PL241022B1 - Sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio z użyciem izoetaryny oraz zastosowanie izoetaryny do depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio - Google Patents
Sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio z użyciem izoetaryny oraz zastosowanie izoetaryny do depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio Download PDFInfo
- Publication number
- PL241022B1 PL241022B1 PL435984A PL43598420A PL241022B1 PL 241022 B1 PL241022 B1 PL 241022B1 PL 435984 A PL435984 A PL 435984A PL 43598420 A PL43598420 A PL 43598420A PL 241022 B1 PL241022 B1 PL 241022B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- isoetarin
- fish
- zebrafish
- research model
- solution
- Prior art date
Links
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 title claims abstract description 50
- HUYWAWARQUIQLE-UHFFFAOYSA-N Isoetharine Chemical compound CC(C)NC(CC)C(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 HUYWAWARQUIQLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 36
- 229960001268 isoetarine Drugs 0.000 title claims abstract description 36
- 238000011160 research Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 title claims abstract description 21
- 230000035614 depigmentation Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical class CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims abstract 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 25
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 231100000378 teratogenic Toxicity 0.000 description 5
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FULZLIGZKMKICU-UHFFFAOYSA-N N-phenylthiourea Chemical compound NC(=S)NC1=CC=CC=C1 FULZLIGZKMKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003061 melanogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000003367 Hypopigmentation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 239000000808 adrenergic beta-agonist Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016966 beta-2 Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010014499 beta-2 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003454 betamimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004373 eye development Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003425 hypopigmentation Effects 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N kojic acid Chemical class OCC1=CC(=O)C(O)=CO1 BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007653 larval development Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000003101 melanogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 230000000270 postfertilization Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010008359 protein kinase C lambda Proteins 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób depigmentacji modelu badawczego ryby zwłaszcza z gatunku danio pręgowanego, polegający na przygotowaniu medium odżywczego dla ryb zawierającego mieszaninę soli w wodzie demineralizowanej z dodatkiem substancji aktywnej, a następnie umieszczeniu w nim modelu badawczego ryby i utrzymywaniu w medium odżywczym do uzyskania pożądanego stopnia odbarwienia, korzystnie całkowitego odbarwienia charakteryzuje się tym, że jako substancję aktywną w medium odżywczym stosuje się izoetarynę w postaci soli kwasu mesylowego, w ilości od 1,7106 g do 5,0313 g na 1L wodnego roztworu medium hodowlanego, odpowiadający stężeniu izoetaryny w zakresie od 5,1 mM do 15 mM. Przedmiotem zgłoszenia jest także izoetaryna do zastosowania w depigmentacji ryby, zwłaszcza z gatunku danio pręgowatego.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio, stosowanego do celów diagnostycznych, z użyciem izoetaryny oraz zastosowanie izoetaryny jako nowego narzędzia do wygenerowania modelu in vivo transparentnej ryby z gatunku Danio rerio.
Danio pręgowany (łac. Danio rerio) jest organizmem modelowym stosowanym w badaniach in vivo podczas analiz biomedycznych. Rozwój embrionalny i larwalny danio pręgowanego został szczegółowo opisany w literaturze [Kimmel C.B., Ballard W.W., Kim-mel S.R., Ullmann B., Schilling T.F., 1995 - Stages of Embryonic De-velopment of the Zebrafish. Dev. Dynam. 203, 255-31]. Warunki chowu tego gatunku zostały zwalidowane w warunkach laboratoryjnych, dzięki czemu uzyskano powtarzalność wyników doświadczeń oraz popularyzację tego modelu na świecie. Łączy on zdolność przetwórczą bezkręgowców o dużej przepustowości i znaczne podobieństwo genetyczne do ludzi [Howe K., Clark M. D., Torroja C. F., Torrance J., Berthelot C., et al. 2013. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature 496, 498-503. Chen YM, Su WC, Li C, Shi Y, Chen QX, Zheng J, Tang DL, Chen SM, Wang Q. Anti-melanogenesis of novel kojic acid derivatives in B16F10 cells and zebrafish. Int J Biol Macromol. 2019 Feb 15; 123: 723-731.]. Danio pręgowany znajduje szerokie zastosowanie w badaniu patogenezy chorób, testowaniu nowych leków oraz do opracowywania nowych terapii. Do najważniejszych chorób, zaliczanych do zagrożeń cywilizacyjnych, nad którymi prowadzone są badania przy zastosowaniu modelu danio pręgowanego należą: choroby neurodegeneracyjne i psychiczne, choroby nowotworowe i serca, choroby układu mięśniowo-kostnego, różnego typu zaburzenia układu i rozwoju. Ponadto, model ten stosowany jest w badaniach dotyczących farmakodynamiki, toksykologii oraz kontroli środowiska. W szczególności, danio pręgowany stanowi model in vivo w badaniach procesu melanogezy [The extract of Rhodobacter sphaeroides inhibits melanogenesis through the MEK/ERK signaling pathway. Liu WS, Kuan YD, Chiu KH, Wang WK, Chang FH, Liu CH, Lee CH Mar Drugs. 2013 Jun 3; 11(6): 1899-908.].
Obecnie, komercyjnie dostępne są transparentne larwy oraz osobniki dorosłe danio pręgowanego, otrzymane na drodze mutacji genowej, regulującej formowanie pigmentu (nacrew2/w2 and roya9/a9) lub syntezę melaniny (albb4/b4) [Antinucci, P., & Hindges, R. (2016). A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Sci Rep, 6, 29490. doi: 10.1038/srep29490, Michael A Pickart 1, Sridhar Sivasubbu, Aubrey L Nielsen, Sabitha Shriram, Richard A King, Stephen C Ekker. Functional genomics tools for the analysis of zebrafish pigment. Pigment Cell Res. 2004 Oct; 17(5): 461-70]. Transparentność indukować można również działając na larwy danio pręgowanego związkiem chemicznym o nazwie 1-fenylo-2-tiomocznik (PTU) [Choi, T. Y., Kim, J. H., Ko, D. H., Kim, C. H., Hwang, J. S., Ahn, S., Kim, S. Y., Kim, C. D., Lee, J. H., Yoon, T. J. (2007). Zebrafish as a new model for phenotype-based screening of melanogenic regulatory compounds. Pigment Cell Res, 20(2), 120-127. doi: 10.1111/j. 16000749.2007.00365. Li, Z., Ptak, D., Zhang, L., Walls, E. K., Zhong, W., & Leung, Y. F. (2012). Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One, 7(6), e40132. doi: 10.1371/joumal.pone.0040132.]. Dane literaturowe wskazują, że optymalne stężenie PTU potrzebne do wywołania transparentności to zaledwie 75 μΜ. Dla stężeń już 2.7 razy wyższych obserwowane były zmiany teratogenne, np. deformacje szczęki, dlatego w jego stosowaniu zalecana jest ostrożność [Karlsson, J., von Hofsten, J., & Olsson, P. E. (2001). Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY), 3(6), 522-527. doi:10.1007/s1012601-0053-4].
Podczas badań nieoczekiwanie okazało się, że izoetaryna jest skutecznym narzędziem do wygenerowania transparentnego modelu ryby z gatunku Danio rerio.
Wynalazek rozwiązuje zagadnienie depigmentacji modelu badawczego ryby Danio rerio przy użyciu izoetaryny, który wykorzystywany jest przy badaniach w celach diagnostycznych w szczególności chorób neurodegeneracyjnych, nowotworowych, krążenia, układu mięśniowo-kostnego oraz różnego typu zaburzeń w rozwoju.
Izoetaryna (łac. isoetharinum) należy do grupy katecholamin wykazujących działanie agonistyczne wobec receptora β2 adrenergicznego (e2-AR). Izoetaryna jest selektywnym agonistą e2-AR wykazującym krótki czas działania. Izoetaryna do roku 2015 znajdowała zastosowanie w Polsce jako lek w leczeniu astmy powodujący natychmiastowy rozkurcz mięśni gładkich oskrzeli.
Pomimo istnienia wzmianek na temat wpływu związków działających agonistycznie wobec receptora e2-AR i należących do grupy beta-mimetyków na hipopigmentacje [Wang, Z., Nishimura, Y., Shimada, Y., Umemoto, N., Hirano, M., Zang, L., Oka, T., Sakamoto, C., Kuroyanagi, J., Tanaka, T. (2009).
PL 241 022 B1
Zebrafish beta-adrenergic receptor mRNA expression and control of pigmentation. Gene, 446(1), 18-27. doi:10.1016/j.gene.2009.06.005], nie istnieją żadne doniesienia traktujące o wpływie izoetaryny na redukcję ubarwienia u ryb zwłaszcza danio pręgowanego.
Istota sposobu depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku danio pręgowanego, polega na tym, że przygotowuje się najpierw medium hodowlane dla ryb, odpowiadające warunkom naturalnym, zawierające mieszaninę soli korzystnie NaCl, KCl, (CaCl2 2H2O), (MgCl2 6H2O) lub MgSO4, po czym dodaje się izoetarynę w postaci soli kwasu mesylowego w ilości od 1,7106 g do 5,0313 g na 1 litr wodnego roztworu medium hodowlanego, odpowiadający stężeniu izoetaryny w zakresie od 5,1 mM do 15 mM, następnie umieszcza się w nim ryby Danio rerio korzystnie natychmiast po zapłodnieniu na okres od 96 do 120 godzin po zapłodnieniu, następnie ryby korzystnie całkowicie odbarwione stosuje się do eksperymentów badawczych.
Korzystnie model badawczy ryby umieszczony jest w medium odżywczym o temperaturze 20-29°C.
Korzystnie medium odżywcze z mieszaniną soli posiada pH na poziomie: 6,9-7,5.
Korzystnie pH 6,9-7,5 uzyskuje się za pomocą wodnego roztworu wodorotlenku, korzystnie NaOH.
Korzystnie model badawczy ryby umieszcza się w roztworze z dodatkiem izoetaryny na 96 godzin od momentu zapłodnienia.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie izoetaryny do depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku danio pręgowanego wykorzystywanej do celów monitorowania rozwoju fizjologicznego/biologicznego oraz do celów diagnostycznych.
Izoetaryna jest skutecznym narzędziem w depigmentacji ryb zwłaszcza larw danio pręgowanego, stosowanego jako model badawczy w celach diagnostycznych (m.in. badania przesiewowe substancji będących potencjalnymi lekami, testowanie leków, opracowywanie nowych terapii).
Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że larwy danio pręgowanego wystawione na działanie roztworu izoetaryny w stężeniu korzystnie 7,50 mM ulegały całkowicie i trwale odbarwieniu. Ponadto, roztwór izoetaryny w użytych stężeniach nie powoduje zmian teratogennych. Dawka LC50, określająca stężenie powodujące śmiertelność u 50% badanych osobników, wyniosła 20,54 mM i jest czterokrotnie wyższa od AC50 (stężenie powodujące depigmentację u 50% badanej populacji) równego 5,10 mM; sprawia to, że używanie izoetaryny jest bezpieczne. Ponadto, zastosowanie roztworu izoetaryny o stężeniu 15,00 mM, dwukrotnie wyższym od stężenia optymalnego (7,50 nM), nie powoduje zmian teratogennych oraz śmiertelności u larw danio pręgowanego w 96 godzinie po zapłodnieniu.
Wynalazek pozwala uzyskiwać każdorazowo do celów badawczych transparentną rybę przy użyciu izoetaryny w ilości według wynalazku w sposób kontrolowany. Ponadto sposób pozwala uniknąć rozbudowanych procedur pozwalających na użycie w obrocie zwierząt GMO. To z kolei umożliwia podejmowanie i prowadzenie w dogodnym czasie badań diagnostycznych na modelu transparentnej ryby otrzymanej według wynalazku np. przy testowaniu różnych leków.
Wynalazek jest przedstawiony w poniższych przykładach, gdzie uzyskano depigmentację na przykładzie larw danio pręgowanego.
P r z y k ł a d 1:
Izoetarynę w postaci soli kwasu mesylowego w postaci wodnego roztworu o stężeniu 5,10 mM zastosowano w medium hodowlanym (stężenie powodujące depigmentację u 50% badanych osobników w 96-godzinie od zapłodnienia).
Roztwór stanowiący medium hodowlane sporządzony był wg. poniższych procedur:
1. Roztwór podstawowy:
Mieszaninę soli w poniższych proporcjach: 17,4 g NaCl, 0,8 g KCl, 2,9 g (CaCl2 2H2O), 4,89 g (MgCl2 6H2O) rozpuszczono w wodzie demineralizowanej tak, aby otrzymać 1 litr roztworu. Otrzymany roztwór przechowywano w lodówce.
2. Roztwór E3 (roztwór podstawowy z dodatkiem NaOH):
16,5 ml roztworu podstawowego (przygotowanie jw.) dodajemy do 1 litra wody demineralizowanej (ultrapure water). Otrzymany roztwór miareczkujemy roztworem 0,1 M NaOH do uzyskania pH na poziomie pH: 7,0. Otrzymany roztwór utrzymywany jest w temp. pokojowej 18-25°C. Otrzymany w powyższy sposób roztwór E3 stanowi medium hodowlane dla ryb Danio rerio dedykowane do hodowli odpowiadającej warunkom naturalnym.
Następnie otrzymano roztwór izoetaryny:
Do 1 litra roztworu E3 dodano izoetarynę w postaci soli kwasu mesylowego w ilości 1,7106 g.
PL 241 022 B1
P r z y k ł a d 2:
Sposobem opisanym w przykładzie 1 sporządzono wodny roztwór izoetaryny o stężeniu 7,5 mM, w tym celu do 1 litra roztworu E3 dodano izoetarynę w postaci soli kwasu mesylowego w ilości 2,5156 g, przy czym roztwór E3 posiadał pH 7,1.
P r z y k ł a d 3:
Sporządzono wodny roztwór izoetaryny o stężeniu 15,0 mM, sposobem opisanym w przykładzie 1, przy czym do 1 litra roztworu E3 dodano izoetarynę w postaci soli kwasu mesylowego w ilości 5,0313 g, przy czym roztwór E3 posiadał pH 7,1.
W tak sporządzonej serii wodnych roztworów izoetaryny opisanych w przykładzie 1-3 umieszczono embriony danio pręgowanego natychmiast po zapłodnieniu. Embriony oraz larwy danio pręgowanego umieszczone w 96-dołkowej płytce wystawiono na ekspozycję wodnego roztworu izoetaryny przez okres 96 hpf (godziny po zapłodnieniu; ang. hours post fertilization). Każdego dnia przygotowywano świeży roztwór izoetaryny i delikatnie wymieniano.
Każdego dnia embriony/larwy danio pręgowanego obserwowano pod mikroskopem stereoskopowym, natomiast w 96 hpf obserwowano i odnotowywano liczbę larw, u których zaszły zmiany pod wpływem badanego związku. Przez cały okres badań danio pręgowany utrzymywany był w temperaturze 28,5±0,5°C w cyklu dobowym 14 h/10 h dzień/noc.
W wyniku przeprowadzenia procesu depigmentacji larwy danio pręgowanego wystawione na działanie izoetaryny w stężeniu 7,50 mM ulegały całkowicie odbarwieniu w 4 dniu po zapłodnieniu (96 hpf), co przedstawia Rys. 1, obejmujący zdjęcia 1-4. Proces ten zaszedł u 100% badanych larw.
Na zdjęciach pokazano porównanie larwy danio pręgowanego (96 hpf) wystawionej na działanie roztworu izoetaryny o stężeniu 7,5 mM przez okres 96 godzin od momentu zapłodnienia - zdjęcia z prawej strony (model odbarwiony). Zdjęcia z lewej strony przedstawiają kontrolę - larwę danio pręgowanego (96 hpf) utrzymywanego w medium hodowlanym (E3). Porównanie larw na zdjęciach uwzględnia widok z góry (widok grzbietowy) oraz boku larwy (widok boczny).
Natomiast wystawienie na działanie izoetaryny w stężeniu 5,10 mM spowodowało odbarwienie u 50% badanej grupy danio pręgowanego przez okres 96 godzin od zapłodnienia. Zaś wystawienie danio pręgowanego na działanie izoetaryny w stężeniu 15 mM spowodowało całkowite odbarwienie i nie powodowało zmian teratogennych oraz śmiertelności u ryb w 96 godzinie od zapłodnienia. Wszystkie zaobserwowane zmiany w morfologii (odbarwienie) ryb wystąpiły pod wpływem izoetaryny (izoeteryna użyta w postaci soli kwasu mesylowego, wodny roztwór).
Wyznaczona wartość AC50 (50% efektywnego stężenia wywołującego depigmentację) wyniosła 5,10 mM. Wyindukowana transparentność dotyczyła całego organizmu, w tym również najsilniej ubarwionego narządu u ryb, jakim jest oko. To dodatkowo czyni otrzymany model atrakcyjnym w badaniach nad rozwojem oka, testowaniem nowych, odpowiednich preparatów farmaceutycznych oraz opracowywaniem nowych terapii stosowanych w chorobach okulistycznych.
Izoetaryna jest skutecznym narzędziem w indukowaniu depigmentacji ryb zwłaszcza danio pręgowanego, stosowanego jako model badawczy do celów diagnostycznych. Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że larwy danio pręgowanego wystawione na działanie wodnego roztworu izoetaryny w stężeniu korzystnie 7,50 mM ulegały całkowicie odbarwieniu po 96 godzinach od zapłodnienia. Ponadto, nie odnotowano aby wodny roztwór izoetaryny w użytych stężeniach powodował zmiany teratogenne. Dawka LC50 (ang. lethal concentration), określająca stężenie powodujące śmiertelność u 50% testowanych osobników, wyniosła 20,54 mM i jest czterokrotnie wyższa od AC50 równego 5,10 mM; sprawia to, że używanie izoetaryny jest bezpieczne.
Technika otrzymywania transparentnych larw jest szybka (obserwuje się szybką i stabilną depigmentację) oraz nieskomplikowana, gdyż transparentne larwy otrzymuje się poprzez użycie tylko jednego odczynnika. Opracowany model stanowić będzie tanią i łatwą do otrzymania alternatywę dla dostępnych komercyjnie przezroczystych linii danio pręgowanego (casper zebrafish) DOI:10.1016/j.stem.2007.11.002. Ponadto, z uwagi na 4-krotną różnicę pomiędzy wartościami AC50 (5,10 mM) i LC50 (20,54 mM), stanowić będzie bezpieczniejszy model w porównaniu z modelem indukowanym 1-fenylo-2-tiomocznikiem (PTU).
Model transparentnej ryby danio pręgowanego posłużyć może w badaniach in vivo prowadzonych nad rozwojem narządów i funkcjonowaniem organizmu, patogenezą chorób, testowaniem leków mających na celu opracowanie nowych skutecznych terapii. Przykładem zastosowania związku może być trwałe odbarwienie oka modelu badawczego danio pręgowanego w celu przeprowadzania badań leków stosowanych w okulistyce docelowo na ww. narząd.
Claims (7)
1. Sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku danio pręgowanego, polegający na przygotowaniu medium odżywczego dla ryb zawierającego mieszaninę soli w wodzie demineralizowanej z dodatkiem substancji aktywnej, a następnie umieszczeniu w nim modelu badawczego ryby i utrzymywaniu w medium odżywczym do uzyskania pożądanego stopnia odbarwienia, korzystnie całkowitego odbarwienia, znamienny tym, że jako substancję aktywną w medium stosuje się izoetarynę w postaci soli kwasu mesylowego, w ilości od 1,7106 g do 5,0313 g na 1 L wodnego roztworu medium hodowlanego (E3), odpowiadający stężeniu izoetaryny w zakresie od 5,1 mM do 15 mM.
2. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że jako mieszaninę soli stosuje się sole: NaCI, KCI, (CaCI2 2H2O), (MgCI2 6H2O) lub MgSO4.
3. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że w roztworze z dodatkiem izoetaryny umieszcza się ryby Danio rerio natychmiast po zapłodnieniu na okres od 96 do 120 godzin po zapłodnieniu, korzystnie 96 godzin po zapłodnieniu.
4. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura medium odżywczego, w którym umieszczone są ryby wynosi 20-29°C.
5. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że medium odżywcze z mieszaniną soli posiada pH na poziomie: 6,9-7,5.
6. Sposób wg zastrz. 4, znamienny tym, że pH 6,9-7,5 uzyskuje się za pomocą wodnego roztworu wodorotlenku, korzystnie NaOH.
7. Zastosowanie izoetaryny do depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku danio pręgowanego wykorzystywanej do celów monitorowania rozwoju fizjologicznego/biologicznego oraz do celów diagnostycznych.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL435984A PL241022B1 (pl) | 2020-11-16 | 2020-11-16 | Sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio z użyciem izoetaryny oraz zastosowanie izoetaryny do depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL435984A PL241022B1 (pl) | 2020-11-16 | 2020-11-16 | Sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio z użyciem izoetaryny oraz zastosowanie izoetaryny do depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL435984A1 PL435984A1 (pl) | 2021-11-22 |
| PL241022B1 true PL241022B1 (pl) | 2022-07-18 |
Family
ID=78719755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL435984A PL241022B1 (pl) | 2020-11-16 | 2020-11-16 | Sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio z użyciem izoetaryny oraz zastosowanie izoetaryny do depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL241022B1 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL449745A1 (pl) * | 2024-09-09 | 2026-03-16 | Uniwersytet Medyczny W Lublinie | Sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio z użyciem cefazoliny i jej kompleksów z cyklodekstrynami oraz nowe zastosowanie cefazoliny i jej kompleksów z cyklodekstrynami |
-
2020
- 2020-11-16 PL PL435984A patent/PL241022B1/pl unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL449745A1 (pl) * | 2024-09-09 | 2026-03-16 | Uniwersytet Medyczny W Lublinie | Sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio z użyciem cefazoliny i jej kompleksów z cyklodekstrynami oraz nowe zastosowanie cefazoliny i jej kompleksów z cyklodekstrynami |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL435984A1 (pl) | 2021-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nishimura et al. | Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing | |
| Fraysse et al. | Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals | |
| Chen et al. | BDE-47 disrupts axonal growth and motor behavior in developing zebrafish | |
| De Esch et al. | Zebrafish as potential model for developmental neurotoxicity testing: a mini review | |
| van den Brandhof et al. | Fish embryo toxicity of carbamazepine, diclofenac and metoprolol | |
| Liu et al. | Response mechanisms to joint exposure of triclosan and its chlorinated derivatives on zebrafish (Danio rerio) behavior | |
| Huang et al. | Parental exposure to bisphenol A affects pharyngeal cartilage development and causes global transcriptomic changes in zebrafish (Danio rerio) offspring | |
| Nikam et al. | Zebrafish: An emerging whole-organism screening tool in safety pharmacology | |
| Pastva et al. | Morphological effects of Bisphenol-A on the early life stages of medaka (Oryzias latipes) | |
| Zhao et al. | Acute toxic responses of embryo-larval zebrafish to zinc pyrithione (ZPT) reveal embryological and developmental toxicity | |
| Mitovic et al. | Cadmium significantly changes major morphometrical points and cardiovascular functional parameters during early development of zebrafish | |
| Liang et al. | Serotonin and dopamine regulate the aggressiveness of swimming crabs (Portunus trituberculatus) in different ways | |
| Child | Some considerations concerning the nature and origin of physiological gradients | |
| Newman et al. | Embryonic oxidative stress results in reproductive impairment for adult zebrafish | |
| Chahardehi et al. | Zebrafish, a biological model for pharmaceutical research for the management of anxiety | |
| Wei et al. | Effects of water fluoridation on early embryonic development of zebrafish | |
| PL241022B1 (pl) | Sposób depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio z użyciem izoetaryny oraz zastosowanie izoetaryny do depigmentacji modelu badawczego ryby z gatunku Danio rerio | |
| Pospisilova et al. | Embryonic and larval development of the Northern pike: An emerging fish model system for evo‐devo research | |
| Leibundgut et al. | A contribution to toxicity of fluorescent tracers | |
| Carlsson et al. | Comparison of embryo toxicity using two classes of aquatic vertebrates | |
| Kulkarni | Comparative studies on blood electrolytes of the fresh water fish, Notopterus notopterus from three aquatic bodies | |
| Babic et al. | Comparative toxicity evaluation of targeted anticancer therapeutics in embryonic zebrafish and sea urchin models | |
| JP5024985B2 (ja) | 魚類の標識剤と標識方法 | |
| Abdelsalam et al. | Evaluation of establishment and maintenance of primary cell cultures from several strains of common carp (Cyprinus carpio L.) | |
| Mudgal et al. | Zebrafish: A versatile learning tool |