PL240632B1 - Zastosowanie nanokapsuły z ciekłym rdzeniem olejowym w terapii przeciwnowotworowej - Google Patents
Zastosowanie nanokapsuły z ciekłym rdzeniem olejowym w terapii przeciwnowotworowej Download PDFInfo
- Publication number
- PL240632B1 PL240632B1 PL425141A PL42514118A PL240632B1 PL 240632 B1 PL240632 B1 PL 240632B1 PL 425141 A PL425141 A PL 425141A PL 42514118 A PL42514118 A PL 42514118A PL 240632 B1 PL240632 B1 PL 240632B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- capsules
- hyc12
- oil
- nanocapsules
- Prior art date
Links
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 title claims description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 67
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid group Chemical group C(CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)(=O)O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 41
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 40
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 37
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims description 34
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 11
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 claims description 11
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 claims description 3
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 claims description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 claims 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 claims 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 39
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 29
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 28
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 18
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 18
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 14
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 12
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 11
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 11
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- -1 modified HyC12 polysaccharide Chemical class 0.000 description 4
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N Fulvestrant Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3[C@H](CCCCCCCCCS(=O)CCCC(F)(F)C(F)(F)F)CC2=C1 VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 2
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 2
- 229960002258 fulvestrant Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 235000021281 monounsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 101100463133 Caenorhabditis elegans pdl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122440 HIV protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000019495 Pecan oil Nutrition 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 239000002842 anticancer formulation Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000010495 camellia oil Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940115080 doxil Drugs 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000004030 hiv protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000004667 medium chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006677 mitochondrial metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000010470 pecan oil Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Botany (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
PL 240 632 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nanokapsuły z ciekłym rdzeniem olejowym w terapii przeciwnowotworowej.
Na rynku farmaceutycznym i biomedycznym istnieje duże zapotrzebowanie na wyspecjalizowane nośniki związków bioaktywnych. Wprowadzenie na rynek liposomalnego nośnika doksorubicyny, znanego pod nazwą handlową Doxil®, dało początek dopuszczeniu wielu preparatów do testów klinicznych oraz do użytku.
Jednym z ważniejszych problemów sprzyjających rozwojowi prac nad nośnikami leków jest fakt, że około 50% związków aktywnych farmaceutycznie oraz ok. 70% syntezowanych obecnie związków będących potencjalnymi lekami wykazuje właściwości hydrofobowe bądź lipofilowe. Związki o takiej charakterystyce, zwykle określanej za pomocą wartości logarytmu z odpowiedniego współczynnika podziału (logP), mają istotne trudności związane z biodystrybucją i biodostępnością w organizmie, bowiem dla wydajnego działania najczęściej konieczne jest rozpuszczenie substancji leczniczej w roztworze wodnym celem jej efektywnego wychwytu przez organizm.
Z patentu nr US 2015 0231153 znany jest przykład kompozycji leku przeciwnowotworowego Fulvestrant, którego logP = 8,9. Kompozycja ta przewiduje podawanie Fulvestrantu w postaci płynnej. Lek rozpuszczany jest w mieszaninie alkoholu z polisorbatem 80, antyoksydantem oraz olejem rycynowym. W celu uniknięcia stosowania rozpuszczalników organicznych, jak np. alkohole oraz stabilizatorów i dodatkowych małocząsteczkowych związków, prowadzone są intensywne badania nad tzw. układami zdyspergowanymi (koloidami), które dzięki wysokiemu rozdrobnieniu substancji aktywnej pozwalają osiągnąć zadowalającą dystrybucję leków w organizmie oraz kontrolę czasu i miejsca ich uwalniania. Nośniki koloidalne tworzą bardzo różnorodną grupę struktur, co wiąże się z liczbą zaproponowanych metod ich otrzymywania, wykorzystywanych materiałów oraz zastosowań. (Mishra, B., et al., Nanomedicine, 2010, 6, 9-24; Natarajan, J. V., et al., J. Control. Release, 2014, 193, 122-138; Garg, T., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 2015, 32, 89-147). Wśród najczęściej proponowanych, a tym samym wykazujących obiecujące właściwości struktur, wymienić należy lipidowe nośniki olejowe, układy zdyspergowane stabilizowane surfaktantami, liposomy, emulsje. Spośród nich najbardziej interesującymi z punktu widzenia przemysłu oraz wykazującymi unikatowe właściwości fizykochemiczne są emulsje. Mają one bowiem szanse rozwiązać problem niskiej biodostępności leków zaklasyfikowanych do grupy II w systemie klasyfikacji biofarmaceutycznej (ang. Biopharmaceutics Classification System, BCS), charakteryzujących się niską rozpuszczalnością w wodzie i wysoką przenikalnością. Drobne kropelki olejowe łatwiej penetrują organizm. Dlatego też wiele uwagi poświęca się formulacjom typu olej w wodzie (O/W). Pozwalają one na bezpośrednią enkapsulację lipofilowych związków aktywnych. Jedną z takich substancji jest kwas oleinowy (OA), będący jednonienasyconym kwasem tłuszczowym zawierającym 18 atomów węgla w cząsteczce. Występuje on zarówno w olejach roślinnych jak i zwierzęcych, m. in. w oliwie z oliwek (80%), olejku z orzechów pekanowych (85%), herbacianym (85%), arachidowym (60%). Olej ten w temperaturze poniżej 16°C występuje w stanie stałym, powyżej tej temperatury stanowi jasnożółty lepki płyn. (Liebert, M. A., J. Am. Coll. Toxicol., 1987, 6, 321-401). W temperaturze powyżej 80°C ulega rozkładowi. Kwas ten jest nierozpuszczalny w wodzie, zaś dobrze rozpuszczalny w alkoholach, eterach, acetonie oraz benzenie.
Jednonienasycone kwasy tłuszczowe n-9, jakim jest budzący szczególne zainteresowanie kwas oleinowy, wykazują właściwości przeciwnowotworowe. Zarówno badania epidemiologiczne jak i naukowe, na poziomie komórkowym, donoszą o istotnym wpływie diety bogatej w kwas oleinowy, lub samego kwasu na inhibicję proliferacji komórek nowotworowych. (Liu, J., et al., Chem. Biodivers., 2009, 6, 503-512; Hughes-Fulford, M., et al., Carcinogenesis, 2001,22, 701-707; Martine, J., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2005, 315, 466-474; Grao, J., et al., Anticancer Res., 1986, 6, 241-244). Poza inhibicją proliferacji zaobserwowano również indukcję apoptozy w nowotworowych komórkach piersi (Menendez, J. A., et al., Ann. Oncol., 2005, 15, 359-371), czy zmniejszenie aktywności katalazy w nowotworowych komórkach krwi (Azevedo-Martins, A. K., et al., Cell. Biochem. Funct., 2008, 26, 87-94). Proponowane układy często wykorzystują amfifilową budowę kwasu oleinowego stosując go jako stabilizator.
Z międzynarodowego patentu nr WO 2016000669 znana jest formulacja przeciwnowotworowa tworzona w oparciu o mieszaninę hydrofobowo modyfikowanego kwasu hialuronowego i nieorganicznych nanocząstek, stabilizowana kwasem oleinowym. Kompozycja może zawierać m. in. nanocząstki superparamagnetyczne lub ZnO.
PL 240 632 Β1
Znany z amerykańskiego patentu nr US 7432294 jest sposób ulepszenia rozpuszczalności preparatów farmaceutycznych. Lipofilowy inhibitor proteazy HIV osiąga lepszą rozpuszczalność w proponowanym medium zawierającym średnio lub długołańcuchowy kwas tłuszczowy (preferowany kwas oleinowy), etanol lub glikol propylenowy i wodę.
W międzynarodowym opisie patentowym nr WO 2000053231 opisano koniugaty kwasów tłuszczowych (w tym głównie kwas oleinowy) ze środkami przeciwnowotworowymi. Obniżają one toksyczność leków zwiększając jednocześnie ich efektywność.
Z amerykańskiego opisu patentowego o numerze US 2009238865 znane są nanokapsuły o rozmiarach mniejszych niż 50 nm, których olejowy rdzeń jest ciekły lub półciekły w temperaturze pokojowej. Struktury te tworzone są na bazie nanoskopowych układów emulsyjnych i otoczone stałą otoczką lipidową.
W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 2012095543 opisane są nanokapsuły o rozmiarach nieprzekraczających 300 nm, złożone z kwasu glutaminowego (PGA), kwasu hialuronowego (HA) i poliasparaginianu (PAS). Struktury te otoczone są glikolem polietylenowym (PEG), stabilizowane surfaktantem kationowym bromkiem heksadecylotrimetyloamoniowym (CTABr) i przeznaczone do enkapsulacji cytostatyka docetakselu (DCX). Ciekły, olejowy rdzeń stanowi mieszanina triglicerydów.
W zgłoszeniach WO 2017014655 oraz PL413155 opisano sposób otrzymywania biokompatybilnych polisacharydowych kapsuł na ciekłych olejowych rdzeniach o średnicach nie przekraczających 1 pm, które są stabilizowane bez konieczności stosowania małocząsteczkowych surfaktantów, charakteryzujące się efektywną enkapsulacją związków o charakterze hydrofobowym i wysoką stabilnością w wodnej zawiesinie. W zgłoszeniach tych nie ujawniono zastosowania nanokapsuł tworzących układy typu „rdzeń-powłoka”.
Pomimo tego, że w literaturze przedmiotu są znane sposoby wytwarzania i stabilizacji emulsji olejowych, to nie ma nośnika przenoszącego skutecznie substancje cytotoksyczne, jak np. kwas oleinowy, który byłby w stanie zapewnić odpowiednio duże stężenie aktywnej substancji o charakterze lipofilowym albo hydrofobowym wewnątrz komórki nowotworowej. Ponadto kwas oleinowy zazwyczaj jest stosowany jako substancja stabilizująca kompozycje polimerowe lub emulsje, co nie zapewnia jego wystarczającego stężenia w obrębie komórki. Inną istotną cechą, która nie jest zapewniana przez rozwiązania znane ze stanu techniki, jest stabilność układu nośnik-substancja czynna. Nadal więc istnieje zapotrzebowanie na formulację zawierającą biokompatybilny nośnik substancji aktywnej - kwas oleinowy, która powodowałaby zauważalny efekt terapeutyczny poprzez dostarczenie istotnej ilości tej substancji do komórki nowotworowej. Nieoczekiwanie wspomniane problemy techniczne rozwiązał prezentowany wynalazek.
Przedmiotem wynalazku jest nanokapsuła z ciekłym rdzeniem olejowym, która posiada:
a) ciekły rdzeń olejowy z kwasu oleinowego,
b) otoczkę stabilizującą z hydrofobowo modyfikowanego kwasu hialuronowego zawierają 12 atomów węgla, gdzie stopień podstawienia hydrofobowych łańcuchów bocznych nie przekracza 5%, o wzorze:
gdzie p jest równe 12, m jest liczbą całkowitą o wartości 22 dla HyC12, a n jest liczbą całkowitą o wartości ok. 460 dla HyC12,
c) średnicę od 100 nm do 700 nm i jest stabilnie zawieszona w środowisku wodnym, do stosowania w terapii przeciwnowotworowej, szczególnie w leczeniu lub profilaktyce nowotworu gruczołu sutkowego albo czerniaka.
Korzystnie nanokapsuła do stosowania wykazuje cytotoksyczność względem komórek nowotworowych, przy czym indeks terapeutyczny LDso wynosi 1.5.
PL 240 632 B1
Enkapsulacja powoduje, że niesiony w kapsułach ładunek (kwas oleinowy) jest bardzo efektywnie wprowadzany do wnętrza komórki, gdzie dochodzi do jego uwolnienia. Kwas oleinowy w emulsji niestabilizowanej nie jest w stanie tak efektywnie penetrować membrany komórkowej oraz dostać się do wnętrza w ilości wykazującej działanie terapeutyczne.
Wykazano cytotoksyczność dla komórek mysiego czerniaka (komórki linii B16-F10) oraz linii mysich komórek nowotworu gruczołu sutkowego (4T1). Nowotwory, których modele zostały zbadane, to jedne z najczęściej występujących schorzeń. Toksyczność porównano ze zdrowymi mysimi prawidłowymi komórkami gruczołu sutkowego (NMuMG). Jednoznacznie wykazano istotnie wyższą toksyczność kapsuł dla komórek nowotworowych niż zdrowych.
Zbadano również szybkość penetracji kapsuł do wnętrza komórek, która jest istotna z punktu widzenia ewentualnych efektów ubocznych czy też efektywności terapii.
Istotnie, nanokapsuły z kwasem oleinowym penetrują membranę komórkową w czasie między 15 min a 1,5 godziny po podaniu.
Zasadniczą korzyścią prezentowanych nanokapsuł jest wydajna enkapsulacja kwasu ole inowego. Prosty skład i nieskomplikowana technika otrzymywania kapsuł pozwalają uzyskać stabilne układy, które można przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej kilka miesięcy. Stosowany materiał polisacharydowy jest biozgodny. Kapsuły jednoznacznie wykazują wyższą cytotoksyczność dla komórek nowotworowych hodowanych w takich samych warunkach jak komórki zdrowe.
Tylko takie rozwiązanie zapewnia biodostępność kwasu oleinowego. Stabilna emulsja gwarantuje aktywność przeciwnowotworową i to odpowiada za duży potencjał tej formulacji jako aktywnej farmaceutycznie w terapii przeciwnowotworowej.
Przykłady realizacji wynalazku przedstawiono na rysunkach: na Fig. 1 zaprezentowano wygląd emulsji tuż po otrzymaniu oraz po 14 dniach od sporządzenia (przechowywane w temperaturze pokojowej), na Fig. 2 ilościowy opis cytotoksyczności hydrofobowo modyfikowanego polisacharydu HyC12 względem komórek B16-F10 (analiza NRU), na Fig. 3 ilościowy opis cytotoksyczności hydrofobowo modyfikowanego polisacharydu HyC12 względem komórek B16-F10 (analiza XTT), na Fig. 4 ilościowy opis cytotoksyczności hydrofobowo modyfikowanego polisacharydu HyC12 względem komórek 4T1 (analiza NRU), na Fig. 5 ilościowy opis cytotoksyczności hydrofobowo modyfikowanego polisacharydu HyC12 względem komórek 4T1 (analiza XTT), na Fig. 6, ilościowy opis cytotoksyczności hydrofobowo modyfikowanego polisacharydu HyC12 względem komórek NMuMG (analiza NRU), na Fig. 7 ilościowy opis cytotoksyczności hydrofobowo modyfikowanego polisacharydu HyC12 względem komórek NMuMG (analiza XTT), na Fig. 8 ilościowa ocena cytotoksyczności kapsuł HyC12-OA (1) oraz niestabilizowanej emulsji bezpolimerowej PBS-OA (2) względem komórek B16-F10 (analiza NRU), na Fig. 9 ilościową ocenę cytotoksyczności kapsuł HyC12-OA (1) oraz niestabilizowanej emulsji bezpolimerowej PBS-OA (2) względem komórek B16-F10 (analiza XTT), na Fig. 10 ilościową ocenę cytotoksyczności kapsuł HyC12-OA (1) oraz niestabilizowanej emulsji bezpolimerowej PBS-OA (2) względem komórek 4T1 (analiza NRU), na Fig. 11 ilościową ocenę cytotoksyczności kapsuł HyC12-OA (1) oraz niestabilizowanej emulsji bezpolimerowej PBS-OA (2) względem komórek 4T1 (analiza XTT), na Fig. 12 ilościową ocenę cytotoksyczności kapsuł HyC12-OA (1) oraz niestabilizowanej emulsji bezpolimerowej PBS-OA (2) względem komórek NMuMG (analiza NRU),na Fig. 13 ilościową ocenę cytotoksyczności kapsuł HyC12-OA (1) oraz niestabilizowanej emulsji bezpolimerowej PBS-OA (2) względem komórek NMuMG (analiza XTT), na Fig. 14 kapsuły z rdzeniem z kwasu oleinowego i enkapsulowaną czerwienią Nilu (obraz wykonany za pomocą mikroskopii konfokalnej), na Fig. 15 internalizację kapsuł HyC12-NR-OA do komórek 4T1 w warunkach bezsurowiczych (preparaty wykonane w różnych odstępach czasu po podaniu do komórek).
P r z y k ł a d 1 Opis otrzymywania polisacharydowych nanokapsuł
Nanometryczne kapsuły na ciekłych rdzeniach otrzymywano poprzez bezpośrednią emulsyfikację fazy wodnej z rozpuszczonym kwasem hialuronowym zmodyfikowanym dodecylowymi węglowodorowymi łańcuchami bocznymi (1 g/l w 0,01mol/dm3 PBS) i fazy olejowej (w stosunku objętościowym 1000:3). Wstępną homogenizację prowadzono z wykorzystaniem mechanicznego 10-minutowego mieszania za pomocą wytrząsarki vortex, zaś emulsyfikację techniką 30-minutowej impulsowej sonikacji w łaźni ultradźwiękowej. Proces sonikacji prowadzono w temperaturze pokojowej.
Otrzymano kapsuły (kapsHyC12-OA) o średnicy hydrodynamicznej ok. 380 nm. Rozmiar określono na podstawie pomiaru dynamicznego rozpraszania światła, DLS. Emulsję badano kontrolnie przez kilkanaście tygodni mierząc rozmiary i stabilność. Badano próbki przechowywane w temperaturze pokojowej oraz w 4°C.
PL 240 632 Β1
Przykład 2 Otrzymywanie próby kontrolnej - emulsji bezpolimerowej
Próbę kontrolną przygotowano analogicznie jak w przykładzie 1, z tym że fazę wodną stanowił 0,01 mol/dm3 roztwór buforu fosforanowego o pH = 7,4. Krople olejowe nie były stabilizowane żadnym dodatkowym związkiem.
Rozmiar kropel olejowych (PBS-OA) wyniósł ok. 220 nm, co zostało określone na podstawie pomiarów DLS. Badania próbek przechowywanych w temperaturze pokojowej oraz w 4°C wykazały, że wraz z czasem istotnie zmniejszają się rozmiary kropel wykrywalnych za pomocą DLS, drastycznie wzrasta potencjał dzeta, a makroskopowo emulsja rozwarstwia się tworząc dwie fazy: olejową i wodną.
Tabela 1 Rozmiary kapsuł i niestabilizowanych emulsji bezpolimerowych, rozkład w zależności od temperatury przechowywania próbki i czasu.
| 25°C | 4°C | |||||||
| kapsuły | emulsja bezpolimerowa | kapsuły | emulsja bezpolimerowa | |||||
| średnica [nm] | Pdl | średnica [nm] | Pdl | średnica [nm] | Pdl | średnica [nm] | Pdl | |
| 1 dzień | 383±28a | 0,313 | 21719 | 0,432 | 537123 | 0,306 | 15716 | 0,462 |
| 3 dzień | 367118 | 0,376 | 219110 | 0,506 | 498143 | 0,326 | 21912 | 0,423 |
| 1 tydzień | 392128 | 0,380 | 233+5 | 0,628 | 438+54 | 0,437 | 201 ±1 | 0,124 |
| 6 tydzień | 370114 | 0,258 | 191 ±9 | 0,373 | 421+14 | 0,284 | 218+7 | 0,379 |
| 15 | 286+6 | 0,205 | 49+9 | 0,351 | 346118 | 0,261 | 132+84 | 0,788 |
| tydzień |
“Błąd wyznaczenia średnicy określono na podstawie odchylenia standardowego.
Tabela. 2 Potencjały dzeta kapsuł i niestabilizowanych emulsji bezpolimerowych: rozkład w zależności od temperatury przechowywania próbki i czasu.
| 25°C | 4°C | |||
| Kapsuły | emulsja bezpolimerowa | kapsuły | emulsja bezpolimerowa | |
| potencjał dzeta [mV] | potencjał dzeta [mV] | potencjał dzeta [mV] | potencjał dzeta [mV| | |
| 1 dzień | -19,8±0,4b | 53,311,8 | -19,111,1 | -50,0+0,4 |
| 3 dzień | -20,810,9 | -48,411,3 | -20,410,2 | -49,811,7 |
| 1 tydzień | -21,010,4 | -35,610,2 | -21,211,3 | -46,210,8 |
| 6 tydzień | -25,510,8 | -9,610.1 | -21,411,0 | -11,410,9 |
| 15 tydzień | -19,810,8 | -12,712,1 | -23,910,1 | N/A |
bBląd wyznaczenia potencjałów określono na podstawie odchylenia standardowego.
PL 240 632 B1
P r z y k ł a d 3 Cytotoksyczność dodecylowej pochodnej hialuronianu wobec komórek czerniaka mysiego B16-F10 - analiza wychwytu czerwieni neutralnej
Eksperymentalnym modelem nowotworu był mysi czerniak, komórki linii B16-F10. Komórki hodowane były na szalkach Petriego o średnicy 10 cm, w temperaturze 37°C, w atmosferze 95% wilgotności, wzbogaconej 5% CO2. Stosowano medium hodowlane Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM). Komórki hodowano w medium wzbogaconym płodową bydlęcą surowicą (FBS) w ilości 5% objętościowych. Komórki pasażowano po uzyskaniu 70% konfluencji. Usuwano wówczas medium z szalki, płukano 2-krotnie buforem fosforanowym (PBS), odklejano komórki za pomocą trypsyny, wirowano przez 5 min z szybkością 1000 rpm i zawieszano w odpowiedniej ilości medium. Komórki do dalszego wzrostu wysiewano na szalkach, natomiast do eksperymentów na płytkach 24-dołkowych.
Wszystkie prace wykonywano w warunkach jałowych, w komorze z przepływem laminarnym.
Celem oceny toksyczności wykonano testy przeżywalności komórek po podaniu komórkom wysianym na płytki 24-dołkowe czynnika. W niniejszym przykładzie był to hydrofobowo modyfikowany polimer (HyC12). Podawano go po 4 godzinach od wysiania komórek w medium o odpowiednim stężeniu surowicy. Do kolejnych próbek dodawano odpowiednio rozcieńczone porcje czynnika, zaś próbki kontrolne traktowano buforem fosforanowym (PBS). W pierwszym kroku próbkę rozcieńczano odpowiednio do stężeń objętościowych: 80% (0,8 ml 1 g/l HyC12 + 0,2 ml 0,01 mol/dm3 PBS), 60% (0,6 ml HyC12 + 0,4 ml PBS), 40% (0,4 ml HyC12 + 0,6 ml PBS), 20% (0,2 ml HyC12 + 0,8 ml PBS), 10% (0,1 ml HyC12 + 0,9 ml PBS). Następnie tak przygotowane i zmieszane roztwory wprowadzano do dołków z komórkami (0,1 ml próbki do 1 ml DMEM z FBS i komórkami) otrzymując następujące finalne zawartości polimeru:
10% - 91 mg/l HyC12
8% - 73 mg/l HyC12 6% - 55 mg/l HyC12 4% - 36 mg/l HyC12 2% - 18 mg/l HyC12 1% - 9 mg/l HyC12
Każdy eksperyment przeprowadzano dla komórek znajdujących się w pożywce z surowicą (5% FBS w DMEM) i bez surowicy. W przypadku eksperymentów na pożywce bezsurowiczej tuż przed podaniem czynnika odciągano medium z surowicą i dodawano medium bezsurowicze.
Analizę przeżywalności wykonywano po 24 godzinach inkubacji komórek z podanym czynnikiem.
W celu oceny przeżywalności komórek wykonano analizę wychwytu czerwieni obojętnej do lizosomów żywych komórek (ang. Neutral Red Uptake, NRU). W teście tym sprawdzono przeżywalność komórek za pomocą pomiaru spektroskopowego.
Czerwień obojętną rozpuszczano w wodzie dejonizowanej (5 mg/ml), a następnie rozcieńczano 100-krotnie medium hodowlanym. Przygotowany roztwór wirowano przez 15 min z szybkością 4000 rpm w celu odseparowania nierozpuszczonych kryształków barwnika. Roztwór ogrzewano w łaźni wodnej do temperatury 37°C. Dołki płytek z komórkami gotowymi do poddania testowi w pierwszym kroku płukano ciepłym medium hodowlanym (każdy objętością 1 ml). Następnie dołek zalewano ostrożnie 0,8 ml ciepłego roztworu czerwieni obojętnej. Płytki umieszczano w inkubatorze w warunkach identycznych do hodowlanych i pozostawiano osłonięte od światła na 3 h. Po tym czasie w warunkach niejałowych płukano każdy dołek ciepłym roztworem PBS (po 1 ml na dołek), a następnie zalewano 0,5 ml odbarwiacza (wodny roztwór 50% etanolu i 1% kwasu octowego). Płytki zabezpieczone przed dostępem światła pozostawiano na kilka minut na wytrząsarce orbitalnej przy minimalnej szybkości kołysania. Następnie mierzono absorbancję roztworów znajdujących się w dołkach płytki, z zastosowaniem czytnika płytek, przy długościach fali 540 nm oraz 790 nm.
Dla każdej próbki wykonywano po 3 powtórzenia. Obliczano przeżywalność względem kontrolnych próbek oraz odchylenie standardowe.
Otrzymane wyniki wskazują, że modyfikowany hydrofobowo kwas hialuronowy (HyC12) jest materiałem niemal nietoksycznym dla badanej linii komórkowej. Przeżywalność wszystkich próbek utrzymała się na poziomie od 50% do 100%, przy czym znacznie mniejszą toksyczność obserwowano w obecności surowicy (5% FBS w DMEM). Badania potwierdziły, że polimer nie będzie wykazywał synergistycznego działania z podawanymi w kolejnych eksperymentach czynnikami.
PL 240 632 B1
P r z y k ł a d 4 Cytotoksyczność dodecylowej pochodnej hialuronianu wobec komórek czerniaka mysiego B16-F10 - ocena za pomocą testu XTT
Eksperyment przygotowano i przeprowadzono jak w przykładzie 3, z tym że analizę przeżywalności przeprowadzono wykonując test XTT, pozwalający ocenić aktywność metabolizmu mitochondrialnego przetrwałych, żyjących komórek. Przeprowadzono eksperyment dla komórek hodowanych w DMEM zawierającym 5% FBS oraz bez zawartości FBS.
W przeprowadzanym teście sól tetrazolowa XTT ulega redukcji do nierozpuszczalnego formazanu pod wpływem działania dehydrogenazy mitochondrialnej. Makroskopowo efekt uwidacznia się zmianą barwy roztworu. Test XTT jest czulszy niż NRU i pozwala na ilościową ocenę przeżywalności. Wynik testu XTT docelowo podlega analizie na podstawie pomiaru absorbancji.
Pomiary potwierdziły, że dodecylowa pochodna hialuronianu (HyC12) jest materiałem niskotoksycznym dla linii komórek B16-F10.
P r z y k ł a d 5 Cytotoksyczność dodecylowej pochodnej hialuronianu wobec mysich komórek nowotworowych gruczołu sutkowego 4T1 - analiza wychwytu czerwieni neutralnej
Eksperyment przebiegł jak w przykładzie 3, z tym, że badaniom podlegała linia mysich komórek nowotworowych 4T1. Komórki hodowano w DMEM zawierającym 2,5% FBS oraz bez FBS.
Hialuronian modyfikowany dodecylowym łańcuchem alkilowym nie wykazał istotnej toksyczności dla badanego układu. W porównaniu do linii komórek czerniaka mysiego B16-F10 toksyczność jest znacznie mniejsza.
P r z y k ł a d 6 Cytotoksyczność dodecylowej pochodnej hialuronianu wobec mysich komórek nowotworowych gruczołu sutkowego 4T1 - ocena za pomocą testu XTT
Przebieg eksperymentu był analogiczny do tego przedstawionego w przykładzie 5, z tym, że wyniki analizowano za pomocą testu XTT.
Potwierdzono brak toksyczności dodecylowej pochodnej kwasu hialuronowego dla komórek.
P r z y k ł a d 7 Cytotoksyczność dodecylowej pochodnej hialuronianu wobec mysich prawidłowych komórek gruczołu sutkowego NMuMG - analiza wychwytu czerwieni neutralnej
Eksperyment przebiegł jak w przykładzie 3, z tym, że badaniom podlegała linia mysich prawidłowych komórek NMuMG. Komórki hodowano w DMEM zawierającym 10% FBS oraz insulinę (w ilości 1 μl na 1 ml).
Hialuronian modyfikowany dodecylowym łańcuchem alkilowym nie wykazał toksyczności względem badanych komórek.
P r z y k ł a d 8 Cytotoksyczność dodecylowej pochodnej hialuronianu wobec mysich prawidłowych komórek gruczołu sutkowego NMuMG - ocena za pomocą testu XTT
Badanie wykonano jak w przykładzie 7, z tym, że analizę toksyczności przeprowadzono za pomocą testu XTT. Potwierdzono brak istotnej toksyczności dla prawidłowych komórek pochodnej kwasu hialuronowego.
P r z y k ł a d 9 Cytotoksyczność nanokapsuł z rdzeniem z kwasu oleinowego oraz emulsji bezpolimerowej wobec komórek czerniaka mysiego B16-F10 - analiza wychwytu czerwieni neutralnej
Przygotowano nanokapsuły oraz emulsję bezpolimerową jak w przykładzie odpowiednio 1 i 2. Pozostawiono je w temperaturze pokojowej na okres 14 dni. Po tym czasie emulsję bezpolimerową sączono przez sączek o porach o średnicy 91 mm w celu odseparowania dużych kropli olejowych, które zbierały się na powierzchni niestabilnej emulsji, zaś próbkę kapsuł podawano komórkom bez dodatkowego oczyszczania.
Eksperyment na komórkach przebiegł analogicznie do przedstawionego w przykładzie 3, z tym, że podawany czynnik miał następujące składy: 10% - 91 mg/l HyC12, 0,86 mmol/dm3OA 8% - 73 mg/l HyC12, 0,69 mmol/dm3OA 6% - 55 mg/l HyC12, 0,54 mmol/dm3OA 4% - 36 mg/l HyC12, 0,35 mmol/dm3OA 2% - 18 mg/l HyC12, 0,18 mmol/dm3OA 1% - 9 mg/l HyC12, 0,09 mmol/dm3OA
PL 240 632 B1
Zaś w przypadku podawania emulsji bezpolimerowej:
10% - 0,86 mmol/dm3 OA
8% - 0,69 mmol/dm3 OA
6% - 0,54 mmol/dm3 OA
4% - 0,35 mmol/dm3 OA
2% - 0,18 mmol/dm3 OA
1% - 0,09 mmol/dm3 OA
Analiza NRU pozwoliła zaobserwować istotną toksyczność stosowanego układu stabilizowanego hydrofobowo modyfikowanym polisacharydem. Brak toksyczności emulsji bezpolimerowej wynika z jej niestabilności, przez co nie jest możliwe dostarczenie do komórek takiej ilości OA, jak poprzez nanokapsuły. Potwierdza to słuszność enkapsulacji kwasu oleinowego w kapsułach na bazie kwasu hialuronianowego.
P r z y k ł a d 10 Cytotoksyczność nanokapsuł z rdzeniem z kwasu oleinowego oraz emulsji bezpolimerowej wobec komórek czerniaka mysiego B16-F10 - ocena za pomocą testu XTT
Eksperyment przeprowadzono analogicznie do przykładu 9, z tym, że do oceny toksyczności wykorzystano test XTT. Potwierdzono istotną toksyczność kapsuł stabilizowanych za pomocą dodecylowej pochodnej hialuronianu, zaś brak toksyczności układu niestabilnej emulsji bezpolimerowej.
P r z y k ł a d 11 Cytotoksyczność nanokapsuł z rdzeniem z kwasu oleinowego oraz emulsji bezpolimerowej wobec mysich komórek nowotworowych gruczołu sutkowego 4T1 - analiza wychwytu czerwieni neutralnej
Badanie przebiegło analogicznie do tego opisanego w przykładzie 9, z tym, że badaniu podległa linia mysich nowotworowych komórek 4T1 hodowana w DMEM zawierającym 10% FBS oraz w warunkach bezsurowiczych.
Zaobserwowano wysoką toksyczność kapsuł z OA występującą już po podaniu czynnika w ilości 6%. Emulsja bezpolimerowa nie wykazała toksycznego działania na komórki.
P r z y k ł a d 12 Cytotoksyczność nanokapsuł z rdzeniem z kwasu oleinowego oraz emulsji bezpolimerowej wobec mysich komórek nowotworowych gruczołu sutkowego 4T1 - ocena za pomocą testu XTT
Eksperyment przeprowadzono jak w przykładzie 11, z tym, że toksyczność oceniono na podstawie testu XTT. Wyniki potwierdziły wnioski o toksyczny wpływ nanokapsuł i brak toksyczności emulsji niestabilizowanej polimerem względem mysich komórek nowotworowych gruczołu sutkowego 4T1.
P r z y k ł a d 13 Cytotoksyczność nanokapsuł z rdzeniem z kwasu oleinowego oraz emulsji bezpolimerowej wobec mysich prawidłowych komórek gruczołu sutkowego NMUMG - ocena za pomocą wychwytu czerwieni neutralnej
Badania przebiegły analogicznie jak w przykładzie 11, z tym że eksperyment przeprowadzono na linii prawidłowych komórek gruczołu sutkowego NMuMG hodowanych w DMEM z 10% FBS i insuliną (1 μl na 1 ml).
Kapsuły nie wykazały tak silnej toksyczności jak dla linii nowotworowych, w szczególności w porównaniu do linii komórek nowotworu gruczołu sutkowego 4T1. Emulsja niestabilizowana nie wykazała toksycznego działania.
P r z y k ł a d 14 Cytotoksyczność nanokapsuł z rdzeniem z kwasu oleinowego oraz emulsji bezpolimerowej wobec mysich prawidłowych komórek gruczołu sutkowego NMUMG - ocena za pomocą testu XTT
Eksperyment wykonano analogicznie jak ten w przykładzie 13, z tym, że cytotoksyczność oceniono za pomocą testu XTT. Potwierdzono wyniki otrzymane za pomocą testu NRU wykazując niższą toksyczność kapsuł dla komórek prawidłowych niż dla komórek nowotworowych oraz brak toksyczności emulsji bezpolimerowej.
P r z y k ł a d 15 Enkapsulacja czerwieni Nilu, NR, do celów obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej
Nanokapsuły przygotowano jak w przykładzie 1, z tym, że enkapsulowano kwas oleinowy z rozpuszczonym w nim barwnikiem czerwienią Nilu o stężeniu 1 g/l. Otrzymano kapsuły o średnicy hydrodynamicznej ok. 320 nm, określonej na podstawie pomiaru DLS. Potwierdzono zdolność kapsuł do efektywnej enkapsulacji hydrofobowych barwników. Zobrazowano kapsuły za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej.
Claims (2)
- PL 240 632 Β1Przykład 16 Internalizacja nanokapsuł z rdzeniem z kwasu oleinowego z enkapsulowanym NR do komórek nowotworowych gruczołu sutkowego 4T1W celu zaobserwowania internalizacji nanokapsuł do komórek wysiano nowotworowe komórki linii 4T1 na płytkach 6-dołkowych, na mikroskopowych szkiełkach nakrywkowych. Po ok. 4 godzinach podano nanokapsuły z enkapsulowaną czerwienią Nilu (przygotowane według opisu z przykładu 15). Bezpośrednio przed podaniem czynnika wymieniono medium zawierające surowicę (2,5%) na medium bezsurowicze. Podawano 5-krotnie rozcieńczoną próbkę w ilości 100 μΙ na dołek z przyklejonymi komórkami zalanymi 2 ml DMEM bez FBS. Próbki utrwalano w następujących odstępach czasu: 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 24 h od podania czynnika. Proces utrwalania rozpoczynano od płukania dołków ciepłym 0,01 mol/dm3 PBS w warunkach niejałowych. Następnie zalewano dołki 2 ml 4% formaliny w PBS. Po około 10 minutach płukano ponownie dołki ciepłym PBS i umieszczano szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych. Preparaty przechowywano w temperaturze pokojowej, osłonięte przed światłem.Preparaty obrazowano za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej w świetle przechodzącym używając lasera o długości fali wzbudzenia Xex= 561 nm.Uzyskane zdjęcia pozwoliły w sposób powtarzalny zaobserwować drogę wchodzenia kapsuł do wnętrza komórki i wstępnie postulować opis mechanizmu internalizacji kapsuł w komórkach, w szczególności w badanych w tym przypadku komórkach nowotworowych gruczołowych (4T1). Tuż po podaniu, kapsuły wraz z niesionym ładunkiem są wychwytywane i lokują się w komórce w postaci tzw. wczesnych endosomów. Wraz z upływem kolejnych minut endosomy dojrzewają, są wzbogacane w różne związki, m. in. hialuronidazę trawiącą hialuronianową powłokę kapsuł (Vaes, G., Biochem. J., 1967, 103, 802-804). Dochodzi do rozpadu nośnika oraz endosomu i wypływu zawartości kapsuły - oleju - do cytoplazmy (preparat utrwalony po 2 h). Następnie krople olejowe zbierają się do tzw. kropli lipidowych, które należą do tzw. organelli dynamicznych. (Martin, S., Parton, R. G., Nat. Rev. Mol. Celi Bio., 2006, 7, 373-378.) Obserwowane procesy jednoznacznie potwierdzają zdolność przygotowanych kapsuł do efektywnego dostarczenia ładunku do wnętrza komórki.Zastrzeżenia patentowe1. Nanokapsuła z ciekłym rdzeniem olejowym, która posiada:a) ciekły rdzeń olejowy z kwasu oleinowego,b) otoczkę stabilizującą z hydrofobowo modyfikowanego kwasu hialuronowego zawierają 12 atomów węgla, gdzie stopień podstawienia hydrofobowych łańcuchów bocznych nie przekracza 5%, o wzorze:gdzie p jest równe 12, m jest liczbą całkowitą o wartości 22 dla HyC12, a n jest liczbą całkowitą o wartości ok. 460 dla HYC12,c) średnicę od 100 nm do 700 nm i jest stabilnie zawieszona w środowisku wodnym, do stosowania w terapii przeciwnowotworowej, szczególnie w leczeniu lub profilaktyce nowotworu gruczołu sutkowego albo czerniaka.
- 2. Nanokapsuła do stosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że wykazuje cytotoksyczność względem komórek nowotworowych, przy czym indeks terapeutyczny LDso wynosi 1.5.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL425141A PL240632B1 (pl) | 2018-04-06 | 2018-04-06 | Zastosowanie nanokapsuły z ciekłym rdzeniem olejowym w terapii przeciwnowotworowej |
| PCT/PL2019/050021 WO2019194692A1 (en) | 2018-04-06 | 2019-04-06 | Nanocapsule with liquid oil core, its preparation method and application |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL425141A PL240632B1 (pl) | 2018-04-06 | 2018-04-06 | Zastosowanie nanokapsuły z ciekłym rdzeniem olejowym w terapii przeciwnowotworowej |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL425141A1 PL425141A1 (pl) | 2019-10-07 |
| PL240632B1 true PL240632B1 (pl) | 2022-05-09 |
Family
ID=68099314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL425141A PL240632B1 (pl) | 2018-04-06 | 2018-04-06 | Zastosowanie nanokapsuły z ciekłym rdzeniem olejowym w terapii przeciwnowotworowej |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL240632B1 (pl) |
| WO (1) | WO2019194692A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL4321175T3 (pl) | 2022-08-11 | 2025-12-22 | Chde Polska S.A. | Magnetyczne nanokapsuły polimerowe nadające się do stosowania w terapii, zwłaszcza antynowotworowej |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2445763A1 (en) * | 2001-05-01 | 2002-11-07 | Angiotech Pharmaceuticals Inc. | Compositions comprising an anti-microtubule agent and a polypeptide or a polysaccharide and the use thereof for the preparation of a medicament for the treatment of inflammatory conditions |
| HK1209021A1 (en) * | 2012-06-07 | 2016-03-24 | President And Fellows Of Harvard College | Nanotherapeutics for drug targeting |
| PL229276B1 (pl) * | 2015-07-17 | 2018-06-29 | Univ Jagiellonski | Nanokapsuła do przenoszenia związku lipofilowego i sposób jej wytwarzania |
-
2018
- 2018-04-06 PL PL425141A patent/PL240632B1/pl unknown
-
2019
- 2019-04-06 WO PCT/PL2019/050021 patent/WO2019194692A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL425141A1 (pl) | 2019-10-07 |
| WO2019194692A1 (en) | 2019-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Khurana et al. | Improving the biopharmaceutical attributes of mangiferin using vitamin E-TPGS co-loaded self-assembled phosholipidic nano-mixed micellar systems | |
| Zhang et al. | Enhancement of transdermal delivery of artemisinin using microemulsion vehicle based on ionic liquid and lidocaine ibuprofen | |
| Zhai et al. | In vitro and in vivo toxicity and biodistribution of paclitaxel-loaded cubosomes as a drug delivery nanocarrier: A case study using an A431 skin cancer xenograft model | |
| Cavalcante et al. | Doxorubicin-loaded pH-sensitive micelles: A promising alternative to enhance antitumor activity and reduce toxicity | |
| Nagi et al. | Quality by design based silymarin nanoemulsion for enhancement of oral bioavailability | |
| Yang et al. | Near-infrared light triggered liposomes combining photodynamic and chemotherapy for synergistic breast tumor therapy | |
| Yi et al. | Rhamnolipid nanoparticles for in vivo drug delivery and photodynamic therapy | |
| Meure et al. | The depressurization of an expanded solution into aqueous media for the bulk production of liposomes | |
| Kaur et al. | Development of mirtazapine loaded solid lipid nanoparticles for topical delivery: Optimization, characterization and cytotoxicity evaluation | |
| KR102924306B1 (ko) | 건강관리 제품을 위한 계면활성제 | |
| Zhu et al. | Glycyrrhetinic acid-modified TPGS polymeric micelles for hepatocellular carcinoma-targeted therapy | |
| Deshpande et al. | Enhancing cubosome functionality by coating with a single layer of poly-ε-lysine | |
| CN101579310A (zh) | 一种多烯紫杉醇自微乳组合物及其制备方法 | |
| Kuznetsova et al. | Novel hybrid liposomal formulations based on imidazolium-containing amphiphiles for drug encapsulation | |
| KR20220114639A (ko) | 건강관리 제품에 사용하기 위한 계면활성제 | |
| Lacatusu et al. | Lipid nanocarriers based on natural compounds: An evolving role in plant extract delivery | |
| JP2011516472A (ja) | 微小管相互作用薬の脂質−油−水型ナノエマルジョンデリバリシステム | |
| Streck et al. | Tailoring microstructural, drug release properties, and antichagasic efficacy of biocompatible oil-in-water benznidazol-loaded nanoemulsions | |
| KR20070046819A (ko) | 지질 부형제의 자가 유화 혼합물의 갈레노스 용도 | |
| Nazar et al. | Fourth-generation antibiotic gatifloxacin encapsulated by microemulsions: structural and probing dynamics | |
| Nnamani et al. | SRMS142-based solid lipid microparticles: application in oral delivery of glibenclamide to diabetic rats | |
| Dhawan et al. | Implementation of quality by design (QbD) concept for the development of emulsion based nanotailored gel for improved antiphotoageing potential of Silymarin | |
| He et al. | Core–shell structured gel-nanocarriers for sustained drug release and enhanced antitumor effect | |
| Izadiyan et al. | Improvement of physicochemical properties of nanocolloidal carrier loaded with low water solubility drug for parenteral cancer treatment by Response Surface Methodology | |
| Yaghmur et al. | In situ monitoring of the formation of lipidic non-lamellar liquid crystalline depot formulations in synovial fluid |