PL241227B1 - Znaczniki fluorescencyjne, sposób znakowania i sposób ich usuwania - Google Patents
Znaczniki fluorescencyjne, sposób znakowania i sposób ich usuwania Download PDFInfo
- Publication number
- PL241227B1 PL241227B1 PL428084A PL42808418A PL241227B1 PL 241227 B1 PL241227 B1 PL 241227B1 PL 428084 A PL428084 A PL 428084A PL 42808418 A PL42808418 A PL 42808418A PL 241227 B1 PL241227 B1 PL 241227B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- group
- carbon atoms
- general formula
- reaction
- oligonucleotide
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 85
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 52
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 51
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 44
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 40
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 34
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 29
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 26
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 claims description 24
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 23
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 19
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 19
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 18
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 16
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 15
- 125000004417 unsaturated alkyl group Chemical group 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 12
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 9
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 9
- XSWODFNOUCZADO-UHFFFAOYSA-N 5-benzyl-1-sulfanyltetrazole Chemical compound SN1N=NN=C1CC1=CC=CC=C1 XSWODFNOUCZADO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 8
- -1 nitro, carboxyl Chemical group 0.000 claims description 8
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 7
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- KYVBNYUBXIEUFW-UHFFFAOYSA-N 1,1,3,3-tetramethylguanidine Chemical compound CN(C)C(=N)N(C)C KYVBNYUBXIEUFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 6
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- ZFFMLCVRJBZUDZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbutane Chemical group CC(C)C(C)C ZFFMLCVRJBZUDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 claims description 5
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 claims description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 4
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims description 4
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 4
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 4
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 150000003510 tertiary aliphatic amines Chemical class 0.000 claims description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Chemical class C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 3
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 125000004923 naphthylmethyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC=CC=C12)C* 0.000 claims description 3
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 2
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940083094 guanine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 claims description 2
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 claims description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 claims description 2
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 claims 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 claims 1
- CPAWWCYRFWIRPH-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid;n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound OP(O)O.CC(C)NC(C)C CPAWWCYRFWIRPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical group NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- HIDWOJOSWKLIKW-CMDGGOBGSA-N 2-[methyl-[6-[(E)-2-pyridin-2-ylethenyl]pyridin-2-yl]amino]ethanol Chemical compound CN(CCO)C1=NC(=CC=C1)\C=C\C1=NC=CC=C1 HIDWOJOSWKLIKW-CMDGGOBGSA-N 0.000 description 5
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 5
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 5
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 4
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 4
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 4
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 4
- GREVJTHYHOFFOY-MDZDMXLPSA-N 2-[methyl-[6-[(E)-2-pyridin-2-ylethenyl]pyridin-2-yl]amino]propan-1-ol Chemical compound CN(C(CO)C)C1=NC(=CC=C1)\C=C\C1=NC=CC=C1 GREVJTHYHOFFOY-MDZDMXLPSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LINDOXZENKYESA-UHFFFAOYSA-N TMG Natural products CNC(N)=NC LINDOXZENKYESA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000001327 Förster resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IRFKBRPHBYCMQU-IVZWLZJFSA-N [(2r,3s,5r)-2-(hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl] acetate Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OC(=O)C)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IRFKBRPHBYCMQU-IVZWLZJFSA-N 0.000 description 2
- BRWRDMMDQJQLQS-HBNTYKKESA-N [(2r,3s,5r)-2-(hydroxymethyl)-5-[2-(2-methylpropanoylamino)-6-oxo-3h-purin-9-yl]oxolan-3-yl] acetate Chemical compound C1=2NC(NC(=O)C(C)C)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](OC(C)=O)[C@@H](CO)O1 BRWRDMMDQJQLQS-HBNTYKKESA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical group NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032373 Coiled-coil domain-containing protein 85B Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101000868814 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 85B Proteins 0.000 description 1
- OXTYJSXVUGJSGM-HTVVRFAVSA-N N-Isobutyrylguanosine Chemical compound C1=2NC(NC(=O)C(C)C)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OXTYJSXVUGJSGM-HTVVRFAVSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- UHOVQNZJYSORNB-MZWXYZOWSA-N benzene-d6 Chemical compound [2H]C1=C([2H])C([2H])=C([2H])C([2H])=C1[2H] UHOVQNZJYSORNB-MZWXYZOWSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 150000001923 cyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- JNFFNLBKOZTBJO-MZOAUBCWSA-N dT12 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)[C@@H](O)C1 JNFFNLBKOZTBJO-MZOAUBCWSA-N 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- LVTYICIALWPMFW-UHFFFAOYSA-N diisopropanolamine Chemical compound CC(O)CNCC(C)O LVTYICIALWPMFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079865 intestinal antiinfectives imidazole derivative Drugs 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- ANPWLBTUUNFQIO-UHFFFAOYSA-N n-bis(phenylmethoxy)phosphanyl-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound C=1C=CC=CC=1COP(N(C(C)C)C(C)C)OCC1=CC=CC=C1 ANPWLBTUUNFQIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical group 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
- Y02W30/00—Technologies for solid waste management
- Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są znaczniki fluorescencyjne na bazie prekursorów o wzorach ogólnych 1, 2 lub 3 oraz sposób ich wytwarzania i zastosowanie w których A oznacza grupę o wzorze 4 lub 5. Znaczniki te charakteryzują się termowrażliwością dzięki czemu zmieniając temperaturę można je odłączyć od znakowanej biocząsteczki bez destrukcji tejże biocząsteczki.
Description
PL 241 227 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są nowe barwniki fluorescencyjne, sposób znakowania materiału biologicznego barwnikami fluorescencyjnymi wykorzystywany w analizach biologicznych, chemicznych i fizycznych oraz sposób usuwania tych barwników.
Wiele współcześnie stosowanych technik analitycznych, diagnostycznych i syntetycznych wykorzystuje zjawisko fluorescencji. Wśród najbardziej rozpowszechnionych wymienić należy FISH (Fluorescent Hybridization In Situ), RT-PCR (Real-Time PCR), FRET (Forster Resonance Energy Transfer), metodologię stosowania sond molekularnych pojedynczo i podwójnie znakowanych, fluorescencję aminokwasów, białek lub kropek kwantowych. Źródłem fluorescencji jest najczęściej barwnik, który w procesie znakowania jest łączony z inną cząsteczką np. biopolimerem, najczęściej kwasem nukleinowym, peptydem lub białkiem.
Fluorescencyjne znakowanie biocząsteczek ma na celu pozyskiwanie informacji o lokalizacji biomolekuł w komórkach lub narządach, o oddziaływaniach fizyko-chemicznych czy zmianach konformacyjnych, np. fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) służy do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA (kwas deoksyrybonukleinowy), za pomocą specyficznych sond znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi. Metody fluorescencyjne charakteryzują się małą inwazyjnością, jak również niewielkim negatywnym wpływem na zdrowie operatora i środowisko, dzięki czemu w wielu przypadkach mają przewagę nad innymi technikami znakowania, np. znakowaniem radioizotopowym.
Znane barwniki fluorescencyjne stosowane do znakowania materiału biologicznego różnią się między sobą widmem absorpcyjno-emisyjnym. W dodatku zakres każdego z widm reprezentuje jedynie wąski wycinek z zakresu światła widzialnego. Wynika z tego, że nie ma jednego barwnika o uniwersalnym zastosowaniu i szerokiej funkcjonalności. Czasami, aby uzyskać oczekiwany efekt, należy zastosować kombinację kilku barwników.
Mianem znacznika fluorescencyjnego określa się barwnik o właściwościach fluorescencyjnych, skoniugowany z jakąkolwiek cząsteczką organiczną na przykład biopolimerem takim jak kwas nukleinowy, peptyd czy białko.
Wśród metod wykorzystywanych do fluorescencyjnego znakowania oligonukleotydów najbardziej wygodne i efektywne jest przekształcenie barwnika fluorescencyjnego w postać amidofosforynu, który wykorzystywany jest do znakowania oligonukleotydów poprzez przyłączenie do grupy hydroksylowej, aminowej lub karboksylowej w oligomerze lub jego części.
Do najpopularniejszych barwników fluorescencyjnych dostępnych w postaci amidofosforynów należą: fluoresceina i jej tetra- i heksachlorowane pochodne (TET i HEX). Zaletą tych barwników jest wystarczająca stabilność w środowisku zasadowym, koniecznym w końcowym odblokowaniu oligonukleotydu poprzez usunięcie grup ochronnych. Pochodne amidofosforynowe stosujemy również do znakowania oligomerów za pomocą barwników takich jak cyjaniny, jednak związki te, po przyłączeniu do oligomeru mogą być niestabilne w warunkach zasadowych, i wymagają zmiany warunków odblokowywania oligonukleotydów.
Drugim sposobem fluorescencyjnego znakowania oligonukleotydów jest znakowanie wewnątrz sekwencji oligonukleotydowej.
W tym rodzaju znakowania fluorescencyjnego oligonukleotydów możliwe jest przyłączanie barwnika fluorescencyjnego do zasad azotowych lub pierścienia rybozy odpowiedniego nukleozydu albo podczas syntezy oligonukleotydu albo po zakończeniu syntezy oligomeru.
W pierwszym przypadku, barwnik na drodze chemicznej konwersji przekształcany jest w amidofosforyn, który następnie w wyniku aktywacji za pomocą pochodnych 1- H-tetrazolu przyłącza się do wolnej grupy hydroksylowej oligonukleotydu podczas chemicznej syntezy oligonukleotydu metodą amidofosforynową, na podłożu stałym.
W drugim przypadku barwnik fluorescencyjny jest włączany do oligonukleotydu w procesie postsyntetycznym, czyli po zakończeniu syntezy oligonukleotydu, pochodna barwnika w wyniku reakcji z odpowiednio modyfikowanym nukleotydem oligomeru jest przyłączana wiązaniem kowalencyjnym.
Przykładami post-syntetycznego znakowania oligomerów są:
- wykorzystanie reakcji wolnej grupy aminowej jednego z nukleotydów oligomeru z estrem N-hydroksy sukcynimidowym barwnika lub pochodną izotiocyjanianową barwnika. W wyniku reakcji pomiędzy takimi pochodnymi barwnika a częścią heterocykliczną oligomeru powstaje stabilne wiązanie chemiczne, odpowiednio: amidowe lub tiomocznikowe;
PL 241 227 Β1 reakcja bazująca na tzw. „click chemistry”, pomiędzy oligonukleotydem zawierającym nukleotyd modyfikowany ugrupowaniem alkinowym a barwnikiem fluorescencyjnym zawierającym grupę azydkową. W wyniku reakcji pomiędzy nimi tworzy się pierścień triazolowy, poprzez powstanie wiązań kowalencyjnych węgiel - azot.
Wszystkie znane i przedstawione powyżej metody znakowania opierają się na wytworzeniu trwałego wiązania chemicznego między barwnikiem a kwasem nukleinowym.
W pewnych sytuacjach pożądanym byłoby jednakże, aby barwnik fluorescencyjny mógł być odłączony od kwasu nukleinowego bez jego całkowitej lub częściowej degradacji. Nawet częściowy rozkład kwasu nukleinowego skutkuje bowiem utratą naturalnych funkcji. Dla przykładu - często obserwowanym zjawiskiem jest to, że przyłączenie barwnika zmienia właściwości kwasu nukleinowego (tj. blokuje jej niektóre funkcje), przez co uniemożliwia jej wykorzystanie zgodnie z naturalnymi właściwościami.
Do dnia dzisiejszego nie zostały ujawnione w literaturze przypadki bezpiecznego usuwania znaczników z kwasów nukleinowych. Dotychczas znane metody usunięcia znacznika powodują jednoczesny proces destrukcji całej cząsteczki kwasu nukleinowego. Dla przykładu: istnieją metody usuwania barwników fluorescencyjnych ze znakowanych kwasów nukleinowych za pomocą trawienia enzymatycznego: enzym krok po kroku usuwa z biopolimeru elementy przyłączone wiązaniem fosforodiestrowym, poczynając od końca 5’. Jeśli na końcu 5’ takiego biopolimeru znajduje się barwnik fluorescencyjny, to zostanie on usunięty w pierwszej kolejności, jednak działania enzymu nie można zatrzymać, co w konsekwencji prowadzi do degradacji całego kwasu.
Celem wynalazku było opracowanie barwnika fluorescencyjnego, stosowanego jako znacznik fluorescencyjny, zwłaszcza do znakowania kwasów nukleinowych, nukleozydów, nukleotydów, peptydów lub białek, który mógłby być odłączany od znakowanej biocząsteczki bez jej uszkadzania lub degradacji. W drugim aspekcie celem wynalazku było opracowanie sposobu znakowania biocząsteczek znacznikiem barwnikiem fluorescencyjnym oraz sposobu usuwania znacznika z biocząsteczki, pozostawiając biocząsteczkę w formie nienaruszonej.
Przedmiotem wynalazku są znaczniki fluorescencyjne na bazie prekursorów o wzorach ogólnych 1,2 lub 3
| 0 A-C-N A \ R P-N / R A A w których A oznacza grupę o wzorze 4 lub 5 R6 R+ X x r3 Ki ii R | υ 7 7 2) X ,R7 P-N ' R7 0) R: R2 ^NJ < TCH^T 0— J J n r3 (4) R2 VNfcH]yO·^ 3 (5) |
PL 241 227 Β1 w których:
n przyjmuje wartość 1 lub 2, _ „jww” oznacza wiązanie pomiędzy tlenem grupy A a atomem węgla prekursora o wzorze 1 lub tlenem grupy A a atomem fosforu prekursora o wzorze 2 lub 3, Ri oznacza:
o wodór, metyl, grupę aminową, grupę karbonylową, naftyl, naftylometyl, fenyl, benzyl, chinolinometyl, o benzyl podstawiony jednym lub kilkoma takimi samymi lub różnymi podstawnikami: chlorem, fluorem, metylem, o nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla podstawiony fenylem, grupą aminową, grupą hydroksylową lub równocześnie fenylem i grupą hydroksylową lub fenylem i grupą aminową, o lub nienasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne, R2 oznacza: wodór, metyl, benzyl, fenyl, naftyl, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne, R3 są takie same lub różne i oznaczają wodór, metyl, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla, lub nienasycony alkil zawierający 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne, grupę aminową, grupę nitrową, grupę azydkową, grupę o wzorze ogólnym 6
R4 oznacza azot,
Rs i Re są takie same lub różne i oznaczają wodór, metyl, benzyl, fenyl, naftyl, halogen (F, Cl, Br, I), hydroksyl, grupę aminową, grupę nitrową, grupę karboksylową, nasycony alkil zawierający 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne, nienasycony alkil zawierający 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne podstawiony fenylem, R7 oznacza izo-propyl.
Sposób wykonania znakowania według wynalazku polega na przyłączeniu do nukleozydów, nukleotydów lub oligonukleotydów prekursorów o wzorach ogólnych 1,2 lub 3, w których A, n, R1, R2, R3, R4, Rs i Re mają wyżej podane znaczenie, przy czym w celu przyłączenia tych znaczników, w pierwszym etapie związki o wzorach 7 lub 8
w których n, R1, R2, R3, R4, Rs i Re mają wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji chemicznej z 1,1’-karbonylodiimidazolem lub z A/,A/,A/’,A/-tetraizopropylodiamidochloro-fosforynem lub (2-cyjanoetylo)-A/,A/,A/’,A/-bis(diizopropylodiamido)fosforynem w odpowiednich reakcjach przedstawionych w dalszej treści opisu, uzyskując prekursory według wzorów 1,2 lub 3.
Związki o wzorach 7 i 8 oraz sposób ich otrzymywania zostały ujawnione i opisane w polskim zgłoszeniu patentowym nr P.428083.
PL 241 227 Β1
Po przekształceniu w wyżej wspomniane formy prekursorowe poddaje się je reakcji z wolną pierwszorzędową grupą hydroksylową lub aminową nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu w celu znakowania tych biocząsteczek.
Sposób wykonania znakowania poprzez aktywne pochodne imidazolowe według wzoru 1
Barwnik fluorescencyjny według wzorów ogólnych 7 i 8 rozpuszcza się w bezwodnym polarnym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu lub tetrahydrofuranie i dodaje się do niego karbodiimidazol w proporcji molowej od 1 :1 do 1 :1,5 stosunku molowego, korzystnie w stosunku 1:1,3 molowym do zastosowanego barwnika fluorescencyjnego. Reakcję prowadzi się w temperaturze otoczenia, korzystnie 25°C, nie wyższej niż 30°C. Czas reakcji wynosi od 30 minut do 2 godzin, korzystnie 1 godzinę. Po tym czasie powstaje aktywna forma imidazolowa (według wzoru 1), którą dodaje się do nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu (z wolną grupa hydroksylową lub aminową) w nadmiarze od 1 :1 do 2 :1 stosunku molowego, korzystnie 1,5 :1 stosunku molowego do nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu. Reakcje prowadzi się z dodatkiem nienukleofilowej zasady organicznej z grupy imin, pochodnych guanidyny, korzystnie tetrametyloguanidyny (TMG) w proporcji molowej w przedziale od 0,3:1 do 7,8:1, korzystnie 3,5:1 stosunku molowego do nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu w temperaturze otoczenia, korzystnie 25°C, nie wyższej jednak niż 30°C. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik jest usuwany, a produkt izolowany standardowymi metodami.
Przykładem nukleozydu znakowanego aktywną pochodną imidazolowa według wzoru 1 jest związek o wzorze 9
OAc (9) gdzie B oznacza zasadę heterocykliczną, np. tyminę.
Sposób wykonania znakowania poprzez amidofosforyn
Metoda znakowania oligomerów za pomocą amidofosforynu według wzoru 2
Etap I: otrzymywanie amidofosforynu według wzoru 2
Barwnik fluorescencyjny z grupy barwników opisanych wzorem 7 lub 8 rozpuszcza się w bezwodnym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu lub chlorku metylenu, stosując atmosferę gazu obojętnego, korzystnie argonu. Cały proces prowadzi się stosując temperaturę z zakresu 15-30°C, korzystnie 20°C. Następnie do roztworu dodaje się bezwodną trzeciorzędową aminę alifatyczną, korzystnie diizopropyloetyloaminę w ilości nie mniejszej niż 1 :1 stosunku molowego, korzystnie 1,3 :1 stosunku molowego do barwnika fluorescencyjnego. Następnie do roztworu dodaje się A/,A/,A/’,A/--tetraizopropylodiamidochlorofosforyn w ilości od 0,8 :1 do 1,1 :1 stosunku molowego, korzystnie w stosunku 1 :1 molowym do barwnika fluorescencyjnego. Przebieg reakcji monitoruje się, korzystnie analizą TLC stosując fazę rozwijającą benzen :trójetyloamina (9:1). Po zaobserwowaniu zaniku substratu dodaje się kolejną porcję barwnika fluorescencyjnego w stosunku molowym 1 :1 do ilości tego samego barwnika fluorescencyjnego dodanych na początku reakcji oraz pochodną 1 -/-/-tetrazolu, korzystnie 5-benzylo-mercaptotetrazol (BMT) w stosunku molowym do barwnika fluorescencyjnego o wzorze ogólnym 7 lub 8 dodanego w drugim etapie reakcji od 0,2 :1 do 0,8 :1, korzystnie 0,5 :1 stosunku molowego. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik jest usuwany, a produkt według wzoru 2 izolowany standardowymi metodami, stosując oczyszczanie chromatograficzne produktu końcowego w obecności trzeciorzędowej aminy alifatycznej, korzystnie trójetyloaminy.
Etap II: znakowanie nukleozydu lub nukleotydu, lub oligomerów
Otrzymany i oczyszczony amidofosforyn według wzoru 2 rozpuszcza się w bezwodnym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu, chlorku metylenu lub toluenie i miesza się z pochodną 1-/-/-tetrazolu, korzystnie BMT w stosunku molowym nie mniejszym niż 1 :1 do zastosowanego amidofosforynu. Następnie mieszaninę dodaje się do nukleozydu lub nukleotydu, lub oligonukleotydu posiadającego wolną grupę hydroksylową lub aminową. Proporcje równomolowej mieszaniny amidofosforynu, według wzoru 2, z pochodną 1-/-/-tetrazolu, korzystnie BMT, w stosunku molowym do nukleozydu lub nukleotydu, lub oligonukleotydu dla reakcji wfazie ciekłej stanowią 2:1 stosunku molowego, natomiast
PL 241 227 Β1 dla reakcji prowadzonych na fazie stałej (porowate szkło) 20 :1 stosunku molowego. Czas reakcji również zależy od zastosowanej metodologii prowadzenia reakcji i wynosi dla reakcji w fazie ciekłej od 0,5 do 3 godzin, korzystnie 1 godzinę, na fazie stałej od 0,5 do 6 minut, korzystnie 3 minuty. Po przyłączeniu amidofosforynu do nukleozydu lub nukleotydu, lub oligonukleotydu, przeprowadza się reakcję utleniania atomów fosforu z III do V stopnia utlenienia za pomocą czynnika utleniającego, korzystnie roztworu jodu w uwodnionej pirydynie. Po zakończeniu ww. reakcji otrzymuje się znakowany nukleozyd lub nukleotyd, lub oligonukleotyd. Następnie rozpuszczalnik jest usuwany metodami standardowymi dla odpowiedniej metodologii reakcji (faza stała lub ciekła), a produkt izolowany standardowymi metodami.
Metoda znakowania oligomerów za pomocą amidofosforynu według wzoru 3
Etap I: otrzymywanie amidofosforynów według wzoru 3
Barwnik fluorescencyjny według wzoru 7 lub 8 rozpuszcza się w bezwodnym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu lub chlorku metylenu stosując atmosferę gazu obojętnego, korzystnie argonu. Następnie do roztworu dodaje się (2-cyjanoetylo)-N,N,A/’,A/-bis(diizopropylodiamido)fosforyn w ilości od 1 :1 do 3 :1 stosunku molowego, korzystnie 1,3 :1 stosunku molowego do zastosowanego barwnika fluorescencyjnego według wzorów ogólnych 7 lub 8, a następnie dodaje się pochodną 1-/-/-tetrazolu, korzystnie 5-benzylo-mercaptotetrazol (BMT) w stosunku molowym nie większym niż 1 :1. korzystnie 0,8 :1 stosunku molowego względem barwnika fluorescencyjnego, w temperaturze od 15-30°C, korzystnie 20°C. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik jest usuwany, a produkt w postaci amidofosforynu według wzoru 3 izolowany standardowymi metodami, stosując podczas oczyszczania produktu końcowego dodatek trzeciorzędowej aminy alifatycznej, korzystnie trójetyloaminy.
Etap II: znakowanie nukleozydu, nukleotydu lub oligomerów
Otrzymany i oczyszczony amidofosforyn według wzoru 3 rozpuszcza się w bezwodnym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu, chlorku metylenu lub toluenie i miesza się z pochodną 1-/-/-tetrazolu, korzystnie BMT w stosunku molowym nie mniejszym niż 1 :1 do zastosowanego amidofosforynu. Następnie mieszaninę dodaje się do nukleozydu lub nukleotydu, lub oligonukleotydu posiadającego wolną grupę hydroksylową lub aminową. Proporcje równomolowej mieszaniny amidofosforynu, według wzoru 3, z pochodną 1-/-/-tetrazolu, korzystnie BMT, w stosunku do nukleozydu lub nukleotydu, lub oligonukleotydu dla reakcji w fazie ciekłej stanowią 2 :1 stosunku molowego, natomiast dla reakcji prowadzonych na fazie stałej (porowate szkło) 20 :1 stosunku molowego. Czas reakcji zależy również od zastosowanej metodologii prowadzenia reakcji i wynosi dla reakcji w fazie ciekłej od 0,5 do 3 godzin, korzystnie 1 godzinę, na fazie stałej od 0,5 do 6 minut, korzystnie 3 minuty. Po przyłączeniu amidofosforynu do nukleozydu lub nukleotydu, lub oligonukleotydu, przeprowadza się reakcję utleniania atomów fosforu z III do V stopnia utlenienia za pomocą czynnika utleniającego, korzystnie roztworu jodu w uwodnionej pirydynie. Po zakończeniu ww. reakcji otrzymuje się znakowany nukleozyd lub nukleotyd, lub oligonukleotyd. Następnie rozpuszczalnik jest usuwany metodami standardowymi dla odpowiedniej metodologii reakcji (faza stała lub ciekła), a produkt izolowany standardowymi metodami.
Przykładem nukleozydu znakowanego aktywną pochodną amidofosforynową według wzoru 2 lub 3 jest związek o wzorze 10
OAc (10) gdzie B oznacza zasadę heterocykliczną, np. tyminę.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób termicznego usuwania znaczników fluorescencyjnych ze znakowanego nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu, w wyniku czego oprócz nieznakowanego nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu powstaje związek cykliczny o wzorze ogólnym 11, 12 lub 13.
R2 (11)
PL 241 227 Β1
Usuwanie przeprowadza się w następujący sposób: znakowany nukleozyd, nukleotyd lub oligonukleotyd rozpuszcza się w buforze fosforanowym (pH 6,86 lub 7,2) i jeżeli nie nastąpiło całkowite rozpuszczenie dodaje się acetonitrylu w takiej ilości, aby otrzymać klarowny roztwór. Następnie roztwór ogrzewa się w zamkniętym naczyniu w przedziale temperatur 30-90°C.
Na schemacie 1 przedstawiono przykład termicznego usuwania znacznika fluorescencyjnego z nukleozydu po znakowaniu pochodną imidazolową, zaś na schemacie 2 przykład termicznego usuwania znacznika fluorescencyjnego z nukleotydu po znakowaniu pochodną amidofosforanową wraz z mechanizmem tworzenia się pięcioczłonowej bicyklicznej formy barwnika.
Schemat 1
Gdzie B oznacza zasadę heterocykliczną, np. tyminę, a A dowolny anion występujący w roztworze, korzystnie fosforan.
Schemat 2
Gdzie B oznacza zasadę heterocykliczną, np. tyminę,
Warunki, w jakich poszczególne znaczniki ulegają odłączeniu, są charakterystyczne dla danego znacznika i różnią się pomiędzy sobą, z tego względu przed użyciem danego znacznika należy określić parametry potrzebne do całkowitego jego usunięcia poprzez wykreślenie krzywej wzorcowej obejmującej zależność usuwania danego znacznika od temperatury lub/i czasu, która umożliwi odpowiedni dobór zarówno temperatury procesu usuwania znacznika, jak i jego czas.
Krzywa wzorcowa jest charakterystyczna dla danego znacznika. Nie zależy natomiast od sposobu przyłączania (metoda amidofosforynowa lub metoda imidazolowa) i rodzaju związku do jakiego barwnik jest przyłączony.
Poniżej przedstawiono przykładową procedurę wykonania krzywej wzorcowej. W pierwszej kolejności należy określić temperaturę korzystną do usunięcia znacznika. W tym celu znakowaną biocząsteczkę, np. nukleozyd, nukleotyd lub oligonukleotyd znakowany danym barwnikiem dzieli się na 7 oddzielnych porcji, każda po 1 miligramie, rozpuszcza się w buforze fosforanowym (pH 6,86 lub 7,2) lub mieszaninie: bufor fosforanowy (pH 6,86 lub 7,2)/acetonitryl(ACN) (2/1; v/v) w zamykanym naczyniu. Następnie, wytrząsając prowadzi się ogrzewanie każdej z nich przez 2 h w różnych temperaturach: 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90°C. Próbki poddaje się kolejno analizie RP-HPLC (ang. reversed phase high-performance liquid chromatography [wysokosprawna chromatografia cieczowa na fazie
PL 241 227 Β1 odwróconej]) z detektorem fluorescencyjnym i na podstawie chromatogramów przedstawiających stopień usunięcia znacznika z nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu wykreśla się krzywą zależności od temperatury. Na podstawie krzywej wybieramy temperaturę, dla której chcemy oznaczyć czas całkowitego usunięcia znacznika.
W celu określenia czasu całkowitego usunięcia znacznika w oznaczonej wcześniej temperaturze postępujemy następująco: znakowaną biocząsteczkę, np. nukleozyd, nukleotyd lub oligonukleotyd znakowany danym barwnikiem w ilości 1 miligrama rozpuszcza się w buforze fosforanowym (pH 6,86 lub 7,2) lub mieszaninie: bufor fosforanowy (pH 6,86 lub 7,2)/acetonitryl (2/1; v/v) w zamykanym naczyniu. Następnie wytrząsając, prowadzi się ogrzewanie w oznaczonej wcześniej temperaturze. Próbkę poddaje się analizie RP-HPLC z detektorem fluorescencyjnym, pobierając analit z tej samej próbki po czasie 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90 minut. Na podstawie chromatogramów przedstawiających stopień zaniku znacznika wykreśla się krzywą zależności całkowitego zaniku znacznika od czasu. Na podstawie krzywej określamy czas potrzebny do całkowitego usunięcia znacznika z nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu w zadanej temperaturze.
Postęp reakcji usuwania znacznika i tworzenia formy cyklicznej barwnika można obserwować z krzywej wzorcowej otrzymanej metodami spektrofotometrycznymi, korzystnie RP-HPLC z detektorem fluorescencyjnym, który identyfikuje powstawanie cyklicznej formy barwnika. Na schemacie 1 przedstawiono przykład usuwania znacznika z nukleozydu i tworzenia się formy cyklicznej barwnika w trakcie usuwania znacznika ze znakowanej cząsteczki nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu.
Przykładowo, jeżeli do znakowania użyto barwnik o wzorze ogólnym 14, to po cyklu „tworzenie prekursora - przyłączenie znacznika do nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu - usunięcie znacznika” powstanie pięcioczłonowa bicykliczna forma o wzorze ogólnym 11. Podobnie, jeżeli do znakowania użyto barwnik o wzorze 15, to po cyklu „tworzenie prekursora - przyłączenie znacznika do nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu - usunięcie znacznika” powstanie pięcioczłonowa bicykliczna forma o wzorze 12.
Natomiast, jeżeli do znakowania użyto barwnik o wzorze 16, to po cyklu „tworzenie prekursora przyłączenie znacznika do nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu - usunięcie znacznika” powstanie sześcioczłonowa bicykliczna forma o wzorze 13.
(U)
15) (12)
PL 241 227 Β1
W trzecim aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób oceny stopnia usunięcia znacznika fluorescencyjnego ze znakowanej biocząsteczki, polegający na pomiarze różnicy intensywności fluorescencji cząsteczki znakowanej, a intensywności fluorescencji znacznika odłączanego od znakowanej biocząsteczki podczas podwyższania temperatury (figura 4). Sposób polega na pomiarze intensywności fluorescencji cząsteczek znakowanych przy długości fali wzbudzenia i emisji oznaczonych jako maksima dla cząsteczki znakowanej i zmierzonych po zakończeniu procesu przyłączania znacznika, a następnie w określonych przedziałach czasowych przy stałej podwyższonej temperaturze lub po określonej czynności wykonanej z użyciem znakowanej cząsteczki wykonuje się pomiar przy tej samej długości fali wzbudzenia i emisji, mierząc fluorescencję w mieszaninie po usunięciu barwnika. Po uzyskaniu danych poddaje się je analizie matematycznej i na jej podstawie ustala dynamikę rozkładu, stopień rozkładu, a także ocenę wpływu czynników zewnętrznych na stabilność połączenia znacznika z biocząsteczką.
W celu pomiaru poziomu usunięcia znacznika z biocząsteczki, a tym samym poziomu jej znakowania przeprowadza się pomiar intensywności fluorescencji dla znakowanej biocząsteczki oraz po usunięciu znacznika za pomocą detektora fluorescencyjnego dla 1 molowego roztworu znakowanej biocząsteczki rozpuszczonej w takim rozpuszczalniku lub mieszaninie rozpuszczalników (np. ACN, dimetyloformamid (DMF), bufor fosforanowy, bufor cytrynianowy) oraz takiej podwyższonej temperaturze, dla jakiej chcemy określić czas całkowitego usunięcia znacznika. Pomiaru dokonuje się przy długości fali maksimum fluorescencji znakowanej biocząsteczki lub maksimum fluorescencji formy cyklicznej powstałej po usunięciu znacznika. Pomiaru dokonuje się w przedziałach czasowych (korzystnie w 6 punktach) i wykreśla się krzywą zależności intensywności fluorescencji dla znakowanej biocząsteczki lub cyklicznej formy po usunięciu znacznika od czasu. Proces odłączania znacznika od biocząsteczki, w podwyższonej temperaturze możemy monitorować za pomocą detektora fluorecencyjnego, ponieważ właściwości absorpcyjno-emisyjne znakowanej biocząsteczki różnią się od formy cyklicznej (powstałej po usunięciu znacznika) zarówno intensywnością fluorescencji, jak i maksimum długością fali emisji. Dzięki temu, możemy wykreślić krzywą zależności zmian intensywności fluorescencji/długości fali emisji znakowanej biocząsteczki i usuniętego znacznika (forma cykliczna) od czasu w danej temperaturze. Na podstawie wyznaczonej krzywej zmiany intensywności/długości fali emisji możemy ilościowo wyznaczyć stopień usuwania znacznika. Co jest wynikiem zmiany profilu intensywności fluorescencji emitowanej przez barwnik, a emisją jego formy cyklicznej (figura 4).
Sposób ten umożliwia badanie stopnia rozkładu znakowanej biocząsteczki poza układem, w którym w danej chwili znajduje się ta biocząsteczką, gdyż cykliczny produkt rozkładu można wyizolować np. ze środowiska reakcji i dokonywać pomiarów niezależnie od prowadzonego procesu chemicznego.
Sposób jest przydatny m.in. do oceny warunków przechowywania dowolnych towarów, gdzie znakowana biocząsteczką jest wykorzystywana do oceny wpływu tych warunków na dany towar, na podstawie stopnia odłączenia znacznika, zachodzącego pod wpływem zmian termicznych. Również, stopień odłączenia znacznika może być przydatny do weryfikacji przydatności dowolnych produktów, które ulegają rozkładowi w warunkach, w których znacznik odłącza się od cząsteczki. Ocena taka jest przeprowadzana na podstawie pomiaru fluorescencji.
W przykładach przedstawiono przykładowe opisy procedur znakowania biocząsteczek, procedur usuwania znaczników oraz przykłady ustalania warunków usuwania znaczników. Na rysunkach przedstawiono wybrane wyniki przedstawiające krzywe zależności usuwania znacznika od czasu i temperatury, różnicę intensywności fluorescencji pomiędzy formą znakowaną a cykliczną powstałą po usunięciu barwnika oraz analizę HPLC ilustrującą ten proces.
PL 241 227 B1
Przykład 1
Przekształcenie 2-(pirydyno-2-yl)winylo]pirydynowych aminoalkoholi w formę karbaminianową. (E)-2-(metylo{6-[2-(pirydyn-2-yl)winylo]pirydyn-2-yl}amino)etan-1-ol (0,1 mmol) rozpuszczono w bezwodnym acetonitrylu (2 ml) i umieszczono w kolbie z mieszadłem magnetycznym. Do roztworu dodano 1’,1’-karbonylodiimidazol (0,24 mmol) i reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a jej przebieg kontrolowano za pomocą TLC (ang. Thin Layer Chromatography [cienkowarstwowa chromatografia cieczowa]) (octan etylu/ n-heksan 9/1). Po upływie 30 minut otrzymano aktywną formę karbaminianową aminoalkoholu, którą wykorzystano w następnym przykładzie bez jakiegokolwiek izolacji.
Przykład 2
Znakowanie 3’-O-Acetylotymidyny za pomocą karbaminianowej formy barwnika fluorescencyjnego Do otrzymanego w poprzednim przykładzie roztworu karbaminianowej formy aminoalkoholu dodano 3’-O-Acetylotymidynę (0,1 mmol) i 1,1,3,3-tetrametyloguanidynę (0,16 mmol). Reakcję mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przebieg reakcji kontrolowano za pomocą analizy TLC (dichlorometan/metanol 95/5 v/v). Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (dichlorometan (DCM)/metanol (MeOH); 0-5% metanol (MeOH)), otrzymując czysty produkt, który scharakteryzowano metodami spektroskopowymi.
1H NMR (400 MHz; Chloroform-d) δ 8,66-8,55 (m; 1H); 7,70-7,65 (m; 1H); 7,63 (d; J = 5,3 Hz; 1H); 7,48 (d; J = 8,6 Hz; 1H); 7,44 (d; J = 8,0 Hz; 2H); 7,35 (d; J = 2,2 Hz; 2H); 7,14 (dd; J = 7,5; 4,9 Hz; 1H); 6,71 (d; J = 7,3 Hz; 1H); 6,45 (d; J = 8,5 Hz; 1H); 6,35 (dd; J = 8,8; 5,7 Hz; 1H); 5,16 (dd; J = 5,2; 3,2 Hz; 1H); 4,52 (dt; J = 11,5; 5,9 Hz; 1H); 4,42 (q; J = 4,6; 3,7 Hz; 1H); 4,39 (d; J = 2,9 Hz; 1H); 4,33 (dd; J = 11,8; 2,8 Hz; 1H); 4,17 (q; J = 2,7 Hz; 1H); 4,02 (tq; J = 14,7; 8,8; 7,4 Hz; 2H); 3,10 (s; 3H); 2,40-2,29 (m; 1H); 2,22-2,10 (m; 2H); 2,09 (s; 3H); 1,88 (s; 3H).
13C NMR (101 MHz; Chloroform-d) δ 169,89; 163,00; 157,25; 155,08; 154,11; 152,11; 149,93; 149,18; 137,44; 136,01; 134,34; 132,11; 130,24; 127,82; 122,10; 121,78; 112,34; 111,15; 104,99; 84,04; 81,62; 74,07; 66,76; 65,86; 47,87; 36,73; 36,64; 20,39; 12,13.
Przykład 3
Usuwanie znacznika z 3’-O-Acetylo-5’-(2-{metylo-[6-(2-pirydin-2-yl-winylo)-pirydin-2-yl)-aminoetyloksykarbonylotymidyny
Otrzymany w przykładzie 2 znakowany nukleozyd rozpuszczono w buforze fosforanowym pH 6,86 w 5 porcjach po 1 mg i umieszczono w zamkniętych fiolkach. Następnie, wytrząsając prowadzono ogrzewanie każdej z nich w następujących temperaturach: 30, 40, 50, 60 i 70°C i stałym czasie 2 godzin. Po zakończeniu ogrzewania i szybkim schłodzeniu (w suchym lodzie) pobierano próbki każdej z porcji i poddano je analizie za pomocą zestawu HPLC wyposażonego w detektor diodowy (DAD) w zakresie 220-700 nm) oraz detektor fluorescencyjny (FLD) w zakresie λabs. = 370 nm, λem = 476 nm, stosując kolumnę Synergy Fusion - RP 80 A (wraz z prekolumną firmy Phenomenex), o wymiarach 150 χ 4,6 mm, stosując metodę gradientową: bufor A (0,01 M octan trietyloamoniowy)/ bufor B (0,01 M octan trietyloamoniowy w 40% acetonitrylu), szybkość przepływu 1 ml/min, czas trwania analizy 30 min. Wyniki kinetyki usuwania barwnika przedstawiono na wykresie: szybkość zaniku formy znakowanej w zależności od temperatury - figura 1. Całkowite usunięcie znacznika zachodzi w 70°C.
Przykład 4 (E )-2-(metylo{6-[2-(pirydyn-2-yl)winylo]pirydyn-2-yl}amino)propan-1-ol (0,13 mmol, 35 mg) rozpuszczono w bezwodnym acetonitrylu (2 ml) i umieszczono w kolbie z mieszadłem magnetycznym z 1’1’-karbonylodiimidazol (0,13 mmol, 38,09 mg). Reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a jej przebieg kontrolowano za pomocą TLC (octan etylu/n-heksan 9/1). Po upływie 30 minut otrzymano aktywną formę karbaminianową (E)-2-(metylo{6-[2-(pirydyn-2-yl)winylo]pirydyn-2-yl}amino)propan-1-olu, którą wykorzystano w następnym przykładzie bez jakiegokolwiek izolacji.
Przykład 5
Do otrzymanego w poprzednim przykładzie 4 roztworu karbaminianowej formy (E)-2-(metylo{6-[2-(pirydyn-2-yl)winylo]pirydyn-2-yl}amino)propan-1-olu dodano 3’-O-Acetylowaną tymidynę (0,13 mmol, 38,09 mg) oraz 1,1,3,3-tetrametyloguanidynę (0,21 mmol, 20 μL). Reakcję mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przebieg reakcji kontrolowano za pomocą analizy TLC (dichlorometan/metanol 95/5 v/v). Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (DCM/MeOH; 0-5% MeOH), otrzymując czysty produkt (19 mg), który scharakteryzowano metodami spektroskopowymi.
PL 241 227 B1 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8,67-8,57 (d, J = 4,01 1H); 7,70-7,65 (m, 1H); 7,63 (d,
J = 5,3 Hz, 1H); 7,48 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,44 (d, J = 8,0 Hz, 2H); 7,35 (d, J = 2,2 Hz, 2H); 7,14 (dd, J = 7,5, 4,9 Hz, 1H); 6,71 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 6,35 (d, J = 8,5 Hz, 1H); 6,35 (dd, J = 8,8, 5,7 Hz, 1H); 5,16 (dd, J = 5,2, 3,2 Hz, 1H); 4,52 (dt, J = 11,5, 5,9 Hz, 1H); 4,42 (q, J = 4,6, 3,7 Hz, 1H); 4,39 (d, J = 2,9 Hz, 1H); 4,33 (dd, J = 11,8, 2,8 Hz, 1H); 4,17 (q, J = 2,7 Hz, 1H); 4,02 (tq, J = 14,7, 8,8, 7,4 Hz, 2H); 3,10 (s, 3H); 2,43-2,39 (m, 1H); 2,24-2,19 (m, 2H); 2,15-2,08 (m, 2H); 2,04 (s, 3H); 1,82 (s, 3H).
13C NMR (101 MHZ, Chloroform-d) δ 170,40; 163,22; 157,86; 155,44; 154,64; 152,11; 149,93; 149,21; 137,78; 136,82; 134,87; 132,11; 130,24; 128,30; 122,10; 121,78; 112,57; 111,63; 105,60; 84,52; 81,62; 74,07; 66,76; 65,86; 47,87; 36,73; 36,64; 25,16; 20,39; 12,58.
Przykład 6
Usuwanie znacznika z 3’-O-Acetylo-5’-(2-{metylo-[6-(2-pirydin-2-yl-winylo)-pirydin-2-yl)-aminopropyloksykarbonylotymidyny
Otrzymany w przykładzie 5 znakowany nukleozyd (1 mg) rozpuszczono w buforze fosforanowym pH 6,86 w (0,5 mL, Ph = 7). Próbkę ogrzewano (90°C), a następnie pobierano co godzinę 50 μm (0,2 OD) i szybko schłodzono do temp 0°C. Po pobraniu 4 próbek wykonano analizę TLC obrazującą rozkład. Ogrzewanie prowadzono 24 godziny i stwierdzono całkowity rozpad substratu. Z płytki TLC wyizolowano produkt rokady i wykonano analizę masową, która potwierdziła masę bicyklicznego sześcioczłonowego produktu 15.
MS-ESI: C16H18N3+ obliczone 252,1495 [M]+, obserwowane 252 [M]+.
Przykład 7
Usuwanie znacznika z 3’-O-Acetylo-5’-(2-{metylo-[6-(2-pirydin-2-yl-winylo)-pirydin-2-yl)-aminoetyloksykarbonylotymidyny
Otrzymany w przykładzie 2 znakowany nukleozyd rozpuszczono w buforze fosforanowym pH 6,86 w szklanej fiolce z zakrętką gwintowaną. Następnie, wytrząsając prowadzono ogrzewanie przy stałej temperaturze 90°C w przeciągu 45 minut, pobierając próbkę w 5, 15, 30 i 45 minucie i po schłodzeniu wykonując jej analizę za pomocą zestawu HPLC wyposażonego w detektor DAD (diodowy w zakresie 220-700 nm) oraz detektor FLD (λabs. = 370 nm, λem = 476 nm), stosując kolumnę Synergy Fusion - RP 80 A (wraz z prekolumną firmy Phenomenex), o wymiarach 150 χ 4,6 mm, stosując metodę gradientową: bufor A (0,01 M octan trietyloamoniowy)/ bufor B (0,01 M octan trietyloamoniowy w 40% acetonitrylu), szybkość przepływu 1 ml/min, czas trwania analizy 30 min. Wyniki kinetyki usuwania barwnika przedstawiono na wykresie: szybkość zaniku formy znakowanej w zależności od czasu - figura 2. Całkowite usunięcie znacznika zachodzi po 45 minutach.
Przykład 8
Powstawanie cyklicznej formy barwnika w wyniku opracowanego sposobu usunięcia znacznika z 3’-O-Acetylo-5’-(2-{metylo-[6-(2-pirydin-2-yl-winylo)-pirydin-2-yl-aminoetyloksykarbonylotymidyny
Otrzymany w przykładzie 2 znakowany nukleozyd rozpuszczono w buforze fosforanowym pH 6,86 w szklanej fiolce z zakrętką gwintowaną. Następnie, wytrząsając prowadzono ogrzewanie w temperaturze 90°C przez 45 minut, do całkowitego zaniku znakowanej biocząsteczki, co stwierdzono za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej wypełnionej silikażelem.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,68 (dd, J = 5,1, 1,7 Hz, 1H), 8,04 (dd, J = 8,8, 7,6 Hz, 1H), 7,91 (td, J = 7,7, 1,8 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 15,7 Hz, 1H), 7,72 (dt, J = 7,9, 1,1 Hz, 1H), 7,59 (d, J = 15,7 Hz, 1H), 7,48-7,44 (m, 1H), 7,43-7,39 (m, 1H), 7,12 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,80 (dd, J = 10,6, 9,0 Hz, 2H), 3,95 (dd, J = 10,6, 9,1 Hz, 2H), 3,10 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 172,75; 171,48; 154,94; 152,61; 150,02; 145,44; 144,12;
138,44; 137,39; 124,78; 120,41; 109,65; 106,01; 49,21; 48,09.
HRMS-ESI: C15H16N3 obliczone 238,1344 [M+H]+, obserwowane 238,1343 [M+H]+.
Przykład 9
Przekształcenie (E )-2-(metylo{6-[2-(pirydyn-2-yl)winylo]pirydyn-2-yl}amino)etan-1-olu w formę karbaminianową (E)-2-(metylo{6-[2-(pirydyn-2-yl)winylo]pirydyn-2-yl}amino)etan-1-ol (25 mg, 0,098 mmol) rozpuszczono w bezwodnym acetonitrylu (2 ml) i umieszczono w kolbie z mieszadłem magnetycznym. Do roztworu trzykrotnie dodano 1’1’-karbonylodiimidazol, w równych ilościach w 15 minutowych odstępach (57,10 mg; 0,36 mmol) i reakcję prowadzono w sumie przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej, a jej przebieg kontrolowano za pomocą TLC (octan etylu/ n-heksan 9/1). Po upływie 1,5 godziny godziny
PL 241 227 B1 otrzymano formę karbaminianową aminoalkoholu, którą zastosowano w kolejnym przykładzie, bez jakiejkolwiek izolacji.
Przykład 10
Znakowanie 3’-O-acetylo-N2-isobutyrylodeoksyguanozyny za pomocą karbaminianowej formy barwnika fluorescencyjnego
Do otrzymanego w przykładzie 6 roztworu karbaminianowej formy aminoalkoholu dodano 3’-O-acetylo-N2-izobutyrylodeoksyguanozynę (0,1 mmol) i 1,1,3,3-tetrametyloguanidynę (0,78 mmol). Reakcję mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przebieg reakcji kontrolowano za pomocą analizy TLC (dichlorometan/metanol 95/5 v/v). Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (DCM/MeOH; 0-5% MeOH), otrzymując czysty produkt z wydajnością 30%.
Przykład 11
Usuwanie znacznika z 5’-[6-(2-pirydyn-2-yl-winylo)-pirydyn-2-yl)-aminoetyloksykarbonylo-N2-izobutyryloguanozyny
Otrzymaną według metody opisanej w przykładzie 7 znakowaną N2-isobutyryloguanozynę rozpuszczono w buforze fosforanowym pH 6,86, w 5 porcjach po 1 mg i umieszczono w zamkniętych fiolkach. Następnie, wytrząsając prowadzono ogrzewanie każdej z nich w następujących temperaturach 30, 40, 50, 60 i 70°C i stałym czasie 2 godzin. Po zakończeniu ogrzewania i szybkim schłodzeniu (w suchym lodzie) pobrano próbki i poddano je analizie za pomocą zestawu HPLC wyposażonego w detektor DAD (diodowy w zakresie 220-700 nm) oraz detektor FLD (λabs. = 370 nm, λem = 476 nm), stosując kolumnę Synergy Fusion - RP 80 A (wraz z prekolumną firmy Phenomenex), o wymiarach 150 χ 4,6 mm, stosując metodę gradientową: bufor A (0,01 M octan trietyloamoniowy)/ bufor B (0,01 M octan trietyloamoniowy w 40% acetonitrylu), szybkość przepływu 1 ml/min, czas trwania analizy 30 min. Kinetykę usuwania barwnika przedstawiono na wykresie: szybkość zaniku formy znakowanej w zależności od temperatury - figura 3. Całkowite usunięcie znacznika obserwuje się w temperaturze 70°C.
Przykład 12
Przekształcenie 2-(pirydyno-2-yl)winylo]pirydynowych aminoalkoholi w formę amidofosforanową Związek 3( E )-2-(metylo{6-[2-(pirydyn-2-yl)winylo]pirydyn-2-yl}amino)etan-1-ol (80 mg; 0,313 mmola) zliofilizowano z benzenu, a następnie suszono pod próżnią wytworzoną przez pompę olejową przez okres 12 h. Następnie związek umieszczono w niewielkiej kolbie okrągłodennej przedmuchanej argonem i zabezpieczonej septą. Do kolby dodano 1 ml bezwodnego dichlorometanu, otrzymując klar owny roztwór barwy żółtej. Dodano w jednej porcji 40,9 μl (0,235 mmola) N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA), a następnie roztwór schłodzono do temp. ok . -5°C. Do klarownego roztworu dodano 41,75 mg (0,156 mmola) N,N,N, N-tetraizopropylodiamidochlorofosforynu. W momencie gdy analiza TLC w układzie rozwijającym: heksan/dichlorometan/trójetyloamina; v/v/v/; 6/3/1; wykazała połowiczny zanik substratu dodano 15 mg (0,078 mmola) 5-benzylmerkaptotetrazolu (BMT) do całkowitego zaniku substratu. Roztwór odparowano na wyparce obrotowej, a produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy); stosując elucję gradientową w układzie dichlorometan/heksan/trójetyloamina; v/v/v; od 1/8/1 do 2/7/1. Połączone frakcje produktu odparowano na wyparce obrotowej i zliofilizowano z benzenu. Otrzymano w ten sposób 30 mg bis[2-(metylo{6-[2-(pirydyno-2-ylo)winylo]pirydyn-2-ylo]aminoetylo) N,N-diizopropyloamidofosforynu w postaci żółtego oleju; z wydajnością 30%.
Produkt scharakteryzowano przy użyciu spektroskopii 31P NMR:
31P NMR (400 MHz; benzen): 146,46 (s).
Przykład 13
Przekształcenie 2-(pirydyno-2-yl)winylo]pirydynowych aminoalkoholi w formę amidofosforanową (E)-2-(metylo{6-[2-(pirydyn-2-yl)winylo]pirydyn-2-yl}amino)etan-1-ol (80 mg; 0,313 mmola) zliofilizowano z benzenu, a następnie suszono pod próżnią wytworzoną przez pompę olejową przez okres 12 h. Następnie związek ten umieszczono w niewielkiej kolbie okrągłodennej przedmuchanej argonem i zabezpieczonej gumowym kapslem. Do kolby dodano 1 ml bezwodnego dichlorometanu, otrzymując klarowny bezbarwny roztwór. Następnie dodano w jednej porcji 58,56 μl (0,177 mmola) (2-cyjanoetyloN,N,N’, N’-bis(diizopropylodiamido)-fosforynu i pozostawiono otrzymany roztwór na okres 5 minut. Do klarownego roztworu przez okres 1 h dodawano porcjami po około 4,8 mg 5-benzylo-merkaptotetrazolu (BMT) (0,128 mmola, 23,7 mg). Otrzymany roztwór pozostawiono w temperaturze pokojowej na okres 1 h. Następnie do roztworu dodano w jednej porcji 70 μl N,N-diizopropyloaminy (DIPA), a całość odpa
PL 241 227 B1 rowano na wyparce obrotowej. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy); stosując elucję gradientową w układzie dichlorometan : heksan : trójetyloamina; v : v : v; 1 : 8 : 1 do 4 : 5 : 1. Połączone frakcje produktu odparowano na wyparce obrotowej, a pozostałość bezzwłocznie zliofilizowano z benzenu. Otrzymano w ten sposób ok. 25 mg 2-metylo{6-[2-(pirydyno-2-ylo)winylo-pirydyn-2-ylo)aminoetylo]-2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamidofosforynu w postaci sypkiego proszku.
Produkt scharakteryzowano przy użyciu analizy 31P NMR:
31P NMR (400 MHz; benzen-d6): 146,46 (s).
Przykład 14
Znakowanie oligomeru
Przeprowadzono syntezę 12-merowego oligomeru o sekwencji 5’-TTT TTT TTT TTT-3’ na fazie stałej, stosując podłoże krzemianowe Q-dT (Glen Research) oraz komercyjny amidofosforyn tymidyny. Syntezę prowadzono wykorzystując automatyczny syntetyzer DNA, powtarzając cyklicznie dla każdego przyłączanego nukleotydu 4 etapy (detrytylacja, kondensacja, kappowanie, utlenianie). W tym celu kolumienkę ze stałym złożem Q-dT napełniano roztworami, dla każdego etapu stosując następujące warunki:
1. detrytylacja: 3% roztwór kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, czas reakcji 2 minuty;
2. kondensacja: 0,1 molowy roztwór amidofosforynu dT w acetonitrylu zmieszany w równych proporcjach z 0,1 molowym roztworem 5-benzylo-merkaptotetrazolu (BMT), czas reakcji 3 minuty;
3. kappowanie: mieszanina dwóch roztworów (A i B) o równych proporcjach, czas reakcji 1 minuta. Roztwór A - 10% roztwór 1- N-metyloimidazolu w tetrahydrofuranie. Roztwór B - 10% roztwór bezwodnika octowego w bezwodnym tetrahydrofuranie;
4. utlenienie: 0,05 molowy roztwór jodu w uwodnionej pirydynie, czas reakcji 1 minuta.
Po każdym takim etapie kolumienkę przepłukuje się bezwodnym acetonitrylem i przedmuchuje suchym argonem. Po przyłączeniu ostatniego oligonukloetydu usunięto ostatnią grupę dimetoksytrytylową (etap detrytylacji) i przeprowadzono etap kondensacji, stosując mieszaninę roztworu amidofosforynu barwnika (amidofosforyn barwnika (12 mg) rozpuszczony w 200 μl suchego ACN) oraz 0,1 molowego roztworu BMT w równych proporcjach. Czas reakcji to 10 minut. Następnie przeprowadzono etap utleniania jw.
Po jego zakończeniu i przepłukaniu kolumny acetonitrylem i przedmuchaniu suchym argonem podłoże umieszczono na 2 minuty w stężonym roztworze amoniaku w temperaturze 22°C. Następnie z roztworu usunięto podłoże krzemianowe przez dekantację, a znakowany oligomer rozpuszczony w amoniaku naniesiono na górę kolumienki LGC MicroPure II. Następnie przeprowadzono przemywanie kolumienki następującymi mieszaninami, każdorazowo zbierając wymyte frakcje do osobnych probówek:
1. 97% 1 M TEAA + 3% MeCN v/v,
2. ultraczysta woda o przewodności równej 18,2 ΜΩ cm w 25°C (tzw. H2O MiliQ),
3. 20% roztwór acetonitrylu w wodzie MiliQ.
Spektrofotometrycznie stwierdzono obecność znakowanego oligonukleotydu we frakcji wymytej za pomocą H2O MiliQ (w ilości 14 jednostek optycznych OD). Oligonukleotyd odparowano nie stosując grzania i poddano dalszej analizie.
Przykład 15
Oczyszczanie znakowanego oligomeru na HPLC
Przygotowanie analitu: znakowany oligonukleotyd (0,4 OD) rozpuszczono w 500 μl wody MiliQ, wymieszano na Vortexie i odwirowano. Wykonano kolejno pomiar OD przy długości fali 260 nm, na podstawie którego wyznaczono objętość nastrzyku na kolumnę chromatograficzną.
(OD260 - 0,528, Objętość analitu - 100 μl).
Warunki analizy:
kolumna Synergy Fusion - RP 80 A Phenomenex, 150 χ 4,6 mm z prekolumną metoda gradientowa czas trwania 30 min:
- szybkość przepływu 1 ml/min,
- analiza w gradiencie bufor A (0,01 M octan trietyloamoniowy)/ bufor B (0,01 M octan trietyloamoniowy w 40% acetonitrylu),
- Detektor DAD diodowy 220-700 nm,
- Detektor FLD (λabs. = 370 nm, λem = 476 nm).
Claims (12)
- PL 241 227 Β1Znakowany oligomer 1, oczyszczony za pomocą chromatografii wysokociśnieniowej HPLC w wyżej wymienionych warunkach, odparowano, a następnie odparowano jeszcze 3-krotnie z wody MiliQ (by pozbyć się resztek buforu TEAA) i zliofilizowano. Otrzymany analit poddano analizie MALDI.Wartość masy obliczona teoretycznie: 3904,6258 g/mol.Obserwowana masa znakowanego oligonukleotydu: m/z 3905, 561 Da.Przykład 16Usuwanie barwnika z oligomeruW celu usunięcia znacznika z oligonukleotydu, znakowany oligonukleotyd (w ilości 10 OD) rozpuszczono w 1000 μΙ wody MiliO, wymieszano na Vortexie i odwirowano. Wykonano kolejno pomiar OD przy długości fali 260 nm i na tej podstawie którego wyznaczono objętość roztworu zawierającego 6 OD oligomeru. Roztwór umieszczono w naczyniu z gwintowaną nakrętką i ogrzewano przez 4 godziny w temperaturze 90°C. Co godzinę pobierano z mieszaniny próbkę, która zawierała około 1 OD oligomeru, po ochłodzeniu (suchy lód) każdą z nich poddano analizie za pomocą zestawu HPLC wyposażonego w detektor DAD (diodowy w zakresie 220-700 nm) oraz detektor FLD (kabs. = 370 nm, kem = 476 nm), stosując kolumnę Synergy Fusion - RP 80 A (wraz z prekolumną firmy Phenomenex), o wymiarach 150 χ 4,6 mm, stosując metodę gradientową: bufor A (0,01 M octan trietyloamoniowy)/ bufor B (0,01 M octan trietyloamoniowy w 40% acetonitrylu), szybkość przepływu 1 ml/min, czas trwania analizy 30 min. Wyniki analiz usuwania barwnika przedstawiono na chromatogramach RPHPLC.I tak:• na figurze 5 przedstawiono chromatogramy oligomeru nieogrzewanego oraz ogrzewanego przez 2 i 4 godziny, zarejestrowane z wykorzystaniem detektora DAD, • na figurze 6 przedstawiono chromatogramy oligomeru nieogrzewanego oraz ogrzewanego przez 2 i 4 godziny, zarejestrowane z wykorzystaniem detektora fluorescencyjnego przy wzbudzeniu 370 i emisji 480.Tabela 1Czas retencji poszczególnych związków na kolumnie Synergy Fusion - RP 80 A podczas analizy z użyciem zestawu HPLC wykonanej w powyżej opisanych warunkach dla analizowanych związków rodzaj substancji Czas retencji [minjZnakowany oligonukleotyd 14,49Oligonukleotyd bez barwnika 12,57Cykliczna forma barwnika 22,64-24,52Zastrzeżenia patentowe1. Znaczniki fluorescencyjne na bazie prekursorów o wzorach ogólnych 1,2 lub 31)P-N / 'R?(3)PL 241 227 Β1 w których A oznacza grupę o wzorze ogólnym 4 lub 5(4)(5) w których:- n przyjmuje wartość 1 lub 2, _ „jvw” oznacza wiązanie pomiędzy tlenem grupy A a atomem węgla prekursora o wzorze ogólnym 1 lub tlenem grupy A a atomem fosforu prekursora o wzorze ogólnym 2 lub 3,Ri oznacza:wodór, metyl, grupę aminową, grupę karbonylową, naftyl, naftylometyl, fenyl, benzyl, chinolinometyl, benzyl podstawiony jednym lub kilkoma takimi samymi lub różnymi podstawnikami: chlorem, fluorem, metylem, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla podstawiony fenylem, grupą aminową, grupą hydroksylową lub równocześnie fenylem i grupą hydroksylową lub fenylem i grupą aminową,R2 oznacza: wodór, metyl, benzyl, fenyl, naftyl, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne,R3 są takie same lub różne i oznaczają wodór, metyl, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne, grupę aminową, grupę nitrową, grupę azydkową, grupę o wzorze ogólnym 6 n'n(6)- R4 oznacza azot,- Rs i Re są takie same lub różne i oznaczają wodór, metyl, benzyl, fenyl, naftyl, halogen (F, Cl, Br, I), hydroksyl, grupę aminową, grupę nitrową, grupę karboksylową, nasycony alkil zawierający 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne, nienasycony alkil zawierający 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne podstawiony fenylem,- R7 oznacza izo-propyl.
- 2. Sposób znakowania nukleozydów, nukleotydów lub oligonukleotydów barwnikami fluorescencyjnymi znamienny tym, że do nukleozydów, nukleotydów lub oligonukleotydów przyłącza się prekursory o wzorach ogólnych 1,2 lub 3OII / A-C-N (1)PL 241 227 Β1A \ 37P-N,A R7P-N / O Ry (3) w których A oznacza grupę o wzorze 4 lub 5w których:- n przyjmuje wartość 1 lub 2, _ „jww” oznacza wiązanie pomiędzy tlenem grupy A a atomem węgla prekursora o wzorze ogólnym 1 lub tlenem grupy A a atomem fosforem prekursora o wzorze ogólnym 2 lub 3,- Ri oznacza:o wodór, metyl, grupę aminową, grupę karbonylową, naftyl, naftylometyl, fenyl, benzyl, chinolinometyl, o benzyl podstawiony jednym lub kilkoma takimi samymi lub różnymi podstawnikami: chlorem, fluorem, metylem, o nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla podstawiony fenylem, grupą aminową, grupą hydroksylową lub równocześnie fenylem i grupą hydroksylową lub fenylem i grupą aminową,- R2 oznacza: wodór, metyl, benzyl, fenyl, naftyl, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne,- R3 są takie same lub różne i oznaczają wodór, metyl, nasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne, grupę aminową, grupę nitrową, grupę azydkową, grupę o wzorze ogólnym 6- R4 oznacza azot,- Rs i Re są takie same lub różne i oznaczają wodór, metyl, benzyl, fenyl, naftyl, halogen (F, Cl, Br, I), hydroksyl, grupę aminową, grupę nitrową, grupę karboksylową, nasycony alkil zawierający 2 do 8 atomów węgla, nienasycony alkil zawierający od 2 do 8 atomów węglaPL 241 227 Β1 oraz jedno wiązanie podwójne, nienasycony alkil zawierający 2 do 8 atomów węgla oraz jedno wiązanie podwójne podstawiony fenylem,- R? oznacza izo-propyl, przy czym w celu przyłączenia tych znaczników w pierwszy etapie związki o wzorach ogólnych 7 lub 8w których n, Ri, R2, R3, R4, Rs i Re mają wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji chemicznej z karbodiimidazolem lub z (2-cyjanoctylo)-A/,A/,A/’,A/-bis(diizopropyloamido)fosforynem lub z A/,A/,A/’,A/-tetraizopropylodiamidochlorofosforynem, a następnie uzyskany prekursor poddaje się reakcji z wolną pierwszorzędową grupą hydroksylową lub aminową nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu.
- 3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że w pierwszym etapie przeprowadza się reakcję pomiędzy związkiem 7 lub 8 a karbodiimidazolem w bezwodnym polarnym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu lub tetrahydrofuranie w atmosferze gazu obojętnego, korzystnie argonu, przy czym reakcję prowadzi się w temperaturze nie wyższej niż 30°C.
- 4. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że stosunek molowy związku o wzorze ogólnym 7 lub 8 do karbodimidazolu wynosi w przedziale od 1 :1 do 1 :1,5, korzystnie w stosunku molowym 1 :1,3.
- 5. Sposób według zastrz. 2 albo 3, albo 4 znamienny tym, że po zakończeniu pierwszego etapu do mieszany reakcyjnej dodaje się nukleozyd, nukleotyd lub oligonukleotyd w stosunku molowym w przedziale od 1 :1 do 1 :2, korzystnie w stosunku 1 :1,5 molowym do związku o wzorze ogólnym 1, przy czym reakcję prowadzi się z dodatkiem nienukleofilowej zasady organicznej z grupy imin, pochodnych guanidyny, korzystnie tetrametyloguanidyny w stosunku molowym do nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu w przedziale od 0,3:1 do 7,8:1 mola, korzystnie 3,5 :1 mola, w temperaturze nie wyższej niż 30°C.
- 6. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że w przypadku prekursorów o wzorze ogólnym 2, w pierwszym etapie przeprowadza się reakcję pomiędzy związkiem 7 lub 8 a Ν,Ν,Ν’,Ν-tetraizopropylodiamidochlorofosforynem w bezwodnym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu lub chlorku metylenu, w atmosferze gazu obojętnego, korzystnie argonu w obecności bezwodnej trzeciorzędowej aminy alifatycznej, korzystnie diizopropyloetyloaminy, przy czym reakcję prowadzi się w temperaturze nie wyższej niż 30°C.
- 7. Sposób według zastrz. 6 znamienny tym, że A/,A/,A/’,A/-tetraizopropylodiamidochlorofosforynem stosuje się w stosunku molowym od 0,8 :1 do 1,1 :1, korzystnie w stosunku molowym 1 :1 do związku o wzorze ogólnym 7 lub 8.
- 8. Sposób według zastrz. 6 lub 7 znamienny tym, że po zaniku substratu, w drugim etapie dodaje się taką samą ilość barwnika fluorescencyjnego według wzoru 7 lub 8, jaką dodano w pierwszym etapie, oraz pochodną 1-/-/-tetrazolu, korzystnie 5-benzylo-mercaptotetrazol w stosunku molowym do barwnika fluorescencyjnego o wzorze ogólnym 7 lub 8 dodanego w drugim etapie reakcji od 0,2 :1 do 0,8 :1, korzystnie w stosunku molowym 0,5:1.
- 9. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że w przypadku prekursorów o wzorze ogólnym 3, w pierwszym etapie przeprowadza się reakcję pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 7 lub 8PL 241 227 B1 a (2-cyjanoetylo)-N,N,N’, N'-bis(diizopropylodiamido)fosforynem w bezwodnym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu lub chlorku metylenu, w atmosferze gazu obojętnego, korzystnie argonu, przy czym reakcję prowadzi się w temperaturze nie wyższej niż 30°C.
- 10. Sposób według zastrz. 8 znamienny tym, że (2-cyjanoetylo)-N,N,N’,N’-bis(diizopropylodiamido)fosforynu stosuje się w stosunku molowym do zastosowanego barwnika fluorescencyjnego o wzorze ogólnym 7 lub 8 w przedziale od 0,8 : 1 do 1,1 : 1, korzystnie 1 : 1.
- 11. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że przeprowadza się reakcję pomiędzy prekursorem o wzorze ogólnym 2 a nukleozydem lub nukleotydem, lub oligonukleotydem posiadającym wolną grupę hydroksylową lub aminową, w bezwodnym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu, chlorku metylenu lub toluenie w obecności pochodnej 1- H-tetrazolu, korzystnie 5-benzylo-merkaptotetrazolu w stosunku molowym nie mniejszym niż 1 : 1 do prekursora o wzorze ogólnym 2, a następnie po zakończeniu reakcji przyłączenia prekursora o wzorze ogólnym 2 do grupy hydroksylowej nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu przeprowadza się reakcję utleniania atomów fosforu z III do V stopnia utlenienia za pomocą czynnika utleniającego, korzystnie roztworu jodu w uwodnionej pirydynie.
- 12. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że proporcja molowa mieszaniny amidofosforynu z pochodną 1-H-tetrazolu, korzystnie 5-benzylo-merkaptotetrazolu, w stosunku do nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu dla reakcji prowadzonych w fazie ciekłej wynosi odpowiednio 2 : 1.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL428084A PL241227B1 (pl) | 2018-12-06 | 2018-12-06 | Znaczniki fluorescencyjne, sposób znakowania i sposób ich usuwania |
| US17/311,678 US20220025432A1 (en) | 2018-12-06 | 2019-12-03 | Method for fluorescence labeling of biological materials, thermally removable fluorescent labels for this method, and methods of their preparation and use |
| PCT/PL2019/000116 WO2020117079A1 (en) | 2018-12-06 | 2019-12-03 | Method for fluorescence labeling of biological materials, thermally removable fluorescent labels for this method, and methods of their preparation and use |
| EP19850823.6A EP3891225A1 (en) | 2018-12-06 | 2019-12-03 | Method for fluorescence labeling of biological materials, thermally removable fluorescent labels for this method, and methods of their preparation and use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL428084A PL241227B1 (pl) | 2018-12-06 | 2018-12-06 | Znaczniki fluorescencyjne, sposób znakowania i sposób ich usuwania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL428084A1 PL428084A1 (pl) | 2020-06-15 |
| PL241227B1 true PL241227B1 (pl) | 2022-08-22 |
Family
ID=71086897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL428084A PL241227B1 (pl) | 2018-12-06 | 2018-12-06 | Znaczniki fluorescencyjne, sposób znakowania i sposób ich usuwania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL241227B1 (pl) |
-
2018
- 2018-12-06 PL PL428084A patent/PL241227B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL428084A1 (pl) | 2020-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Telser et al. | Synthesis and characterization of DNA oligomers and duplexes containing covalently attached molecular labels: comparison of biotin, fluorescein, and pyrene labels by thermodynamic and optical spectroscopic measurements | |
| CN101312941B (zh) | 多核苷酸标记试剂 | |
| KR0156095B1 (ko) | 적외선 염료로 표지화된 포스포르아미다이트 및 그의 핵산검출에 있어서의 사용방법 | |
| ES2511991T5 (es) | Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energía donador-aceptor | |
| US6027709A (en) | Fluorescent cyanine dyes | |
| JP4843044B2 (ja) | 非蛍光性エネルギー移動 | |
| CN109790196B (zh) | 可逆封闭的核苷类似物及其用途 | |
| WO2019105421A1 (zh) | 核苷类似物、制备方法及应用 | |
| EP2130835A1 (en) | Compound having structure derived from mononucleoside or mononucleotide, nucleic acid, labeling substance, and method and kit for detection of nucleic acid | |
| JP2001512131A (ja) | 塩基アナログ | |
| JP2003516163A (ja) | 蛍光消光検出試薬及び方法 | |
| CA2581639C (en) | Luminescent lanthanide complexes | |
| JP4801445B2 (ja) | 生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット | |
| JP2007516695A (ja) | ユニバーサル塩基アナログを含む組合せ核酸塩基オリゴマーならびにこれらを作製する方法および使用する方法 | |
| EA032482B1 (ru) | Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени | |
| KR101427354B1 (ko) | 생체분자용 표지색소 및 표지키트와 생체분자의 검출방법 | |
| ES2621507T3 (es) | Nuevos complejos a base de iridio para EQL | |
| CA2412292A1 (en) | Base analogues | |
| EP1152010B1 (en) | Oligonucleotide labeling reactants and their use | |
| PL241227B1 (pl) | Znaczniki fluorescencyjne, sposób znakowania i sposób ich usuwania | |
| CN116284185A (zh) | 核苷酸类似物及其在测序中的应用 | |
| WO2020117079A1 (en) | Method for fluorescence labeling of biological materials, thermally removable fluorescent labels for this method, and methods of their preparation and use | |
| JP6814139B2 (ja) | クマリン系化合物及び関連する方法 | |
| US9458515B2 (en) | RNA including nucleoside compound, method for regulating amount of protein produced from the RNA, and nucleoside compound | |
| JP5582558B2 (ja) | 新規プリンヌクレオシド化合物、その異性化方法および光特性を変化させる方法、ならびに光スイッチング型デバイス材料 |