PL240405B1 - Przeciwciało monoklonalne oraz sposób jego otrzymywania - Google Patents
Przeciwciało monoklonalne oraz sposób jego otrzymywania Download PDFInfo
- Publication number
- PL240405B1 PL240405B1 PL422316A PL42231617A PL240405B1 PL 240405 B1 PL240405 B1 PL 240405B1 PL 422316 A PL422316 A PL 422316A PL 42231617 A PL42231617 A PL 42231617A PL 240405 B1 PL240405 B1 PL 240405B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sialyltransferase
- identity
- seq
- monoclonal antibody
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 11
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 title description 2
- MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 6,6-dimethyl-1-[3-(2,4,5-trichlorophenoxy)propoxy]-1,6-dihydro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound CC1(C)N=C(N)N=C(N)N1OCCCOC1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- 229960003824 ustekinumab Drugs 0.000 claims description 75
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 36
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 30
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 claims description 30
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 26
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 19
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 claims description 17
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 10
- 125000003169 alpha-Gal epitope group Chemical group [C@H]1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](O[C@@H]([C@@H]1O)CO)O[C@H]1[C@@H]([C@H](C(O[C@@H]1CO)*)NC(C)=O)O)O 0.000 claims description 8
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N N-glycoloyl-beta-neuraminic acid Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 141
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 description 17
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 17
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 16
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 9
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 8
- SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N N-glycoloyl-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(NC(=O)CO)C(O)CC(=O)C(O)=O SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 7
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 7
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 235000008995 european elder Nutrition 0.000 description 6
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 6
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 5
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 5
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 5
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 5
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 5
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 5
- 240000006028 Sambucus nigra Species 0.000 description 5
- 235000003142 Sambucus nigra Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 5
- 229940124829 interleukin-23 Drugs 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108010054255 CMP-N-acylneuraminate phosphodiesterase Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029945 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- AVWQQPYHYQKEIZ-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-dodecylbenzenesulfonate;3-dodecylbenzenesulfonate;4-dodecylbenzenesulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].CCCCCCCCCCCCC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1.CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O AVWQQPYHYQKEIZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 BEH Glycan Chemical class 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N CMP-N-acetyl neuraminic acid Natural products O1C(C(O)C(O)CO)C(NC(=O)C)C(O)CC1(C(O)=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N CMP-N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@]1(C(O)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000666730 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000208829 Sambucus Species 0.000 description 1
- 235000018735 Sambucus canadensis Nutrition 0.000 description 1
- 102100038410 T-complex protein 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 description 1
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 235000007123 blue elder Nutrition 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000007124 elderberry Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940113601 irrigation solution Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003863 physical function Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229940071598 stelara Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
PL 240 405 B1
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek jest ukierunkowany na sposób otrzymywania przeciwciała monoklonalnego, które jest zasadniczo identyczne z ustekinumabem, obejmujący etap hodowania komórki CHO, która koekspresjonuje wymienione przeciwciało i aktywną a2,6-sialilotransferazę, jak dodatkowo zdefiniowano w zastrzeżeniach. W porównaniu do ustekinumabu otrzymanego według sposobu ze stanu techniki, przeciwciało uzyskane za pomocą sposobu według niniejszego wynalazku wykazuje brak epitopów α-Gal oraz brak lub mniejszą ilość glikozylacji zawierających NGNA, który dla ludzi może być immunogenny. Przeciwciało otrzymane sposobem według niniejszego wynalazku wykazuje ponadto wysoki stopień fukozylacji rdzenia i sialilacji. Dodatkowo opisano kompozycję farmaceutyczną zawierającą wymienione przeciwciało oraz jej zastosowania medyczne. Na koniec, poprzez niniejsze ujawnienie zapewnia się również komórkę CHO, która koekspresjonuje przeciwciało i aktywną a2,6-sialilotransferazę oraz hodowlę komórkową zawierającą wymienioną komórkę CHO.
TŁO WYNALAZKU
Rekombinowane, terapeutyczne przeciwciało monoklonalne ustekinumab sprzedawane jest przez Jannsen-Cilag pod nazwą handlową Stelara, a wcześniejsza jego nazwa to CNTO-1275. Ustekinumab jest w pełni humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym IgG1 kappa, złożonym z 1326 reszt aminokwasowych, z dwoma identycznymi łańcuchami ciężkimi i lekkimi połączonymi kowalencyjnymi wiązaniami disiarczkowymi oraz niekowalencyjnymi oddziaływaniami pomiędzy łańcuchami ciężkim/ciężkim i ciężkim/lekkim. Przeciwciało zawiera pojedyncze miejsce N-glikozylacji na Asp299 każdego łańcucha ciężkiego i ma całkowitą masę cząsteczkową wynoszącą około 148 600 Da. Głównym źródłem heterogenności masy cząsteczkowej i ładunku są modyfikacje potranslacyjne spowodowane różnymi glikoformami i częściową utratą C-końcowej lizyny. Ustekinumab jest ukierunkowany na podjednostkę p40 występującą w dwóch cytokinach, interleukinie 12 (IL-12) i interleukinie 23 (IL-23), co zapobiega ich oddziaływaniu z oraz przekazywaniu sygnałów przez ich receptor. Wytwarzanie IL-12 i IL-23 jest kluczowe w chorobach zapalnych. Od 2009 roku ustekinumab jest zatwierdzony w Kanadzie, Europie i Stanach Zjednoczonych do leczenia umiarkowanych do ciężkich plam łuszczycowych. W badaniach Fazy II sprawdzono go pod kątem sarkoidozy i tocznia rumieniowatego układowego, a w dwóch badaniach Fazy III pod kątem leczenia łuszczycy. W 2013, FDA zatwierdziła zastosowanie ustekinumabu do leczenia łuszczycowego zapalenia stawów. W listopadzie 2011, w kolejnym badaniu wykazano potencjał ustekinumabu do leczenia ciężkiej choroby Crohna. Według raportu oceniającego Europejskiej Agencji ds. Leków (European Medicines Agency), ustekinumab jest wytwarzany w linii komórkowej mysiego szpiczaka C463A, która pochodzi z komórek Sp2/0, poprzez zastosowanie wektora ekspresyjnego opartego na pSV2gpt. Następnie przeciwciało jest oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa z zastosowaniem Białka A, chromatografii kationowymiennej, chromatografii anionowymiennej, filtracji usuwającej wirusa i zatężania poprzez ultrafiltrację i diafiltrację. Oczyszczone przeciwciało jest formułowane w stężeniu 45 mg/ml lub 90 mg/ml w 0,01 M buforowanym roztworze L-histydyny, zawierającym 8,5% sacharozę jako środek tonizujący, 0,001% polisorbat 80, pH 6,0.
Nieodłączną cechą terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych (mAb), które są otrzymywane w systemach ekspresyjnych specyficznej linii komórkowej, są profile modyfikacji potranslacyjnych charakterystycznych dla tej linii komórkowej gospodarza. W zależności od linii komórkowej systemu ekspresyjnego, szczególnie mocno mogą być zróżnicowane profile N-glikozylacji. Wzorce glikozylacji decydują o stabilności i funkcjonalności powstałych glikokoniugatów. Glikozylacja nadaje białku funkcjonalną odmienność, a błędna glikozylacja białek prowadzi często do białek nieaktywnych lub nieprawidłowych.
Przykładowo, większość linii komórkowych pochodzenia mysiego zawiera dodatkowy enzym glikozylacyjny określany jako a1,3-galaktozylotransferaza, który pośredniczy w przenoszeniu reszt Gal z UDP-Gal w konfiguracji α do reszt Gal wewnętrznych i/lub eksponowanych. U ludzi występują przeciwciała przeciwko tym, tak zwanym, epitopom aGal.
PL 240 405 Β1
ΝΑΝΑ—Gal—Gn—M Fuc \ I
M—Gn—Gn—Asn /
NANA—Gal—Gn—M aGal—Gal—Gn—M Fuc \ I
M—Gn—Gn—Asn /
aGal—Gal—Gn—M
Glikozylacja ludzkich IgG
Glikozylacja z epitopami aGal
Asn = asparagina; Gn = N-acetyloglukozamina; Fuc = fukoza; M = mannoza; Gal = galaktoza; NANA = kwas N-acetyloneuraminowy
Inna różnica pomiędzy glikozylacja z ludzkich i mysich linii komórkowych jest taka, że mysie linie komórkowe powodują glikozylacje obejmujące kwas N-glikoliloneuraminowy (NGNA) oprócz lub zamiast kwasu N-acetyloneuraminowego (NANA). Uważa się, że glikoproteiny zawierające reszty NGNA są dla ludzi immunogenne.
Dodatkowo, choć ponad 95% glikozylacji przeciwciał pochodzenia ludzkiego zawiera reszty rdzeniowe fukozy (Fuc na schemacie powyżej), około 10-40% glikanów przeciwciał pochodzących z komórek mysich nie wydaje się zawierać reszt rdzeniowych Fuc rdzenia. Wykazano jednak, że nieobecność rdzeniowej Fuc w przeciwciałach poprawia aktywność ADCC i wpływa na funkcje efektorowe przeciwciał terapeutycznych.
Powyższe mankamenty można przezwyciężyć stosując linię komórkową pochodzenia ludzkiego, taką jak komórki Per.C6. Komórek tych nie można jednak hodować przy wysokim zagęszczeniu komórek i nie są one optymalne pod względem wydajności wytwarzania.
Komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) stanowią powszechnie stosowany system wytwarzania, który umożliwia glikozylowanie białek w sposób podobny do tego, w jaki robią to komórki ludzkie. Przeciwciała wytworzone w komórkach CHO zawierają głównie oligosacharydy z fukozylacją rdzenia, tak jak przeciwciała wytwarzane w komórkach ludzkich. Przeciwciała pochodzące z komórek CHO zawierają jednak jedynie reszty kwasu sialowego przyłączone w pozycji a2,3, podczas gdy przeciwciała pochodzenia ludzkiego zawierają również reszty kwasu sialowego przyłączone w pozycji a2,6.
Bragonzi i wsp. w Biochimica et Biophysica Acta 1474: 273-282 (2000) podają, że wadliwą sialilację w komórkach CHO można skorygować poprzez transfekowanie komórek konstruktem ekspresyjnym a2,6-sialilotransferazy z wątroby szczura. Onitsuka i wsp. w Appl. Microbiol Biotechnol 94: 69-80 (2011) donoszą, że komórki CHO zachowują gen kodujący a2,6-sialilotransferazę, ale jego ekspresja jest mocno supresjonowana i regulowana. Onitsuka i wsp. sklonowali w związku z tym gen a2,6-sialilotransferazy i nadekspresjonowali go w komórkach CHO w postaci związanej z błoną i rozpuszczalnej stosując wektor ekspresyjny pcDNA3 pod kontrolą promotora SV40. Choć Onitsuka i wsp. podają, że komórki te mogą mieć istotny wpływ na zwiększenie sialilacji przeciwciał, np. poprzez możliwe przedłużenie okresu półtrwania w surowicy, autorzy wskazują również na możliwe działania negatywne spowodowane nadekspresją a2,6-sialilotransferazy: obniżenie specyficznego wzrostu i szybkości wytwarzania, oraz niskie maksymalne stężenie komórek. W celu przezwyciężenia tych przeszkód, autorzy sugerują regulowanie ekspresji poprzez właściwe dodawanie pożywki do hodowli komórkowych lub poprzez regulowanie ekspresji a2,6-sialilotransferazy za pomocą regulatorowego systemu ekspresyjnego, takiego jak system Tet-on/off i promotora wrażliwego na temperaturę.
Ponieważ oryginalna linia komórkowa CHO została opisana w 1956, opracowano wiele wariantów tej linii komórkowej. W jednym ze szczepów, CHO DG44, oba allele w locus DHFR zostały całkowicie wyeliminowane (Urlaub et al. Celi, 33: 405-412 (1983)). Został on jednak scharakteryzowany jedynie jako mający niedobór DHFR i nie został nazwany (jedenasty z 12 klonów poddanych badaniu przesiewowemu, strona 408). Po raz pierwszy DG44 został nazwany i scharakteryzowany w Urlaub i wsp., Somatic Celi and Molec. Genet., 12: 555-566 (1986). Te szczepy z niedoborem DHFR wymagają do wzrostu glicyny, hipoksantyny i tymidyny.
W WO 2011/019619 ujawniono zastosowanie linii komórkowych gospodarza DHFR- CHO do otrzymywania przeciwciał monoklonalnych.
W EP 2 202 307 A1 opisano otrzymywanie przeciwciał poprzez zastosowanie, między innymi, komórek CHO zawierających zwiększoną liczbę kopii DNA kodującego wymienione przeciwciało.
PL 240 405 B1
W WO 2006/070011 A1, WO 2009/127826 A1, WO 2011/042688 A1, WO 2013 093/760 A2 i US 2006/0099685 opisano otrzymywanie glikoprotein, takich jak erytropoetyna (EPO), ludzka gonadotropina kosmówkowa (hGC), hormon folikulotropowy (FSH), hormon luteinizujący (LH), czynnik VIII i czynnik von Willebrand w ludzkiej linii komórkowej Per.C6 nadekspresjonującej a2,6-sialilotransferazę i/lub a2,3-sialilotransferazę.
W WO 2005/080585 A1 zaproponowano kilka strategii dla zwiększenia stopnia sialilacji rekombinowanych glikoprotein, w tym (i) otrzymywanie komórek gospodarza, które nadekspresjonują poszczególne sialilotransferazy lub galaktozylotransferazy, (ii) zapobieganie degradacji kwasu sialowego gospodarza poprzez regulację enzymów glikohydrolitycznych, (iii) hodowanie komórek gospodarza wytwarzających rekombinowane glikoproteiny w obecności dodatkowych koniugatów cukrowych i innych substratów celem zwiększenia wytwarzania oligosacharydów, (iv) zróżnicowanie warunków hodowli, (v) mutacja białka do wprowadzania dodatkowych łańcuchów węglowodanowych, a przez to większej ilości kwasów sialowych, (vi) i sialilacja całkowicie in vitro za pomocą oczyszczonych sialilotransferaz po wytworzeniu glikoproteiny.
Celem wynalazku było zapewnienie sposobu otrzymywania przeciwciała monoklonalnego ustekinumabu wykazującego mniej immunogenną glikozylację, bez ograniczenia gęstości komórek i wydajności otrzymywania. Celem było szczególnie zapewnienie systemu ekspresyjnego zapewniającego wyższe wydajności wytwarzania z jednoczesnym utrzymaniem lub nawet poprawieniem jakości, bezpieczeństwa i skuteczności produktu przeciwciałowego.
ISTOTA WYNALAZKU
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przeciwciała monoklonalnego, którym jest ustekinumab, charakteryzujący się tym, że obejmuje etapy: hodowania komórki CHO DG44, która koekspresjonuje przeciwciało monoklonalne i aktywną a2,6-sialilotransferazę, do uzyskania ekspresji tego przeciwciała i jego sialilacji przez a2,6-sialilotransferazę; oraz izolowania przeciwciała monoklonalnego z hodowli komórkowej z etapu (a), przy czym:
- przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2,
- komórka CHO DG44 ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę posiadającą sekwencję aminokwasową wybraną spośród: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 5,
- ekspresja rekombinowanej a2,6-sialilotransferazy jest pod kontrolą promotora wybranego spośród SV40, CMV, β-aktyny i natywnego promotora a2,3-sialilotransferazy CHO DG44.
Korzystnie, hodowla komórki CHO DG44 jest prowadzona w warunkach hodowli komórkowej bez surowicy i/lub bez białka, korzystnie w hodowli zawiesinowej.
Korzystnie, N-glikozylacja przeciwciała monoklonalnego otrzymanego w etapie (b) jest prowadzona z pominięciem epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA.
Korzystnie, w etapie (b) izoluje się przeciwciało monoklonalne posiadające stopień sialilacji wynoszący 32% lub więcej oraz posiadające stopień fukozylacji rdzenia wynoszący ponad 90%, przy czym jego N-glikozylacja nie obejmuje epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne, którym jest ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, przy czym: - stopień sialilacji tego przeciwciała wynosi 32% lub więcej, - stopień fukozylacji rdzenia tego przeciwciała wynosi ponad 90%, natomiast - N-glikozylacja tego przeciwciała nie obejmuje epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA.
KRÓTKI OPIS WYNALAZKU
Glikozylacja odgrywa dominującą rolę w określaniu funkcji, farmakokinetyki, farmakodynamiki, stabilności i immunogenności bioterapeutyków. Istnieje wiele fizycznych funkcji N-glikozylacji w mAb, takich jak wpływanie na jego rozpuszczalność i stabilność, odporność na proteazy, wiązanie do receptorów Fc, transport komórkowy i czas półtrwania w układzie krążenia in vivo. Jednocześnie, szczep produkcyjny wykazuje wysoki pik stężenia żywotnych komórek i osiąga wydajność wytwarzania wyższą, niż wydajność wytwarzania podana dla systemu ekspresyjnego SP2/0.
Niniejsi wynalazcy opracowali sposób otrzymywania przeciwciała monoklonalnego, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ
PL 240 405 B1
ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2, przy czym sposób obejmuje etapy:
(a) hodowania komórki CHO, która koekspresjonuje przeciwciało monoklonalne i aktywną α2,6-sialilotransferazę w warunkach sprzyjających ekspresji wymienionego przeciwciała i jego sialilacji przez wymienioną a2,6-sialilotransferazę; oraz (b) otrzymywania przeciwciała monoklonalnego z hodowli komórkowej z etapu (a).
W korzystnym przykładzie wykonania wymienionym przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab mający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, a komórka CHO ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę pochodzenia ludzkiego (SEQ ID NO: 3), pochodzącą od chomika (SEQ ID NO: 4) lub pochodzącą od szczura (SEQ ID NO: 5), która wykazuje aktywność a2,6-sialilotransferazy. W jeszcze korzystniejszym przykładzie wykonania problemy związane z nadekspresją a2,6-sialilotransferazy są przezwyciężane poprzez wprowadzenie ekspresji wymienionej rekombinowanej a2,6-sialilotransferazy pod kontrolę promotora wybranego spośród β-aktyny i natywnego promotora a2,3-sialilotransferazy z CHO. Dodatkowo korzystne jest, że komórka CHO przystosowana jest do hodowli zawiesinowej, jak również warunków hodowli komórkowej bez surowicy i/lub bez białka, np. przy czym komórką CHO jest komórka CHO DG44.
Przeciwciało monoklonalne uzyskane za pomocą sposobu według niniejszego ujawnienia posiada kilka charakterystycznych, korzystnych cech. Niniejszy wynalazek jest zatem również ukierunkowany na przeciwciało monoklonalne, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2, przy czym jego N-glikozylacja nie zawiera epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA. Wymienionym przeciwciałem monoklonalnym jest korzystnie ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. Przeciwciało monoklonalne według niniejszego ujawnienia wykazuje stopień sialilacji wyższy niż 18%, korzystnie wyższy niż 20%, korzystniej wyższy niż 22%, korzystniej wyższy niż 24%, korzystniej wyższy niż 26%, korzystniej wyższy niż 28%, jeszcze korzystniej wyższy niż 30%, a najkorzystniej stopień sialilacji wynoszący 32% lub wyższy; i/lub stopień fukozylacji rdzenia wyższy niż 40%, korzystnie wyższy niż 50%, korzystniej wyższy niż 60%, korzystniej wyższy niż 70%, korzystniej wyższy niż 80%, jeszcze korzystniej wyższy niż 85%, a najkorzystniej wyższy niż 90%.
Dodatkowo zapewnia się komórkę CHO, która koekspresjonuje przeciwciało monoklonalne, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2 oraz aktywną a2,6-sialilotransferazę; przy czym w szczególności wymienionym przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. Korzystne przykłady wykonania dotyczące a2,6-sialilotransferazy są takie, jak opisano powyżej. Podobnie, w niniejszym ujawnieniu opisano również hodowlę komórkową zawierającą ujawnioną niniejszym komórkę CHO.
Na koniec, niniejsze ujawnienie jest również ukierunkowane na kompozycję farmaceutyczną zawierającą przeciwciało otrzymywane sposobem według niniejszego ujawnienia i jak dodatkowo niniejszym opisano. Pod uwagę bierze się ponadto, że wymienione przeciwciało jest odpowiednie do zastosowania w leczeniu choroby wybranej spośród łuszczycy, łuszczycy plackowatej, łuszczycowego zapalenia stawów, choroby Crohna, sarkoidozy i tocznia rumieniowatego układowego, jak wykazano w badaniach klinicznych z zastosowaniem przeciwciała ustekinumabu ze stanu techniki otrzymanego w komórkach SP2/0.
SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNYCH PRZYKŁADÓW WYKONANIA
Bardziej szczegółowo, w niniejszym ujawnieniu zapewnia się sposób otrzymywania przeciwciała monoklonalnego, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2, przy czym sposób obejmuje etapy:
(a) hodowania komórki CHO DG44, która koekspresjonuje przeciwciało monoklonalne i aktywną a2,6-sialilotransferazę w warunkach sprzyjających ekspresji wymienionego przeciwciała i jego sialilacji przez wymienioną a2,6-sialilotransferazę; oraz (b) otrzymywania przeciwciała monoklonalnego z hodowli komórkowej z etapu (a).
W znaczeniu tu zastosowanym, wyrażenie „przeciwciało monoklonalne” dotyczy przeciwciała uzyskanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał tj. poszczególne przeciwciała stanowiące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, przy czym są skierowane przeciw pojedynczemu miejscu antygenowemu. Ponadto, w przeciwieństwie do preparatów
PL 240 405 Β1 przeciwciał poliklonalnych, które obejmują różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne skierowane jest przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. W dodatku do swojej swoistości, przeciwciała monoklonalne są syntetyzowane niezanieczyszczone przez inne przeciwciała. Przydawka „monoklonalne” wskazuje na cechę przeciwciała jako uzyskanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał.
Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciała monoklonalnego, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności, korzystnie co najmniej 98% identyczności, jeszcze korzystniej 99% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności, korzystnie co najmniej 98% identyczności, jeszcze korzystniej 99% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2. W najbardziej korzystnym przykładzie wykonania przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2.
Ogólnie, sekwencja aminokwasowa wykazuje „co najmniej x % identyczności” z inną sekwencją aminokwasową, kiedy identyczności sekwencji pomiędzy tymi dwiema przyrównanymi sekwencjami wynosi co najmniej x % w zakresie pełnej długości wskazanej niniejszym sekwencji aminokwasowej. Takie przyrównanie można przeprowadzić, przykładowo, stosując dostępne publicznie programy komputerowe do homologii, takie jak program „BLAST” dostępny na stronie internetowej NCBI pod adresem http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi, stosując wskazane tam ustawienia domyślne. W stanie techniki znane są dodatkowe sposoby wyliczania procent identyczności sekwencji zestawów sekwencji kwasów nukleinowych.
Korzystnie, przeciwciało monoklonalne według niniejszego ujawnienia zawiera jedynie (o ile w ogóle) podstawienia (semi-)konserwatywne. Podstawieniami konserwatywnymi są te, które zachodzą w obrębie rodziny aminokwasów powiązanych pod względem swoich łańcuchów bocznych i właściwości chemicznych. Przykładami takich rodzin są aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi, z kwasowymi łańcuchami bocznymi, z niepolarnymi, alifatycznymi łańcuchami bocznymi, z niepolarnymi, aromatycznymi łańcuchami bocznymi, z polarnymi łańcuchami bocznymi bez ładunku, z małymi łańcuchami bocznymi, z dużymi łańcuchami bocznymi itd. Typowymi podstawieniami semikonserwatywnymi i konserwatywnymi są:
| Aminokwas | Podstawienie konserwatywne | Podstawienie semikonserwatywne |
| A | G; S; T | U; V; C |
| C | A; V; L | Μ; I; F; G |
| D | E; N; Q | A; S; T; K; R; H |
| E | D; Q; N | A; 3; T; K; R; H |
| F | W; Y; L; Μ; H | I; V; A |
| G | A | S; N; T; D; E; N; Q |
| H | Y; F; K; R | L·; M; A |
| I | V; L; M; A | F; Y; W; G |
| K | R; H | D; E; N; Q; S; T; A |
| L | Μ; I; V; A | F; Y; W; H; C |
| M | L; I; V; A | F; Y; W; C; |
| N | Q | D; E; S; T; A; G; K; R |
| P | V; I | L; A; M; W; Y; S; T; C; F |
| Q | N | D; E; A; S; T; L; Μ; K; R |
| R | K; H | N; Q; S; T; D; E; A |
| S | A; T; G; N | D; E; R; K |
| T | A; S; G; N; V | D; E; R; K; I |
| V | A; L; I | Μ; T; C; N |
| w | F; Y; H | L; Μ; I; V; C |
| Y | F; W; H | L; Μ; I; V; C |
PL 240 405 B1
Specjalista w dziedzinie zauważy ponadto, że glicyny na pozycjach sterycznie wymagających nie powinny być podstawiane oraz że prolina nie powinna być wprowadzana do tych części białka, które mają strukturę helisy alfa lub kartki beta.
W znaczeniu tu zastosowanym, wyrażenie „jest ustekinumab” ma oznaczać, że przeciwciało monoklonalne według wynalazku ma takie same właściwości wiążące, jak ustekinumab ze stanu techniki, wytworzony w komórkach SP2/0. W szczególności, przeciwciało monoklonalne według niniejszego ujawnienia ma takie same CDRy i/lub wiąże się do tego samego epitopu na podjednostce p40 z IL-12 i IL-23, jak przeciwciało ustekinumab ze stanu techniki, wytworzone w komórkach SP2/0; oraz ma taką samą liczbę miejsc glikozylacji zlokalizowanych na tych samych pozycjach w obrębie cząsteczki przeciwciała. W najbardziej korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciało monoklonalne według niniejszego ujawnienia uzyskane w etapie (b) sposobu według niniejszego ujawnienia różni się od ustekinumabu ze stanu techniki wytworzonego w komórkach SP2/0 jedynie pod względem glikozylacji.
Oprócz przeciwciała monoklonalnego, komórka CHO DG44 podana w etapie (a) sposobu według niniejszego ujawnienia ekspresjonuje ponadto aktywną a2,6-sialilotransferazę, tj. enzym wykazujący aktywność według klasy enzymów EC 2.4.99.1. Określenie „aktywna” w etapie (a) sposobu według niniejszego ujawnienia ma wskazywać, że komórka CHO DG44 ekspresjonuje funkcjonalną a2,6-sialilotransferazę.
To, czy enzym jest funkcjonalny, można przetestować poprzez analizę glikozylacji przeciwciała monoklonalnego uzyskanego w etapie (b), przykładowo poddając przeciwciało analizie Western Blot i późniejszej immunodetekcji za pomocą lektyny z Sambucus nigra, jak dodatkowo opisano w Przykładzie 1, poniżej. Wyznakowana fluorescencyjnie lub biotynylowana lektyna z Sambucus nigra jest dostępna handlowo na przykład w Vector Laboratories (nr kat. FL-1301, nr kat. B-1305). Lektyna z Sambucus nigra, wyizolowana z kory bzu, wiąże się preferencyjnie do kwasu sialowego przyłączonego do końcowej galaktozy w układzie α-2,6.
Co do zasady, w sposobie według niniejszego ujawnienia można zastosować każdy enzym wykazujący aktywność według klasy enzymów EC 2.4.99.1, tj. wykazujący aktywność a2,6-sialilotransferazy, pod warunkiem, że wymieniony enzym wykazuje swoją aktywność w warunkach hodowlanych wymaganych również do ekspresji przeciwciała monoklonalnego. Jednak wykazano już, że niektóre a2,6-sialilotransferazy są użyteczne w ekspresji w systemie ekspresyjnym komórek CHO (np. a2,6-sialilotransferaza szczurza) i/lub są korzystne ponieważ pochodzą z tego samego organizmu, co komórka gospodarza (chomik) lub z tego samego organizmu, co przeciwciało monoklonalne, które ma zostać wytworzone (człowiek).
Zatem w korzystnym przykładzie wykonania, komórka CHO DG44 ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę wykazującą aktywność a2,6-sialilotransferazy i mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 (ludzka α2,6-sialilotransferaza), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 3.
W innym, podobnym, korzystnym przykładzie wykonania, komórka CHO DG44 ekspresj onuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę wykazującą aktywność a2,6-sialilotransferazy i mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 4 (a2,6-sialilotransferaza chomika), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 4.
W jeszcze innej alternatywie, komórka CHO DG44 ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę wykazującą aktywność a2,6-sialilotransferazy i mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 5 (a2,6-sialilotransferaza szczurza), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej
PL 240 405 B1 co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identycznoś ci i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 5.
Dobrą ekspresję w komórkach CHO DG44 można uzyskać, przykładowo, kiedy ekspresja wymienionej rekombinowanej a2,6-sialilotransferazy jest pod kontrolą konstytutywnego promotora aktywnego w komórkach CHO DG44. Pod uwagę bierze się niniejszym szczególnie promotory takie jak SV40 i CMV.
Z drugiej strony, Onitsuka i wsp. podali, że nadekspresja rekombinowanej a2,6-sialilotransferazy może zmniejszyć specyficzne szybkości wzrostu i wytwarzania oraz obniżyć maksymalne stężenie komórek. W celu przezwyciężenia tych przeszkód, autorzy sugerują regulowanie ekspresji poprzez właściwe dodawanie pożywki do hodowli komórkowych lub poprzez regulowanie ekspresji a2,6-sialilotransferazy za pomocą regulatorowego systemu ekspresyjnego, takiego jak system Tet-on/off i promotora wrażliwego na temperaturę. Regulacja ekspresji a2,6-sialilotransferazy poprzez dodawanie pożywki może się jednak okazać trudna, ponieważ wymagałoby to stałego monitorowania poziomu ekspresji a2,6-sialilotransferazy, a brak pożywki może ograniczyć optymalny wzrost komórek. W alternatywie zaproponowanej przez Onitsuka i wsp. etap hodowli wymaga dodatku tetracykliny. Dodatek antybiotyków jest jednak kosztowny i ogólnie niepożądany.
Niniejsi wynalazcy opracowali inne rozwiązanie poprzez zastosowanie promotora, który konstytutywnie ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę, ale którego ekspresja jest słabsza w porównaniu do ekspresji promotora SV40 lub CMV. Przykładem takiego słabszego promotora jest promotor β-aktyny, co jest ogólnie wiadome w stanie techniki. Onitsuka i wsp. w Appl. Microbiol Biotechnol 94: 69-80 (2011) podają, że chociaż komórki CHO DG44 ekspresjonują endogenny gen α2,3-sialilotransferazy, komórki CHO DG44 zachowują również gen kodujący a2,6-sialilotransferazę, ale jego ekspresja jest mocno ograniczona i regulowana. W związku z tym, w kolejnej alternatywie, można również zastosować promotor genu a2,3-sialilotransferazy lub promotor z ekspresjonowanego genu a2,3-sialilotransferazy, lub genu a2,6-sialilotransferazy od innych gatunków, np. od ludzi lub innych gatunków gryzoni. Sekwencje odpowiednich genów i ich sekwencje promotorowe można uzyskać z baz danych sekwencji nukleotydowych i można je sklonować z DNA chromosomowego, stosując wyłącznie rutynowe sposoby lub można je nawet syntezować sztucznie. W korzystnym przykładzie wykonania rekombinowana a2,6-sialilotransferaza jest pod kontrolą promotora wybranego spośród promotora β-aktyny i natywnego promotora a2,3-sialilotransferazy z CHO.
W jeszcze innym przykładzie wykonania można po prostu wymienić mocno ograniczany i regulowany region promotorowy genu endogennej a2,6-sialilotransferazy CHO DG44 na promotor bardziej dostępny, np. promotor wybrany spośród SV40, CMV, β-aktyny, region promotorowy genu a2,3-sialilotransferazy CHO DG44 lub region promotorowy genu a2,3-sialilotransferazy, lub genu a2,6-sialilotransferazy innych gatunków, który jest funkcjonalny w komórce CHO DG44. W konsekwencji, komórka CHO DG44 zostanie zmodyfikowana do ekspresjonowania genu swojej endogennej a2,6-sialilotransferazy.
Pod uwagę bierze się dalsze modyfikacje komórki CHO DG44. Przykładowo, komórkę CHO można zmodyfikować do obniżenia, korzystnie zniesienia, aktywności hydrolazy kwasu CMP-N-acetyloneuraminowego poprzez zastosowanie rutynowych technik wyciszania genów lub nokautu genów. Sekwencja genowa hydrolazy kwasu CMP-N-acetyloneuraminowego jest dostępna publicznie w bazach danych banków genowych.
Jeżeli przeciwciało uzyskane w etapie (b) sposobu według niniejszego wynalazku jest przeznaczone do wprowadzenia do kompozycji farmaceutycznej, korzystne jest ogólnie, aby etap hodowli komórkowej przeprowadzać w zdefiniowanych warunkach, tj. w warunkach bez surowicy, a korzystniej w zdefiniowanej pożywce, takiej jak zdefiniowana chemicznie pożywka bez białek. Wiadomo ponadto, że syntezę białek można dodatkowo poprawić, jeżeli komórki CHO DG44 hoduje się w zawiesinie, ponieważ w takim przypadku następuje lepsze pobieranie składników odżywczych i tlenu. W związku z tym jest korzystnie zaadaptowana do warunków hodowli bez surowicy i/lub bez białka, i/lub do hodowli zawiesinowej.
Komórki CHO DG44 są dostępne handlowo i charakteryzują się tym, że są DHFR-ujemne. Komórkami zastosowanymi w poniższych przykładach są CHO DG44, które zaadaptowano do warunków hodowli komórkowej bez surowicy i bez białka. W niniejszym przypadku, osiągnięto to poprzez stopniowe obniżanie stężeń surowicy z 10% do 2%, do 0,5%, do 0,1% i do 0%. Komórki zaadaptowane do warunków bez surowicy można również hodować w pożywce bez białka. Pożywki odpowiednie do pozbawionej białka hodowli komórkowej komórek CHO DG44 również są dostępne handlowo.
PL 240 405 B1
Komórkę można utrzymywać i hodować w odpowiedniej mieszaninie temperatury i gazu (zazwyczaj 37°C, 5% CO2), opcjonalnie w inkubatorze komórkowym znanym specjaliście w dziedzinie i jak podano przykładowo w przykładach. Poza mieszaniną temperatury i gazu, najczęściej zróżnicowanym czynnikiem w systemach hodowli komórkowych jest pożywka hodowlana. Przepisy na pożywki hodowlane mogą różnić się, między innymi, pH, stężeniem glukozy, czynnikiem wzrostu i obecnością innych składników odżywczych. Pożywki hodowlane są albo dostępne handlowo, albo mogą być otrzymywane według składów, które można uzyskać z American Tissue Culture Collection (ATCC). W każdym z tych przypadków specjalista w dziedzinie upewni się, że warunki hodowli i pożywka hodowlana wybrane zostały tak, że sprzyjają ekspresji wymienionego przeciwciała, ekspresji wymienionej a2,6-sialilotransferazy, sialilacji przeciwciała przez wymienioną a2,6-sialilotransferazę. Przykładowo, pożywkę można suplementować prekursorami lub reagentami, takimi jak kwas CMP-N-acetyloneuraminowy dla a2,6-sialilotransferazy.
Etap (b) można przeprowadzić stosując standardowe techniki znane w dziedzinie, włączając chromatografię powinowactwa do Białka A. Przeciwciało można przykładowo oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa stosując Białko A, następnie chromatografię kationowymienną i chromatografię anionowymienną, filtracje usuwającą wirusy i zatężanie przez ultrafiltrację i diafiltrację, jak podano dla ustekinumabu oraz z zastosowaniem rutynowych technik.
W wyniku zastosowania sposobu według niniejszego ujawnienia, N-glikozylacja przeciwciała monoklonalnego uzyskanego w etapie (b) nie zawiera epitopów α-Gal; i/lub N-glikozylacja przeciwciała monoklonalnego uzyskanego w etapie (b) nie zawiera reszt NGNA, które są rozpoznawane przez układ immunologiczny człowieka. Przeciwciało monoklonalne uzyskane w etapie (b) w ramach N-glikozylacji zawiera jednocześnie zarówno kwas sialowy przyłączony w pozycji α2,6, jak i w pozycji α2,3, tak jak przeciwciało monoklonalne ustekinumab ze stanu techniki, otrzymane w mysiej linii komórkowej SP2/0.
Dodatkowo, przeciwciało uzyskane w etapie (b) będzie miało wysoki stopień sialilacji, który wskazuje się, jako przedłużający okres półtrwania przeciwciała w surowicy w przypadku podawania człowiekowi. Jak pokazano w przykładach, można uzyskać stopień sialilacji w zakresie od 18% do ponad 32%. W związku z tym, w korzystnym przykładzie wykonania przeciwciało monoklonalne uzyskane w etapie (b) ma stopień sialilacji wynoszący ponad 18%, korzystnie ponad 20%, korzystniej ponad 22%, korzystniej ponad 24%, korzystniej ponad 26%, korzystniej ponad 28%, jeszcze korzystniej ponad 30%, a najkorzystniej stopień sialilacji wynoszący 32% lub więcej. Stopień sialilacji można określić tak, jak przedstawiono w przykładach poniżej.
Przeciwciało uzyskane w etapie (b) ma ponadto wyższy stopień fukozylacji rdzenia w porównaniu do przeciwciał otrzymanych w mysich liniach komórkowych, takich jak komórki SP2/0. Ponieważ ustekinumab przeznaczony jest głównie do hamowania aktywności IL-12 i IL-23, działania ADCC, które wymagają oddziaływania z receptorami Fc, są mniej pożądane. Można to osiągnąć poprzez zwiększenie stopnia fukozylacji rdzenia, ponieważ wiadomo, że obniża to działania ADCC. W związku z tym korzystne jest, że przeciwciało monoklonalne uzyskane w etapie (b) ma stopień fukozylacji rdzenia wynoszący ponad 40%, korzystnie ponad 50%, korzystniej ponad 60%, korzystniej ponad 70%, korzystniej ponad 80%, jeszcze korzystniej ponad 85%, a najkorzystniej ponad 90%.
Stopień sialilacji i fukozylacji rdzenia można określić stosując dowolny, odpowiedni sposób umożliwiający glikoprofilowanie. Jednak w korzystnym przykładzie wykonania glikoprofilowanie przeprowadza się za pomocą multipleksowanej kapilarnej elektroforezy żelowej z detekcją fluorescencji wzbudzonej laserem (xCGE-LIF). Ten sposób jest w stanie techniki rutynowy, a glikoprofilowanie z zastosowaniem xCGE-LIF oferowane jest przez kilka firm w postaci usługi.
W stanie techniki znane są również inne sposoby (choć są mniej korzystne), przykładowo wysokowydajna chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych (HILIC) z detekcją fluorescencji. W tym sposobie zawartość N-glikanów określa się poprzez analizowanie glikanów uwolnionych enzymatycznie z białka wyznakowanego cząsteczką fluorescencyjną (np. 2-aminobenzamidem; 2-AB), następnie przeprowadza się wysokowydajną chromatografię cieczową oddziaływań hydrofilowych z detekcją fluorescencji (HILIC). W korzystnym przykładzie wykonania znakowanie przeprowadza się za pomocą 2AB z zastosowaniem następującego protokołu:
1) Denaturacja i deglikozylacja - w tym etapie stosujemy RapiGest SF (Waters, P/N 186002123) do denaturacji, DDT do redukcji, jodoacetamid (IAM) do alkilacji, a do deglikozylacji PGNazę F (New England Biolab, nr kat. P0704S). W skrócie, 100 μg próbki glikoproteiny rozpuszcza się w 50 mM wodorowęglany amonu (Sigma Aldrich, nr kat. 09830-500G) do końcowego stężenia wynoszącego około 1 mg/ml. Standard traktuje się w taki sam sposób. Do roztworu
PL 240 405 B1 dodaje się 50 μl RapiGest z 0,5% roztworu RapiGest, a reakcję inkubuje się przez 10 min w 22°C. Następnie do próbek dodaje się 4 μl 0,5 M DTT, a następnie inkubuje przez 30 min w 37°C. Po tej drugiej inkubacji do próbek dodaje się 4 μl 0,5 M IAM i inkubuje się je ponownie przez 30 min w 22°C w ciemności. Na koniec do każdej próbki dodaje się 1 μl roztworu 10 mU/μl PNGazy F i inkubuje się przez noc (około 18 godz.) w 37°C.
2) Ekstrakcja uwolnionych glikanów - do ekstrakcji uwolnionych glikanów stosuje się płytkę GlycoWorks HILIC μElution. Po ekstrakcji uwolnionych glikanów przeprowadza się etap obróbki kwasem mrówkowym. W tym etapie stosuje się niskie stężenie kwasu mrówkowego w celu przekształcenia wszystkich glikanów do wolnych glikanów redukujących, poprawiając w ten sposób ogólną wydajność znakowania FLR poprzez reduktywną aminację. W skrócie, do mieszaniny reakcyjnej uzyskanej w etapie 1) dodaje się 250 μ! acetonitrylu (Sigma Aldrich, nr kat. 360457-1L). Płytkę GlycoWorks HILIC μElution kondycjonuje się najpierw poprzez dodanie 200 μl wody Mili-Q i jej odessanie z zastosowaniem Vacuum Manifold, a następnie dodanie 200 μl 85% acetonitrylu i jego odessanie. Następnie wprowadza się próbki, a płytkę przemywa się trzy razy stosując każdorazowo 200 μl 85% acetonitrylu. Tacę na odpadki zastępuje się następnie 96-dołkową płytką zbierającą ze szklanymi wkładami. Glikany wymywa się dwa razy stosując za każdym razem 100 μl 100 octanu amonu w 5% acetonitrylu. Eluaty przenosi się następnie do nowej probówki typu Eppendorf i do każdej próbki dodaje się 100 μl 1% roztworu kwasu mrówkowego, a następnie przeprowadza się inkubację przez 40 minut w 22°C. Następnie glikany osusza się stosując odparowanie próżniowe, co pozwala osuszyć je całkowicie. Konieczne jest całkowite osuszenie próbki przed przejściem do następnego etapu.
3) Reakcja znakowania glikanów FLR - do znakowania stosuje się mieszaninę kwasu octowego, DMSO, 2-AB i cyjanoborowodorek sodu. W skrócie, mieszaninę znakującą otrzym uje się poprzez zmieszanie 300 μl kwasu octowego z 700 μl DMSO i 10 mg 2AB. Całość dodaje się do fiolki z cyjanoborowodorkiem sodu w zestawie odczynników GlycoWorks (Waters, nr kat. 186007034). Mieszaninę należy chronić przed światłem i zużyć w ciągu godziny. Do każdej wysuszonej próbki dodaje się 10 μl roztworu znakującego, co zapewnia całkowite odtworzenie rozpuszczonych glikanów w znaczniku 2AB. Następnie próbki inkubuje się przez 3,5 godz. w 65°C z ochroną przed światłem.
4) Usuwanie nadmiaru odczynnika znakującego - w tym celu stosuje się nowy dołek płytki Glycoworks HILIC μElution. Bardziej szczegółowo, do 10 μl próbki glikanu wyznakowanego przez 2AB dodaje się 100 μl acetonitrylu. Następnie mieszaninę wprowadza się do dołka i eluuje z płytki Glycoworks HILIC μElution poprzez zastosowanie takich samych warunków, jak podano w etapie 2, powyżej. Następnie glikany osusza się poprzez odparowanie. Glikany można przechowywać w ultraczystej wodzie w - 20°C do chwili użycia.
Kompozycję glikanów wyznakowanych przez 2-AB rozdziela się następnie i określa poprzez pomiar HILIC-UPLC. Rozdział chromatograficzny przeprowadza się za pomocą wysokowydajnej, anionowymiennej chromatografii cieczowej w systemie UPLC H-Class Bio System z zastosowaniem detekcji fluorescencji (wzbudzenie przy 330 nm, emisja przy 420 nm) pod kontrolą oprogramowania Empower™ Software. Przy aplikacji eluentów stosuje się Waters BEH Glycan (1,7 μm, 4,6 mm śr. wewn. * 150 mm): A: Acetonitryl i B: 0,1M mrówczan amonu o pH 4,4 doprowadzonym kwasem mrówkowym. Glikany rozdziela się stosując gradient liniowy od 22% B do 44,1% B w ciągu 38,5 min, przy prędkości przepływu 0,7 ml/min i temperaturze kolumny 60°C. Po gradiencie stosuje się etap przemywania 100% eluentem B w ciągu 2 min i ponownego równoważenia za pomocą 78% rozpuszczalnika A. Całkowity czas pracy wynosi 48 min. Dane są oceniane z zastosowaniem oprogramowania Waters Empower 3. Ocenę piku przeprowadza się na podstawie czasu retencji. Skład próbki określono poprzez wykrycie pików w oparciu o ich czas retencji, a względne proporcje każdego z pików wyliczono na podstawie obszarów pików. Zapewnia się zatem ponadto przeciwciało monoklonalne, które można otrzymać sposobem według niniejszego ujawnienia, którym jest przeciwciało monoklonalne ustekinumab o właściwościach wiązania przeciwciała ustekinumabu ze stanu techniki, ale z korzystniejszym wzorcem glikozylacji. Zapewnia się szczególnie przeciwciało monoklonalne, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności, korzystnie co najmniej 98% identyczności, jeszcze korzystniej 99% identyczności z pełne j długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności, korzystnie co najmniej 98% identyczności, jeszcze korzystniej 99% identyczności z pełnej długości sekwencją amino
PL 240 405 B1 kwasową SEQ ID NO: 2, którego N-glikozylacja nie zawiera epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA. W najbardziej korzystnym przykładzie wykonania wymienionym przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2.
Dodatkowe cechy charakterystyczne są takie, jak opisano powyżej. W szczególności, aby wymienić te najbardziej interesujące, przeciwciało monoklonalne wykazuje stopień sialilacji wyższy niż 18%, korzystnie wyższy niż 20%, korzystniej wyższy niż 22%, korzystniej wyższy niż 24%, korzystniej wyższy niż 26%, korzystniej wyższy niż 28%, jeszcze korzystniej wyższy niż 30%, a najkorzystniej stopień sialilacji wynoszący 32% lub wyższy; i/lub przeciwciało monoklonalne wykazuje stopień fukozylacji rdzenia wyższy niż 40%, korzystnie wyższy niż 50%, korzystniej wyższy niż 60%, korzystniej wyższy niż 70%, korzystniej wyższy niż 80%, jeszcze korzystniej wyższy niż 85%, a najkorzystniej wyższy niż 90%. Stopień sialilacji i fukozylacji rdzenia można określić stosując wysokowydajną chromatografię cieczową oddziaływań hydrofilowych (HILIC) z detekcją fluorescencji, jak opisano powyżej.
Przeciwciało z opisanymi powyżej korzystnymi właściwościami można odpowiednio wprowadzać do kompozycji farmaceutycznej, korzystnie w kombinacji z co najmniej jednym farmaceutycznie dopuszczalnym rozczynnikiem. Przykładowo, przeciwciało można formułować w sposób podobny do przeciwciała ustekinumab ze stanu techniki, np. w stężeniu 45 mg/ml lub 90 mg/ml w 0,01 M buforowanym roztworze L-histydyny, zawierającym 8,5% sacharozę jako środek tonizujący, 0,001% polisorbat 80, pH 6,0.
Przeciwciało lub kompozycję farmaceutyczną można odpowiednio stosować w leczeniu choroby wybranej spośród łuszczycy, łuszczycy plackowatej, łuszczycowego zapalenia stawów, choroby Crohna, sarkoidozy i tocznia rumieniowatego układowego. Jak podano powyżej, od 2009 ustekinumab jest zatwierdzony do leczenia umiarkowanej do poważnej łuszczycy plackowatej i został z powodzeniem przetestowany pod kątem leczenia sarkoidozy i tocznia rumieniowatego układowego, oraz w dwóch badaniach Fazy III pod kątem leczenia łuszczycy. W 2013, FDA zatwierdziła zastosowanie ustekinumabu do leczenia łuszczycowego zapalenia stawów. W listopadzie 2011, w kolejnym badaniu wykazano potencjał ustekinumabu do leczenia ciężkiej choroby Crohna.
Sposób według niniejszego ujawnienia nie tylko zapewnia przeciwciało monoklonalne o nowych właściwościach, ale również komórkę CHO DG44, która koekspresjonuje przeciwciało monoklonalne, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2, oraz aktywną a2,6-sialilotransferazę.
Dodatkowe cechy charakterystyczne wymienionej komórki CHO DG44 są takie, jak opisano powyżej w odniesieniu do sposobu według niniejszego ujawnienia. Szczegółowo, wymienionym przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności, korzystnie co najmniej 98% identyczności, jeszcze korzystniej 99% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności, korzystnie co najmniej 98% identyczności, jeszcze korzystniej 99% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2. Wymienionym przeciwciałem monoklonalnym jest najkorzystniej ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2.
W kolejnych korzystnych przykładach wykonania, komórka CHO DG44 ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę wykazującą aktywność a2,6-sialilotransferazy i mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 (ludzka α2,6-sialilotransferaza), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 3; lub komórka CHO DG44 ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę wykazującą aktywność a2,6-sialilotransferazy i mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 4 (a2,6-sialilotransferaza chomika), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana α2, 6-sialilotransferaza ma pełnej długości sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 4; lub
PL 240 405 B1 komórka CHO DG44 ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę wykazującą aktywność a2,6-sialilotransferazy i mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 5 (a2,6-sialilotransferaza szczurza), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma pełnej długości sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 5.
Ekspresja wymienionej rekombinowanej a2,6-sialilotransferazy może być pod kontrolą promotora wybranego spośród promotora SV40, CMV, β-aktyny i natywnego promotora a2,3-sialilotransferazy z CHO DG44. W niektórych przykładach wykonania promotorem jest promotor dla β-aktyny lub natywny promotor a2,3-sialilotransferazy CHO. Alternatywnie, komórka CHO DG44 może zostać zmodyfikowana do ekspresjonowania genu swojej endogennej a2,6-sialilotransferazy. Jeżeli celem jest otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych do celów medycznych, komórkę CHO DG44 adaptuje się do warunków hodowli komórkowej bez surowicy i/lub bez białka; i/lub adaptuje się do hodowli zawiesinowej. Komórka CHO DG44 jest korzystnie zaadaptowana do warunków hodowli komórkowej bez surowicy i/lub bez białka; i do hodowli zawiesinowej. W celu dodatkowego zwiększenia i poprawy sialilacji, komórkę CHO DG44 można zmodyfikować do obniżenia, korzystnie zniesienia aktywności hydrolazy kwasu CMP-N-acetyloneuraminowego.
Dodatkowo, w niniejszym ujawnieniu zapewnia się również hodowlę komórkową zawierającą komórkę CHO DG44, jak niniejszym opisano powyżej. Co ciekawe, hodowla komórkowa według niniejszego ujawnienia nie tylko charakteryzuje się tym, że wytworzone przeciwciało ma korzystny wzorzec glikozylacji, ale hodowla komórkowa wykazuje jednocześnie wysoki pik stężenia żywotnych komórek i lepszą wydajności wytwarzania w porównaniu do systemu ekspresji SP2/0.
W znaczeniu tu zastosowanym, wyrażenie „pik stężenia żywotnych komórek” ma oznaczać pik stężenia żywotnych komórek określony poprzez zastosowanie barwienia błękitem trypanu. W korzystnym przykładzie wykonania do tego określenia stosuje się Vi-Cell XR Viability Analyzer. Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer jest systemem obrazowania wideo do analizowania komórek drożdżowych, owadzich i ssaczych w pożywce hodowlanej lub w zawiesinie. Automatyzuje on protokół wykluczania barwnika błękitu trypanu i został zaprojektowany do analizowania ogromnej różnorodności typów komórek. Oprogramowanie zawiera funkcje monitorowania bioreaktorów i innych procesów zachodzących w hodowli komórkowej i zostało zaprojektowane tak, aby spełniać wymagania regulacji Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (US Food and Drug Administration, FDA) dotyczące rejestrów elektronicznych i podpisów elektronicznych (CFR 21, część 11). Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer działa w zakresie stężeń od 50 000 do 10 000 000 komórek na ml i zakresie wielkości komórek od 2 μm do 70 μm. Pomiar ogólnego stanu hodowli komórkowych wymaga dokładnych pomiarów zarówno stężenia komórek, jak i procentu komórek żywotnych lub żywych.
Sposób wykluczania błękitu trypanu jest ogólnie znanym sposobem określania żywotności komórek. Kiedy komórki umierają, ich błony stają się przepuszczalne, co umożliwia pobieranie barwnika błękitu trypanu. W efekcie komórki martwe lub nieżywotne stają się ciemniejsze niż komórki żywotne. Ten kontrast mierzy się w celu określenia żywotności. Beckman Coulter Vi-CELL XR automatyzuje sposób wykluczania barwnika błękitu trypanu. Wykorzystując technologię wideo-rejestracji i obróbki próbek, ViCELL XR pobiera próbkę komórek i dostarcza ją do kuwety przepływowej i kamery do obrazow ania. Następnie Vi-CELL XR rejestruje do 100 obrazów celem określenia żywotności komórek. Oprogramowanie określa, które komórki zaabsorbowały barwnik błękitu trypanu, a które nie. Komórki, które zaabsorbowały barwnik błękitu trypanu wydają się ciemniejsze, zatem mają niższe wartości na skali odcieni szarości. Komórki z wyższymi wartościami na skali odcieni szarości uważa się za żywotne. W skrócie, protokół obejmuje następujące etapy:
1. Umieść minimum 0,5 ml (maks. 2,5 ml) próbki w pojemniku na próbkę.
2. Umieść pojemnik na próbkę w dostępnej pozycji na karuzeli.
3. Zaloguj próbki poprzez kliknięcie przycisku Log in sample (logowanie próbki).
4. Wybierz pozycję pojemnika z próbką na karuzeli (jeżeli dotyczy).
5. Wciśnij Sample ID (ID próbki).
6. Wybierz Cell type (typ komórki).
7. Wybierz Dilution factor (współczynnik rozcieńczenia), jeżeli próbka została wstępnie rozcieńczona.
PL 240 405 B1
8. Wciśnij OK.
9. Naciśnij Start queue (uruchom kolejkę), aby rozpocząć analizę.
Pik stężenia żywotnych komórek wynosi korzystnie ponad 1,0 x 106 komórek/ml, tak jak ponad 1,2 x 106 komórek/ml, korzystniej ponad 1,4 x 106 komórek/ml, tak jak ponad 1,5 x 106 komórek/ml, korzystniej ponad 1,6 x 106 komórek/ml, korzystniej ponad 1,8 x 106 komórek/ml, korzystniej ponad 2,0 x 106 komórek/ml i najkorzystniej ponad 2,1 x 106 komórek/ml.
Dla specjalisty w dziedzinie będzie zrozumiałe, że wydłużony czas fermentacji może zwiększyć wydajności wytwarzania linii komórkowej pod względem ilości docelowego białka, które jest uzyskiwane na objętość hodowli komórkowej, podczas gdy skrócenie czasu fermentacji będzie zazwyczaj skutkować obniżoną wydajnością. Celem wyjaśnienia, w znaczeniu tu zastosowanym pojęcie „wydajności wytwarzania” ma oznaczać wydajności wytwarzania 11-dniowego procesu określoną z zastosowaniem chromatografii z Białkiem A. Bardziej szczegółowo, pomiary UPLC (system UPLC, klasa bio H) do ilościowego określenia ustekinumabu w supernatantach z hodowli komórkowej przeprowadza się z zastosowaniem HPLC Białka A. W skrócie, supernatanty z hodowli komórkowej nanoszono na kolumnę z Białkiem A (POROS A 20 2,1 x 30 mm, Applied Biosystems) z 50 mM buforem fosforanu sodu, 0,15 M NaCl, pH 7,5 (faza mobilna A), a związany ustekinumab eluowano poprzez przejście do 50 mM buforu fosforanu sodu, 0,15 M NaCl, pH 2,5 (faza mobilna B). Roztworem do przemywania i przepłukiwania jest 50 mM bufor fosforanu sodu, pH 7,5. Gradient rozpoczął się wstępnym zrównoważeniem za pomocą 100% buforu A w 0,8 min, następnie uzyskano 30% bufor B w 0,1 min. Liniowy gradient elucji rozpoczął się od 30% do 100% buforu B w 3,1 min. Po elucji kolumnę przemywano 100% rozpuszczalnikiem B przez 2 min i ponownie równoważono 100% rozpuszczalnikiem A. Całkowity czas pracy wynosi 12 min. Szybkość przepływu wynosiła 0,5 ml/min, a objętość nastrzyku wynosi 2 μl. Temperatura kolumny wynosiła 25°C, a elucję monitorowano przy 280 nm. Stężenia produktu określa się poprzez porównanie z krzywą standardową, którą opracowuje się dla materiału referencyjnego (ustekinumab ze stanu techniki). Zmienność sposobu kwantyfikacji wynosi około ±10%.
Hodowla komórkowa według niniejszego ujawnienia uzyskuje wydajność wytwarzania ponad 2,7 g/l; korzystnie ponad 3,0 g/l; korzystniej ponad 3,5 g/l; korzystniej ponad 4,0 g/l; korzystniej ponad
4,5 g/l, korzystniej ponad 5, 0 g/l; korzystniej ponad 5, 5 g/l; korzystniej ponad 5,6 g/l; korzystniej ponad
5,7 g/l; korzystniej ponad 5,8 g/l; korzystniej ponad 5,9 g/l; a najkorzystniej ponad 6,0 g/l.
Wynalazek jest dodatkowo opisany za pomocą następujących przykładów wykonania.
1. Sposób otrzymywania przeciwciała monoklonalnego, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2, przy czym sposób obejmuje etapy:
(c) hodowania komórki CHO DG44, która koekspresjonuje przeciwciało monoklonalne i aktywną a2,6-sialilotransferazę w warunkach sprzyjających ekspresji wymienionego przeciwciała i jego sialilacji przez wymienioną a2,6-sialilotransferazę; oraz (d) otrzymywania przeciwciała monoklonalnego z hodowli komórkowej z etapu (a); przy czym szczegółowo, wymienionym przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2.
2. Sposób według przykładu wykonania 1, przy czym komórka CHO DG44 ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę wykazującą aktywność a2,6-sialilotransferazy (i) mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 (ludzka a2,6-sialilotransferaza), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana α2,6- sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 3; lub (ii) mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 4 (a2,6-sialilotransferaza chomika), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności,
PL 240 405 B1 korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 4; lub (iii) mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 5 (a2,6-sialilotransferaza szczurza), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 5.
3. Sposób według przykładu wykonania 2, przy czym ekspresja wymienionej rekombinowanej a2,6-sialilotransferazy jest pod kontrolą promotora wybranego spośród promotora SV40, CMV, β-aktyny i natywnego promotora a2,3-sialilotransferazy CHO DG44.
4. Sposób według któregokolwiek z przykładów wykonania 1-3, przy czym komórka CHO DG44 jest zaadaptowana do warunków hodowli komórkowej bez surowicy i/lub bez białka, i/lub przy czym komórka CHO jest zaadaptowana do hodowli zawiesinowej.
5. Sposób według któregokolwiek z przykładów wykonania 1-4, przy czym N-glikozylacja przeciwciała monoklonalnego otrzymanego w etapie (b) nie obejmuje epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA.
6. Sposób według któregokolwiek z przykładów wykonania 1-5, przy czym przeciwciało monoklonalne otrzymane w etapie (b) (i) ma stopień sialilacji wynoszący ponad 18%, korzystnie ponad 20%, korzystniej ponad 22%, korzystniej ponad 24%, korzystniej ponad 26%, korzystniej ponad 28%, jeszcze korzystniej ponad 30%, a najkorzystniej stopień sialilacji wynoszący 32% lub więcej; i/lub (ii) ma stopień fukozylacji rdzenia wynoszący ponad 40%, korzystnie ponad 50%, korzystniej ponad 60%, korzystniej ponad 70%, korzystniej ponad 80%, jeszcze korzystniej ponad 85%, a najkorzystniej ponad 90%.
7. Przeciwciało monoklonalne, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2, przy czym jego N-glikozylacja nie obejmuje epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA;
przy czym szczegółowo, wymienionym przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2.
8. Przeciwciało monoklonalne według przykładu wykonania 7, przy czym przeciwciało monoklonalne ma stopień sialilacji wynoszący ponad 18%, korzystnie ponad 20%, korzystniej ponad 22%, korzystniej ponad 24%, korzystniej ponad 26%, korzystniej ponad 28%, jeszcze korzystniej ponad 30%, a najkorzystniej stopień sialilacji wynoszący 32% lub więcej; i/lub przy czym przeciwciało monoklonalne ma stopień fukozylacji rdzenia wynoszący ponad 40%, korzystnie ponad 50%, korzystniej ponad 60%, korzystniej ponad 70%, korzystniej ponad 80%, jeszcze korzystniej ponad 85%, a najkorzystniej ponad 90%.
9. Komórka CHO DG44, która koekspresjonuje przeciwciało monoklonalne, którym jest ustekinumab mający co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 i co najmniej 97% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2 oraz aktywną a2,6-sialilotransferazę;
przy czym szczegółowo wymienionym przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab mający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, przy czym komórka CHO jest zaadaptowana do warunków hodowli komórkowej bez surowic y i/lub bez białka; i/lub przy czym komórka CHO DG44 jest zaadaptowana do hodowli zawiesinowej;
10. Komórka CHO DG44 według przykładu wykonania 9, przy czym komórka CHO ekspresjonuje rekombinowana a2,6-sialilotransferazę wykazującą aktywność a2,6-sialilotransferazy (i) mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 (ludzka a2,6-sialilotransferaza), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności,
PL 240 405 B1 korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 3; lub (ii) mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 4 (a2,6-sialilotransferaza chomika), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 4; lub (iii) mającą co najmniej 80% identyczności z pełnej długości sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 5 (a2,6-sialilotransferaza szczurza), przy czym korzystnie wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma co najmniej 85% identyczności, korzystniej co najmniej 88% identyczności, korzystniej co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 92% identyczności, korzystniej co najmniej 94% identyczności, korzystniej co najmniej 96% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności i przy czym najkorzystniej wymieniona rekombinowana a2,6-sialilotransferaza ma sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 5;
przy czym szczegółowo, ekspresja wymienionej rekombinowanej a2,6-sialilotransferazy jest pod kontrolą promotora wybranego spośród promotora SV40, CMV, β-aktyny i natywnego promotora a2,3-sialilotransferazy CHO.
11. Hodowla komórkowa zawierająca komórkę CHO według przykładu wykonania 10 lub 9.
12. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało według przykładu wykonania 7 lub 8.
13. Przeciwciało według przykładu wykonania 7 lub 8 do stosowania w leczeniu choroby wybranej spośród łuszczycy, łuszczycy plackowatej, łuszczycowego zapalenia stawów, choroby Crohna, sarkoidozy i tocznia rumieniowatego układowego.
W dalszej części niniejszy wynalazek, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach patentowych, został dodatkowo zilustrowany poniższymi przykładami, które nie mają ograniczać zakresu niniejszego wynalazku. Wszystkie przytaczane niniejszym odnośniki literaturowe zostały wyraźnie włączone poprzez odniesienie.
OPIS FIGUR
Na Figurze 1 przedstawiono lektynowy Western blot reprezentatywnych klonów komórki CHO DG44 koekspresjonujących ustekinumab i a2,6-sialilotransferazę pochodzenia ludzkiego i chomiczego, odpowiednio. Jak przedstawiono w porównaniu do klonu komórki CHO ekspresjonującego wyłącznie ustekinumab, przeciwciało otrzymane z koekspresjonującej linii komórkowej CHO DG44 jest silnie wykrywane przez lektynę Sambucus nigra, która wykazuje wysoką preferencję względem a2,6-sialilacji.
PRZYKŁADY
P r z y k ł a d 1: Opracowanie linii komórkowej
Sekwencję aminokwasową peptydu sygnalnego (SEQ ID NO: 7) dodano do sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO: 1) i łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 2) ustekinumabu, a odpowiadające im sekwencje nukleotydowe zaprojektowano i syntezowano tak, że zostały one zoptymalizowane pod względem wykorzystania kodonów w komórkach CHO DG44 (Cricetulus griseus). Podczas syntezy do sekwencji kodującej na końcu 5' dodano ponadto miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Kpn I (HC) i Bam EI (LC), a na końcu 3' dodano miejsca rozpoznawane przez Hind Ill (HC) i Xho I (LC). Sekwencje nukleotydowe podano w SEQ ID NO: 8 i SEQ ID NO: 9, odpowiednio.
Następnie, stosując standardowe wektory ekspresyjne, wygenerowano konstrukty ekspresyjne ustekinumabu.
Kompetentne komórki E. coli transformowano za pomocą mini prep DNA otrzymanego z prawidłowego klonu uzyskanego podczas procedury klonowania molekularnego. 200 ml pożywki TB zawierającej ampicylinę zaszczepiono za pomocą transformowanych bakterii i inkubowano w 30°C przez noc z wytrząsaniem. Z tej hodowli otrzymano DNA plazmidowe z zastosowaniem zestawu PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep i poddano go ocenie za pomocą fotometrii, analizy restrykcyjnej i częściowemu sekwencjonowaniu, aby upewnić się co do poprawności i integralności konstruktu.
PL 240 405 B1
DNA plazmidowe linearyzowano do transfekcji, a produkt trawienia poddano analizie pod kątem jego kompletności za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. DNA plazmidowe oczyszczono i zatężono poprzez precypitację izopropanolem, odtworzono w 10 mM Tris pH 8,0, a czystość DNA oceniono za pomocą fotometrii.
Nietransfekowane komórki CHO DG44 hodowano w pożywce wzrostowej CHO w kolbach do wytrząsania w wilgotnej atmosferze w 36,8°C i 7,5% pCO2 z liniowym wytrząsaniem w tempie 110 rpm. 1 x 106 komórek gospodarza zwirowano, supernatant wyrzucono, osad ponownie rozpuszczono w 100 μl roztworu V Nucleofector i dodano do 10 μg linearyzowanego wektora DNA w probówce 1,5 ml. Zmieszaną zawiesinę przeniesiono do kuwety (Lonza) i poddano działaniu impulsu elektrycznego z urządzenia Nucleofector II, stosując program U24. Następnie dodano 500 μl ogrzanej wcześniej pożywki hodowlanej dla CHO, a komórki przeniesiono do 6-dołkowej płytki zawierającej 3,4 ml tej samej pożywki. Po 4 godzinnym okresie inkubacji w 36,8°C i 7,5% pCO2 bez wytrząsania, komórki hodowano dalej z liniowym wytrząsaniem w tempie 110 rpm w takich samych warunkach.
Komórki po transfekcji hodowano w pożywce hodowlanej dla CHO przez 1 dzień. Następnie przeniesiono je do pożywki selektywnej i wysiano do 96-dołkowych płytek płaskodennych w ilości 2000 komórek/dołek i 4000 komórek/dołek (2 płytki na zestaw warunków), odpowiednio. Komórki przeniesiono dodatkowo do pożywki selektywnej + 2,5 nM MTX i wysiano do 96-dołkowych płytek płaskodennych w ilości 4000 komórek/dołek (2 płytki). Wszystkie komórki hodowano przez 20-22 dni. Wyrośnięte kolonie przeniesiono do płytek 24-dołkowych zawierających taką samą pożywkę, jak podczas hodowli komórek na płytkach 96-dołkowych. Po 3-7 dniach, komórki przeniesiono do płytek 12-dołkowych i hodowano przez 4-7 dni. Rosnące komórki przeniesiono do płytek 6-dołkowych, przesiewając co 3-4 dni aż do odzyskania przez komórki żywotności i rozpoczęcia wzrostu. Rosnące komórki przen iesiono do pożywki selektywnej + 30 nm MYX i przesiewano do tej samej pożywki co 3-4 dni aż do odzyskania przez komórki żywotności i rozpoczęcia wzrostu. Komórki rozhodowano do poziomu kolb do wytrząsania.
Do wprowadzenia a-2,6-sialilotransferazy od człowieka (SEQ ID NO: 3) i chomika (SEQ ID NO: 4), odpowiednio, potrzebna była druga transfekcja. Do tej transfekcji zastosowano 1 μg linearyzowanego DNA wektorowego i transformowano je do najlepszych puli z poprzedniej transfekcji. Oprócz genu dla a-2,6-sialilotransferazy człowieka (SEQ ID NO: 10) lub chomika (SEQ ID NO: 11), plazmid zastosowany do drugiej transfekcji zawiera gen odporności na genetycynę (G418) jako drugi marker selekcyjny. W konsekwencji, wszystkie następne pożywki selektywne zawierają, oprócz 30 nM MTX, także 250 μg/ml genetycyny. Komórki wysiano następnie do 96-dołkowych płytek płaskodennych w ilości 1000 komórek/dołek, 2000 komórek/dołek i 4000 komórek/dołek (2 płytki na zestaw warunków), odpowiednio.
Jako następny etap, stosując sorter komórek FACSAria, przeprowadzono klonowanie pojedynczej komórki. 3 x 106 komórek zwirowano i wybarwiono za pomocą Białka A skoniugowanego z DyLight 650. Następnie komórki przemyto, ponownie zawieszono w PBS, przefiltrowano przez probówkę FACS z korkiem z filtrującym komórki i poddano analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Wybrano górne 3-5% populacji pod względem fluorescencji DyLight 650, a pojedyncze komórki przesortowano do 384-dołkowych płytek płaskodennych. Po 14-dniowym okresie hodowli wyrośnięte kolonie przeniesiono do płytek 24-dołkowych zawierających odpowiednią pożywkę selektywną (pożywka selektywna + 30 nM MTX i 250 μg/ml G418) i w ciągu kolejnych 35 dni rozhodowano je do poziomu kolb do wytrząsania.
Kolonie poddano ocenie pod kątem poprawności a2,6-sialilacji za pomocą Western Blot i immunodetekcji lektynowej. Kwas N-acetyloneuraminowy (NANA) może być wykrywany i specyficznie rozpoznawany przez aglutyninę Sambucus nigra (SNA), która wiąże kwas N-acetyloneuraminowy przyłączony do galaktozy w pozycji α2-6. Zestawy komercyjne sprzedawane są przykładowo przez Vector Laboratories i mogą być stosowane według instrukcji producenta:
1. Przeprowadzić elektroforezę i przenieść białka na membranę według standardowych procedur.
2. Zablokować niespecyficzne wiązanie poprzez inkubację membrany w roztworze blokującym Carbo-Free™ (SP-5040) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zastosować objętość wystarczającą do całkowitego przykrycia membrany.
3. Inkubować membranę w PBS zawierającym w przybliżeniu 2-20 μg/ml biotynylowanej lektyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć za pomocą TPBS (PBS + 0,05% Tween™ 20).
4. Przygotować odczynniki VECTASTAIN® ® ABC (peroksydaza, PK-6100) lub VECTASTAIN® ABC-AP (fosfataza alkaliczna, AK-5000) według instrukcji z zestawu. Inkubować
PL 240 405 B1 membranę w odczynniku przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć za pomocą TPBS.
5. Zastosować substrat odpowiedni dla systemu enzymatycznego użytego w etapie 4. Dla peroksydazy zaleca się chemiluminescencyjny/fluorescencyjny substrat dla peroksydazy DuoLuX™ (SK-6604) lub ImmPACT™ DAB (SK-4105); dla fosfatazy alkalicznej zaleca się chemiluminescencyjny/fluorescencyjny substrat dla fosfatazy alkalicznej (SK-6605) lub BCIP/NBT (SK-5400).
W celu walidacji wyników wiązania należy równocześnie przeprowadzić kontrole negatywne. W takich warunkach wciąż może występować śladowe wiązanie do sekcji (blot itd.), co prawdopodobnie wskazuje na obecność cukrów preferowanych w drugiej lub trzeciej kolejności. Wyniki tych kontroli negatywnych powinny zostać porównane z wynikami testów celem określenia specyficzności wiązania.
Jak przedstawiono na Figurze 1, możliwe było uzyskanie klonów komórek koekspresjonujących ustekinumab i a2,6-sialilotransferazę pochodzącą od człowieka lub chomika, jak wykazano poprzez wykrycie a2,6-sialilacji łańcucha ciężkiego ustekinumabu.
P r z y k ł a d 2: Analiza stężenia (miana) przeciwciała monoklonalnego (mAb)
Wybrano 24 klony ekspresjonujące na wysokim poziomie ustekinumab i poddano je ocenie w standardowym procesie z zasilaniem wsadowym pod kątem wydajności wytwarzania i cech procesu.
Analizę chromatograficzną przeprowadzono poprzez chromatografię powinowactwa wobec Białka A w UPLC H-Class Bio System z zastosowaniem detektora UV pod kontrolą oprogramowania Empower 3 Software. Do testu wykorzystano kolumnę Applied Biosystems Poros® Protein A (20 μm, 2,1 mm śr. wewn. x 30 mm) i zastosowano dwa etapy gradientu liniowego buforu A (50 mM bufor fosforanu sodu o pH 7,5, 0,15 M NaCl) i buforu B (50 mM bufor fosforanu sodu o pH 2,5, 0,15 M NaCl). Gradient rozpoczęto wstępnym zrównoważeniem za pomocą 100% buforu A w 0,8 min, następnie uzyskano 30% bufor B w 0,1 min. Liniowy gradient elucji rozpoczął się od 30% do 100% buforu B w 3,1 min. Po elucji kolumnę przemywano 100% rozpuszczalnikiem B przez 2 min i ponownie równoważono 100% rozpuszczalnikiem A. Całkowity czas pracy wynosi 12 min. Prędkość przypływu wynosiła 5 ml/min. Temperatura kolumny wynosiła 25°C, a elucję monitoruje się przy 280 nm.
Wyliczenie stężenie mAb w oparciu o liniową krzywą standardową przeprowadzono za pomocą oprogramowania Empower 3 Software. Jako korzystne produkcyjne linie komórkowe wybrano klony wypadające najlepiej pod kątem jakości produktu o wydajności wytwarzania pomiędzy 3,8 - 6,1 g/l w 11-dniowym procesie i piku stężeń żywotnych komórek pomiędzy 10,4 x 106/ml i 21,1 x 106/ml. Dla jednego z klonów po 11 dniach hodowli wykazano pik stężenia żywotnych komórek wynoszący w przybliżeniu 19,6 x 106/ml i stężenie produktu wynoszące około 6,1 g/l.
P r z y k ł a d 3: Analiza profilu N-glikozylacji
Profilowanie N-glikozylacji zlecono zewnętrznemu usługodawcy (glyXera GmbH, Niemcy). Analizę przeprowadzono stosując modularny, wysokowydajny system do glikoanalizy glyXbox™ oparty na multipleksowej kapilarnej elektroforezie żelowej z detekcją fluorescencji wzbudzonej laserem (ang. Capillary Gel Electrophoresis with Laser Induced Fluorescence detection, xCGE-LIF):
Za pomocą systemu glyXbox™ przeprowadzono standardowe glikoprofilowanie: Najpierw białka w próbce zdenaturowano, a N-glikany ze zdenaturowanych białek uwolniono poprzez trawienie enzymatyczne (PNGaza F). W następnym etapie struktury N-glikanowe wyznakowano za pomocą APTS. Wyznakowane N-glikany oczyszczono stosując HILIC-SPE i poddano analizie w multipleksowym systemie CGE-LIF.
Bardziej szczegółowo, przeprowadzono badanie charakterystycznych śladów (ang. fingerprints) N-glikanów (elektroferogram znormalizowany na osi czasu (x-) poprzez ortogonalną podwójną normalizację z zastosowaniem standardów wewnętrznych i (w stosownych przypadkach) ze znormalizowaną osią intensywności sygnału (y-) (RPH [%] z TPH)) z próbek 45 mAb (3 dla ustekinumabu ze stanu techniki, 42 dla ustekinumabu uzyskanego z komórek CHO koekspresjonujących a2,6-sialilotransferazę) w postaci duplikatów technicznych (90 charakterystycznych śladów). Do Unity-Profile Comparison (UPC) zastosowano jedność wszystkich pików wybranych z dowolnych, charakterystycznych śladów z analizowanych próbek. Struktury N-glikanów reprezentowane przez piki w charakterystycznych śladach N-glikanów, dla których czasy migracji pokrywały się z bazą danych, oznaczono poprzez standardowe glikoprofilowanie (przypisanie struktur glikanów do pików (uprzednio wybranych, zintegrowanych i oznaczonych liczbowo) poprzez dopasowanie czasu migracji z wpisami w bazie danych). Podstawowe informacje dla obu linii komórkowych (Sp2/0 i CHO DG44) zastosowano oddzielnie.
PL 240 405 Β1
Porównując najbardziej rozpowszechnione piki dla próbek oryginalnych i próbek biopodobnych, najwyższe podobieństwo średniej, względnej wysokości piku stwierdzono dla pików reprezentujących strukturę FA2G1, FA2G0 i FA2G1. Standardowe glikoprofilowanie wykazało, że próbki ustekinumabu ze stanu techniki zawierają struktury z końcową α-galaktozą, jak również kwasem N-glikooliloneuraminowym (NGNA). W przeciwieństwie do tego, w ustekinumabie uzyskanym z komórek CHO DG44 koekspresjonujących a2,6-sialilotransferazę nie stwierdzono struktur zawierających końcową a-galaktozę, a glikozylacja obejmowała jedynie kwas N-acetyloneuraminowy (NANA). Przykładowe wyniki standardowego glikoprofilowania przedstawiono dodatkowo w tabeli poniżej.
| Nazwa próbki | Suma sialiłowanych glikanów | G0F | G1F+G1F'+G2F | G0+G1+G2 |
| Ustekinumab ze stanu techniki | 24,47 ± 0,24 * | 27,56 ± 1, 89 | 41,91 ± 0,85 | 0,44 ± 0, 09 |
| Klon 1 | 26, 71 # | 26, 73 | 35, 67 | 0, 94 |
| Klon 2 | 24,67 11 | 29,36 | 34,20 | 2, 01 |
| Klon 3 | 24, 58 # | 26, 28 | 38, 80 | 0, 75 |
* 20,0% wyłącznie NGNA; 0,41% wyłącznie NANA; 4,05% mieszanina NGNA i NANA # wyłącznie NANA
Trzy powyższe klony poddano dodatkowo rozszerzonemu glikoprofilowaniu i uzyskano następujące wyniki:
| Procent całkowitej wysokości pików względnych (= 100%) dla pików reprezentujących | Klon 1 | Klon 2 | Klon 3 |
| struktury sialilowane (wyłącznie NANA) | 35 | 33 | 33 |
| struktury z fukozylacją rdzenia | 99 | 97 | 99 |
| struktury z końcową a-galaktozą | 0 | 0 | 0 |
| struktury o wysokiej zawartości mannozy lub typu hybrydowego | 1 | 1 | 1 |
| struktury z końcową β-galaktozą | 46 | 44 | 50 |
| struktury z końcową β-Ν- acetyloglukozaminą | 82 | 83 | 81 |
Podsumowując, wynalazcy zdołali otrzymać i wyizolować komórkę CHO DG44 koekspresjonującą ustekinumab i a2,6-sialilotransferazę o wydajnościach wytwarzania pomiędzy 3,8 - 6,1 g/l w 11-dniowym procesie oraz pikach stężeń żywotnych komórek pomiędzy 10,4 x 106/ml i 21,1 x 106/ml. Jeden z klonów wykazuje pik stężenia żywotnych komórek wynoszący w przybliżeniu 19,6 x 106/ml i stężenie produktu wynoszące około 6,1 g/l. Przeciwciała uzyskane z tych klonów wykazują podobny profil N-glikozylacji jak przeciwciało ustekinumab ze stanu techniki otrzymane z komórek SP2/0. Jednak
PL 240 405 B1 w porównaniu do ustekinumabu ze stanu techniki, przeciwciała uzyskane z komórek CHO DG44 koekspresjonujących a2,6-sialilotransferazę nie zawierają żadnej końcowej α-galaktozy lub kwasu N-glikoliloneuraminowego (NGNA), które są rozpoznawane przez układ immunologiczny człowieka. Przeciwciała uzyskane z komórek CHO DG44 koekspresjonujących a2,6-sialilotransferazę wykazują jednocześnie wysoki stopień struktur fukozylacji rdzenia, jakie stwierdzono również w ludzkich przeciwciałach IgG1.
WYKAZ ODNOŚNIKÓW LITERATUROWYCH
1. EP2202307
2. US2006/0099685
3. WO2013/093760
4. WO2011/042688
5. WO2009/127826
6. WO2009/009523
7. WO2006/070011
8. WO2005/080585
9. WO95/19790
10. Bragonzi et al. Biochimica et Biophysica Acta 1474: 273-282 (2000).
11. Onitsuka et al. Appl. Microbiol Biotechnol 94: 69-80 (2011).
12. G. Urlaub, E. Kas, A.M. Carothers, and L.A. Chasin, Deletion of the Diploid Dihydrofolate Locus from Cultured Mammalian Cells. Cell, 33: 405-412 (1983).
13. G. Urlaub, P.J. Mitchell, E. Kas, L.A. Chasin, V.L. Funanage, T.T. Myoda and J.L. Harnlin, The Effect of Gamma Rays at the Dihydrofolate Reductase Locus: Deletions and Inversions, Somatic Cell and Molec. Genet., 12: 555-566 (1986).
14. W. Zhou, C.-C. Chen, B. Buckland and J. Aunins, Fed-Batch Culture of Recombinant NS0 Myeloma Cells with High Monoclonal Antibody Production, Biotechnology and Bioengineering, 55(5): 783-792 (1997).
15. Assessment report for Ustekinumab of the European Medicines Agency (EMA)
PL 240 405 Β1
Wykaz sekwencji
Łańcuch ciężki ustekinumabu (SEQ ID NO: 1)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTTYWLGWVRQMPGKGLDWIGIMSPVDSDIRYS PSFQGQVTMSVDKSITFAYLQWNSLKASDTAMYYCARRRPGQGYFDFWGQGTLVTVSSSST ΚΟ?3νΕΡΕΑΡ35Κ3Τ3σ0ΤΑΑΣα0ίνΚΟΥΡΡΕΡντν3ΝΝ3ΟΑΕΤ5θνΗΤΓΡΑνΕ033ΟΕΥ5 LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FP ?K PKD T LMIS R T PE VT C WYDYS Η E DP E VK FNW YVD GYEYHNAKT KPRE EQYNS T YR VV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Łańcuch lekci ustekinumabu (SEQ ID NO: 2)
DIQMTQSP3SLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLTYAASSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGIASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK AD YEKHKYYAC E V T H QGL S S PYTK S FNRGE C a2,6-sialilotransferaza człowieka (SEQ ID NO: 3)
MIHTNLKKKFSCCVLVFLLFAVICVWKEKKKGSYYDSFKLQTKEFQVLKSLGKLAMGSDSQ SVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKY KVSYKGPGPGIKrSAEALRCIILRDIIVNVSM\rEVTDFPFNTSEWEGYLPKES IRTKAGPWGR CAWSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFL KDSLYNEGILIWDP3VYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELW DILęEISPEEIOPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTM GAYHPLLYEKNŁVKHLNQGTDEDIYLLGKATL?GFRTIHC a2,6-sialilotransferaza chomika (SEQ ID NO: 4)
MIHTNLKKKFSYFILAFLLFALICVWKKGSYEALKLQAKEFQVTRSLEKLAMRSGSQSMSS 3SKQDPKQDSQVLSHARVTAKVKPQPSYQWDKNSSSKNLNPRLQKILKNYLNMNKYKVSY KG?GPGVKFSAEALRCRLRDRVNVSMIEATDFPFNTTEWAGYLPKENIRTKAGPWHRCAW SSAGSLKSSQLGREIDNHDAVLRFNGAPVANFQQDVGTKTTIRLMNSQLITTEKQFLKDSL YSEGILIVWDPSLYHADIPSWYQKPDYNFFETYKSYRKLYPDQPFYILRPQMPWELWDIIQ
PL 240 405 Β1
EIAPDRIQPNPPSSGMLGIMIMMTLCDQVDIYEFLPSRRKTDVCYYHQKFFDSACTMGAYH PLLFEKNMVKQLNEGTDEDIYIFGKATLSGFRTIHC «2,6-sialiIotransferaza szczura (SEQ ID NO: 5)
MIHTNLKKKFSLFILVFLLFAVICVWKKGSDYEALTLQAKEF2MPKSQEKVAMGSASQWF
SNSKQDPKEDIPILSYHRVTAKVKPQPSFQVWDKDSTYSKLNPRLLKIWRNYLNMNKYKVS
YKGPGPGVKFSVEALRCHLRDHVNVSMIEATDFPFNTTEWEGYLPKENFRTKVGPWQRCAV
VSSAGSLKNSQLGREIDNHDAVLRFNGAPTDNFQQDVGSKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDS LYTEGILIVWDPSVYHADIPKWYQKPDYNFFETYKSYRRLNPSQPFYILKPQMPWELWDII QEISADLIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYHQKFFDSACTMGAY DP LL FEKNMYKHLNE GT DE D T , FGKATLSG FRNT RC ot2, 6-sialilotransferaza myszy (SEQ ID NO: 6)
MIHTNLKRKFSCFVLVFLLFAIICVWKKGSDYEALTLQAKVFQMPKSQEKVAVGPAPQAVF SNSKQDPKEGVQILSYPRVTAKVKPQPSLQVWDKDSTYSKLNPRLLKIWRNYLNMNKYKVS YKGPGPGVRFSVEGLRCHLRDHVNVSMIEATDSPFNTTEWEGYLPKETFRTKAGPCTKCAV
VSSAGSLKNSQLGREIDNHDAVLRFNGAPTDNFQQDVGTKTTZRLVNSQLVTTEKRFLKDS LYTEGILILWDPSVYHADIPQWYQKPDYNFFETYKSYRRLHPSQPFYILKPQMPWELWDII QEISPDLIQPNPPSSGMLGII2MMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYHQKFFDSACTMGAY HP L L FE KNMYKHLNEGT DE DIYL FGKATLS G FRNNRC
Sekwencja sygnalna dla łańcucha ciężkiego i lekkiego ustekinumabu (SEQ ID NO: 7)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
Sekwencja nukleotydowa łańcucha ciężkiego ustekinumabu (SEQ ID NO: 8)
Kodony start i stop pogrubiono, sekwencję sygnalną podkreślono.
gatatcggt ac cgccaccatgaagtgggtcaccttcatccccctgctgtttctgttctcca gcgcctactccgaggtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtgaagaagcccggcgagtc cctgaagatctcctgcaagggctccggctactccttcaccacctactggctgggctgggtc
PL 240 405 Β1 cgacagatgcccggcaagggcctggactggaucggcatcatgicccccgtggac; tccgaca tccggtactcccccagcttccagggccaggtcacaaagtccg^ggacaagtccatcaccac cgcctacctgcagtggaactccctgaaggcctccgacaccgccatgtactactgcgccaga aggcggcctggccagggctacttcgatttctggggccagggcaccctggtcaccgtgtcct ccagctccaccaagggcccctccgtgttcccuctggcccccuccagcaagtccacctctgg cggcaccgctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcc tggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccutcccugccgtgctgcagtcctccg gcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctcctctagcctgggcacccagaccta catctgcaacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaacccaag tcctgcgacaagacccacacctgtcccccctgccctgccccugaactgctgggcggacctt ccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacacccugatgacctcccggacccccgaagt gacctgcgtggtggtggaug tgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaat Lgg Lacgtg gacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacct accgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaa gtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccarctccaaggccaag ggccagccccgcgagccccaggtgtacacccagccccctagccgggacgagctgaccaaga accaggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctaccccsccgacattgccgtggaatg ggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgżgctggacagcgac ggctcattcttcctgtactccaagctgaccg^ggataagtcccggtggcagcagggcaacg tgttctcctgczccgtgatgcacgaggccctgcacaaccaczacacccagaagtccctgtc cctgagccccggcaagtgatagaagcttgatatc
Sekwencja nukleotydowa łańcucha lekkiego ustekinumabu (SEQ ID NO: 9)
Kodony start i stop pogrubiono, sekwencję sygnalną podkreślono.
gatatcggatccgccac catgaagtgggtcaccttcatctccctgctgtttctgttctcct ccgcctactccgacatccagatgacccagtccccctccagcctgtccgcctccgtgggcga cagagtgaccaocacctgtcgggcctcccagggcatctccagctggctggcctggtatcag cagaagcccgagaaggcccccaagtccctgatctacgccgccagctccctgcagtccggcg tgccctccagactctccggctctggctccggcaccgacttcaccctgaccatctccagcct gcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtacaacatctacccctacaccttc ggccagggcaccaagctggaaatcaagcggaccgtggccgctccctccgtgttcatcttcc caccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaactt
PL 240 405 Β1 ctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaactcc caggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctga ccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccaggg cctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctgatagctcgaggatatc
Sekwencja nukleotydowa c<2, 6-sialilotransferazy człowieka (SEQ ID NO: 10)
Kodony start i stop pogrubiono.
gatatcggtaccgccaccatgatccacaccaacctgaagaagaaattctcctgctgcgtgc tggtgttcctgctgttcgccgtgatctgcgtgtggaaagagaagaagaagggctcctacta cgactccttcaagctgcagaccaaagaattccaggtgctgaagtccctgggcaagctggcc acgggctccgactctcagtccgtgtcctccagctctacccaggacccccacagaggcagac agaccctgggctctctgagaggcctggccaaggctaagcctgaggcctccttccaggtgtg gaacaaggactcctccagcaagaacctgatcccccggctgcagaagatctggaagaactac cngtccatgaacaagtacaaggtgtcctacaagggccctggccctggcatcaagttctctg ccgaggccctgagatgccacctgagggaccatgtgaacgtgtccatggtggaagtgaccga cttcccattcaacacctccgagtgggagggctacctgcccaaagagtccatccggaccaag gctggcccttggggcagatgtgctgtggtgtcctctgccggctccctgaagtcctctcagc tgggcagagagatcgacgaccacgacgccgtgctgcggtttaatggcgcccctaccgccaa cttccagcaggacgtgggcaccaagaccaccatccggctgatgaactcccagctcgtgaca accgagaagcggttcctgaaggactccctgtacaacgagggcatcctgatcgtgtgggacc cctccgtgtaccactccgacatccccaagtggtatcagaaccccgactacaacttcttcaa ca a eta ca aga ccta ccggaagctgcaccccaaccagccct.tctacatcctgaagcccc.ag atgccctgggagctgtgggacattctgcaggaaatctcccccgaggaaatccagcccaacc ccccttcctctggcatgctgggcatcattatcatgatgaccctgtgcgaccaggtggacat ccacgagtttctgccctccaagagaaagaccgacgtgtgctactactaccagaagttcttc gactccgcctgcaccatgggcgcctaccaccctctgctgtacgagaagaacctcgtgaagc acctgaaccagggcaccgacgaggacatctatctgctgggcaaggccaccctgcctggctt cagaaccatccactgctgatagctcgaggatatc
Sekwencja nukleotydowa «2,6-sialilotransferaza chomika (SEQ ID NO: 11)
Kodony start i stop pogrubiono-
Claims (5)
- PL 240 405 Β1 gatatcggtaccgccaccatgatccacaccaacctgaagaagaagttctcctacttcatcc tggcctttctgctgttcgccctgatctgcgtgtggaagaagggctcctacgaggccctgaa gctgcaggccaaagaattccaagtgacccggtccctggaaaagctggccatgagatccggc tcccagtccatgtcctccagctccaagcaggaccctaagcaggactcccaggtgctgtccc acgccagagtgaccgccaaagtgaagccccagccctcctaccaagtgtgggacaagaactc ctccagcaagaacctgaacccccggctgcagaagatcctgaagaactacctgaacatgaac aagtacaaggtgtcctacaagggccctggccctggcgtgaagttttccgccgaggctctgc ggtgccggctgagagatagagtgaacgtgtccatgatcgaggccaccgacttcccattcaa caccaccgagtgggccggctacctgcccaaagagaacatccggaccaaggctggcccctgg cacagatgtgctgtggtgtcctctgccggctccctgaagtcctctcagctgggcagagaga tcgacaaccacgacgccgtgctgcggttcaatggcgcccctgTggccaacttccagcagga Ggtgggcaccaagaccaccatccggctgatgaactcccagctgattacaaccgagaagcag ttcctgaaggactccctgtactccgagggcatcctgatcgtgtgggacccttccctgtacc acgccgacatccccagctggtatcagaagcccąactacaacttcttcgaąacatacaaątc ctaccggaagctgtaccccgaccagcccttctacatcctgcggccccagatgccttgggag ctgtgggacatcatccaggaaatcgcccccgacagaatccagcccaaccctccttcctctg gcatgctgggcatcatgattatgatgaccctgtgcgaccaggtggacatctacgagtttct gccctctcggagaaagaccgacgtgtgctactaccaccagaagttcttcgactccgcctgc accatgggcgcctaccaccctctgctgtttgagaagaacatggtcaagcagctgaacgagg gcaccgacgaggacatctatatcttcggcaaggccaccctgtccggcttccggaccattca ctgttgatagctcgaggatatcZastrzeżenia patentowe1. Sposób otrzymywania przeciwciała monoklonalnego, którym jest ustekinumab, znamienny tym, że obejmuje etapy:hodowania komórki CHO DG44, która koekspresjonuje przeciwciało monoklonalne i aktywną a2,6-sialilotransferazę, do uzyskania ekspresji tego przeciwciała ijegosialilacji przez a2,6-sialilotransferazę; oraz izolowania przeciwciała monoklonalnego z hodowli komórkowej z etapu (a), przy czym:- przeciwciałem monoklonalnym jest ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2,- komórka CHO DG44 ekspresjonuje rekombinowaną a2,6-sialilotransferazę posiadającą sekwencję aminokwasową wybraną spośród: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 5, - ekspresja rekombinowanej a2,6-sialilotransferazy jest pod kontrolą promotora wybranego spośród SV40, CMV, β-aktyny i natywnego promotora a2,3-sialilotransferazy CHO DG44.PL 240 405 B1
- 2. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1, znamienny tym, że hodowla komórki CHO DG44 jest prowadzona w warunkach hodowli komórkowej bez surowicy i/lub bez białka, korzystnie w hodowli zawiesinowej.
- 3. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-2, znamienny tym, że N-glikozylacja przeciwciała monoklonalnego otrzymanego w etapie (b) jest prowadzona z pominięciem epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA.
- 4. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienny tym, że w etapie (b) izoluje się przeciwciało monoklonalne posiadające stopień sialilacji wynoszący 32% lub więcej oraz posiadające stopień fukozylacji rdzenia wynoszący ponad 90%, przy czym jego N-glikozylacja nie obejmuje epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA.
- 5. Przeciwciało monoklonalne, którym jest ustekinumab o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, przy czym:- stopień sialilacji tego przeciwciała wynosi 32% lub więcej,- stopień fukozylacji rdzenia tego przeciwciała wynosi ponad 90%, natomiast- N-glikozylacja tego przeciwciała nie obejmuje epitopów α-Gal i/lub reszt NGNA.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422316A PL240405B1 (pl) | 2017-07-24 | 2017-07-24 | Przeciwciało monoklonalne oraz sposób jego otrzymywania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422316A PL240405B1 (pl) | 2017-07-24 | 2017-07-24 | Przeciwciało monoklonalne oraz sposób jego otrzymywania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL422316A1 PL422316A1 (pl) | 2019-01-28 |
| PL240405B1 true PL240405B1 (pl) | 2022-03-28 |
Family
ID=65034002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL422316A PL240405B1 (pl) | 2017-07-24 | 2017-07-24 | Przeciwciało monoklonalne oraz sposób jego otrzymywania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL240405B1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112852743B (zh) * | 2021-01-25 | 2021-11-02 | 江苏荃信生物医药有限公司 | 用于生产乌司奴单抗的生物类似药的细胞株及生产方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL2019864T3 (pl) * | 2006-05-24 | 2012-02-29 | Univ De Provence Aix Marseille 1 | Wytwarzanie i zastosowania sekwencji genowych kodujących chimerowe glikozylotransferazy o optymalizowanej aktywności glikozylacji |
| EP2824176A1 (en) * | 2013-07-11 | 2015-01-14 | Siamed'xpress | Methods for producing sialylated therapeutic proteins |
-
2017
- 2017-07-24 PL PL422316A patent/PL240405B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL422316A1 (pl) | 2019-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Müthing et al. | Effects of buffering conditions and culture pH on production rates and glycosylation of clinical phase I anti‐melanoma mouse IgG3 monoclonal antibody R24 | |
| US12098196B2 (en) | Production of biosimilar ustekinumab in CHO cells | |
| CA2972932C (en) | O-glycan sialylated recombinant glycoproteins and cell lines for producing the same | |
| WO2018002036A1 (en) | Recombinant production of monoclonal antibodies | |
| US20240384238A1 (en) | Antibodies with modulated glycan profiles | |
| Ha et al. | Knockout of sialidase and pro-apoptotic genes in Chinese hamster ovary cells enables the production of recombinant human erythropoietin in fed-batch cultures | |
| US20240239871A1 (en) | Hypersialylating cells | |
| JP2020526196A (ja) | 糖タンパク質を作製するための細胞培養方法 | |
| US9464137B2 (en) | Glycoprotein | |
| WO2018196796A1 (zh) | 用于生产糖蛋白的动物细胞株及方法、糖蛋白及其用途 | |
| PL240405B1 (pl) | Przeciwciało monoklonalne oraz sposób jego otrzymywania | |
| US20150210777A1 (en) | Glycoprotein | |
| EP3932943A1 (en) | Biologically active recombinant equine chorionic gonadotropin (recg) and process for obtaining same, veterinary composition and use | |
| US20240083970A1 (en) | Compositions comprising fusion protein and analytical attributes thereof | |
| KR100701199B1 (ko) | 내재적 수준보다 높은 수준으로 시알릴화 당단백질 및ｃｍｐ－ｓａｔ를 발현하는 포유류 유래 세포 및 그를이용하여 ｎ－글리콜릴뉴라민산의 함량이 감소되어 있고ｎ－아세틸뉴라민산의 함량이 증가된 시알릴화 당단백질을생산하는 방법 | |
| CN117242175A (zh) | 超唾液酸化细胞 | |
| Goletz et al. | GlycoOptimization for fully human and largely improved biopharmaceutical antibodies and proteins | |
| Butnev et al. | Supplement to: Production, purification, and characterization of recombinant hFSH glycoforms for functional studies | |
| EA042958B1 (ru) | Процесс культивирования клеток для получения гликопротеина | |
| HK1243728B (zh) | O-聚糖唾液酸化的重组糖蛋白及用於生产其的细胞系 | |
| JP2014226081A (ja) | 糖鎖構造パターンを改変した糖タンパク質の製造方法 |