PL242163B1

PL242163B1 - Element do wykonania zastawki serca oraz sposób wytwarzania zmodyfikowanej bakteryjnej celulozy do wytwarzania tego elementu

Info

Publication number: PL242163B1
Application number: PL427652A
Authority: PL
Inventors: Piotr Siondalski; Magdalena KOŁACZKOWSKA; Magdalena Kołaczkowska; Waldemar WILANDT; Waldemar Wilandt; Dariusz BOBIŃSKI; Dariusz Bobiński; Aldona Długa; Kinga Dawidowska; Michał Ditrich; Leszek Wilczyński; Hanna Staroszczyk; Paulina DEDERKO; Paulina Dederko; Edyta Malinowska-Pańczyk; Agata SOMMER; Agata Sommer; Izabela SINKIEWICZ; Izabela Sinkiewicz; Ilona KOŁODZIEJSKA
Original assignee: Bowil Biotech Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia; Centrum Techniki Okretowej Spolka Akcyjna; Fund Rozwoju Kardiochirurgii Im Profesora Zbigniewa Religi; Gdanski Univ Medyczny; Politechnika Gdanska; Univ Gdanski
Priority date: 2018-11-05
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2023-01-23
Also published as: PL427652A1; WO2020096469A1; US20220001078A1; EP3876869B1; EP3876869A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest układ elementu do wykonania zastawki serca, sposób wytwarzania zmodyfikowanej bakteryjnej celulozy (BC) z wykorzystaniem szczepu Gluconacetobacter xylinus do wytwarzania elementu do wykonania zastawki serca, zestaw do wszczepiania oraz zastosowanie elementu do użycia w kardiochirurgii.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest element do wykonania zastawki serca oraz sposób wytwarzania zmodyfikowanej bakteryjnej celulozy z wykorzystaniem szczepu Gluconacetobacter xylinus do wytwarzania tego elementu.

Protezy zastawek serca mogą być wykonane z materiałów sztucznych - nazwane są wówczas protezami mechanicznymi oraz z materiałów biologicznych - nazywane są wówczas protezami biologicznymi.

Dla chorych z wadami zastawkowymi serca, u których wykorzystano wszystkie metody leczenia zachowawczego, jedynym sposobem terapii jest wszczepienie protezy zastawki serca.

Problemy jakie są związane z implantacją tych protez, to przede wszystkim: degeneracja protezy biologicznej i wykrzepianie na protezie mechanicznej. Zastawka zbudowana z BC stanowi rozwiązanie tych problemów, bo jak dowodzą przeprowadzone badania, na jej powierzchni nie dochodzi do wykrzepiania oraz materiał ten, charakteryzuje się dużą wytrzymałością w porównaniu do naturalnych tkanek.

Protezy dostępne obecnie na rynku są bardzo drogie, co za tym idzie wybór uzależniony jest nie tylko od wartości biologicznych, ale także od kosztów związanych z implantacją różnych protez. Proponowane przez nas rozwiązanie daje lekarzowi i pacjentowi możliwość zastosowania taniego, bezpiecznego leczenia.

Obecnie znane i stosowane zastawki posiadają wiele wad. Wymagają dodatkowego leczenia np. przeciwkrzepliwego, ulegają degeneracji i dlatego poszukuje się nowego materiału.

Z opisów wynalazków znany jest m.in. elastyczny stent biologicznie zespolonych zastawek serca umożliwiający jednoczasową implantację biologicznej protezy zastawek aortalnej i mitralnej - PL 180925 B. Z europejskiego opisu wynalazku EP 1083845 B znana jest, ulepszona, trójlistkowa, mechaniczna zastawka serca, gdzie obudowa zastawki ma mechanizm przegubowy co umożliwia obracanie listków i ich podtrzymywanie. Z innego opisu wynalazku PL 229562 B znana jest mechaniczna zastawka serca trójpłatkowa.

Przydatność bakteryjnej celulozy (BC) w gojeniu różnego rodzaju ran udowodniono już w latach dziewięćdziesiątych. W odniesieniu do opatrunków i zastosowań powierzchniowych BC jest materiałem nietoksycznym, niedrażniącym, hypoalergicznym, niepirogennym i biokompatybilnym.

Materiałem do produkcji trwałych, wewnętrznych implantów (protez naczyniowych i protez zastawek serca), stosowanych szczególnie w chirurgii naczyniowej oraz kardiochirurgii może być BC.

Bakteryjna celuloza jest materiałem nietoksycznym, niedrażniącym, hipoalergicznym, niepirogennym i biokompatybilnym. Charakteryzuje się ponadto dużą wytrzymałością mechaniczną.

Podejmowane są liczne próby zastąpienia obecnie stosowanych implantów sercowo-naczyniowych, z materiałów odzwierzęcych oraz sztucznych, protezami błon BC.

Walorem BC jest jej nieprzepuszczalność nawet dla najmniejszych elementów komórkowych krwi (średnica trombocytów osiąga wartości 1000-2000 nm, a wielkość otworów w siatce włókien biocelulozy kształtuje się od 20-100 nm). Powierzchnia BC jest zatem zupełnie gładka dla krwi co zmniejsza prawdopodobieństwo wytworzenia skrzeplin. Ta własność powinna też powodować brak możliwości przerastania BC przez własne komórki organizmu gospodarza.

Dotychczas opisano wynalazki sposobu modyfikacji in situ BC, polegającej na stosowaniu chemicznych dodatków do podłoża hodowlanego. W biomedycynie wynalazki te stosowane są najczęściej jako materiał opatrunkowy nowej generacji szczególnie do trudno gojących się ran oraz jako materiał zastępujący naturalne tkanki, m.in. tkankę chrzęstną.

Z opisu patentu PL 190961 B1 znany jest sposób otrzymywania modyfikowanej błony BC, poprzez dodanie do podłoża hodowlanego poliaminosacharydów, szczególnie chitozanu, w postaci mikrokrystalicznej, o średnim ciężarze cząsteczkowym 20-500 kDa i stopniu deacetylacji 70-95%, w ilości 0,1-30 części wagowych. Otrzymane według wynalazku błony BC mają w łańcuchu glukozaminy, utworzone w wyniku degradacji poliaminosacharydów lub ich pochodnych. Otrzymany w ten sposób materiał kompozytowy charakteryzuje się pożądaną dla zastosowań biomedycznych bioaktywnością oraz biozgodnością i jest biodegradowalny.

W opisie patentowym EP 346507 A, ujawniono sposób wytwarzania modyfikowanej BC, poprzez zastosowanie dodatku do podłoża hodowlanego w postaci karboksymetylocelulozy (CMC), użytej w ilości 0,1% - 5% w/v. Wytworzone w obecności CMC błony BC charakteryzują się większą suchą i mokrą masą oraz zwiększoną chłonnością wody w porównaniu do błon BC syntetyzowanych bez dodatku CMC.

W patencie PL 214844 B1 przedstawiono sposób modyfikacji błon BC polegający na wzbogaceniu podłoża hodowlanego 0,25-1% CMC, a następnie, po zakończeniu hodowli, utlenieniu błon 1% roztworem nadjodanu sodu w temperaturze 22°C przez 2 godziny. Otrzymane błony charakteryzują się zwiększoną wodochłonnością oraz większą zdolnością zatrzymywania wody, w efekcie czego powstaje grubszy, lepiej uwodniony materiał.

Z opisu patentowego US 2009/0220560 A1 znany jest opatrunek otrzymany z BC, powlekany nanosrebrem, który nadaje polimerowi właściwości przeciwbakteryjne. Wynalazek ujawnia wytwarzanie włókien celulozowych z zastosowaniem szczepu Acetobacter xylinum BPR 2001. Włókna celulozowe po oczyszczeniu poddawane są działaniu, kolejno, 0,16 M nadjodanu sodu, 1% aminotiomocznika w kwasie octowym, 1% proteinianu srebra w 2% boranie sodu i soli srebra w wodzie amoniakalnej o temperaturze 95°C. Powstające w efekcie szeregu reakcji cząsteczki nanosrebra pokrywają włókna BC.

W opisie patentu PL 216702 B1 ujawniony został sposób wytwarzania biomateriału o właściwościach chrząstki przy użyciu BC wytworzonej w hodowli bakterii G. xylinus na podłożu stacjonarnym. Po wyprodukowaniu i oczyszczaniu błonę BC modeluje się w konstrukcję przestrzenną o żądanym kształcie i poddaje modyfikacji polegającej na działaniu 30% wodnym roztworem ługu sodowego, płukaniu w wodzie destylowanej, działaniu 10% wodnym roztworem kwasu octowego i powtórnym płukaniu w wodzie destylowanej, aż do uzyskania przez materiał celulozowy pH 5,6 - 6,8. Otrzymany w ten sposób materiał ma bardzo dużą wytrzymałość mechaniczną, odpowiadającą naturalnej tkance chrzęstnej, jest biokompatybilny z organizmem człowieka oraz niealergizujący.

Dla zastosowań w kardiochirurgii i chirurgii naczyniowej, wytworzone w opisany powyżej sposób materiały są nieodpowiednie, ponieważ mogą charakteryzować się zmniejszoną biozgodnością z organizmem człowieka, niewłaściwymi właściwościami mechanicznymi, nieodpowiednią morfologią oraz przyspieszoną biodegradowalnością.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowej zastawki serca oraz nowego sposobu modyfikacji BC jako materiału, z którego wykonana jest zastawka.

Przedmiotem wynalazku jest element do wykonania zastawki serca składający się z płaskiego arkusza bakteryjnej celulozy (BC) o trzech osiach symetrii, który ma centralnie położony otwór o trzech równych bokach tworzących figurę o symetrii trójkąta równobocznego, charakteryzujący się tym, że - krawędzie centralnie położonego otworu stanowią wewnętrzne boki pierwszych obszarów elementu (I), - pierwsze obszary elementu (I) są w kształcie czworoboku,

- pomiędzy pierwszymi obszarami elementu (I) znajdują się, bezpośrednio do nich przylegające, drugie obszary elementu (II),

- drugie obszary elementu (II) są wycinkami koła o kątach środkowych (β), których miara wynosi od 2π/3 do 5π/6 i promieniach równych długości krawędzi drugich boków (H) pierwszych obszarów elementu (I), - długość zewnętrznych boków (H) pierwszych obszarów elementu (I) jest co najmniej równa długości pierwszych, wewnętrznych boków (A) pierwszych obszarów elementu (I),

- stosunek długości promienia (R) okręgu o środku pokrywającym się ze środkiem symetrii (O) centralnie położonego otworu i stycznego do zewnętrznych boków (A’) pierwszych obszarów elementu (I), w połowie ich długości, do długości drugich boków (H) pierwszych obszarów elementu (I) wynosi od 2π/9 do 5π/6,

- stosunek długości pierwszych wewnętrznych boków (A) pierwszych obszarów elementu (I) do drugich boków (H) pierwszych obszarów elementu (I) wynosi od π/3 do 2π/3.

Element według wynalazku korzystnie jest figurą dwuspójną. W elemencie według wynalazku osie symetrii przecinają się w jednym punkcie. W elemencie według wynalazku osie symetrii elementu i otworu pokrywają się.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania zmodyfikowanej bakteryjnej celulozy (BC) z wykorzystaniem szczepu G. xylinus do wytwarzania elementu zdefiniowanego powyżej, polegający na tym, że:

- wysterylizowane błony bakteryjnej celulozy układa się na płaskiej powierzchni i suszy się do stałej masy w temperaturze pokojowej, nie wyższej niż 25°C,

- sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 20 min.,

- otrzymaną BC przechowuje się w jałowych warunkach.

Sposób gdzie wysuszone BC poddaje się naświetlaniu promieniowaniem UV-C z zastosowaniem lamp o łącznej mocy 12 W i maksimum emisji przy 254 nm, przez czas 30 min, z zachowaniem jałowości.

Sposób gdzie wysuszone BC namacza się w jałowej wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej przez czas do 120 min i przechowuje się w warunkach chłodniczych z zachowaniem jałowości.

Sposób gdzie po naświetlaniu namacza się w jałowej wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej przez czas do 120 min i przechowuje w warunkach chłodniczych z zachowaniem jałowości.

Sposób modyfikacji błony bakteryjnej celulozy (BC) w celu zastosowania jej jako materiału do produkcji bioprotez w układzie krążenia, otrzymywanych podczas stacjonarnej hodowli z wykorzystaniem szczepu G. xylinus charakteryzuje się, według wynalazku tym, że sterylne błony BC suszy się do osiągnięcia stałej masy w temperaturze pokojowej, nie wyższej niż 25°C, a następnie namacza w jałowej wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej przez czas nieprzekraczający 120 min i przechowuje z zachowaniem jałowych warunków.

W jednej odmianie sposobu według wynalazku jest błona BC suszona do osiągnięcia stałej masy w temperaturze pokojowej, nie wyższej niż 25°C, a następnie poddawana naświetlaniu promieniowaniem UV-C o łącznej mocy 12 W i maksimum emisji 254 nm przez czas nieprzekraczający 30 minut. Po naświetlaniu błony są namaczane w jałowej wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej przez czas nieprzekraczający 120 min i przechowywane z zachowaniem jałowych warunków.

Dzięki wykorzystaniu sposobu modyfikacji według wynalazku możliwe jest otrzymanie biozgodnego materiału o właściwościach porównywalnych z naturalnymi tkankami budującymi ściany naczyń krwionośnych lub zastawki, znajdującego zastosowanie w kardiochirurgii i chirurgii naczyniowej do produkcji bioimplantów. W przeciwieństwie do błon niemodyfikowanych, zmodyfikowany według wynalazku materiał charakteryzuje się zbliżoną do naturalnych tkanek zawartością wody, oraz znacznie większą wytrzymałością mechaniczną. Otrzymany według wynalazku materiał ma także zwiększoną odporność na procesy degradacyjne w organizmie człowieka.

Element do wykonania zastawki serca wykonany jest z jednego arkusza materiału biozgodnego, korzystnie z polimeru, korzystnie z BC i stanowi figurę płaską, korzystnie dwuspójną, korzystnie o trzech osiach symetrii przecinających się w jednym punkcie, z centralnie wykonanym otworem o trzech równych bokach, niekoniecznie prostoliniowych, tworzących figurę o symetrii analogicznej z trójkątem równobocznym. Osie symetrii elementu i otworu pokrywają się. Krawędzie otworu stanowią pierwsze, wewnętrzne boki pierwszych obszarów elementu, przy czym pierwsze obszary elementu są zasadniczo w kształcie czworoboku. Pomiędzy pierwszymi obszarami elementu znajdują się, bezpośrednio do nich przylegające, drugie obszary elementu, których zewnętrzne krawędzie korzystnie są wypukłe zaokrąglone. Drugie boki pierwszych obszarów są zasadniczo prostopadłe do pierwszych boków pierwszych obszarów, przy czym stosunek długości pierwszego boku pierwszego obszaru do drugiego boku pierwszego obszaru zawiera się w przedziale od π/3 do 2π/3. Miara kątów zawartych pomiędzy drugimi bokami pierwszych obszarów wynosi 2π/3 do 5π/6. Długość zewnętrznych boków pierwszych obszarów jest co najmniej równa długości pierwszych, wewnętrznych boków pierwszych obszarów. Stosunek promienia okręgu o środku pokrywającym się ze środkiem symetrii otworu i stycznego do zewnętrznego boku pierwszego obszaru w połowie jego długości do długości drugiego boku pierwszego obszaru wynosi od 2π/9 do 5π/6.

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia element do utworzenia zastawki

Fig. 1a - przedstawia element do utworzenia zastawki

Fig. 2 - przedstawia element do utworzenia zastawki

Fig. 3 - przedstawia schemat obszarów elementu oznaczonego na Fig. 1 i/lub Fig. 2 numerem II, które stanowią „T” kształtne zakładki, poprzez połączenie ich ze ścianą tuby

Fig. 4a - przedstawia wytrzymałość na rozciąganie przetrzymywane w roztworze soli fizjologicznej

Fig. 4b - przedstawia wytrzymałość na rozciąganie utrwalane aldehydem glutarowym

Fig. 4c - przedstawia wytrzymałość na rozciąganie: płaty BC natywna; kompozyty: bnc- alkohol poliwinylowy pva, bnc- kwas hialuronowy;

Fig. 4d - przedstawia wytrzymałość na rozciąganie: płaty BC modyfikowana: bnc sucha s, bnc 9 dniowa, bnc 8 dniowa

Fig. 4e - przedstawia wytrzymałość na rozciąganie: płaty BC modyfikowana: bnc z dodatkiem aminobaku

Fig. 5 - przedstawia wartości modułu elastyczności i odkształcenia w teście zrywania mierzone w kierunku obwodowym i osiowym

Fig. 6 - przedstawia wartości energii zrywania mierzone w kierunku osiowym i obwodowym

Fig. 7 - przedstawia badanie histerezy przed dynamicznym testem zmęczeniowym

Fig. 8 - przedstawia badanie histerezy po zakończonym dynamicznym teście zmęczeniowym.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.

PL 242163 Β1

Przykład 1

Wysterylizowane błony BC ułożono na płaskiej powierzchni i suszono w temperaturze pokojowej, nie przekraczającej 25°C, do stałej masy. Następnie błony zapakowano i sterylizowano w autoklawie w121°C przez 20 minut. Wysuszone błony BC przechowywano z zachowaniem jałowości.

Przykład 2

Wysuszone jak w przykładzie 1 błony BC poddawano naświetlaniu promieniowaniem UV-C z zastosowaniem lamp o łącznej mocy 12 W i maksimum emisji przy 254 nm. Wysuszone błony BC umieszczono w odległości 5 cm od lampy i naświetlano przez czas 30 min. Błony BC przechowywano z zachowaniem jałowości.

Przykład 3

Błony BC przygotowane jak w przykładzie 1, namaczano w jałowej wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej przez czas do 120 min i przechowywano w warunkach chłodniczych z zachowaniem jałowości.

Przykład 4

Błony BC przygotowane jak w przykładzie 2, namaczano w jałowej wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej przez czas do 120 min i przechowywano w warunkach chłodniczych z zachowaniem jałowości.

Przykład 5

Element do utworzenia zastawki serca wykonany jest z jednego arkusza materiału biozgodnego, przykładowo z BC, jak przedstawiono na Fig. 1. Krawędzie centralnego otworu 1, który wykonany jest w kształcie trójkąta równobocznego, stanowią boki wewnętrzne A pierwszych obszarów elementu I. Pierwsze obszary elementu I mają kształt zbliżony do czworoboku, którego zewnętrzne krawędzie stanowią boki zewnętrzne pierwszych obszarów elementu (I) i są one wypukłe zaokrąglone, tak, że łuk tego zaokrąglenia w najwyższym jego punkcie jest styczny do okręgu o promieniu R równym długości krawędzi A, oraz o środku pokrywającym się ze środkiem centralnego otworu 1. Pomiędzy pierwszymi obszarami I elementu znajdują się bezpośrednio do nich przylegające drugie obszary elementu II, których zewnętrzne krawędzie są wypukłe zaokrąglone. Drugie boki H pierwszych obszarów elementu I są prostopadłe do krawędzi A centralnego otworu 1. Miara kąta β zawartego pomiędzy drugimi bokami 2 wynosi 2π/3, a wzajemna zależność pomiędzy długością krawędzi A a długością drugiego boku H pierwszego obszaru I wynosi

H = π

Z tak ukształtowanego elementu za pomocą odpowiedniego zespolenia w narożnikach centralnego otworu 1, przykładowo poprzez zszycie, otrzymuje się przestrzennie ukształtowaną zastawkę serca.

R=A β

A 1

Η 2^π

R _ A H ⁼ H

Przykład 6

Element do utworzenia zastawki serca jak przedstawiono na fig. 2 wykonany jest jak w przykładzie I, z tym, że dla miary kąta β wynoszącej 2π/3, zależności pomiędzy promieniem okręgu R a długością krawędzi A centralnego otworu 1 oraz długości drugiego boku H wynoszą:

PL 242163 Β1

3A

2π

A 2 — = — τι

R _7π Η ⁼ Ϊ2

Przykład 7

Sposób wszycia zakłada wyznaczenie trzech punktów co 120 stopni, na obwodzie okręgu w tubie, w której ma działać zastawka. Pierścień ten będzie stanowił miejsce połączenia brzegów centralnego otworu elementu z tubą, w której będzie funkcjonowała zastawka. Tuba może być wykonana ze sztucznego materiału lub z naturalnych tkanek. Połączenie brzegów centralnego otworu z pierścieniem, może być wykonane techniką szwu chirurgicznego ciągłego lub przerywanego.

Obszary elementu oznaczone na Fig. 2 numerem II będą stanowiły „T” kształtne zakładki, poprzez połączenie ich ze ścianą tuby zgodnie ze schematem fig. 3. Wysokość tego połączenia określa H, liczona od punktów wszycia narożników otworu centralnego do góry na ścianie tuby równo położonych nad punktami narożników. W ten sposób dolne piętro połączenia zastawki wewnątrz światła tuby z elementem pozostaje całkowicie szczelne - nieprzepuszczalne dla cieczy, a od góry wszycie „T” kształtnych zakładek spowoduje, że przepływająca w kierunku od góry do dołu w tubie ciecz spowoduje szczelne doleganie obszarów elementu oznaczonych numerem I na Fig. 2. Odwrotnie płynąca ciecz spowoduje swobodne rozchylenie obszarów I i tym samym swobodny przepływ cieczy jedynie w tym kierunku.

Przykład 8

Modyfikacje BC zmierzające do uzyskania materiału odpornego na działanie enzymów i wybranych mikroorganizmów chorobotwórczych oraz określenie wpływu tych modyfikacji na inne właściwości polimeru.

Odporność modyfikowanej BC na degradację w warunkach in vitro badano poprzez określenie zmian zachodzących w polimerze podczas inkubowania prób w temperaturze 37°C w roztworze symulującym płyny fizjologiczne w nieobecności oraz obecności pleśni Aspergillus fumigatus.

Modyfikacja BC:

Jałowe błony BC, w kształcie kwadratów o wymiarach 2,5 x 2,5 cm oraz pasków o wymiarach 1,5 x 10 cm, zmodyfikowane poprzez suszenie w temperaturze pokojowej i namaczanie w wodzie oraz poprzez suszenie w temperaturze pokojowej. Wysuszone błony celulozowe poddano dodatkowo modyfikacji przez naświetlanie promieniowaniem UV, stosując dwie lampy rtęciowe niskociśnieniowe, każda o mocy 6 W i maksimum emisji przy 254 nm. Próby umieszczono w odległości 5 cm od lamp i naświetlano przez 30 min, po czym moczono je przez 60 min w jałowej wodzie destylowanej. Modyfikację przeprowadzono z zachowaniem jałowości.

Próby BC (o wymiarach 2,5 x 2,5 cm) modyfikowanej przez suszenie w temperaturze pokojowej i namaczanie w wodzie oraz przez suszenie w temperaturze pokojowej, naświetlanie promieniowaniem UV i namaczanie w wodzie umieszczano w jałowych butelkach o objętości 100 mL wypełnionych 62,5 mL jałowego płynu SBF. Do badań właściwości mechanicznych, paski modyfikowanej BC (o wymiarach 1,5 x 10 cm) umieszczano w 150 mL roztworu w sterylnych woreczkach. Do części prób zanurzonych w roztworze SBF dodawano odpowiednią ilość płynnej hodowli pleśni A. fumigatus tak, aby początkowe stężenie wynosiło ok. 103 komórek w 1 mL płynu. Zmiany degradacyjne prób BC badano po 3, 7, 14, 30 dniach od rozpoczęcia inkubacji.

Oznaczenie stopnia biodegradacji BC:

1. określenie zmian mokrej masy BC

2. badanie właściwości mechanicznych BC

3. badanie właściwości termicznych i strukturalnych

4. rentgenowska analiza dyfrakcyjna (XRD)

5. analiza mikroskopowa z wykorzystaniem techniki SEM

Wyniki doświadczalne opracowano przy użyciu programu statystycznego SigmaPlot 11.0 (SYSTAT Software, Niemcy), za pomocy analizy wariancji z klasyfikacją jednoczynnikową ANOVA dla poziomu istotności p<0,05.

Mokra masa prób BC modyfikowanych poprzez suszenie w temperaturze pokojowej i namaczanie w wodzie, a następnie przechowywanych w jałowym płynie SBF przez 3, 7 i 14 dni, zwiększyła się 2-krotnie, natomiast po 30 dniach inkubacji istotnych statystycznie różnic nie zaobserwowano. W przypadku prób inkubowanych w obecności A. fumigatus zaobserwowano większe zmiany mokrej masy niż w przypadku prób BC przechowywanych w warunkach jałowych. Już po 3 dniach inkubacji mokra masa zwiększyła się około 2,5-krotnie, a po 7 dniach 4-krotnie.

Odmienne wyniki uzyskano podczas przechowywania prób BC modyfikowanych poprzez suszenie w temperaturze pokojowej, naświetlanie promieniowaniem UV i namaczane w wodzie. W tym przypadku inkubacja w jałowym płynie SBF spowodowała zmniejszenie zawartości mokrej masy BC o ok. 60% (Rys. 3), a inkubacja w płynie SBF w obecności A. fumigatus wywołała zmniejszenie tej zawartości o ok. 50% jedynie po 3 dniach inkubacji.

Naprężenie przy zerwaniu (σ) nieinkubowanych prób BC, modyfikowanych przez suszenie w temperaturze pokojowej i namaczanie w wodzie, wynosiła ok. 112 MPa, a względne wydłużenie przy zerwaniu (ε) ok. 13%. W przypadku prób modyfikowanych poprzez suszenie w temperaturze pokojowej, naświetlanie promieniowaniem UV i namaczanie w wodzie, σ błon nieinkubowanych wynosiła ok. 160 MPa, a ε ok. 9%. Przechowywanie zarówno w jałowym płynie SBF, jak i w obecności A. fumigatus pogorszyło wytrzymałość mechaniczną błon BC modyfikowanych poprzez suszenie w temperaturze pokojowej i namaczanie w wodzie. Już po 3 dniach inkubacji w jałowym płynie SBF zauważono obniżenie σ o ok. 60%, po 7 dniach o ok. 20%, natomiast po 14 i 30 dniach o ok. 50%. Inkubacja w obecności A. fumigatus przez okres 3 dni spowodowała podobne zmniejszenie σ jak inkubacja bez pleśni, o ok. 60%, jednak po 14 i 30 dniach o zmniejszyła się znacznie więcej, odpowiednio o 70 i 90%. ε prób nie zmieniało się przez cały okres inkubacji w jałowym płynie SBF, natomiast w obecności A. fumigatus uległo obniżeniu po 14 dniach inkubacji o ok. 30%, a po 30 dniach o ok. 70%. Wartości σ i ε prób BC suszonych w temperaturze pokojowej, naświetlanych promieniowaniem UV i moczonych w wodzie, a następnie inkubowanych w jałowym płynie SBF nie zmieniały się w porównaniu do prób nieinkubowanych, z wyjątkiem ε prób przechowywanych przez 14 dni, której wartość zwiększyła się o ok. 20%. Z kolei próby BC inkubowane w płynie SBF w obecności A. fumigatus wykazywały ok. 20 i 60% mniejszą wartość σ, odpowiednio po 7 i 30 dniach inkubacji, w porównaniu do prób naświetlanych i nieinkubowanych. ε tych prób nie ulegało zmianie, z wyjątkiem prób inkubowanych przez 14 dni, której wartość zwiększyła się o ok. 30%.

Analizując dyfraktogramy wszystkich modyfikowanych prób BC zaobserwowano 3 charakterystyczne pasma dyfrakcyjne przy kącie odbłysku 2Θ 14,46°, 16,7° i 22,62°. Inkubacja prób w warunkach symulujących ludzki organizm nie wpływała na położenie linii dyfrakcyjnych, ale powodowała zmianę intensywności pasm dyfrakcyjnych przy kątach odbłysku 2Θ 14,46° i 22,62°. Dodatkowo zauważono, że w przypadku dyfraktogramu BC suszonej w temperaturze pokojowej i namaczanej w wodzie, a następnie przechowywanej przez 3 dni zarówno w jałowym płynie SBF, jak i w płynie SBF w obecności A. fumigatus, zwiększa się intensywność linii dyfrakcyjnej przy kącie 2Θ 16,7°. Obliczony na podstawie wzoru Segala i wsp. (1959) stopień krystaliczności (Cr.I.) wszystkich modyfikowanych prób BC wynosił ok. 90%.

Zestawiono zmiany stopnia krystaliczności BC spowodowane biodegradacją, odpowiednio prób modyfikowanych poprzez suszenie w temperaturze pokojowej i namaczanie w wodzie oraz suszenie w temperaturze pokojowej, naświetlanie promieniowaniem UV i namaczanie w wodzie. Stopień krystaliczności wszystkich badanych prób różnił się tylko nieznacznie. Wyjątek stanowiła BC suszona w temperaturze pokojowej i namaczana w wodzie, a następnie przetrzymywana przez okres 3 dni w obecności pleśni. W tym przypadku zaobserwowano zmniejszenie Cr.I. o ok. 5% w porównaniu z próbą nieinkubowaną.

Temperatura rozkładu BC nieinkubowanej, suszonej w temperaturze pokojowej, naświetlanej promieniowaniem UV i namaczanej w wodzie była o ok. 6°C mniejsza niż BC suszonej w temperaturze pokojowej i namaczanej w wodzie. Niższa temperatura rozkładu świadczy o mniejszej stabilności termicznej materiału, spowodowanej prawdopodobnie większą podatnością na biodegradację. Obrazy SEM powierzchni wszystkich prób BC modyfikowanych, a następnie inkubowanych w jałowym płynie SBF, nie wykazywały różnic w porównaniu do powierzchni prób nieinkubowanych. Na powierzchni prób można zaobserwować mało widoczne, cienkie włókna. Bardziej zwarta struktura prób BC inkubowanych w jałowym płynie SBF może być powodem jej zwiększonej wytrzymałości mechanicznej, w porównaniu do prób inkubowanych w SBF w obecności A. fumigatus.

Uzyskanie BC o większej odporności na biodegradację właściwej bioprotezom naczyń krwionośnym oraz zastawek aortalnych.

Przykład 9

Badania mechaniczne BC oraz materiałów kompozytowych na bazie BC

Realizowane badania pozwoliły na wybranie BC charakteryzującej się nie gorszą wytrzymałością na rozciąganie niż naturalne tkanki świńskiego układu krążenia. W tym celu płaty BC o wymiarach 10 x 1,5 cm, zostały poddane próbie rozciągania. Materiałem referencyjnym były naturalne tkanki: aorta, zastawka aortalna oraz fragmenty worka osierdziowego. Naturalne tkanki zostały odpowiednio wypreparowane i dostarczone przez Gdański Uniwersytet Medyczny. Tkanki podzielone zostały na dwie grupy. Pierwszą grupę stanowiły tkanki przechowywane w roztworze soli fizjologicznej, od momentu dos tarczenia próbek, do momentu wykonania próby rozciągania. Natomiast drugą grupę - tkanki dodatkowo przepłukiwane 0,5% aldehydem glutarowym przez okres 10 min poprzedzający wykonanie próby rozciągania.

Materiał to: BC natywna, BC modyfikowana oraz kompozyty BC-alkohol poliwinylowy, BC-kwas hialuronowy.

Próbę rozciągania wykonano na maszynie wytrzymałościowej firmy - INSTRON model 1112. Prędkość rozciągania jednoosiowego wynosiła 5 mm/s. Odległość między szczękami dla rozciągania BC - 50 mm.

Badania pokazują, że BC modyfikowana termicznie tzn. suszona „s” a następnie moczona charakteryzuje się najlepszą wytrzymałością na rozciąganie ze wszystkich materiałów bionanocelulozowych i posiada wytrzymałość rzędu 22 MPa. BC natywna (jednorodna) oraz materiały kompozytowe na bazie BC posiadają wytrzymałości na rozciąganie ok. 5 MPa, co jest wartością mniejszą niż uzyskują materiały naturalne. Wartość ok. 22 MPa odpowiadająca BC modyfikowanej termiczne pozwala na dalsze prowadzenie badań wytrzymałościowych (próba rozdzierania, badania zmęczeniowe) na wybranym materiale BC, który może być potencjalnym materiałem mającym zastosowanie w kardiochirurgii i chirurgii naczyniowej.

Określono podatność bakteryjnej celulozy na degradację in vitro w warunkach symulujących osocze krwi (płyn SBF - simulated body fluid, temperatura 37°C). Zastosowano różne metody monitorowania zmian degradacyjnych, m.in. oznaczenie zmian suchej i mokrej masy, określenie zawartości produktów hydrolizy biomateriału za pomocą chromatografii cieczowej oraz stabilności termicznej BC. Przeprowadzono ocenę powierzchni biomateriału za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz monitorowano również rozwój mikroorganizmów celowo wprowadzonych do środowiska, w którym inkubowano BC.

Podczas przetrzymywania prób BC w jałowym płynie SBF i buforze PSB nie stwierdzono zmian suchej masy przez cały 6-miesięczny okres przechowywania. Również w obecności bakterii S. aureus i drożdży C. albicans sucha masa próbek celulozy utrzymywała się na zbliżonym poziomie. Wyraźne zmniejszenie suchej masy BC zaobserwowano tylko w próbach inkubowanych przez 6 miesięcy w obecności pleśni A. fumigatus - sucha masa BC zmniejszyła się o 41%. W przypadku mokrej masy stwierdzono, że zwiększała się ona znacząco już po drugim miesiącu przechowywania, niezależnie od warunków (bufor PBS, płyn SBF w obecności i nieobecności mikroorganizmów).

Wykazano także, że podczas przechowywania prób BC następował wzrost wszystkich badanych drobnoustrojów. Po 1 miesiącu liczba komórek S. aureus, C. albicans i A. fumigatus zwiększyła się z ok. 103 do ok. 10⁵ jtk/cm³ i pozostawała na tym samym poziomie do 6 miesiąca, co świadczy, że znajdowały się one w stacjonarnej fazie wzrostu. Wzrost mikroorganizmów oraz mokrej masy BC wskazuje, że w materiale tym zachodzą zmiany degradacyjne, pomimo, iż nie zmienia się znacząco jej sucha masa (z wyjątkiem prób, w których znajdowały się pleśnie A. fumigatus). Stwierdzono również, że pod czas przetrzymywania prób na powierzchni BC tylko pleśnie A. fumigatus tworzyły biofilm na powierzchni tego polimeru. Stężenie sacharydów, będących produktami hydrolizy BC, w płynach poinkubacyjnych było tak małe, że nie można było ich wykryć za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Po 20-krotnym zatężeniu tych płynów, zarówno z prób, bez jak i z bakteriami S. aureus i drożdżami C. albicans również nie stwierdzono produktów hydrolizy BC. Były one natomiast obecne (chociaż w niewielkich ilościach) w zatężonym płynie poinkubacyjnym już po miesiącu przetrzymywania BC z pleśniami A. fumigatus. Analizując uzyskane wyniki można jednakże stwierdzić, że badanie obecności produktów hydrolizy celulozy w płynach poinkubacyjnych nie jest dobrą metodą oznaczania stopnia biodegradacji polimeru, z tego względu, że mikroorganizmy mogą metabolizować powstałe w tym procesie cukry proste, dwucukry i oligosacharydy.

Przechowywanie prób w buforze PBS i jałowym płynie SBF przez okres 5 i 6 miesięcy wpłynęło na obniżenie temperatury rozkładu BNC o ok. 10°C, co świadczy o procesach degradacyjnych, oraz na zredukowanie średnio o połowę ilości zaadsorbowanej na jej powierzchni wody. Podobne zmiany zaobserwowano w próbach przechowywanych w tych okresach czasowych w obecności bakterii S. aureus i drożdży C. albicans, natomiast próby przechowywane przez okres 6 miesięcy w obecności pleśni A. fumigatus miały stabilność termiczną obniżoną o ok. 20°C. Analiza termogramów prób inkubowanych przez 6 miesięcy w płynie SBF w obecności i nieobecności mikroorganizmów wykazała ponadto dodatkowy efekt, wskazujący na utratę wody chemicznie związanej.

Obserwacje mikroskopowe wykazały, że morfologia powierzchni błon BC po inkubowaniu w płynach symulujących przez okres 1-6 miesięcy nie zmienia się w sposób znaczący, staje się jedynie bardziej porowata.

Przykład 10

Opis testów, które zostały wykonane do oceny właściwości BC.

Celem zadania była ocena własności biomechanicznych materiału BC w układzie in vitro.

1. Testy zrywania

Dla każdej próby wykonano jednoosiowe testy zrywania wykorzystując do tego maszynę wytrzymałościową (Tytron 250 Microforce Testing System firmy MTS), z przetwornikiem siły 250 N. Procentowe odkształcenie mierzono za pomocą wideo extensometru (Messphysik). Dla prawidłowej analizy odkształcenie stosowano odpowiednie znaczniki pozwalające na wyznaczenie parametrów L0 i L1 próbki w trakcie rozciągania. Przed każdym badaniem ekstensometr był kalibrowany przy użyciu wzorców dostarczonych przez producenta. W celu właściwego pomiaru starano się zachować proporcję szerokości do długości próbki 1:10. Każdorazowo przed rozpoczęciem testu mierzono grubość próbki co stanowiło dane wejściowe do automatycznego uzyskania wartości powierzchni przekroju i w ten sposób automatycznego przeliczenia wartości modułu elastyczności. W przypadku testów rozciągania próbkę poddawano wstępnemu obciążeniu 0,5 N i od tej wartości każdorazowo rozpoczynano test zrywania. Mierzono wartości modułu elastyczności, procentowego odkształcenia rzeczywistego oraz energii zrywania. Biorąc pod uwagę charakter anizotropowy materiału BC badania wykonywano w dwóch umownych kierunkach obwodowym i osiowym. Przed przystąpieniem do testów materiał badany był każdorazowo ważony, wynikało to z faktu, że BC wykazuje silne właściwości hydrofilne, pozwalało to w związku z tym uzyskać informację w jakim stopniu na parametry biomechaniczne może mieć wpływ stopień uwodnienia próbki.

2. Badanie właściwości lepkosprężystych

Badano również właściwości lepkosprężyste próbek BC wykonując badanie histerezy. Przed badaniem próbki poddawane były wstępnemu obciążeniu do wartości 1N, następnie rozciągane do wartości odkształcenia 4% i utrzymywana przy tym odkształceniu przez 60 s po czym następował powrót do wartości początkowych. Wartość histerezy mierzono jako różnicę energii wejścia i energii wyjścia.

3. Dynamiczna próba zmęczeniowa

Dynamiczna próba zmęczeniowa wykonywana była w temperaturze 370°C w komorze środowiskowej wypełnionej medium DMEM/F12 suplementowanym 10% surowicą i antybiotykami. Podobnie jak w przypadku testów rozciągania próbki BC były ważone przed rozpoczęciem testu oraz po jego zakończeniu. Test wykonywano przy: amplitudzie 5 mm, częstotliwości 3 Hz przy 250 000 cykli. Po zakończeniu próby zmęczeniowej każdorazowo oznaczano histerezę próbki.

Wartości modułu elastyczności, odkształcenia oraz energii zrywania różniły się w zależności od kierunku ułożenia próbki (Fig. 5, 6).

Badania histerezy wskazują, że BC posiada słabe właściwości lepkosprężyste. Ze względu na anizotropowy charakter badanych próbek BC obserwowano usztywnienie materiału wykonanym dynamicznym teście zmęczeniowym (Fig. 7, 8).

Właściwości biomechaniczne wskazują, że badany materiał BC cechuje znacznie większa sztywność w stosunku do tkanek ludzkich i świńskich (zastawki płucne i aortalne). Badany materiał BC cechuje duża hydrofilność.

Cechy otrzymanej zastawki:

dla materiału, który jest płaski, wiotki i grubości od 300 do 600 micm, oraz nieprzesiąkliwy dla elementów morfotycznych krwi:

1. wytrzymałość na rozciąganie powyżej 5 MPa natywna 5 MPa, modyfikowana 22 MPa

Badania pokazują, że BC modyfikowana termicznie tzn. suszona „s” a następnie moczona charakteryzuje się najlepszą wytrzymałością na rozciąganie ze wszystkich materiałów bionanocelulozowych i posiada wytrzymałość rzędu 22 MPa. BC natywna (jednorodna) oraz materiały kompozytowe na bazie BC posiadają wytrzymałości na rozciąganie ok 5 MPa, co jest wartością mniejszą niż uzyskują materiały naturalne. Wartość ok 22 MPa odpowiadająca BC modyfikowanej termiczne pozwala na dalsze prowadzenie badań wytrzymałościowych (próba rozdzierania, badania zmęczeniowe) na wybranym materiale BC, który może być potencjalnym materiałem mającym zastosowanie w kardiochirurgii i chirurgii naczyniowej

2. wytrzymałość na zmęczenie przy następujących parametrach:

siła 45 N amplituda drgań A=5 mm częstotliwość f=3 Hz czas 24 godz.

3. biostabilność (po 6 miesiącach inkubacji w jałowym buforze PBS i w jałowym płynie SBF)

Przechowywanie prób w jałowym buforze PBS i jałowym płynie SBF przez okres 5 i 6 miesięcy wpłynęło na obniżenie temperatury rozkładu BC o ok. 10°C, co świadczy o procesach degradacyjnych, oraz na zredukowanie średnio o połowę ilości zaadsorbowanej na jej powierzchni wody. Podobne zmiany zaobserwowano w próbach przechowywanych w tych okresach czasowych w obecności bakterii S. aureus i drożdży C. albicans, natomiast próby przechowywane przez okres 6 miesięcy w obecności pleśni A. fumigatus miały stabilność termiczną obniżoną o ok. 20°C. Analiza termogramów prób inkubowanych przez 6 miesięcy w płynie SBF w obecności i nieobecności mikroorganizmów wykazała ponadto dodatkowy efekt, wskazujący na utratę wody chemicznie związanej.

4. niski indeks hemolizy

5. niska trombogenność

Badania wykonano na świeżej heparynizowanej krwi świńskiej pozyskiwanej podczas tradycyjnego uboju zwierząt w rzeźni. Łącznie przeprowadzono 13 sesji doświadczalnych - 7 bez BC (kontrolnych) oraz 6 z wykorzystaniem BC (doświadczalnych). W półgodzinnych interwałach badano aktywowany czas krzepnięcia (ACT), całkowite stężenie hemoglobiny (Hb), stężenie wolnej hemoglobiny (fHb), liczbę erytrocytów (RBC) oraz hematokryt (HTC).

Monitorowanie ACT było elementem zastosowanej metodologii - testu Schimy. Parametr ten stanowiący wskaźnik tendencji krwi do koagulacji określa moment zakończenia doświadczenia i sam w sobie nie jest przydatny do oceny stopnia hemolizy, czy trombogenności badanego materiału. HCT, RBC oraz Hb zmieniały się nieznacznie w trakcie badań i nie wykraczały poza normy podawane w literaturze dla świń. fHb w osoczu pozostaje w ścisłej korelacji z procesem hemolizy zachodzącym w badanym medium krążącym. Podczas badań (zarówno kontrolnych, jak i z użyciem BC) podlegało stopniowemu, systematycznemu wzrostowi.

Porównanie dynamiki wzrostu fHb w trakcie badań kontrolnych i doświadczalnych pozwoliło wnioskować na temat wpływu BC na hemolizę. Ponieważ wpływ na nią mają zarówno parametry krwi (hematokryt, początkowe stężenie wolnej hemoglobiny), jak i czas pompowania, uzyskane dane wymagały standaryzacji. W tym celu użyto wskaźnika IH (indeks wolnej hemoglobiny), który określa przyrost zawartości wolnej hemoglobiny w osoczu w mg/l przepompowanej krwi. Jest to szczególnie istotne ze względu na różnice w czasie trwania poszczególnych prób. IH wyliczany był ze wzoru:

PL 242163 Β1

Wg » (100 - HTC)

AHg [mg/l] - różnica w stężeniu wolnej hemoglobiny w plazmie między pierwszym, a ostatnim pomiarem

HTC [%] - hematokryt

Q [l/min] - przepływ

T [min] - czas przepływu

Średni (M±SD) indeks hemoglobiny dla prób kontrolnych wyniósł: IH = 14,71 ±9,42, a dla doświadczalnych IH = 12,87±3,52, natomiast średni (M±SD) czas przepływu medium krążącego dla prób kontrolnych T = 325,57±75,08 min., a dla doświadczalnych T = 330,00±60,75 min., przy czym różnice pomiędzy tymi parami średnich (kontrola/doświadczenie) okazały się być nieistotne statystycznie (p>0,05).

Warto zwrócić uwagę, że pomimo nieco dłuższego czasu pompowania krwi, przy kontakcie z BNC uzyskano niższy indeks hemolizy, niż dla prób kontrolnych.

Badanie trombogenności w badaniach wg protokołu Schimy ograniczone jest do oceny stopnia zakrycia powierzchni badanego materiału przez skrzepliny. Ocena makroskopowa skrawków BC po zakończonych eksperymentach w większości przypadków wykazała obecność stosunkowo niewielkiej liczby czerwonych skrzeplin, przede wszystkim na powierzchni kontaktującej się bezpośrednio z przepływającą krwią. Na „odwrotnych” powierzchniach skrawków, luźno przylegających do ścian kanałów przepływowych aparatury, liczba obserwowanych skrzeplin była jeszcze mniejsza.

Badana testem Schimy BC nie wykazuje istotnego działania hemolitycznego, a jej trombogenność wydaje się być nieznaczna.

6. niska adhezyjność

BC charakteryzuje się niską adhezyjnością. Brak właściwej adhezji komórek wpływa na generowanie procesów nekrotycznych. Modyfikacja powierzchniowa BC za pomocą naturalnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej w sposób istotny poprawia adhezyjność komórek i charakterystykę wzrostu, co może mieć istotne znaczenia w przypadku klinicznych zastosowań BC.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Element do wykonania zastawki serca składający się z płaskiego arkusza bakteryjnej celulozy o trzech osiach symetrii, który ma centralnie położony otwór (1) o trzech równych bokach tworzących figurę o symetrii trójkąta równobocznego, znamienny tym, że

- krawędzie centralnie położonego otworu (1) stanowią pierwsze wewnętrzne boki (A) pierwszych obszarów elementu (I),

- pierwsze obszary elementu (I) są w kształcie czworoboku,

- pomiędzy pierwszymi obszarami elementu (I) znajdują się, bezpośrednio do nich przylegające, drugie obszary elementu (II),

- drugie obszary elementu (II) są wycinkami koła o kątach środkowych (β), których miara wynosi od 2π/3 do 5π/6 i promieniach równych długości krawędzi drugich boków (H) pierwszych obszarów elementu (I),

- krawędzie drugich boków (H) pierwszych obszarów elementu (I) są prostopadłe do pierwszych wewnętrznych boków (A) pierwszych obszarów elementu (I),

- długość zewnętrznych boków (A) pierwszych obszarów elementu (I) jest co najmniej równa długości pierwszych wewnętrznych boków (A) pierwszych obszarów elementu (I),

- stosunek długości promienia (R) okręgu o środku pokrywającym się ze środkiem symetrii (O) centralnie położonego otworu (1) i stycznego do zewnętrznych boków (A¹) pierwszych obszarów elementu (I), w połowie ich długości, do długości drugich boków (H) pierwszych obszarów elementu (I) wynosi od 2π/9 do 5π/6,

- stosunek długości pierwszych wewnętrznych boków (A) pierwszych obszarów elementu (I) do drugich boków (H) pierwszych obszarów elementu (I) wynosi od π/3 do 2π/3.
2. Element według zastrz. 1, znamienny tym, że jest figurą dwuspójną.
3. Element według zastrz. 1, znamienny tym, że osie symetrii elementu i otworu pokrywają się.

PL 242163 Β1
4. Sposób wytwarzania zmodyfikowanej bakteryjnej celulozy z wykorzystaniem szczepu G. xylinus do wytwarzania elementu jak określono w zastrzeżeniu 1, znamienny tym, że wysterylizowaną błonę bakteryjnej celulozy układa się na płaskiej powierzchni i suszy się do stałej masy w temperaturze pokojowej, nie wyższej niż 25°C, następnie sterylizuje się w temperaturze 121 °C przez 20 min., a otrzymaną bakteryjną celulozę przechowuje się wjałowych warunkach.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wysuszone błony bakteryjnej celulozy poddaje się naświetlaniu promieniowaniem UV-C z zastosowaniem lamp o łącznej mocy 12 W i maksimum emisji przy 254 nm, przez czas 30 min i przechowuje się z zachowaniem jałowości.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wysuszone błony bakteryjnej celulozy namacza się w jałowej wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej przez czas do 120 min i przechowuje się w warunkach chłodniczych z zachowaniem jałowości.
7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że błonę bakteryjnej celulozy po naświetlaniu namacza się w jałowej wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej przez czas do 120 min i przechowuje w warunkach chłodniczych z zachowaniem jałowości.