PL241218B1 - Związek do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób neurodegeneracyjnych zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego - Google Patents
Związek do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób neurodegeneracyjnych zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego Download PDFInfo
- Publication number
- PL241218B1 PL241218B1 PL431613A PL43161319A PL241218B1 PL 241218 B1 PL241218 B1 PL 241218B1 PL 431613 A PL431613 A PL 431613A PL 43161319 A PL43161319 A PL 43161319A PL 241218 B1 PL241218 B1 PL 241218B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- compound
- perk
- cells
- treatment
- heptanedione
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 56
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 title claims description 6
- 108010089429 PERK kinase Proteins 0.000 title abstract description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 10
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 title abstract description 6
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 title abstract description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title abstract description 5
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 title description 18
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 title description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- AWFTWXYWQXPBMR-UHFFFAOYSA-N 3-acetyl-6-methylheptane-2,4-dione Chemical compound CC(C)CC(=O)C(C(C)=O)C(C)=O AWFTWXYWQXPBMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 102000008014 Eukaryotic Initiation Factor-2 Human genes 0.000 description 21
- 108010089791 Eukaryotic Initiation Factor-2 Proteins 0.000 description 21
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 14
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 14
- 229940123090 PERK inhibitor Drugs 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108091008038 CHOP Proteins 0.000 description 8
- 102100029145 DNA damage-inducible transcript 3 protein Human genes 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 8
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 230000004906 unfolded protein response Effects 0.000 description 8
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 7
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 6
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- SIXVRXARNAVBTC-UHFFFAOYSA-N gsk2606414 Chemical compound C12=C(N)N=CN=C2N(C)C=C1C(C=C1CC2)=CC=C1N2C(=O)CC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 SIXVRXARNAVBTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002877 time resolved fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 3-acetyl-6-methyl-2,4-heptanedione compound Chemical class 0.000 description 3
- IGMOYJSFRIASIE-UHFFFAOYSA-N 6-Methylheptan-2,4-dione Chemical compound CC(C)CC(=O)CC(C)=O IGMOYJSFRIASIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000905743 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Proteins 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJGMCDHQPXTGAV-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chlorophenoxy)-n-[4-[[2-(4-chlorophenoxy)acetyl]amino]cyclohexyl]acetamide Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1OCC(=O)NC1CCC(NC(=O)COC=2C=CC(Cl)=CC=2)CC1 HJGMCDHQPXTGAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100072149 Drosophila melanogaster eIF2alpha gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- PRWSIEBRGXYXAJ-UHFFFAOYSA-N GSK2656157 Chemical compound CC1=CC=CC(CC(=O)N2C3=C(C(=C(C=4C5=C(N)N=CN=C5N(C)C=4)C=C3)F)CC2)=N1 PRWSIEBRGXYXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229940122907 Phosphatase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KQHKSGRIBYJYFX-UHFFFAOYSA-J Ponceau S Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].Oc1c(cc2cc(ccc2c1N=Nc1ccc(cc1S([O-])(=O)=O)N=Nc1ccc(cc1)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O KQHKSGRIBYJYFX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004617 QSAR study Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150057615 Syn gene Proteins 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N caprylic alcohol Natural products CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CCGKOQOJPYTBIH-UHFFFAOYSA-N ethenone Chemical compound C=C=O CCGKOQOJPYTBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N europium cryptate Chemical compound [Eu+3].N=1C2=CC=CC=1CN(CC=1N=C(C=CC=1)C=1N=C(C3)C=CC=1)CC(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1C(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1CN3CC1=CC=CC2=N1 GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- LCOIAYJMPKXARU-VAWYXSNFSA-N salubrinal Chemical compound C=1C=CC2=CC=CN=C2C=1NC(=S)NC(C(Cl)(Cl)Cl)NC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 LCOIAYJMPKXARU-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000003041 virtual screening Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISULZYQDGYXDFW-UHFFFAOYSA-N 3-methylbutanoyl chloride Chemical compound CC(C)CC(Cl)=O ISULZYQDGYXDFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004482 ATP Translocases Mitochondrial ADP Human genes 0.000 description 1
- 108010017236 ATP Translocases Mitochondrial ADP Proteins 0.000 description 1
- 102100034283 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 102000009122 CCAAT-Enhancer-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048401 CCAAT-Enhancer-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023580 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Human genes 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001609 comparable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 125000005594 diketone group Chemical group 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N n-Octanol Natural products CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 101150029755 park gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012910 preclinical development Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229940040939 repurposed drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000012258 stirred mixture Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- JKUYRAMKJLMYLO-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 3-oxobutanoate Chemical compound CC(=O)CC(=O)OC(C)(C)C JKUYRAMKJLMYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/12—Ketones
- A61K31/121—Ketones acyclic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze ogólnym I, do zastosowania jako lek, związek do zastosowania jako inhibitor kinazy PERK do zapobiegania i leczenia chorób zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego. Korzystnie wspomniane choroby są wybrane z grupy obejmującej jaskrę, chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest związek do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób neurodegeneracyjnych zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego.
Choroby neurodegeneracyjne znane w medycynie od dawna wciąż znajdują się w centrum zainteresowania wielu badaczy, przyczyna - nie dysponujemy zadowalającymi metodami leczenia. Przykładem jest choroba Alzheimera, Parkinsona, czy jaskra, która ze względu na swój bezobjawowy w początkowej fazie, postępujący i nieodwracalny charakter określana jest podstępnym „złodziejem wzroku”.
Jak wynika z raportu Alzheimer’s Association w 2015 roku w samych Stanach Zjednoczonych dotkniętych chorobą Alzheimera było ponad 2 min ludzi. Podobnie jak w przypadku choroby Alzheimera, jaskra rozwija się w wieku podeszłym i jest obecnie główną przyczyną utraty wzroku w starzejącym się społeczeństwie. Szacuje się, iż na całym świecie na jaskrę choruje około 70 mln osób, jak wynika z raportu badań przeprowadzonych w latach 1990-2020. Jaskra została zakwalifikowana do grupy chorób o podłożu neurodegeneracyjnym, w krajach wysokorozwiniętych jest ona jedną z głównych przyczyn nieodwracalnej utraty wzroku. Mimo stale postępującego rozwoju medycyny, cały czas nie do końca znamy dokładne przyczyny jej powstawania. Nie dysponujemy również w pełni skutecznymi metodami leczenia tej choroby. Na podstawie wykonanych badań wnioskuje się, iż jednym z patomechanizmów zaangażowanych w neurodegenerację w procesie starzenia organizmu może być szlak UPR, dlatego specyficzne inhibitory kinazy PERK mogą posiadać potencjalne zastosowania jak substancja ak tywna w procesie formulacji nowych leków (Alzheimer’s Association. 2015 Alzheimer’s Disease Facts and Figures. Alzheimer’s & Dementia 2015; 11 (3)332+; Flaxman SR. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis The Lancet 2017; (17) 30393-5).
Nagromadzenie nieprawidłowo syntetyzowanych białek wewnątrz retikulum endoplazmatycznego (ER) aktywuje mechanizm odpowiedzi komórki na błędnie sfałdowane białka (ang. unfolded protein response - UPR), na który składa się kaskada zdarzeń prowadzących do wyciszenia translacji, transaktywacji promotorów genów opiekuńczych ER i aktywacji układów degradujących białka. Skutkuje to zahamowaniem translacji większości białek w wyniku fosforylacji eukariotycznego czynnika inicjacji translacji 2 (Eukaryotic Initiation Factor 2, eIF2a) przez aktywną kinazę PERK (ang. protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase - PERK). Obok globalnego ograniczenia syntezy białek poprzez fosforylację eIF2a, drugim efektem odpowiedzi zależnej od PERK jest aktywacja czynnika transkrypcyjnego ATF4.
Przewlekły stres ER w wyniku aktywacji ATF4 przyczynia się do preferencyjnej translacji czynników uczestniczących w apoptotycznej śmierci komórek, w tym białka CHOP (ang. CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein, CHOP).
Potrzeba znalezienia nowych, skutecznych substancji o potencjalnym zastosowaniu w chorobach neurodegeneracyjnych skierowała tory poszukiwań na testowanie związków należących do grupy niskocząsteczkowych specyficznych inhibitorów transmembranowej kinazy retikulum endoplazmatycznego PERK.
Pierwszym testowanym niskocząsteczkowym inhibitorem w modelach chorób neurodegeneracyjnych był zsyntetyzowany przez firmę GlaxoSmithKline GSK2606414 charakteryzujący się wysoką selektywnością w stosunku do kinazy PERK. Badania przeprowadzone w Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine wykazały, że w mysim modelu choroby prionowej zahamowanie syntezy większości białek w komórkach było wywołane nadmierną aktywacją kinazy PERK w warunkach wewnątrzkomórkowego stresu ER (Jeffrey M. Axten, Stuart P. Romeril, Arthur Shu, Jeffrey Ralph, Jesύs R. Medina, Yanhong Feng, William Hoi Hong Li, Seth W. Grant, Dirk A. Heerding, Elisabeth Minthorn, Thomas Mencken, Nathan Gaul, Aaron Goetz, Thomas Stanley, Annie M. Hassell, Robert T. Gampe, Charity Atkins, and Rakesh Kumar Discovery of GSK2656157: An Optimized PERK Inhibitor Selected for Preclinical Development ACS Med. Chem. Lett. 2013, 4, 964-968). U myszy, którym podawano inhibitor GSK2606414 wykazano przejściowe przywrócenie syntezy białek w komórkach. Ponadto poziom fosforylowanych form kluczowych białek szlaku UPR, takich jak PERK oraz eIF2α był zdecydowanie niższy w porównaniu z myszami, które nie otrzymywały inhibitora. Jednak GSK2606414 został wykluczony z dalszych badań pod kątem przyszłej strategii terapeutycznej, gdyż analizy wykonane również w Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine wykazały, iż GSK2606414 wywołuje cytotoksyczny efekt w stosunku do komórek trzustki u myszy. U zwierząt, które otrzymywały GSK2606414 stwierdzono znaczną utratę masy ciała oraz hiperglikemię (Heather P. Harding, Huiqing Zeng, Yuhong Zhang, Rivka Jungries, Peter Chung, Heidi Plesken, David D. Sabatini, and David Ron. Diabetes Mellitus and Exocrine Pancreatic Dysfunction in Perk/Mice Reveals a Role for Translational Control in Secretory Cell Survival. Molecular Cell 2001,7, 1153-1163).
PL 241 218 B1
Inhibitor PERK drugiej generacji, zsyntetyzowany przez firmę GlaxoSmithKline, stanowi GSK2656157, charakteryzuje się lepszą farmakokinetyką oraz selektywnością w stosunku do kinazy PERK w porównaniu z GSK2606414. Eksperymenty badawcze przeprowadzone przez Charity Atkins i współpracowników wykazały, iż GSK2656157 wywołuje skuteczną inhibicję fosforylacji kinazy PERK oraz białka eIF2a, jednak, podobnie jak GSK2606414, nie został włączony do badań klinicznych ze względu na jego nieselektywne działanie, również w stosunku do komórek trzustki (Charity Atkins, Qi Liu, Elisabeth Minthorn, Shu-Yun Zhang, David J. Figueroa, Katherine Moss, Thomas B. Stanley, Brent Sanders, Aaron Goetz, Nathan Gaul, Anthony E. Choudhry, Hasan Alsaid, Beat M. Jucker, Jeffrey M. Axten, and Rakesh Kumar. Characterization of a Novel PERK Kinase Inhibitor with Antitumor and Antiangiogenic Activity. Cancer Res. 2013 73(6): 1993-2012).
Kolejnym związkiem testowanym w chorobach neurodegeneracyjnych, jako inhibitor szlaku UPR zależnego od kinazy PERK, był Salubrinal, który został wyselekcjonowany przez Michaela Boyce i współpracowników do dalszych badań na podstawie wirtualnego screeningu bazy ok. 19 000 związków hamujących apoptozę wywołaną stresem ER w komórkach PC 12 (Michael Boyce, Kevin F. Bryant, Celine Jousse, Kai Long, Heather P. Harding, Donalyn Scheuner, Randal J. Kaufman, Dawei Ma, Donald M. Coen, David Ron, Junying Yuan. A Selective Inhibitor of eIF2a Dephosphorylation Protects Cells from ER Stress. Science 2005. 307, 935).
Eksperymenty badawcze wykonane przez Julie A. Moreno i współpracowników wykazały, iż w mysim modelu choroby prionowej Salubrinal nie przyniósł spodziewanego efektu, ponieważ wywołał on wzrost fosforylacji eIF2a. Zwierzęta otrzymujące Salubrinal umierały szybciej w porównaniu do zwierząt nie otrzymujących Salubrinalu (Julie A. Moreno, Helois Radford, Diego Peretti, Joern R. Steinert, Nicholas Verity, Maria Guerra Martin, Mark Halliday, Jason Morgan, David Dinsdale, Catherine A. Ortori, David A. Barrett, Pavel Tsaytler, Anne Bertolotti, Anne E. Willis, Martin Bushell, and Giovanna R. Mallucci. Sustained translational repression by eIF2a-P mediates prion neurodegeneration Nature 2012. 485(7399): 507-511; Julie A. Moreno, Mark Halliday, Colin Molloy, Helois Radford, Nicholas Verity, Jeffrey M. Axten, Catharine A. Ortori, Anne E. Willis, Peter M. Fischer, David A. Barrett, Giovanna R. Mallucci. Oral Treatment Targeting the Unfolded Protein Response Prevents Neurodegeneration and Clinical Disease in Prion-Infected Mice. Science Translational Medicine 2013, 5 (206): 1-10).
Kolejnym związkiem wyselekcjonowanym na University of California, San Francisco przez Carmelę Sidrauski i współpracowników wpływającym na przebieg szlaku UPR w modelu chorób nowotworowych był ISRIB charakteryzujący się dobrą przepuszczalnością bariery krew-mózg (Carmela Sidrauski, Diego Acosta-Alvear, Arkady Khoutorsky, Punitha Vedantham, Brian R. Hearn, Han Li, Karine Gamache, Ciara M. Gallagher, Kenny K.-H. Ang, Chris Wilson, Voytek Okreglak, Avi Ashkenazi, Byron Hann, Karim Nader, Michelle R. Arkin, Adam R. Renslo, Nahum Sonenberg, Peter Walter. Pharmacological brake-release of mRNA translation enhances cognitive memory. Cell biology | Neuroscience 2013;2:1-22).
Prace opublikowane przez zespół Marka Halliday oraz zespół Heather L. Smith donoszą, iż ISRIB pomimo swego efektu neuroprotekcyjnego oraz niskiej cytotoksyczności charakteryzował się słabą rozpuszczalnością, dlatego nie może on stanowić inhibitora szlaku UPR skutecznego w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych (Mark Halliday, Helois Radford, Karlijn A. M. Zents, Collin Molloy, Julie A. Moreno, Nicholas C. Verity, Ewan Smith, Catharine A. Ortori, David A. Barrett, Martin Bushell and Giovanna R. Mallucci. Repurposed drugs targeting eIF2a-P-mediated translational repression prevent neurodegeneration in mice BRAIN 2017: 140; 1768-1783, Heather L. Smith and Giovanna R. Mallucci. The unfolded protein response: mechanisms and therapy of neurodegeneration. BRAIN 2016: 139; 2113-2121).
Powyższe przykłady wskazują, że dotychczas zidentyfikowane związki o potwierdzonych właściwościach inhibitora PERK nie mogą być stosowane w lecznictwie ze względu na cytotoksyczność lub niską rozpuszczalność. Istnieje zatem potrzeba znalezienia skutecznego inhibitora PERK o niskiej i/lub znikomej cytotoksyczności, który mógłby znaleźć zastosowanie do zapobiegania i/lub leczenia chorób neurodegeneracyjnych opartych na mechanizmie inhibicji PERK, w szczególności jaskry.
Znane związki niskocząsteczkowe zdeponowane są w szeregu baz i bibliotek, takich j ak baza LDDN (ang. Laboratory for Drug Discovery in Neurodegeneration) czy amerykańska biblioteka związków niskocząsteczkowych NCI (ang. National Cancer Institute). Jednym ze wspomnianych znanych związków niskocząsteczkowych jest zdeponowany w bibliotece NCI związek nr 42233 o nazwie systematycznej: 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion.
Ze stanu techniki znane jest zgłoszenie US2011230564 A1 ujawniające, że 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion posiada właściwości inhibitora translokazy 4 adeninowej nukleotydu 4 (ang. adenine nucleotide translocase 4 - ANT4) i może być stosowany w leczeniu osobnika cierpiącego lub podatnego
PL241 218 Β1 na zaburzenie lub chorobę związaną z proliferacją komórek, takich jak nowotwory. Ponadto dokument US2011230564 A1 ujawnia, że 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion może być przydatny we wspomaganiu metod antykoncepcji poprzez zmniejszanie lub eliminowanie męskich spermatocytów mejotycznych (bez uszkadzania innych typów komórek) u osobnika.
Celem wynalazku jest zapewnienie skutecznego związku, który można by stosować w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób neurodegeneracyjnych opartych na mechanizmie inhibicji PERK, w szczególności jaskry, jak również zastosowanie takiego związku do wytwarzania wyrobu medycznego oraz leku do zapobiegania i/lub leczenia tego rodzaju chorób.
Istotą wynalazku jest związek o wzorze 1:
Wzór 1
do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego wybranych z grupy obejmującej jaskrę, chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona.
Korzystnie związek o wzorze 1 ma postać soli.
Przy czym, w rozumieniu wynalazku przez inhibitor kinazy PERK rozumie się związek hamujący działanie transmembranowej kinazy retikulum endoplazmatycznego PERK (z ang. protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase).
Niniejszy wynalazek dostarcza szeregu następujących korzyści:
• Zastrzegany związek stanowi selektywny, skuteczny inhibitor PARK;
• Zastrzegany związek nie jest cytotoksyczny;
• Synteza związku nie jest skomplikowana oraz nie wymaga użycia drogiej aparatury, co stanowi ogromną zaletę dla otrzymywania związku na skalę przemysłową.
Syntezę oraz wyniki badań własności związku (I) przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia syntezę 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu, gdzie (A) przedstawia powstanie 6-metylo-heptano-2,4-dionu, a (B) przedstawia przekształcenie 6-metyloheptano-2,4-dionu do 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu; fig. 2 przedstawia wyniki dokowania molekularnego dla 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu; fig. 3 ilustruje analizę poziomu fosforylacji PERK i elF2a in vitro w obecności 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu oznaczonego jako 42233; fig. 4 przedstawia analizę aktywności 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu oznaczonego jako 42233 w astrocytach szczurzych Dl TNC1; fig. 5 przedstawia analizę poziomu fosforylacji elF2a w odpowiedzi na działanie 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu oznaczonego jako 42233 w ludzkich komórkach embrionalnych nerki; fig. 6 przedstawia analizę poziomu fosforylacji elF2a w odpowiedzi na działanie 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu oznaczonego jako 42233 w fibroblastach mysich; fig. 7 przedstawia analizę poziomu fosforylacji PERK w odpowiedzi na 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion oznaczony jako 42233 w mysich komórkach neuronalnych CATH.a; fig. 8 przedstawia analizę poziomu białka CHOP oraz fosforylacji elF2a w odpowiedzi na działanie 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu oznaczonego jako 42233 w astrocytach szczurzych Dl TNC1; fig. 9 przedstawia ocenę cytotoksyczności 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu w astrocytach szczurzych Dl TNC1 poddanych inkubacji 3, 16, 24 oraz 48-godzinnej, gdzie cytotoksyczność oznaczono za pomocą testu ΧΤΤ; fig. 10 przedstawia ocenę wpływu 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu na poziom apoptozy w astrocytach szczurzych Dl TNC1 metodą cystometrii przepływowej; fig. 11 przedstawia analizę cyklu komórkowego w odpowiedzi na 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion w komórkach Dl TNC1 po 24-godzinnej inkubacji.
Wynalazek szczegółowo przedstawiono w poniższych przykładach wykonania, przy czym wszystkie opisane poniżej testy i procedury doświadczalne przeprowadzono z zastosowaniem komercyjnie dostępnych zestawów testowych, odczynników i aparatury, postępując zgodnie z zaleceniami producentów stosowanych zestawów, odczynników i aparatury, o ile nie wskazano wyraźnie inaczej. Wszelkie
PL241 218 Β1 parametry testowe mierzono z zastosowaniem standardowych, powszechnie znanych metod stosowanych w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek.
Przykład 1
Synteza 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu (związku 42233)
3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion (związek 42233) można otrzymywać znanymi sposobami.
W tym przykładzie wykonania wióry magnezowe (26,7 g), absolutny etanol (135 ml) i tetrachlorek węgla (5 ml) umieszczono w okrągłodennej kolbie o pojemności 2 litrów i delikatnie ogrzewano do czasu ustąpienia wydzielania się wodoru. Suchy benzen (200 ml) dodano do mieszanej mieszaniny i kontynuowano ogrzewanie, aż wydzielanie gazu ustało całkowicie (około 4 godzin). Eter dietylowy (500 ml) dodano do ochłodzonej mieszaniny, a następnie dodano acetooctan tert-butylu (161 g), z taką szybkością, aby utrzymać łagodny refluks. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia przez dodatkowe 30 minut. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i potraktowano chlorkiem izowalerylu (120,5 g) przez jego powolne dodawanie.
Po zakończeniu reakcji mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę i pozostawiono na noc. Roztwór ochłodzono w łaźni lodowej i potraktowano 5 M kwasem siarkowym (200 ml) i ilością wody wystarczającą do rozpuszczenia osadu. Warstwę organiczną oddzielono, a fazę wodną dalej ekstrahowano eterem (3 χ 50 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto nasyconym roztworem chlorku sodu (3 χ 200 ml) i wysuszono nad siarczanem sodu. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostały olej potraktowano kwasem p-toluenosulfonowym (1,2 g) i ogrzewano w 150°C aż do ustania wydzielania się dwutlenku węgla (około 2 godziny).
Produkt oczyszczono przez destylację i zebrano w postaci jasnożółtego oleju (78,9 g; wydajność reakcji wynosi 56%), temperatura wrzenia 178-188°C; IR (bez dodatków): v 1615 cm·1 (s, sh, C = O).
Otrzymany w ten sposób 6-metyloheptano-2,4-dion potraktowano następnie etenonem, otrzymując 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion.
Bezwodny węglan potasu (95 g) dodano do mieszaniny 6-metylo-2,4-heptanodionu 25c (30,83 g) i etenonu (47,44 g) w acetonie czystości klasy odczynnikowej (140 ml). Mieszaninę energicznie mieszano pod chłodnicą zwrotną w 80°C przez noc. Ochłodzoną mieszaninę przesączono i stały węglan potasu przemyto obficie acetonem. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostały olej oczyszczono przez destylację, otrzymując pożądany diketon w postaci jasnożółtego oleju (25,59 g; 76%), temperatura wrzenia 150-152°C.
Syntezę związku 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu według przykładu wykonania zilustrowano na fig. 1, a podstawowe dane dotyczące tego związku przedstawiono poniżej w tabeli 1.
Tabela 1
Podstawowe dane dotyczące 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu
| Nazwa produktu | 3-acetylo-6-metyloheptano-2,4-dion |
| Formuła molekularna | CioHieOj |
| Waga molekularna | 184,2322 |
| InChI | InChI = 1 / C10H16O3 / cl-6 (2) 5-9 (13) 10 (7 (3) 11) 8 (4) 12 / h6,10H, 5H2,1-4H3 |
| Numer rejestru CAS | 6303-07-7 |
| Struktura molekularna | o o ch3 |
PL241 218 Β1
Przykład 2
Wstępne ustalenie mechanizmu działania za pomocą dokowania molekularnego
W celu wstępnego potwierdzenia mechanizmu działania 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu (związku 42233) o wzorze 1:
Wzór 1 przeprowadzono wirtualny screening, polegający na komputerowym dokowaniu.
Strategia poszukiwania efektywnego inhibitora PERK zgodna była z metodologią komputerowo wspomaganego projektowania leków (computer-aided drug design, CADD). Badania obejmowały wirtualny screening (virtual screening, YS), który jest komputerową techniką automatycznego przeszukiwania i oceny potencjalnej aktywności biologicznej (rankingowania) dużych baz danych związków chemicznych przy użyciu narzędzi chemoinformatycznych, bioinformatycznych i modelowania molekularnego.
W tym przykładzie wykonania przeprowadzono przeszukiwanie i analizę potencjalnych niskocząsteczkowych związków o nieznanych właściwościach opartą o znaną i/lub przewidzianą strukturę receptora (structure-based virtual screening, SBVS), w toku dokowania komputerowego bazy >200 000 związków zawartych w bibliotece niskocząsteczkowych związków National Cancer Insititute (NCI) oraz Laboratory for Drug Discovery in Neurodegeneration (LDDN). W tym celu posłużono się dostępną strukturą kinazy PERK (Homo sapiens, 4YJZS) z bazy danych Protein Data Bank (RCSB PDB): http://www.rcsb.org/structure/4YZS.
Następnie, projektowanie inhibitorów przeprowadzono w oparciu o struktury znanych ligandów (ligand based design) i analizę właściwości przestrzennych pól - 3D QSAR (3D quantitative structureactivity relationship). W tym, celu wykorzystano oprogramowanie Open3d qsar. Pozwoliło to na opracowanie 80 000 niskocząsteczkowych związkowo potencjalnych właściwościach inhibicyjnych w stosunku do kinazy PERK.
Następnie analizowano in silico struktury pochodnych 80 000 pochodnych inhibitora kinazy PERK. Celem tej części etapu było wyselekcjonowanie związku o wysokich właściwościach inhibicyjnych względem kinazy PERK charakteryzującym się najniższym współczynnikiem Docking Score. Ponadto, oceniano właściwości fizykochemiczne potencjalnej substancji leczniczej, które decydują o szybkości rozpuszczania, jak i szybkości przenikania przez błony biologiczne, a w efekcie o prawdopodobieństwie osiągnięcia w miejscu działania stężenia uznawanego za terapeutyczne.
Modyfikacje przeprowadzono z zastosowaniem teorii Bioizosteryzmu. Bioizostery to podstawniki lub grupy wykazujące podobieństwo właściwości fizycznych i na ogół biologicznych. Bioizosteryzm można wykorzystać do modyfikacji struktury wiodącej, co okazało się skutecznym sposobem zmniejszania toksyczności czy zmian aktywności struktury wiodącej. Teorię opracował w 1925 roku Grimm, który sformułował prawo zastąpienia wodorku. Wszystkie modyfikacje struktury o przeprowadzone były zgodnie z regułami zaproponowanymi przez Lipińskiego i wsp., które posłużyły do stworzenia tak zwanej reguły 5. Reguła ta głosi, że potencjalny związek leczniczy powinien charakteryzować się masą molową <500 MW, współczynnikiem podziału pomiędzy dwie niemieszające się wzajemnie fazy (n-oktanol/woda) logP <5, liczbą donorów wiązania wodorowego (liczbą heteroatomów połączonych z co najmniej jednym atomem H) HBD <5 oraz liczbą akceptorów wiązania wodorowego (sumaryczną liczbą heteroatomów) HBA <10.
Uzyskane wartości docking score (fig. 2) dla badanego związku potwierdzają, że posiada on dobre parametry wiązania ligand-receptor.
Przedmiotem dalszych analiz było potwierdzenie aktywności badanego związku w teście kinazowym in vitro z zastosowaniem izotopu P32 (fig. 3).
PL 241 218 B1
W toku kolejnych badań przesiewowych, opartych na (a) teście radiometrycznym teście kinazowym oraz (b) teście TRF-FRET został wyłoniony związek o najsilniejszych właściwościach inhibicyjnych aktywności kinazy PERK oraz jej głównego substratu eIF2a, który został poddany dalszym analizom. (a) Radiometryczna reakcja kinazowa (Radiometrie Kinase Reaction)
Aby scharakteryzować kinetykę enzymu i ustalić optymalne warunki testu, został zastosowany test radiometryczny. W wyniku optymalizacji reakcji ustanowiono następujący skład mieszaniny reakcyjnej: 20 mM HEPES (pH 7,2), 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl i 0,01% Tween 20 i 1 μM ATP/1 μCi [y-33P] ATP, 1 μM eIF2a z 8 nM PERK.
Reakcję prowadzono przez 90 minut w temperaturze pokojowej i zatrzymywana za pomocą 75 mM kwasu fosforowego. Mieszaniny reakcyjne przenoszono na płytki do filtracji PH Multiscreen (Merck), po czym przeprowadzano intensywne płukanie. Płytki filtracyjne suszono, a formulacja była oznaczona ilościowo za pomocą licznika scyntylacyjnego. Tło (kontrola negatywna) dla formulacji produktu było badane w takiej samej mieszaninie reakcyjnej bez obecności białka PERK. Optymalne stężenie enzymu określano przy wartości, dla której wykres postępu reakcji tworzenia fosfo-eIF2a był liniowy przez co najmniej 60 minut.
(b) TR-FRET oraz HTS (Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer Base Assay and HTS)
W celu screeningu biblioteki związków małocząsteczkowych wykorzystano test TR-FRET (Z > 0,7% współczynnik zmienności [CV] kontroli negatywnej i pozytywnej << 10% i sygnał / poziom tła [S/B] wynoszący 2,45) wykonywany na płytkach 384-dołkowych. Test ten umożliwia pomiar bezpośredniej fosforylacji eIF2a - specyficznego substratu dla kinazy PERK z użyciem fosfo-specyficznego przeciwciała skoniugowanego z fluorescencyjnym donorem kryptatu Europem (Eu3+). Test kinazy TR-FRET przeprowadzano w buforze zawierającym 20 mM HEPES (pH 7,2), 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl i 0,01% Tween 20. Wszystkie odczynniki reakcji kinazowej, takie jak PERK, eIF2a i ATP, przygotowano w tym samym buforze. Enzym PERK (w końcowym stężeniu określonym przy pomocy radiometrycznego testu kinazowego) preinkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej z badanymi potencjalnymi inhibitorami (stężenie końcowe 10 μM) w objętości 2 μl. Po wstępnej inkubacji dodawano 1 μl mieszaniny eIF2a/ATP w celu zainicjowania reakcji kinazy (stężenie końcowe 1 μM substratu eIF2a oraz 1 μM ATP) i prowadzono inkubację przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Analizę przeprowadzano z wykorzystaniem eIF2a i ATP w stężeniu równym Km, co umożliwia identyfikację inhibitorów zarówno kompetycyjnych, jak i niekompetycyjnych. Reakcja enzymatyczna była następnie zatrzymywana za pomocą przeciwciał p-eIF2a (S51) -Eu3+ oraz Flag-d2, które rozpuszczone były w homogenicznym buforze HTRF Transcreener buffer (Cisbio) zawierającym 60 mM EDTA i inkubowane 60 min (końcowa objętość 6 μl). Zastosowana metoda wykrywania opiera się na fosfospecyficznych przeciwciałach skierowanych przeciwko eIF2a wyznakowanych fluorescencyjnym dawcą kryptatu europu (Eu3+) o przedłużonej trwałości i przeciwciałach antyflagowych znakowanych HTRF-akceptorowym fluoroforem d2. Do pomiaru sygnału FRET stosowano czytnik płytek Synergy HT (BioTek).
Analiza danych: Wartość Km dla ATP była obliczona na podstawie równania Michaelisa-Mentena. Wartość Km dla eIF2a była analizowana za pomocą równania Hill. Dane opracowano za pomocą oprogramowania SigmaPlot (Systat Software, San Jose, CA) lub GraphPad Prism (oprogramowanie GraphPad, La Jolla, CA).
Przykład 3
Analiza poziomu fosforylacji PERK oraz eIF2a w komórkach ssaczych w odpowiedzi na obecność 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu
Do oceny aktywności biologicznej 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu (związku 42233) w komórkach wyselekcjonowano 5 linii komórkowych dobranych w taki sposób, by możliwie najlepiej reprezentowały zarówno tkanki uwikłane w procesy neurodegeneracyjne oraz działanie szlaku PERK/eIF2a:
• SH-SY5Y linia morfologicznie uznawana za neuronalną, używana powszechnie w badaniach nad Chorobą Alzheimera oraz Parkinsona;
• CATH.a wyprowadzone z mózgu, komórki neuronalne mysie;
• DI TNC1 wyprowadzone mózgu szczurzego astrocyty;
• NHA - astrocyty ludzkie;
• 293T - ludzkie komórki embrionalne nerek;
• 3T3T - fibroblasty mysie.
PL 241 218 B1
Początkowo na badanych liniach komórkowych 3T3T, SHY5Y, CATH.a oraz DI TNC1) przeprowadzono test cytotoksyczności 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu (związku 42233) stosowanego przez 2 h w następujących stężeniach: 0,4 μΜ, 0,8 μΜ, 1,6 μΜ, 3,125 μΜ, 6,25 μΜ, 12,5 μΜ, 25 μΜ oraz 50 μM. Jako grupę odniesienia wykorzystano komórki nietraktowane inhibitorem ani tapsygarginą i ich żywotność oznaczono jako 100%. Analiza statystyczna nie wykazała istotnego spadku żywotności badanych komórek nawet w najwyższych stężeniach.
Następnie przeprowadzono analizę aktywności związku 42233 w następujących stężeniach:
• 3 μΜ, 6 μΜ, 12 μΜ, 25 μΜ oraz 50 μΜ - dla linii DI TNC1 oraz CATH; ‘ • 10 μΜ oraz 50 μΜ - dla linii 293T oraz 3T3T.
Dobór kontroli do doświadczenia:
• Kontrola doświadczenia - to komórki nietraktowane inhibitorem ani tapsygarginą;
• Kontrolny znany inhibitor o znanym działaniu - to tapsygargina w stężeniu 500 nM;
• Białko kontrolne - to β-aktyna.
Badanie inhibicji kinazy PERK z zastosowaniem linii komórkowych in vitro (eIF2 α) przebiegało następująco. Komórki zostały poddane 1-godzinnej preinkubacji z testowanym inhibitorem PERK, w szeregu stężeń 3 μΜ - 50 μΜ, a następnie w celu aktywacji wewnątrzkomórkowego stresu Retikulum Endoplazmatycznego były traktowane tapsygarginą w stężeniu 500 nM i inkubowane przez 2 godziny. Do przeprowadzonych doświadczeń kontrolę pozytywną stanowiły komórki traktowane wyłącznie t apsygarginą (500 nM), natomiast kontrolę negatywną komórki nie traktowane żadnym ze związków. W celu przygotowania analizowanych prób komórki zbierano, a następnie poddawano lizie przy użyciu buforu EBC (50 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,5% NP-40) suplementowanego koktajlem inhibitora proteazy i fosfatazy. Homogenat zamrażano i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu wykonania oznaczeń.
Pomiaru stężenia ogólnej ilości białka w analizowanych próbach dokonano metodą Bradforda. Aby wyznaczyć stężenie białka w badanych próbach, wykonano krzywą kalibracyjną (wzorcową) przy użyciu szeregu rozcieńczeń surowiczej albuminy bydlęcej. Analizowane próby zostały rozcieńczone buforem EBC, a następnie zmieszane w stosunku 1 : 1 z buforem denaturującym 2 χ Laemmli zawierającym 2-merkaptoetanol. Następnie próby zostały poddane denaturacji w temperaturze 95°C przez 10 minut. Próby zawierające 80 μg całkowitego białka zostały poddane rozdziałowi elektroforetycznemu w 10% żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) w aparacie do elektroforezy pionowej. Po rozdziale elektroforetycznym białka zostały przeniesione na aktywowaną w metanolu membranę PVDF. Po transferze membrana z białkami została wybarwiona 0,1% roztworem Ponceau-S w celu uwidoczniania frakcji białek. Barwnik został usunięty w wyniku trzykrotnego płukania w roztworze TBST zawierającego 0,05% Tween 20. W celu uwidocznienia wszystkich analizowanych białek membrana została przecięta na odpowiednich wysokościach. Następnie membrany blokowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 5% roztworze odtłuszczonego mleka krowiego sporządzonego w roztworze TBST zawierającego 0,05% Tween 20. W kolejnym etapie membrany inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 4°C ze specyficznymi I-rzędowymi przeciwciałami: p-eIF2a, eIF2a, β-aktyna, a następnie przez 1 godzinę z Il-rzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową. Detekcja kompleksów immunologicznych została przeprowadzona przy użyciu zestawu chemiluminescencyjnego ECL. Wyniki zostały zwizualizowane na niebieskoczułych kliszach rentgenowskich. Pomiar densytometryczny prążków został wykonany przy użyciu oprogramowania Gene Tools (Syngene, Cambridge, UK). Ilość białka normalizowano względem sygnału otrzymanego dla β-aktyny stanowiącej białko referencyjne.
W przypadku analizy na astrocytach szczurzych wykazano ponad 50% inhibicję fosforylacji eIF2a dla stężeń 25 μΜ oraz 50 μΜ (fig. 4). Podobne rezultaty uzyskano w fibroblastach mysich oraz ludzkich komórkach embrionalnych nerek (fig. 5 oraz fig. 6). W przypadku mysich komórek neuronalnych wykazano pełną inhibicję PERK dla wszystkich użytych stężeń (fig. 7). Ostatecznie, analiza densytometryczna poziomu fosforylacji eIF2 α w odpowiedzi na 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion (związek 42233) dla wybranych linii: mysich komórek neuronalnych CATH.a, astrocytów szczurzych DI TNC1 oraz astrocytów ludzkich NHA wykazała znaczący spadek poziomu fosforylacji tego białka, a tym samym skuteczność hamowania aktywności kinazy PERK dla analizowanych stężeń inhibitora od 3 μΜ do 50 μΜ, w zakresie 15-49% w stosunku do komórek kontrolnych traktowanych tylko tapsygarginą.
PL 241 218 B1
Przykład 4
Wpływ 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu (związku 42233) na poziom CHOP w komórkach nerwowych
Obok globalnego ograniczenia syntezy białek poprzez fosforylację eIF2a, drugim efektem odpowiedzi zależnej od PERK jest aktywacja czynnika transkrypcyjnego ATF4, który aktywuje szereg genów w tym pro-apoptotyczny CHOP. Inhibicja PERK może zatem nieść podwójną korzyść, dodatkowo zapobiegając degeneracji tkanki nerwowej na drodze apoptozy.
W celu oceny wpływu 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu (oznaczonego jako związek 42233) na poziom CHOP w komórkach nerwowych zaprojektowano następujące doświadczenie. Komórki zostały poddane 1-godzinnej preinkubacji z testowanym inhibitorem PERK, w szeregu stężeń 3 μM - 50 μM, a następnie w celu aktywacji wewnątrzkomórkowego stresu Retikulum Endoplazmatycznego były traktowane tapsygarginą w stężeniu 500 nM i inkubowane przez 2 godziny. Do przeprowadzonych doświadczeń kontrolę pozytywną stanowiły komórki traktowane wyłącznie tapsygarginą (500 nM), natomiast kontrolę negatywną komórki nie traktowane żadnym ze związków. W celu przygotowania analizowanych prób komórki zbierano, a następnie poddawano bzie przy użyciu buforu EBC (50 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,5% NP-40) suplementowanego koktajlem inhibitora proteazy i fosfatazy. Homogenat zamrażano i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu wykonania oznaczeń.
Pomiaru stężenia ogólnej ilości białka w analizowanych próbach dokonano metodą Bradforda. Aby wyznaczyć stężenie białka w badanych próbach, wykonano krzywą kalibracyjną (wzorcową) przy użyciu szeregu rozcieńczeń surowiczej albuminy bydlęcej. Analizowane próby zostały rozcieńczone buforem EBC, a następnie zmieszane w stosunku 1 : 1 z buforem denaturującym 2 χ Laemmli zawierającym 2-merkaptoetanol. Następnie próby zostały poddane denaturacji w temperaturze 95°C przez 10 minut. Próby zawierające 80 μg całkowitego białka zostały poddane rozdziałowi elektroforetycznemu w 10% żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) w aparacie do elektroforezy pionowej. Po rozdziale elektroforetycznym białka zostały przeniesione na aktywowaną w metanolu membranę PVDF. Po transferze membrana z białkami została wybarwiona 0,1% roztworem Ponceau-S w celu uwidoczniania frakcji białek. Barwnik został usunięty w wyniku trzykrotnego płukania w roztworze TBST zawierającego 0,05% Tween 20. W celu uwidocznienia wszystkich analizowanych białek membrana została przecięta na odpowiednich wysokościach. Następnie membrany blokowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 5% roztworze odtłuszczonego mleka krowiego sporządzonego w roztworze TBST zawierającego 0,05% Tween 20. W kolejnym etapie membrany inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 4°C ze specyficznymi I-rzędowymi przeciwciałami: p-eIF2a, eIF2a, CHOP, β-aktyna, a następnie przez 1 godzinę z Il-rzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową. Detekcja kompleksów immunologicznych została przeprowadzona przy użyciu zestawu chemiluminescencyjnego ECL. Wyniki zostały zwizualizowane na niebieskoczułych kliszach rentgenowskich. Pomiar densytometryczny prążków został wykonany przy użyciu oprogramowania Gene Tools (Syngene, Cambridge, UK). Ilość białka normalizowano względem sygnału otrzymanego dla β-aktyny stanowiącej białko referencyjne.
Wykazano, iż w astrocytach szczurzych 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion (oznaczony na fig. 8 jako związek 42233) powodował spadek poziomu CHOP o 15, 30, 45, 50 oraz 70% kolejno dla stężeń 3 μM, 6 μM, 12 μM, 25 μM, 50 μM.
Przykład 5
Ocena niepożądanego wpływu 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu na komórki ssacze
Kolejną podejmowaną kwestią było określenie, czy analizowany inhibitor jako efekt uboczny może działać w sposób niepożądany na komórkę. Aby odpowiedzieć na stawiane pytanie, przeprowadzono szereg eksperymentów pod kątem pomiaru cytotoksyczności, przebiegu cyklu komórkowego oraz możliwości indukcji programowanej śmierci komórki na drodze apoptozy.
(a) Ocena żywotności komórek pod wpływem 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu - analiza XTT
W pierwszej kolejności dokonano ponownej analizy cytotoksyczności 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu (związku 42233) za pomocą kolorymetrycznego testu XTT opartego na redukcji soli tetrazolowej do formazanu w warunkach długotrwałej ekspozycji na inhibitor po 3, 16, 24, oraz 48 godzinach przy w zakresie stężeń od 0,75 μM do skrajnie wysokiego 0,5 mM. Doświadczenie przebiegało następująco. Komórki zostały zasiane na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowych w odpowiedniej pożywce hodowlanej w stężeniu 8 χ 106 komórek. Następnie komórki traktowano inhibitorem PERK w szeregu stężeń 0,75 μM - 50 μM oraz 0,5 mM. Kontrolę pozytywną stanowiły komórki nie traktowane analizowanym inhibitorem PERK, natomiast kontrolę negatywną komórki traktowane 100% DMSO.
PL 241 218 B1
W celu oceny cytotoksyczności rozpuszczalnika dla testowanego inhibitora komórki poddano i nkubacji z 0,01% DMSO. Każda z analizowanych prób została wykonana w trzech powtórzeniach. Komórki inkubowano w czasie 3, 16, 24 oraz 48 godzin. Następnie do każdej próby dodano po 25 μl mieszaniny XTT/PMS. Komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO 2 oraz 95% wilgotności. Absorbancja została zmierzona przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika płytek Synergy HT (BioTek).
Uzyskane wyniki wykazały brak istotnego statystycznie spadku żywotności (fig. 9), a zatem należy stwierdzić, że badany związek nie jest toksyczny dla komórek linii DI TNC1.
(b) Ocena indukcji apoptozy przez 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodion
Analiza poziomu apoptozy w komórkach traktowanych inhibitorem PERK (tj. związkiem 42233) została dokonana za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu podwójnego barwienia Aneksyną V (Ann-V) oraz jodkiem propidyny (PI).
Dobór kontroli do doświadczenia:
• Kontrola doświadczenia - komórki traktowane DMSO, stanowiącego rozpuszczalnik dla 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu (tj. związku 42233);
• Staurosporyna - jako znany inhibitor kinaz białkowych oraz znany czynnik proapoptyczny.
Komórki poddano 1-godzinnej preinkubacji z inhibitorem PERK (tj. związkiem 42233) w stężeniach 6 μM oraz 50 μM, a następnie traktowano tapsygarginą, jako aktywatorem stresu Retikulum Endoplazmatycznego w stężeniu 500 nM. Następnie komórki zostały poddane 24 godzinnej inkubacji. Kontrolę pozytywną stanowiły komórki traktowane 1 μM staurosporyną, jako induktorem apoptozy, a następnie inkubowane w czasie 16 godzin, natomiast kontrolę negatywną stanowiły komórki nie traktowane żadnym ze związków i inkubowane w czasie 24 godzin. Dodatkową kontrolę stanowiły komórki poddane 24 godzin inkubacji z 0,01% DMSO, stanowiącego rozpuszczalnik dla testowanego inhibitora PERK. Następnie, komórki zostały zebrane oraz przepłukane w 1 χ DPBS, a następnie w stężeniu 1 χ 106 /mL zawieszone w 1 χ buforze Binding Buffer. 1 χ 105 komórek przeniesiono do nowych probówek typu Eppendorf, a następnie wybarwiono 5 μL Ann-V oraz 5 μL PI. Po 15 min inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej próby rozcieńczano 400 μL 1 χ buforu Binding Buffer oraz poddano analizie cytometrycznej z zastosowaniem Cytometru przepływowego FACS Canto II (Becton Dickinson).
W wyniku przeprowadzonych badań nie zaobserwowano wpływu badanego inhibitora (związku 42233) na wzrost poziomu apoptozy w komórkach linii DI TNC1 (fig. 10) zarówno dla niskiego stężenia 6 μΜ, jak i górnej granicy stosowanego w testach inhibicji stężenia 50 μΜ, które wykazują porównywalne działanie do DMSO (kontroli rozpuszczalnika). Badany związek nie działa również nekrotycznie na komórki nerwowe. Wyniki analizy zostały przedstawione na fig. 10.
(c) Ocena wpływu 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu (związku 42233) na cykl komórkowy
Na ostatnim etapie przeprowadzono analizę wpływu badanego inhibitora PERK na progresję cyklu komórkowego, która została dokonana za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu barwienia jodkiem propidyny. W tym przykładzie wykonania do przeprowadzanych analiz, jako reprezentacyjne stężenia związku 42233, wybrano niskie stężenie 6 μM, jak i górną granicę stosowaną w testach inhibicji, tj. stężenie 50 μM.
Dobór kontroli do doświadczenia:
• Kontrola doświadczenia - to komórki nietraktowane związkiem 42233 aninokodazolem;
• Nokodazol - kontrolny związek o znanym wpływie na cykl komórkowy.
Komórki na 10 cm szalkach hodowlanych traktowano inhibitorem PERK w stężeniach 6 μM oraz 50 μM, a następnie inkubowano przez 24 godziny. Kontrolę pozytywną stanowiły komórki traktowane 1 μM nokodazolem i inkubowane przez 18 godzin, natomiast kontrolę negatywną komórki nie traktowane żadnym ze związków. Komórki zostały zebrane i przepłukane dwa razy 1 χ DPBS, a następnie utrwalone w 70% etanolu. Komórki wybarwiono mieszaniną zawierającą 50 μg/mL PI, 0,1 mg/mL RNazy A oraz 0,6% buforu NP-40. Po 30 min inkubacji w 4°C próby badane poddano analizie cytometrycznej z zastosowaniem Cytometru przepływowego FACS Canto II (Becton Dickinson). Uzyskane dane eksperymentalne wykazały brak wpływu 3-acetylo-6-metylo-2,4-heptanodionu na przebieg cyklu komórkowego badanych komórek linii DI TNC1 (fig. 11).
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Związek o wzorze 1:do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego wybranych z grupy obejmującej jaskrę, chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona.
- 2. Związek do zastosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że związek o wzorze 1 ma postać soli.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431613A PL241218B1 (pl) | 2019-10-25 | 2019-10-25 | Związek do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób neurodegeneracyjnych zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego |
| EP20204016.8A EP3815682A1 (en) | 2019-10-25 | 2020-10-27 | A perk kinase inhibitor for treating diseases associated with endoplasmic reticulum stress |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431613A PL241218B1 (pl) | 2019-10-25 | 2019-10-25 | Związek do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób neurodegeneracyjnych zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL431613A1 PL431613A1 (pl) | 2021-05-04 |
| PL241218B1 true PL241218B1 (pl) | 2022-08-22 |
Family
ID=73646059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL431613A PL241218B1 (pl) | 2019-10-25 | 2019-10-25 | Związek do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób neurodegeneracyjnych zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3815682A1 (pl) |
| PL (1) | PL241218B1 (pl) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010014253A2 (en) | 2008-08-01 | 2010-02-04 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Ant4 inhibitor compounds and methods of use thereof |
-
2019
- 2019-10-25 PL PL431613A patent/PL241218B1/pl unknown
-
2020
- 2020-10-27 EP EP20204016.8A patent/EP3815682A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL431613A1 (pl) | 2021-05-04 |
| EP3815682A1 (en) | 2021-05-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Weterings et al. | A novel small molecule inhibitor of the DNA repair protein Ku70/80 | |
| Liu et al. | Kinome-wide selectivity profiling of ATP-competitive mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitors and characterization of their binding kinetics | |
| Singla et al. | Design, synthesis and biological evaluation of novel indole-benzimidazole hybrids targeting estrogen receptor alpha (ER-α) | |
| Cheung et al. | High-throughput screening identifies Ceefourin 1 and Ceefourin 2 as highly selective inhibitors of multidrug resistance protein 4 (MRP4) | |
| Sobhy et al. | 3D-QSAR pharmacophore modelling, virtual screening and docking studies for lead discovery of a novel scaffold for VEGFR 2 inhibitors: Design, synthesis and biological evaluation | |
| Hansen et al. | Kinase chemodiversity from the Arctic: The breitfussins | |
| Iwatani et al. | Discovery and characterization of novel allosteric FAK inhibitors | |
| Mroueh et al. | Synthesis, biological evaluation and modeling of hybrids from tetrahydro-1H-pyrazolo [3, 4-b] quinolines as dual cholinestrase and COX-2 inhibitors | |
| Li et al. | Novel vilazodone–tacrine hybrids as potential multitarget-directed ligands for the treatment of alzheimer’s disease accompanied with depression: design, synthesis, and biological evalUation | |
| Kavanagh et al. | The development of CNS-active LRRK2 inhibitors using property-directed optimisation | |
| Li et al. | Hit-to-lead optimization and kinase selectivity of imidazo [1, 2-a] quinoxalin-4-amine derived JNK1 inhibitors | |
| Jorda et al. | Novel arylazopyrazole inhibitors of cyclin-dependent kinases | |
| Zou et al. | Benzo [e] isoindole-1, 3-diones as potential inhibitors of glycogen synthase kinase-3 (GSK-3). Synthesis, kinase inhibitory activity, zebrafish phenotype, and modeling of binding mode | |
| Kamal et al. | Diacetoxy iodobenzene mediated regioselective synthesis and characterization of novel [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] pyrimidines: apoptosis inducer, antiproliferative activities and molecular docking studies | |
| Lin et al. | Identification and analysis of a selective DYRK1A inhibitor | |
| Walker et al. | High throughput screens yield small molecule inhibitors of Leishmania CRK3: CYC6 cyclin-dependent kinase | |
| Marae et al. | Thieno [2, 3‐c] isoquinolines: A novel chemotype of antiproliferative agents inducing cellular apoptosis while targeting the G2/M phase and Tubulin | |
| Liu et al. | Drug repurposing and structure-based discovery of new PDE4 and PDE5 inhibitors | |
| Shihab et al. | Synthesis, In Silico Prediction, and In Vitro Evaluation of Anti-tumor Activities of Novel 4'-Hydroxybiphenyl-4-carboxylic Acid Derivatives as EGFR Allosteric Site Inhibitors | |
| Kaiser et al. | Modulation of autophagy by the novel mitochondrial complex I inhibitor Authipyrin | |
| Fitzgerald et al. | Pharmacological inhibition of polo like kinase 2 (PLK2) does not cause chromosomal damage or result in the formation of micronuclei | |
| Sabatini et al. | The pyrazolobenzothiazine core as a new chemotype of p38 alpha mitogen‐activated protein kinase inhibitors | |
| Islam et al. | Exploiting spirooxindoles for dual DNA targeting/CDK2 inhibition and simultaneous mitigation of oxidative stress towards selective NSCLC therapy; synthesis, evaluation, and molecular modelling studies | |
| PL241218B1 (pl) | Związek do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób neurodegeneracyjnych zależnych od stresu retikulum endoplazmatycznego | |
| Szilágyi et al. | Discovery of isatin and 1H-indazol-3-ol derivatives as d-amino acid oxidase (DAAO) inhibitors |