności białka znakowanego HRP, w testach bezpośrednich zastosowano substancje pomocnicze: wzmacniacze sygnału (SPITZ, DMAP) i środki powierzchniowo czynne (Triton Χ-100, Triton Χ-705, CTAC, DDAPS); luminol/PIP oznacza układ referencyjny (typowy), wszystkie pomiary wykonano w tych samych warunkach eksperymentalnych.
Przykład 1. Sposób otrzymywania soli triflatowych A/-podstawionych estrów arylowych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 1 - związek pośredni.
Poszczególne kroki syntezy (A=E) związków 1a (X = CH=CH, R2 = R7 = Re = H, R2' = OCH3), 1b, (X = CH=CH, R2 = R7 = H, R2' = Re' =OCH3j, 1c (X = CH=CH, R2 = R2' = OCH3, R7 = Re' = H) wraz z zaznaczeniem produktów pośrednich typu 5-9 przedstawiono na schemacie 1 i opisano poniżej.
PL 240 086 B1
Ogólna metoda otrzymywania estrów benzylowych kwasów karboksylowych 6 (droga A). Synteza związków 6a (schemat 1, X = CH=CH, R2' = OCH3, Re' = H), 6b (schemat 1, X = CH=CH, R2' = Re' = OCH3).
Do roztworu, zawierającego dostępną w handlu pochodną kwasu karboksylowego typu 5 (1 mmol) w 2 ml dimetyloformamidu (DMF) dodaje się 1 mmol węglanu potasowego (K2CO3), 1,1 mmol chlorku benzylu (C6H5-CH2-CI): i 0,1 mmol jodku potasu (K1). Zawartość miesza się w zamkniętym naczyniu przez 5-30 godzin w temperaturze pokojowej, po czym mieszaninę reakcyjną wprowadza się do nadmiaru zimnej wody. Produkt ekstrahuje się za pomocą dichlorometanu (CH2CI2), po czym warstwę organiczną należy przemyć wodą, osuszyć przez dodanie bezwodnego MgSO4 i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy ester benzylowy typu 6 oczyszcza się metodą szerokoporowatej chromatografii kolumnowej (ang. flash chromatography; faza stacjonarna: SO2, faza ruchoma; 1-5% izopropanol ((CH3)2CHOH) w chloroformie (CHCI3). Produkty pośrednie identyfikuje się w oparciu o widma masowe typu MALDI-TOF oraz widma magnetycznego, rezonansu jądrowego typu 1H NMR. Wydajności: (E)-3-(4-hydroksy-3-metoksyfenylo)akrylan benzylu (6a) - 73%, (E)-3-(4-hydroksy-3,5-dimetoksyfenylo)-akrylan benzylu (6b) - 67%.
Ogólna metoda otrzymywania pochodnych estrów arylowych kwasu akrydynylo-9-karboksylowego 7 (droga B). Synteza związków 7a (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = Re' = H, R2' = OCH), 7b (X = CH=CH, R2 = R7 = H, R2', Re' =OCH3), 7c (X = CH=CH, R2 = R2' = OCH3, R7 = Re' = H).
Do roztworu zawierającego 1 mmol estru typu 6 rozpuszczonego w 30 ml CH2CI2 dodaje się 3,3 mmola trietyloaminy (Et3N) i katalityczną ilość N, N-dimetylopirydyno-4-aminy (DMAP). Do tak przygotowanej mieszaniny należy wprowadzić 1,1 mola odpowiednio podstawionego chlorowodorku 9-(chIorokarbonylo)akrydyny, otrzymanego według opisanych metod (Krzymiński K, Roshal AD, Zadykowicz B, Białk-Bielińska A, Sieradzan A. (2010): J. Phys. Chem. A 114: 10550-10562; Krzymiński K, Ożóg A, Malecha P, Roshal AD, Wróblewska A, Zadykowicz B, Błażejowski J (2011) J. Org. Chem. 76: 1072-1085). Mieszaninę reakcyjną należy pozostawić na mieszadle magnetycznym przez 4-50 godzin w temperaturze pokojowej, następnie odparować do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem i surowy produkt przekrystalizować z metanolu. Produkty zidentyfikować w oparciu o widma masowe typu MALDITOF i widma typu 1H NMR. Wydajności: akrydynylo-9-karboksylan 4-(( E )-2-((benzyloksy)karbonylo)winylo)-2-metoksyfenylu 7a - wydajność 74%, akrydynylo-9-karboksylan 4-(( E )-2-((benzyloksy)karbonylo)winylo)-2,6-dimetoksyfenylu 7b - wydajność 77%, 2-metoksyakrydynylo-9-karboksylan 4-(( E )-2-((benzyloksy)karbonylo)winylo)-2-metoksy-fenylu 7c - wydajność 69%. Przykładowa analiza 1H NMR dla 7c (CDCI3, 300 K, δ, ppm (J, Hz): 3,98 (3H, s); 4,08 (3H, s); 5.21 (2H, s); 6,41 (1H, d, J = 16,0); 7,18 (2H, m); 7,27-7,38 (6H, m); 7,43 (1H, d, J = 8,8); 7,62 (1H, t, J = 7,6); 7,68 (1H, d, J = 16,0); 7,71 (1H, d, J = 9,1); 7.77 (1H, t, J = 7,3); 8,21-8,34 (2H, m); 8,50 (1H, d, J = 8,7).
Ogólna metoda otrzymywania kwasów (2E)-3-{4-[(akrydynylo-9-karbonylo)oksy]fenylo}akrylowych 8 (droga C). Synteza związków 8a (schemat 5, X = CH=CH, R2 = R7 = Re' =H, R2' = OCH), 8b (X = CH=CH, R2 = R7 = H, R2' = Re' = OCH), 8c (X = CH=CH, R2 = R2' = OCH3, R7 = Re = H).
mmol diestru typu 7 rozpuszcza się w 5 ml 40% roztworu HBr w kwasie octowym i pozostawia na mieszadle przez 1-15 godzin w temperaturze 20-50°C. Po tym czasie mieszaninę rozcieńcza się namiarem wody z lodem, po czym odfiltrowuje się osad surowego produktu. Czysty związek typu 8 otrzymuje się w drodze krystalizacji z etanolu lub mieszaniny etanol-woda (1/1 obj./obj.). Wydajności: kwas (E )-3-{(4-[(akrydynylo-9-(karbonylo)oksy]-3-metoksyfenylo)akrylowy (8a) - 85%; kwas (E )-3-{(4-[(akrydynylo-9-(karbonylo)oksy]-3,5-dimetoksyfenylo)akrylowy (8b) - 91%; kwas (E )-3-{(4-[(2-metoksyakrydynylo-9-(karbonylo)oksy]-3-metoksyfenyIo)akrylowy (8c) - 90%. Przykładowa, analiza 1H NMR dla 8c (DMSO-ds, 300 K, δ, ppm (J, Hz): 4,07 (3H, s); 4,15 (3H, s); 6,68 (1H, d, J = 16,0); 7,44 (2H, m); 7,67 (1H, d, J = 16,0); 7,69 (1H, s); 7,89 (1H, t, 7,9); 7,95 (1H, t, 7,9); 8,13 (1H, d, J = 9,4); 8,25 (1H, d, J = 8,4); 8,36 (1H, d, J = 9,3); 8,59 (1H, d, J = 8,6); 12,5 (1H, ss).
Ogólna metoda otrzymywania estrów sukcynimidylowych kwasów (2E)-3-{4-[(akrydynylo-9-karbonylo)oksy]fenyIo}akrylowych 9 (droga D). Synteza związków 9a (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = Re' = H, R2' = OCH3); 9b (X = CH=CH, R2 = R7 = H, R2' = Re' = OCH3), 9c (X = CH=CH, R2 = R2' = OCH3, R7, Re' = H).
Do chłodzonego lodem roztworu zawierającego 1 mmol; kwasu typu 8 w suchym DMF dodaje się 1,2 mmola dicykloheksylokarbodiimidu (DCC), po czym mieszaninę pozostawia się na mieszadle przez okres 0,5-2 godzin. Następnie do naczynia dodaje się 1,2 milimola N-hydroksybursztynoimidu (NHS)
PL 240 086 B1 i pozostawia na mieszadle przez okres 6-20 godzin. Po zakończeniu reakcji mieszaninę należy rozcieńczyć za pomocą CH2CI2 (około 20 ml) i przemyć wodą (3x). Warstwę organiczną należy osuszyć za pomocą bezwodnego MgSO4, odparować rozpuszczalnik pod zmniejszonym, ciśnieniem i oczyścić produkt metodą grawitacyjnej chromatografii kolumnowej (faza stacjonarna: SiO2, faza ruchoma: 20-50% octan etylu w heksanie lub 1-5% izopropanol w CHCI3). Wydajności: akrydynylo-9-karboksylan 4-( E )-2-((sukcynoimidyloksy)karbonylo)-winylo)-2-metoksy-fenylu (9a) - 75%; akrydynylo-9-karboksylan 4-((E)-2-((sukcynoimidyloksy)karbonylo)winylo)-2,6-dimetoksy-fenylu (9b) - 73%; 2-metoksyakrydynylo-9-karboksyIan 4-(( E )-2-((sukcynoimidyIoksy)karbonylo)winylo)-2-metoksy-fenylu (9c) - 78%.
Przykładowe analizy: 1H NMR (CDCI3, δ, ppm (J, Hz): 9a: 2,81 (4H, s); 3,99 (3H, s); 6,55 (1H, d, J = 16.0); 7,22 (2H, m); 7.30 (1H, d, J = 8,6); 7,60 (2H, t, J = 7,9); 7,77 (2H, t, J = 7,2); 7,87 (1H, d, J = 16,0); 8,23 (2H, d, J = 8,8); 8,31 (2H, d, J = 8,8). 9b: 1H NMR (CDCl3), δ, ppm (J, Hz): 2,89 (4H, s); 4,03 (6H, s); 6,62 (1H, d, J = 16,0); 6,95 (214, s); 7,67 (2H, t, J = 8,0); 7,84 (2H, t, J = 7,4); 7,91 (1H, d, J = 16,0); 8,30 (2H, d, J = 8,7); 8,49 (2H, d, J = 8,7).
Ogólna metoda syntezy N-metylowanych soli triflatowych estrów bursztynoimidylowych kwasów (2E)-3-{4-[(akrydynylo-9-karbonylo)oksy]fenylo}akrylowych 1 (droga) E). Synteza związków 1a (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = R6' = H, R2 = OCH), 1b (X = CH=CH, R2 = R7 = H, R2 = R6 = OCH3), 1c (X = CH=CH, R2 = R2 = OCH3, R7 = R6' = H).
Do roztworu zawierającego 1 milimol estru aktywnego typu 9 w suchym CH2CI2 dodaje się mmole 2,6-di-tert-butylopirydyny (związanej na nośniku polimerycznym) i po około 10 minutach wprowadza 5-10 mmoli trifluorometanosulfonianu (triflatu) metylu (CF3SO3CH3). Mieszaninę reakcyjną należy utrzymywać na mieszadle magnetycznym przez 1-15 godzin. Po zakończeniu reakcji do mieszaniny dodaje się minimalną ilość suchego acetonitrylu do rozpuszczenia wytrąconego osadu soli akrydyniowej, po czym mieszaninę sączy się przez filtr strzykawkowy (0,45 μm, PTFE) i wprowadza wprost do minimum 100-krotnego nadmiaru objętościowego suchego eteru dietylowego. Po ochłodzeniu mieszaniny (około -20°C) osad soli akrydyniowej typu 1 należy odsączyć, przemyć i wysuszyć w próżni i przechowywać bez dostępu wilgoci, w obniżonej temperaturze (około -20°C). Otrzymane związki stanowią emitery chemiluminescencji według zastrzeżenia 1 i 5. Przykładowe analizy: trifluorometanosulfonian 10-metyloakrydynio-9-karbonyloksy)-4-(( E )-2-(sukcynimidyloksy)-karbonylo)winylo)-2-metoksyfenylu (1a) - wydajność: 89%; czystość: 97% (RP-HPLC: faza stacjonarna: C18, faza ruchoma: 60%/40% acetonitryl (CH3CN)/0,1% kwas trifluorooctowy w wodzie (TFAaq); 1H NMR (CD3CN), δ, ppm (J, Hz): 2,84 (4H, s); 4,14 (3H, s); 4,87 (3H, s); 6,90 (1H, d, J = 16.0); 7,49 (1H, d, J = 8,2); 7,60 (1H, d, J = 8,2); 7,64 (1H, s); 8,03 (1H, d, J = 16,0); 8,16 (2H, t, J = 7,3); 8,51 (2H, t, J = 7,3); 8,70 (4H, m). Trifluorometanosulfonian 10-metyloakrydynio-9-(karbonyloksy)-4-((E)-2-((sukcyn-imidyloksy)karbonylo)winylo)2,6-dimetoksyfenylu (1b) - wydajność; 91%; czystość >92% (RP-HPLC: faza stacjonarna: C18, faza ruchoma: CH3CN/0,1% TFAaq = 60%/40% obj./obj.); 1H NMR (CD3CN, δ (ppm), J (Hz): 2,84 (4H, s); 4,09 (6H, s); 4,85 (3H, s); 6,92 (1H, d, J = 16,0); 7,24 (2H, s); 7,99 (1H, d, J = 16,0); 8,18 (2H, t, J = 7,0); 8,51 (2H, t, J = 7,5); 8,68 (2H, d, J = 9,1); 8,72 (2H, d, J = 8,6). Trifluorometanosulfonian 2-metoksy10-metyloakrydynio-9-(karbonyloksy)-4-{(E)-2-((sykcynimidyloksy)karbonylo)-winylo)-2-metoksyfenylu (1c) - wydajność; 78%; czystość: >90%. (RP-HPLC: faza stacjonarna: C18, faza ruchoma: 70% CH3CN/30% 0,1% TFA w H2O); 1H NMR (CD3CN), δ, ppm (J, Hz): 2,84 (4H, s); 4,09 (6H, s); 4,85 (3H, s); 6,92 (1H, d, J = 16.0); 7,24 (2H, s); 7,99 (1H, d, J = 16,0); 8,18 (2H, t, J = 7.0); 8,51 (2H, t, J = 7,5); 8,68 (2H, d, J = 9,1); 8,72 (2H, d, J = 8,6). Przykładowe widmo typu 1H NMR dla związku 1b przedstawiono na fig. 1.
P r z y k ł a d 2. Sposób otrzymywania wybranych soli triflatowych estrów arylowych N-podstawionych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 2 - związek pośredni, przedstawionym na schemacie 2.
Poszczególne kroki syntezy (F, G, C, D, E) związków 2a (R2 = H, R2'-Rs' = H, n = 3), 2b (R2 = H, R2'-R6' = H, n = 4) wraz z zaznaczeniem produktów pośrednich 10-13 przedstawiono ma schemacie 2 i opisano poniżej.
Ogólna metoda otrzymywania estrów arylowych kwasów akrydynylo-2-hydroksy-9-karboksylowych 11 (droga F). Synteza związków 11a (schemat 2, R2 = H, R2-R6' = H, n = 3), 11b (R2 = H, R2-R6' = H, n = 4).
Estry aromatyczne kwasu akrydynylo-9-karboksylowego typu 10 można otrzymać wg metod opisanych w literaturze (Krzymiński K, Roshal AD, Zadykowicz B, Białk-Bielińska A, Sieradzan A (2010): J. Phys. Chem. A 114: 10550-10562; Smith K, Yang JJ, Li Z, Weeks I, Woodhead JS (2009) J. Photochem. Photobiol. A. Chem. 203; 72-79). Grupę metoksylową (2-OCH3) w związkach typu 10 usuwa się
PL 240 086 B1 selektywnie w środowisku kwaśnym. Naważkę związku typu 10 (10a: R2 = H, R2-R6' = H; 10b: R2 = H, R2' = CH3) należy umieścić w kolbie ciśnieniowej i dodać około 100-krotny nadmiar wagowy roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym (HBr/CH3CO2H = 45/55 wagowo). Zawartość kolby miesza się w temperaturze około 100°C przez 3-5 godzin. Po tym czasie roztwór reakcyjny chłodzi się, wprowadza do wody z lodem i zobojętniania nasyconym roztworem węglanu sodu (Na2CO3). Produkt reakcji należy odfiltrować, przemyć wodą i wysuszyć w eksykatorze próżniowym. Otrzymaną 2-hydroksy pochodną akrydyny typu 11 przemywa się na lejku mieszaniną toluen/cykloheksan, aby usunąć ślady mało polarnych zanieczyszczeń.
Przykładowe analizy: 11a: wydajność: 65%; t.t. = 273°C (rozkład); TLC (SO2, toluen/pirydyna = 10/1 obj./obj.): Rf = 0,37; analiza elementarna (% znaleziony/obliczony): C = 75,87/76,18, H = 4,43/4,16, N = 4,26/4,44; 1H NMR (DMSO-ds, t.p.): 7,42 (1H, s), 7,43 (1H, s), 8,20 (3H, ss), 7,74 (1H, t), 7,84 (1H, t), 7,54-7,64 (5H, m). 11b: wydajność: 63%; t.t. = 252°C (rozkład); TLC (SiO2, toluen/pirydyna = 10/1 obj./obj.): R f = 0,39; analiza elementarna (% znaleziony/obliczony): C = 76,39/76,58, H = 4,72/4,59, N = 4,12/4,25.
Ogólna metoda otrzymywania estrów arylowych kwasów akrydynylo(benzyloksykarbonylo)-alkilo-9-karboksylowych 12 (droga G). Synteza związków 12a (schemat 2, R2 = H, R2'-R6' = H, n = 3), 12b (R2 = H, R2'-R6' = H, n = 4).
Aby wprowadzić ugrupowanie separujące (łącznik) z grupą aktywną w położenie 2 rdzenia akrydyny związków typu 11 należy zastosować chronione ^halogenokwasy alifatyczne, np. ester benzylowy lub tert-butylowy kwasu 4-bromomasłowego lub 5-bromowalerianowego, otrzymane z handlowych odczynników według znanych procedur (Vogel Al, Preparatyka organiczna, wyd. 3 (2006), Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa). Osuszoną 2-hydoksy pochodną akrydyny typu 11 rozpuszcza się w niewielkiej ilości bezwodnego DMF i otrzymany roztwór umieszcza w strzykawce. Mieszaninę wkrapla się przez septum w atmosferze gazu obojętnego (Ar) w ciągu około 30 minut do mieszanej i chłodzonej (-20°C) zawiesiny zawierającej 2-3 krotny nadmiar molowy (w stosunku do 11) wodorku sodowego (NaH), rozprowadzonego w niewielkiej ilości suchego DMF. Po tym czasie usuwa się łaźnię z lodem i kontynuuje reakcję przez kolejne 30 min. w temperaturze pokojowej. Następnie sporządza się roztwór stechiometrycznej ilości (w odniesieniu do 11) estru benzylowego lub tert-butylowego kwasu 4-bromomasłowego lub 5-bromowaIerianowego w suchym DMF, który stopniowo dodaje się w ciągu około 30 min. ze strzykawki przez septum do wcześniej otrzymanej O-hydroksy soli związku 11, która nie jest wyodrębniana (t.p., Ar). Po tym czasie mieszaninę reakcyjną należy stopniowo ogrzewać do temp. 6570°C i temperaturę tę utrzymuje się przez 3-5 godzin. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną wprowadza się do rozcieńczonego roztworu HClaq (5-10%) i wytrąconą substancję ekstrahuje toluenem, przemywa wodą, a połączone ekstrakty suszy bezwodnym siarczanem sodu (Na2SO4). Po przefiltrowaniu roztworu i usunięciu rozpuszczalnika otrzymuje się związki typu 12, które oczyszcza się metodą grawitacyjnej chromatografii kolumnowej (faza stacjonarna: SO2, faza ruchoma: toluen/pirydyna = 10/1 obj./obj.). Przykładowe analizy: ester fenylowy kwasu akrydynylo-2(3'-benzyIoksykarbonylo)-propioksy-9-karboksylowego 12a: wydajność chemiczna 86%, TLC: R f = 0,45 (SO2, toluen/pirydyna = 10/1 obj./obj.), temperatura topnienia (t.t.) = 108-110°C; analiza elementarna (% obliczony/znaleziony): C = 75,71/75,78; H = 5,02/5,13; N = 2,92/2,85. 1H NMR (CDCle, δ, ppm (integracja, multipletowość (s singlet, t - triplet, kwi - kwintet, ss - sekstet): 2,21 (2H, kwi.); 2,59 (2H, t); 3,49 (2H, t); 5,16 (2H, s); 7,39 (5H, s). Ester fenylowy kwasu akrydynylo-2(3'-benzyloksykarbonylo)-butooksy-9-karboksylowego (12b): wydajność 89%, TLC: Rf = 0,51 (SO2, toluen/pirydyna = 10/1 obj./obj.), t.t. = 88-89°C, analiza elementarna (% obliczony/znaleziony): C = 75,89/76,05; H = 5,32/5,38; N = 2,76/2,77. 1H NMR (CDCI3, δ, ppm (integracja, multipletowość): 1,80 (4H, ss); 2,40 (2H, t); 3,40 (2H, t); 5,10 (2H, s), 7,32 (5H, s). Otrzymywanie estrów arylowych kwasów 2-((y-sukcynimidyloksykarbonylo)alkoksy)akrydynylo)-9-karboksylowych 13 (droga C, D). Synteza związków 13a (schemat 2, R2 = H, Rg-Rs' = H, n = 3), 13b (R2 = H, R2'-R6' = H, n = 4).
Aby usunąć osłonę benzylową z grupy karboksylowej i następnie aktywować ją, adoptuje się metody opisane w literaturze przedmiotu (Zomer G, Stavenuiter JFC, Van den Berg RH, Jansen EHJM (1991) Pract. Spectrosc. 12: 505-521). W tym celu substraty typu 12 rozpuszcza się w około 10-krotnym nadmiarze wagowym 33% roztworu HBr/CH3CO2H i pozostawia na mieszadle przez około 2 godziny w temp. 40-50°C. Po zakończeniu reakcji mieszaninę wprowadza się do nadmiaru wody, a produkty odsącza, przemywa wodą i suszy w próżni. Otrzymuje się związki, stanowiące estry arylowe kwasów 2-(( Y-karbonylooksy)alkoksy)akrydynylo)-9-karboksyIowych. Aktywację wolnych grup karboksylowych w ostatnich związkach można przeprowadzić z użyciem NHS, otrzymując związki typu 13. Przykładowe
PL 240 086 B1 analizy: ester fenylowy kwasu 2-((3’-sukcynimidyloksykarbonylo)-propioksy)akrydynylo)-9-karboksylowego 13a - wydajność: 70%, TLC: Rf = 0,46 (SO2, CH2CI2/CH3CN = 4/1 obj./obj.), t.t. = 162-163°C, analiza elementarna (% obliczony/znaleziony): C = 65,51/66,46; H = 4,31/4,45; N = 5,63/5,62. 1H NMR (CDCl3, δ, ppm (integracja, multipletowość): 7,38 (1H, d.); 7,48 (1H, d.); 8,24 (2H, t.), 7,68 (1H, t.); 7,81 (1H, t); 8,30 (1H, d); 7,45-7,62 (5H, m.); 4,30 (2H, t.); 2,38 (2H, kwi.); 2,95 (2H, t.); 2,85 (4H, s.). Ester fenylowy kwasu 2-((3’-sukcynimidyloksykarbonylo)-butoksy)akrydynylo)-9-karboksylowego 13b: wydajność: 68%, TLC: R f = 0,47 (SO2, toluen/acetonitryl = 1/1 obj./obj.), t.t. = 140-142°C, analiza elementarna: C =68,01/67,96; H = 4,65/4,72; N = 5,56/5,47. 1H NMR (CDCI3, δ, ppm (integracja, multipletowość): 7,30-8,35 (12H, m.); 4,38 (2H, t.); 2,05 (4H, m.); 2,75 (2H, t.); 2,85 (4H, s.).
Otrzymywanie soli estrów arylowych kwasów 2-((y-sukcynimidyloksykarbonylo)-alkoksy)-10-metyloakrydynio)-9-karboksylowych 2 (droga E). Synteza związków 2a (schemat 2, R2 = H, R^-Re = H, n = 3), 2b (R2 = H, R2-R6' = H, n = 4).
N-metylowane sole akrydyniowe typu (emitery chemiluminescencji) 2 otrzymuje się bezpośrednio ze związków typu 13 w analogiczny sposób, jak opisano powyżej dla związków typu 1 (schemat 5, droga E). Otrzymane związki 2 należy przemyć niewielką ilością toluenu i osuszyć w eksykatorze. Przykładowe analizy: trifluorometanosulfonian estru fenylowego kwasu 2-((3'-sukcynimidyloksykarbonylo)propioksy)-10-metyloakrydynio-9-karboksylowego (2a) - wydajność: 93%, TLC: Rf = 0,20 (SO2, 0,2%.
TFA/CH3CN), t.t. = 110-111°C, analiza elementarna (% obliczony/znaleziony): C = 54,31/54,38; H = 3,78/3,80; N = 4,25/4,23; 1H NMR (CD3CN, δ, ppm (integracja, multipletowość): 7,56 (1H, m.): 8,18 (1H, k.), 8,63 (2H, d.), 8,40 (1H, t.), 8,09 (1H, t.), 8,49 (1H, d), 7,61-7,68 (2H, m.), 7,55-7,61 (2H, m.), 7,49 (1H, t.), 4,42 (2H, t.), 2,33 (2H, kwi.), 2,93 (2H, t.), 2,76 (4H, s.), 4,88 (3H, s.); UV: (CH3CN): 2max = 275 nm (ε = 6,79-104 dm3/molxcm). Trifluorometanosulfonian estru fenylowego kwasu 2-((3'-sukcynimidyloksy-karbonylo)butoksy)-10-metyloakrydynio-9-karboksylowego 2b - wydajność: 96%, TLC: R f = 0,21 (SiO2, 0,2% TFA/acetonitryl), t.t. = 101-1O2°C, analiza elementarna: C = 54,89/55,03; H = 3,98/4,02; N = 4,16/4,14. 1H NMR (CD3CN, δ, ppm (integracja, multipletowość): 7,50 (1H, d.); 8,12 (1H, k.); 8,62 (2H, k.), 8,37 (1H, t); 8,06 (1H, t); 8,44 (1H, d); 7,58 (2H, m.); 7,52-7,58 (2H, m.); 7,47 (1H, t.); 4,33 (2H, t.); 1,99 (4H, m.); 2,93 (2H, t.), 2,78 (2H, t.); 2,76 (4H, s.); 4,84 (3H, s.). UV-Vis (acetonitryl): 2max = 276 nm (ε = 6,82-104 dm3/molxcm). Przykładowe widmo typu MALDI TOF MS dla związku 2b przedstawiono na fig. 2.
P r z y k ł a d 3. Sposób otrzymywania emiterów chemiluminescencji o wzorze ogólnym 3, określony emiter pokazano na Fig. 3, zawierających szkielet oligomeru aminokwasowego.
Poszczególne kroki syntezy oligoestru akrydyniowego na bazie ornityny i kwasu γ-aminomasłowego (3a, Fig. 3) opisano poniżej.
Do otrzymania związku wykorzystuje się związek pokazany na wzorze ogólnym 1 lub 2 - opisany powyżej w przykładach.
Wprowadzanie ochron grup aminowych typu Fmoc do cząsteczek ornityny (Orn) i kwasu γ-aminomasłowego (GABA).
Do naważki każdego z aminokwasów (Orn, GABA), rozpuszczonego w mieszaninie acetonitryl/woda (1/1 obj./obj.) dodaje się 10% nadmiar molowy N-(9-fluorenylometoksykarbonyloksy)-sukcynimidu (Fmoc-OSu) i prowadzi się reakcję przez około 1,5 godziny w zakresie pH = 8,5-9,0, kontrolowanym za pomocą dodatku trietyloaminy (TEA). Następnie mieszaninę zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym, w celu wytrącenia osadu, dodaje się odpowiednią objętość 1,5 M roztworu HCl, aby uzyskać końcowe pH mieszaniny w zakresie 2-3. Produkty z ochronioną grupą aminową (Fmoc-GABA, Fmoc-Orn(Fmoc)-OH) krystalizuje się z toluenu. Wydajność reakcji jest ilościowa (bliska 100%). Osadzanie chronionego aminokwasu Fmoc-GABA na żywicy
Na tym etapie przyłącza się C-koniec chronionego aminokwasu Fmoc-GABA do nośnika stałego, dobranego zgodnie ze strategią Fmoc, na przykład żywicy kopolimerowej, zawierającej usieciowany polistyren z przyłączonymi poprzez mostki eterowe resztami glikolu polietylenowego. Należy umieścić 1 g żywicy, korzystnie typu TentaGel R RAM w suchym naczyniu i dodać kilka mililitrów dichlorometanu (CH2CI2) w celu jej napęcznienia, po czym po około 20 minutach odsącza się żywicę od rozpuszczalnika. Następnie do suchego naczynia odważa się otrzymany w poprzednim etapie chroniony aminokwas typu Fmoc-GABA w ilości odpowiadającej 5-krotnemu molowemu namiarowi w stosunku do stopnia obsadzenia żywicy i rozpuszcza się go w jak najmniejszej ilości DMF. Następnie do kolby z roztworem FmocGABA w DMF wprowadza się 1-(mezytyleno-2-sulfonylo)-3-nitro-1 H-1,2,4-triazol (MSNT) oraz 1-metyloimidazol (Melm) w ilości odpowiadającej 10% namiarowi molowemu w stosunku do użytego Fmoc
PL 240 086 B1
GABA. Mieszaninę umieszcza się na mieszadle magnetycznym i miesza się w t.p. w atmosferze gazu obojętnego (Ar) aż do rozpuszczenia odczynników sprzęgających. Następnie rozpuszczony aminokwas z odczynnikami sprzęgającymi dodaje się do wcześniej przygotowanej żywicy i naczynie z mieszaniną reakcyjną wytrząsa się przez 1-1,5 godziny. Otrzymaną żywicę z osadzonym Fmoc-GABA przemywa się kolejno: 4x3 ml DMF (1 min.), 4x3 ml CH2CI2 (1 min.) 4x3 ml metanolem (1 min.) i 4x3 ml eterem dietylowym (1 min.).
Ustalanie stopnia obsadzenia żywicy
Umieszcza się 20 mg żywicy z osadzonym Fmoc-GABA w kolbie miarowej 25 ml, dodaje 2 ml 2% roztworu 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-enu (DBU) w DMF i wytrząsa się całość przez około 30 minut. Następnie dopełnia się kolbę miarową do kreski acetonitrylem (CH3CN). Stopień obsadzenia wyznacza się metodą spektrofotometryczną (UV-Vis) za pomocą pomiaru absorbancji przy długości fali 330 nm, pochodzącej od dibenzofulwenu (DBF). W opisany sposób uzyskuje się stopień obs adzenia żywicy w granicach 0,10-0,15 mmol. W celu zacetylowania pozostałych wolnych grup aminowych na tak przygotowanej żywicy, wytrząsa się ją przez około 12 godzin z 3,2 mmola N-acetyloimidazolu, rozpuszczonego w minimalnej ilości DMF.
Usunięcie osłony Fmoc z osadzonego pierwszego aminokwasu na nośniku
W celu usunięcia osłony Fmoc z osadzonej na żywicy pochodnej kwasowej Fmoc-GABA, stosuje się wytrząsanie z 50% roztworem piperydyny w DMF (1x5 min., następnie 1x20 min.). W celu przemycia żywicy stosuje się kolejno następujące wytrząsania: 3 x DMF (5 min.), 2 x izopropanol (5 min.) i 1 x DMF (20 min.). Potwierdzenie obecności wolnych grup aminowych (NH2) wykonuje się pomocą testu chloranilowego (Chan WC, White PD, „Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach” (2000), Oxford University Press, Oxford, England). W powyższy sposób uzyskuje się całkowite usunięcie osłony Fmoc z osadzonego na nośniku GABA.
Sprzęganie chronionego aminokwasu Fmoc-Orn(Fmoc)-OH z nośnikiem
Proces polega na tworzeniu wiązania peptydowego z udziałem wolnych grup aminowych (NH2) obecnych w GABA oraz grupy karboksylowej obecnej w N,N'-dichronionej ornitynie, Fmoc-Orn(Fmoc)OH, otrzymanej jak opisano powyżej. Jako czynniki sprzęgające stosuje się N,N-diizopropylokarbodiimid (DIPCI) i N-hydroksybenzotriazol (HOBt). Naważkę (4-krotny molowy namiar w stosunku do stopnia obsadzenia żywicy) rozpuszcza się w minimalnej ilości DMF, a następnie dodaje DIPCI (10% nadmiar molowy w stosunku do Fmoc-Orn(Fmoc)-OH) oraz naważkę HOBt (4-krotny namiar molowy w stosunku do Fmoc-Orn(Fmoc)-OH). Całość rozpuszcza się, a następnie dodaje do żywicy przygotowanej jak opisano powyżej, prowadząc reakcję sprzęgania przez około 1,5 godziny. Nadmiar reagentów usuwa się przez wymywanie za pomocą DMF (4x5 min.). Proces sprzęgania monitoruje się na obecność wolnych grup aminowych za pomocą wyżej wspomnianego testu chloranilowego. Wynik negatywny wskazuje na zakończenie przyłączania pierwszej cząsteczki ornityny Fmoc-Orn(Fmoc)-OH do GABA (ornityna 1). Usuwanie grupy ochronnej z chronionego aminokwasu Fmoc-Orn(Fmoc)-OH osadzonego na nośniku (ornityna 1).
W celu usunięcia grup osłonowych Fmoc z N,N’-dichronionej ornityny Fmoc-Orn(Fmoc) połączonej z GABA, wytrząsa się zmodyfikowaną jak opisano powyżej żywicę z 50% roztworem piperydyny w DMF (1x5 min., 1 x20 min.). W celu przemycia produktu stosuje się wytrząsanie z DMF (3x5 min.), następnie z izopropanolem (2x5 min.) oraz DMF (1x20 min.).
Sprzęganie chronionego aminokwasu typu Fmoc-Orn(Fmoc)-OH z ornityną 1.
Przyłączenie ornityny 2 do żywicy wykonuje się analogicznie jak opisano powyżej, z tym że do reakcji bierze się 2-krotnie wyższy namiar molowy odczynników jak w pierwszym etapie acylowania, ze względu na obecność 2 grup aminowych w ornitynie. Usuwanie grup ochronnych typu Fmoc z ornityny 2 wykonuje się według znanych metod, analogicznie jak opisano powyżej w przypadku ornityny 1. Odszczepienie oligomeru aminokwasowego od żywicy
Do odszczepienia uzyskanego oligomeru aminokwasowego od żywicy stosuje się mieszaninę zawierającą objętościowo 88% kwasu trifluorooctowego (TFA), 5% fenolu, 5% wody i 2% triizopropylosilanu (TIPSI). Tak przygotowany roztwór miesza się ze zmodyfikowaną żywicą (10 ml roztworu na 1 g żywicy) i całość wytrząsa się przez 2 godziny. Po odsączeniu żywicy od roztworu i zagęszczeniu przesączu oligomer aminokwasowy wytrąca się przez wprowadzenie mieszaniny do nadmiaru eteru dietylowego. Wytrącony oligomer odwirowuje się na wirówce (15 min.), a następnie izoluje przez dekantację fazy eterowej. Czynność tę powtarza się 3-krotnie. Po osuszeniu oligomeru rozpuszcza się go w wodzie destylowanej i liofilizuje.
PL 240 086 Β1
Przyłączenie soli akrydyniowej do oligomeru aminokwasowego
Reakcję prowadzi się w warunkach typowych dla sprzęgania pierwszorzędowej grupy aminowej białek z aktywowanymi estrami typu NHS (bufor fosforanowy, pH = 8,5, t.p., 30 min.), mieszając równomolowe ilości emitera chemiluminescencji, otrzymanego według przykładu 1 lub przykładu 2, względnie handlowego produktu (CAS 177332-37-5), z otrzymanym jak opisano powyżej oligomerem aminokwasowym. Produkt oczyszcza się za pomocą półpreparatywnej chromatografii typu RP-HPLC, stosując kolumnę typu C8 (np. 250 mm, 5 pm, 100 A) i gradientową fazą ruchomą (A = H2O, B = 80% ACN + 0,1% TFA, B = 0-100%, objętość nastrzyku 200 μΙ), a następnie izoluje go za pomocą liofilizacji. Powstaje znacznik zawierający cztery ugrupowania estru akrydyniowego w cząsteczce i dany Acr pokazany na fig. 3, z wydajnością chemiczną na poziomie 20-30%. Czystość związku określa się za pomocą RP-HPLC, stosując elucję izokratyczną za pomocą mieszaniny 0,1% TFA w wodzie/0,06% TFA w acetonitrylu w stosunku objętościowym 1/1, kolumnę typu C6-Phenyl lub C-18 i detekcję absorpcyjną przy długości fali 254 nm i 365 nm. Przykładowe widmo typu MALDI-TOF MS dla związku 3a (Fig. 3) przedstawiono na fig. 1A i fig. 1B.
Przykład 4. Odczynnik immunochemiczny do oznaczeń chemiluminescencyjnych zawierający emiter chemiluminescencji o wzorze ogólnym 1, 2, 3, otrzymany według przykładów 1-3. Dodatkowo pokazano właściwości luminescencyjne związków o wzorze 1 i 2 - stanowiące część struktury wynalazku - związku o wzorze 3.
Sposób otrzymywania odczynników immunochemicznych zawierających emitery chemiluminescencji 1a (X = CH=CH, R2 = R7 = R6 = H, R2'=OCH3), 1b(X = CH=CH, R2 = R7 = H, R2'= Re'= OCH3), 1c (X = CH=CH, R2 = R2' = OCH3, R7 = Re' = H), 2a (R2'-R6' = Η, n = 3), 2b (R2'-R6' = Η, n = 4) i 3a (fig. 3) opisano poniżej.
Do małej kolby wprowadza się 0,18 mg (1,2x10-9 mola) handlowego białka typu IgG (np. Goat Anti-Human Immunoglobulin G) w buforze fizjologicznym (pH = 7,5; 0,01 M monofosforan sodowy, 0,25 M NaCI), a następnie odpowiednią ilość zasady (0,01 M NaOH), aby otrzymać roztwór o pH w granicach 8,0-9,0. Do otrzymanej mieszaniny należy wprowadzić roztwór emitera chemiluminescencji, otrzymanego w przykładzie 1 lub 2, rozpuszczonego w bezwodnym DMF lub CH3CN, aby otrzymać mieszaninę zawierającą 10-12-krotny namiar molowy emitera nad znakowanym białkiem, optymalnie 13,6x10-9 mola znacznika, to jest 2,72 μΙ roztworu 1a-2b o stężeniu 5 mM (procedura III, fig. 5). W przypadku zastosowania emitera chemiluminescencji 3a, do otrzymania odczynnika immunochemicznego stosuje się 3-5-krotny nadmiar molowy 3a nad znakowanym białkiem, a reakcję prowadzi w obecności następujących odczynników sprzęgających: 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDAC) i A/-hydroksysukcynimidu (NHS) w ilościach równomolowych w stosunku do użytego emitera.
Pozostałe kroki są identyczne dla wszystkich typów emiterów chemiluminescencji opisanych w dokumencie. Kolbę pozostawia się na mieszadle w temp. pok. przez około 30 minut i po tym czasie do mieszaniny wprowadza się 50 μΙ 1% roztworu lizyny i pozostawia na mieszadle przez kolejne 15 minut. Powstałe koniugaty typu białko-znacznik, stanowiące odczynniki immunochemiczne, należy wyizolować stosując złoże chromatograficzne typu sitowego, na przykład Sephadex G-50 lub G-25 jako fazę stacjonarną oraz kwaśny bufor fosforanowy (pH = 3,5-5,0) w charakterze fazy ruchomej, zbierając frakcje po 1 ml. Następnie należy wykonać pomiary chemiluminescencji poszczególnych frakcji zużyciem luminometru płytkowego w standardowy sposób, opisany w piśmiennictwie (http://www.caymanchem.com/pdfs/200201 .pdf; Krzymiński K, Ożóg A, Malecha P, Roshal AD, Wróblewska A, Zadykowicz B, Błażejowski J (2011) J. Org. Chem. 76: 1072-1085) i wyselekcjonować na tej podstawie 1-2 frakcje o maksymalnej intensywności emisji. Stężenie białka w otrzymanych roztworach odczynników immunochemicznych można wyznaczyć stosując metodę spektrofotometryczną, a korzystnie test Bradforda (http://www.biorad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf). Przygotowany roztwór odczynnika można bezpośrednio stosować w oznaczeniach immunochemicznych, a pomiędzy badaniami należy go przechowywać w obniżonej temperaturze (-20°C). Odczynnik immunochemiczny korzystnie jest wyizolować w stanie suchym, stosując ultrafiltrację molekularną roztworu o największej emisji i filtry wirówkowe o zdefiniowanym punkcie odcięcia masy (np. Centrifugal Filter Units, 30000 NMWL), przemywając produkt zakwaszoną wodą destylowaną (HCIaq, pH = 5,0-5,5) i liofilizując pozostałość otrzymaną na filtrze. Przykładowe rezultaty dotyczące wydajności emisji odczynników immunochemicznych otrzymanych w powyższy sposób z udziałem przykładowego emitera chemiluminescencji 1b przedstawiono na fig. 5. Optymalne odczynniki immunochemiczne, stosowane do dalszych badań, uzyskuje się stosując 11,3-krotny nadmiar molowy emitera chemiluminescencji nad znakowanym białkiem według opisanej w tym przykładzie metodologii.
PL 240 086 B1
P r z y k ł a d 5. Porównanie efektywności emisji odczynników immunochemicznych zawierających emitery chemiluminescencji o wzorze ogólnym 1 i 2 otrzymanych według przykładu 1 i 2, w obecności substancji powierzchniowo czynnych. Intensywność emisji odczynników immunodiagnostycznych uzyskanych z udziałem emiterów chemiluminescencji 1a (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = Rs = H, R2' = OCH3), 1b (schemat 1, X = CHCH, R2 = R7 = H, R2' = Rs' = OCH3), 1c (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R2' = OCH3, R7 = Rs' = H), 2a (schemat 2, R2 = H, R2'-Rs' = H, n = 3), 2b (schemat 2, R2= H, R2'-Rs' = H, n = 4) w układach zawierających N-dodecylo-N, N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonian sodowy, chlorek heksadecylotrimetyloamoniowy i Triton Χ-100.
Efektywność emisji odczynników immunochemicznych, otrzymanych według przykładu 5, zawierających emitery chemiluminescencji 1a, 1b, 1c, 2a, 2b porównano w obecności różnego typu substancji powierzchniowo czynnych, to jest (N-dodecylo-N, N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonianu sodowego (DDAPS), chlorku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAC) i Tritonu Χ-100 (ΤΧ-100), uzyskując końcowe stężenia na płytce pomiarowej w zakresie 5-10 mM w przypadku CTAC i DDAPS oraz 10-20 mM w przypadku TX-100. Wywołanie emisji chemiluminescencji przeprowadzono dodając do studzienek pomiarowych, zawierających określoną ilość odczynnika immunochemicznego według przykładu powyżej, rozpuszczonego buforze fosforanowym (0,04 mg/ml, pH = 3,5-5) kolejno 50 μl 0,06% roztworu nadtlenku wodoru (H2O2) w 0,01 M kwasie azotowym (V) (HNO3) z dodatkiem jednego z powyżej wymienionych środków powierzchniowo czynnych, a następnie 50 μl 0,2 M roztworu NaOH i mierząc całkowity sygnał emisji przy ustalonej czułości aparatu. Dodatek surfaktantów do układu pomiarowego zwiększa intensywność emisji promieniowania, w szczególności w przypadku odczynników immunochemicznych zawierających emitery chemiluminescencji wg zastrzeżenia 1. Szczególnie wysoką efektywność emisji uzyskuje się, stosując emiter 1 b (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = H, R7 = R2' = OCH3) w obecności DDAPS lub TX-100. Porównanie efektywności emisji odczynników immunochemicznych otrzymanych z udziałem emiterów chemiluminescencji 1a, 1b, 1c, 2a, 2b przedstawiono na fig. 7.
Porównanie stabilności chemicznej odczynników immunochemicznych otrzymanych według przykładu 5 z udziałem emiterów chemiluminescencji 2a, 2c oraz substratu handlowego C (fig. 3, CAS: 177332-37-5) w roztworze buforowym przedstawiono na fig. 8. Stabilność chemiczna odczynnika immunochemicznego jest rozumiana w niniejszym wynalazku jako stopień zachowanej pierwotnej zdolności do emisji po jego inkubacji w roztworze alkalicznym przez określony czas (pH = 8,0; 298 K). Wysoka stabilność odczynników jest korzystna ze względu na warunki analiz biomedycznych, które najczęściej wykonuje się w zakresie wartości pH = 7-8. Odczynniki zawierające emitery CL 2a i 2c są stabilniejsze roztworze, aniżeli odpowiednik handlowy C. Odczynniki, zawierające emitery o wzorze ogólnym 1a-1c wykazują stabilność porównywalną z produktem handlowym C.
P r z y k ł a d 6. Sposób określania ilości białkowego analitu biologicznego za pomocą pomiaru chemiluminescencji z udziałem odczynników immunochemicznych o wzorze ogólnym 1 i 2, otrzymanych według przykładów 1 i 2, polegający na immunologicznej metodzie bezpośredniej.
Wykresy kalibracyjne dla odczynników immunochemicznych zawierających 1a (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = Rs =H, R2' = OCH3), 1b (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = H, R2' = Rs' = OCH3),
1c (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R2' = OCH3, R7 = Rs' = H), 2a (schemat 2, R2 = H, R2 ,-Rs' = H, n = 3),
2b (schemat 2, R2 = H, R2'-Rs' = H, n = 4).
Na białe płytki polistyrenowe przystosowane do badań immunochemicznych (na przykład MaxiSorp White Multiwell Plates) pokryte antygenami klasy IgG (analit) nakłada się seryjnie rozcieńczone przeciwciała klasy anty-IgG (np. Goat Anti-Human IgG (H+L)) z przyłączonym kowalencyjnie emiterem chemiluminescencji o wzorze ogólnym 1 i 2, to jest odczynniki immunochemiczne zawierające związki 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, otrzymane jak w przykładzie 5. Płytki należy inkubować przez około 60 minut w temperaturze 37°C, następnie opłukać i osuszyć. Aby wywołać emisję promieniowania, do kolejnych studzienek dodaje się z pomp 10-50 μl 0,0s% roztworu nadtlenku wodoru (H2O2) w 0,01 M HNO3, zawierający 5 mM DDAPS, a następnie taką samą objętość 0,20-0,25 M roztworu wodnego wodorotlenku sodowego (NaOHaq) i mierzy całkowitą (integralną) emisję promieniowania przez okres 3-30 sekund, w zależności od użytego znacznika. Czas pomiaru musi umożliwić zebranie przynajmniej 99% sygnału emisji. Pomiary wykonuje się z udziałem luminometru płytkowego z opcją dozowania odczynników z pomp. Wykresy kalibracyjne, uzyskane w immudiagnostycznych testach bezpośrednich z udziałem odczynników immunochemicznych zawierających przykładowe emitery chemiluminescencji 1a, 1b, 1c, 2a, 2b przedstawiono na fig. 9. Wykres kalibracyjny, uzyskany w tym samym układzie pomiarowym z udziałem handlowego odpowiednika i wykonany według załączonych procedur oznaczono jako C (CAS 177332-37-5; http://www.caymanchem.com/pdfs/200201.pdf).
PL 240 086 B1
P r z y k ł a d 7. Reaktywność odczynników immunochemicznych, zawierających emitery chemiluminescencji o wzorze ogólnym 1 i 2, otrzymane według przykładów 1 i 2 w immunologicznej metodzie pośredniej.
Porównanie czułości i serospecyficzności odczynników immunochemicznych zawierających emitery chemiluminescencji 1a (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = Rs = H, R2' = OCH3), 1b (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R7 = H, R2' = Rs' = OCH3), 1c (schemat 1, X = CH=CH, R2 = R2' = OCH3) R7 = Rs' = H) i 2a (schemat 2, R2 = H, R2'-Rs' = H, n = 3) w badaniach toksoplazmozy z udziałem pomiaru chemiluminescencji.
Białe płytki 96-dołkowe przystosowane do badań immunochemicznych (na przykład MaxiSorp White Multiwell Plates) pokryć antygenami Toxoplasma gondii, inkubować około 60 min. w 37°C i przemyć. Następnie płytki inkubować w tych samych warunkach z surowicą ludzką i po wypłukaniu inkubować je ponownie z odczynnikami immunochemicznymi, to jest przeciwciałami antyludzkimi np. Goat Anti-Human IgG (H+L), znakowanymi emiterami chemiluminescencji 1a lub 1b, lub 2a, otrzymanymi jak opisano w przykładzie powyżej. Dodatkowo, jedną płytkę należy inkubować w tych samych warunkach z udziałem odczynnika immunochemicznego otrzymanego na bazie tego samego białka i porównywalnego handlowego emitera chemiluminescencji (C: CAS 177332-37-5) w sposób opisany w ulotce technicznej produktu (http://www.caymanchem.com/pdfs/200201.pdf).
Po wypłukaniu płytek należy odczytać całkowitą (integralną) emisję promieniowania z użyciem luminometru płytkowego, wprowadzając kolejno do studzienek pomiarowych 50 μl mieszaniny składającej się z 0,06% H2O2 w 0,01M HNO3 zawierającej środek powierzchniowo czynny typu DDAPS o stężeniu 25 mM, jak opisano w przykładzie powyżej, a następnie taką samą objętość 0,2 M roztworu NaOHaq lub TBAOHaq. Wykresy kalibracyjne, przedstawiające zależność intensywności emisji (chemiluminescencji) od stężenia badanego odczynnika immunochemicznego pr zedstawiono na fig. 10. Na podstawie przedziałów ufności danych przedstawionych na powyższych wykresach określono limity detekcji (LOD) i limity oznaczalności (LOQ) odczynników immunochemicznych, które wyniosły: LOD (x10-5 μg< studzienka) = 7,93: 4,55; 3.68 i 11,6 odpowiednio dla 1a, 1b, 2a i C (odczynnik kontrolny) oraz LOQ (x10 μg/studzienka) = 12.5; 7.33; 5.90 i 18.4 odpowiednio dla 1a, 1b, 2a i C. Przykładowe rezultaty dotyczące serospecyficzności opisanej w tym przykładzie metody dla ustalonego i stałego stężenia odczynnika immunochemicznego, równego 0,05 μg/ml, przedstawiono na fig. 11.
Claims (3)
1. Sole estrów arylowych podstawionych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 3 zawierające szkielet oligomeru aminokwasowego:
gdzie:
Acr =
X = CH2-CH2, CH=CH, C=C
R2, R7 = H, CH3, F, Cl, Br, I, OCH3,O(CH2CH2O)nCH3 gdzie n = 1-6 w dowolnej kombinacji
R2', Re = H, CH3, F, Cl, Br, I, OCH3
2.
n = 1-8
R2 = H, CH3, F, Cl, Br, I
R2' - Re’ = H, CH3, F, Cl, Br, I w dowolnej kombinacji A- = CF3SO3-, FSO3-, Iw dowolnej kombinacji
A- = CF3SO3-, FSO3-, h.
Sposób otrzymywania soli estrów arylowych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 3, określonych w zastrz. 1, znamienny tym, że do rozgałęzionego oligomeru aminokwasowego otrzymanego z diaminokwasów, korzystnie z ornityny lub lizyny oraz ćo-aminokwasu, korzystnie kwasu ^aminomasłowego przyłącza się co najmniej dwie cząsteczki związku o wzorze ogólnym 1
PL 240 086 Β1
gdzie:
X = CH=CH, C=C
R2, R7 = H, CH3, F, Cl, Br, I, OCH3, O(CH2CH2O)nCH3 gdzie n = 1-6 w dowolnej kombinacji
R2', Re' = H, CH3, F, Cl, Br, I, OCH3 w dowolnej kombinacji
R = H, SO3H
A- = CF3SO3-, FSO3-, Ilub związku o wzorze ogólnym 2:
gdzie n = 1-8 R2 = H, CH3, F, Cl, Br, I R2-R6' = H, CH3, F, Cl, Br, I w dowolnej kombinacji R = H, SO3H
A- = CF3SO3-, FSO3-, Iprzy czym na nośniku stałym, stosowanym w syntezie zgodnie ze strategią osłon fluorenylo-9-metoksykarbonylowych Fmoc, dającą wolny kwas po odszczepieniu od nośnika, którym korzystnie jest żywica typu polistyren-glikol polietylenowy PS-PEG z kotwiczką alkoholu p-alkoksybenzylowego lub żywica tritylowa lub żywica 2-chlorotritylowa lub żywica Wanga, osadza się korzystnie w stopniu 0,1 milirównoważnika aminokwasu na gram żywicy kwas ro-aminokwas chroniony na A/-końcu osłoną Fmoc otrzymany według znanych metod, a następnie nadmiar grup hydroksylowych nośnika blokuje się przez acetylowanie według znanych metod, korzystnie za pomocą A/-acetyloimidazolu, a następnie usuwa się osłonę grupy aminowej Fmoc z ćt>-aminokwasu przyłączonego do żywicy za pomocą znanych metod, po czym sprzęga się wolną grupę aminową w ro-aminokwasie za pomocą A/,A/-chronionego diaminokwasu według znanych metod, korzystnie za pomocą di(fluorenylo-9-metoksykarbonylo)-ornityny Fmoc-Orn-(Fmoc) lub
PL 240 086 B1 di(fluorenylo-9-metoksykarbonylo)-lizyny Fmoc-Lys-(Fmoc), a następnie usuwa się z przyłączonych aminokwasów osłony typu Fmoc według znanych metod, po czym otrzymany na nośniku stałym produkt ponownie acyluje się jak wyżej za pomocą kolejnej porcji N,N '-chronionego diaminokwasu Fmoc-Orn(Fmoc) lub Fmoc-Lys(Fmoc), a następnie usuwa się osłonę Fmoc z grup aminowych powyższego diaminokwasu według znanych metod, po czym odszczepia się otrzymany oligomer aminokwasowy z żywicy znaną metodą odpowiednią do zastosowanego nośnika stałego, a następnie wytrąca się wolny oligomer aminokwasowy eterem dietylowym i liofilizuje go, po czym sprzęga się wolne grupy aminowe w oligomerze aminokwasowym z solą estrów arylowych podstawionych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 1, lub solą estrów arylowych podstawionych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 2 określonym powyżej, po czym oczyszcza się otrzymany produkt końcowy o wzorze ogólnym 3 określonym powyżej, korzystnie za pomocą chromatografii cieczowej typu HPLC w odwróconych fazach, stosując jako fazę ruchomą mieszaninę acetonitrylu w wodzie w obecności 0,050,20% kwasu trifluorooctowego.
3. Odczynnik immunochemiczny do oznaczeń chemiluminescencyjnych zawierający emiter chemiluminogenny, znamienny tym, że emiterem są sole N-podstawionych estrów arylowych kwasów akrydynylo-9-karboksylowych o wzorze ogólnym 3 określonym w zastrz. 1, który to emiter jest sprzężony z dowolnym białkiem zdolnym do reakcji immunochemicznej z antygenem i korzystnie zawiera 1012-krotny nadmiar molowy emitera nad białkiem i który korzystnie można wyizolować się za pomocą techniki filtracji molekularnej i liofilizacji, i których emisję wywołuje się za pomocą znanych odczynników, korzystnie w obecności substancji powierzchniowo czynnych takich jak etery polimeru glikolu polietylenowego (PEG) i p-t-oktylofenolu C14H22O(C2H4O)n gdzie ilość podjednostek glikolu polietylenowego n = 9-10 lub 55, lub N-dodecylo-N,N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonian sodowy lub chlorek heksadecylotrimetyloamoniowy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL416813A PL240086B1 (pl) | 2016-04-18 | 2016-04-18 | Sole estrów arylowych N-podstawionych kwasów akrydynylo- 9-karboksylowych, sposób ich otrzymywania oraz odczynnik immunochemiczny do oznaczeń chemiluminescencyjnych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL416813A PL240086B1 (pl) | 2016-04-18 | 2016-04-18 | Sole estrów arylowych N-podstawionych kwasów akrydynylo- 9-karboksylowych, sposób ich otrzymywania oraz odczynnik immunochemiczny do oznaczeń chemiluminescencyjnych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL416813A1 PL416813A1 (pl) | 2017-10-23 |
| PL240086B1 true PL240086B1 (pl) | 2022-02-14 |
Family
ID=60083609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL416813A PL240086B1 (pl) | 2016-04-18 | 2016-04-18 | Sole estrów arylowych N-podstawionych kwasów akrydynylo- 9-karboksylowych, sposób ich otrzymywania oraz odczynnik immunochemiczny do oznaczeń chemiluminescencyjnych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL240086B1 (pl) |
-
2016
- 2016-04-18 PL PL416813A patent/PL240086B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL416813A1 (pl) | 2017-10-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1341637C (en) | Chemiluminescent acridinium salts | |
| EP0754178B1 (en) | Novel functionalized hydrophilic acridinium esters | |
| ES2700649T3 (es) | Compuestos de acridinio que contienen zwiteriones | |
| FI93278B (fi) | Diagnostinen analyysielementti ja fluoresoiva konjugaatti | |
| JP3964374B2 (ja) | 均一系アッセイにおけるアクリジニウム化合物および誘導体の新規用途 | |
| US4687747A (en) | Phenanthridinium ester as a labelling compound in luminometric immunoassay | |
| US5521319A (en) | Biotinylation reagent and method of use thereof | |
| JP7663498B2 (ja) | 蛍光ｇｔｐ類似体および使用 | |
| EP0609885B1 (en) | Acridinium compounds and conjugates thereof | |
| KR0183420B1 (ko) | 하전된 링커를 갖는 금속 착물 | |
| US7745229B2 (en) | Chemoselective fluorgenic molecular linkers and methods for their preparation and use | |
| Clavé et al. | A universal and ready-to-use heterotrifunctional cross-linking reagent for facile synthetic access to sophisticated bioconjugates | |
| JP5070057B2 (ja) | 新規な蛍光標識化合物 | |
| JP5189096B2 (ja) | 診断薬及びそれを用いた測定方法 | |
| EP3853214A1 (en) | Coumarin-based crosslinking reagents | |
| PL240086B1 (pl) | Sole estrów arylowych N-podstawionych kwasów akrydynylo- 9-karboksylowych, sposób ich otrzymywania oraz odczynnik immunochemiczny do oznaczeń chemiluminescencyjnych | |
| US7928236B2 (en) | Fluorescent amino acid derivatives | |
| EP3604517A1 (en) | Anti-apoa1 antibody | |
| JP4860352B2 (ja) | 診断薬及びそれを用いた測定方法 | |
| JP3248628B2 (ja) | 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法 | |
| EP4246147A1 (en) | Method for measuring sterol in lipoprotein, and reagent for measuring sterol in lipoprotein | |
| US5151517A (en) | Derivatives of tetrahydro-2,3,6,7,1h,5h,11h-(1)benzopyrano(6,7,8,i,j)quinolizinone-11 usable as markers for organic compounds, particularly biological compounds with a view to their detection by chemiluminescence or fluorescence | |
| JP2011154034A (ja) | 診断薬及びそれを用いた診断方法 | |
| JP3325370B2 (ja) | 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法 | |
| JP6735665B2 (ja) | 安定性が改善され迅速に発光する親水性高量子収率アクリジニウムエステル |