PL242988B1 - Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania - Google Patents
Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania Download PDFInfo
- Publication number
- PL242988B1 PL242988B1 PL437111A PL43711121A PL242988B1 PL 242988 B1 PL242988 B1 PL 242988B1 PL 437111 A PL437111 A PL 437111A PL 43711121 A PL43711121 A PL 43711121A PL 242988 B1 PL242988 B1 PL 242988B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- detection
- oligonucleotide primers
- sequences
- genus phytophthora
- primers
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 title claims abstract description 17
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 6
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 4
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 4
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000233622 Phytophthora infestans Species 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 208000034699 Vitreous floaters Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940067383 optigene Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002683 reaction inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenów należących do rodzaju Phytophthora o sekwencjach nr l, 2, 3, 4, 5 i 6 przedstawionych na liście sekwencji. Zgłoszenie obejmuje też sposób wykrywania fitopatogenicznego organizmu z rodzaju Phytophthora, w którym w reakcji LAMP z zastosowaniem zestawu starterów dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, objawiającej się pojawieniem się krzywej amplifikacji, potwierdzając detekcję powstałego produktu, charakteryzujący się tym że, zestaw starterów stanowią startery oligonukleotydowe przedstawione na liście sekwencji.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenów należących do rodzaju Phytophthora a także sposób wykrywania obecności tych patogenów.
Grzybopochodne lęgniowce z rodzaju Phytophthora, do którego są zaliczane przynajmniej 124 gatunki, są organizmami patogenicznymi występującymi na całym świecie i atakują wiele gatunków roślin uprawnych, w tym truskawek. Co więcej, mikroorganizmy te nie są specyficzne gatunkowo jeśli chodzi o wybór gospodarza, co znacznie utrudnia działania ochronne. Cechą charakterystyczną tych patogenów jest wytwarzanie pływek, które z łatwością rozprzestrzeniają się po plantacjach nie tylko za pomocą maszyn i przyrządów rolniczych, ale również wraz z wodą używaną do podlewania. Wczesna detekcja patogenów z rodzaju Phytophthora jest niezwykle istotna w celu kontroli rozprzestrzeniania się tych mikroorganizmów oraz wdrażania skutecznych zabiegów ochronnych. Klasyczne metody detekcji Phytophthora spp., opierające się o metody płytkowe są długotrwałe, pracochłonne i często dają niejednoznaczne rezultaty. Do molekularnych metod wykrywania tych patogenów zaliczamy klasyczne metody łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), zagnieżdżonej łańcuchowej reakcji polimerazy (nestedPCR) oraz ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR) (Wang T., Gao C., Cheng Y., Li Z., Chen. J., Guo L., Xu. J., 2020. Plants, 9, 6, 1-22, doi: 10.3390/plants9060769); jak również metody izotermicznej amplifikacji wykorzystującej zapętlanie (LAMP) (Si Ammour M., Bilodeau G., Tremblay D., van der Heyden H., Yaseen T, Varvaro L., Carisse O., 2017. Development of real-time isothermal amplification assay for in-site detection of Phytophthora infestans in potato leaves. Plant Diseases, 101, 1269-1277, doi: 10.3390/molecules24071200). Należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że dostępne w literaturze metody detekcji patogenów z rodzaju Phytophthora są oparte o inne markery molekularne oraz charakteryzują się zmienną czułością oraz specyficznością. Dodatkowo, metody zostały opracowywane najczęściej na czystych szczepach mikroorganizmów, z pominięciem oceny przydatności detekcji w próbkach środowiskowych, gdzie występują liczne inhibitory reakcji oraz materiał genetyczny innych patogenów współwystępujących w uprawach roślinnych; bądź zostały przetestowane na pojedynczych próbkach środowiskowych, bądź pochodzących z innych upraw niż plantacje truskawek. W związku z tym nadal istnieje potrzeba dalszych poszukiwań skutecznych sposobów identyfikacji patogenów.
Celem wynalazku jest zatem zaproponowanie zestawu starterów do wykrywania patogenów roślinnych należących do rodzaju Phytophthora, a także sposobu ich wykrywania. Sposób powinien być zwalidowany na próbkach środowiskowych, w szczególności glebie oraz fragmentach roślin.
Istotę wynalazku stanowi zestaw starterów oligonukleotydowych do wykrywania patogenów roślinnych należących do rodzaju Phytophthora o sekwencjach nr 1, 2, 3, 4, 5, 6, jak przedstawiono w zestawieniu sekwencji starterów na liście sekwencji.
Istotą sposobu wykrywania fitopatogenicznego organizmu z rodzaju Phytophthora, w którym w reakcji LAMP z zastosowaniem zestawu starterów dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, objawiającej się pojawieniem się krzywej amplifikacji, potwierdzając detekcję powstałego produktu, jest to, że zestaw starterów stanowią startery oligonukleotydowe o sekwencjach nr 1, 2, 3, 4, 5,
6, przedstawione na liście sekwencji.
Startery zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje genu kodującego czynnik elongacji 1-α, uzyskane z izolatów organizmów należących do rodzaju Phytophthora pochodzących z roślin, owoców i korzeni truskawki oraz z gleby spod upraw truskawek.
Specyficznej detekcji otrzymanego produktu amplifikacji dokonuje się poprzez odczyt fluorescencji o długości fali 520 nm, po wzbudzeniu światłem o długości fali 495 nm lub poprzez przeprowadzenie elektroforezy agarozowej.
Zastosowanie wymienionych starterów oligonukleotydowych do przeprowadzenia izotermicznej reakcji amplifikacji wykorzystującej zapętlanie, przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku, umożliwia amplifikację sekwencji DNA o długości 235 par zasad. Podstawową zaletą opracowanego systemu detekcji jest fakt, że został on zwalidowany nie tylko na czystych szczepach, ale również na próbkach środowiskowych, w szczególności glebie oraz fragmentach roślin, korzeniach i owocach truskawki, w których stwierdzono obecność organizmu patogenicznego z rodzaju Phytophthora.
Wynalazek jest bliżej pokazany w przykładzie wykonania i rysunku, na którym:
- Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA amplifikowanego w reakcji przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów o sekwencjach nr 1 i 2;
- Fig. 2 przedstawia wykres wzrostu fluorescencji w wyniku amplifikacji materiału genetycznego Phytophthora spp. w obecności starterów o sekwencjach nr 1, 2, 3, 4, 5, 6, przedstawionych na liście sekwencji.
Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie detekcji stanowi gleba, korzenie, fragmenty roślin, owoce, komórki lub zarodniki mikroorganizmu. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. Reakcję LAMP przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana wolna od nukleaz, master mix do reakcji LAMP zawierający w składzie polimerazę o aktywności zamiany nici Gsp SSD, kofaktor enzymu - jony Mg2+, termostabilną pirofosfatazę, dNTP, bufor reakcyjny, barwnik fluorescencyjny wiążący dwuniciowe DNA, matrycowe DNA oraz oligonukleotydowe startery o sekwencjach nr 1 i 2 (0,2 μM), 3 i 4 (0,8 μM) oraz 5 i 6 (0,4 μΜ). Amplifikację przeprowadza się w 65°C przez 40-90 minut, z odczytem fluorescencji co minutę lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA i detekcji z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku.
Obecność oczekiwanego produktu potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnego termocyklera typu real-time PCR umożliwiającego wzbudzenie mieszaniny reakcyjnej światłem o długości fali 495 nm i odczyt fluorescencji o długości fali 520 nm lub poprzez przeprowadzenie elektroforezy agarozowej.
Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego patogenów należących do rodzaju Phytophthora w badanej próbce według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.
A. Izolacja DNA z fragmentów roślin, korzeni i owoców truskawki, patogenu oraz gleby
Izolację DNA przeprowadzono z wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji DNA z próbek środowiskowych (FastDNA Spin Kit for Feces - MP Biomedicals).
250 mg tkanki roślinnej/fragmentów patogenu lub 500 mg gleby wprowadzano do probówek o pojemności 2 ml, zawierających matrycę złożoną z kulek ceramicznych o średnicy 1,4 mm, kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm oraz 1 kulki szklanej o średnicy 4 mm. Próbki następnie płukano w buforze fosforanowo-sodowym (825 μl) z odczynnikiem PLS (275 μl). Następnie wirowano (5 minut, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Dodano bufor fosforanowo-sodowy (978 μl) i bufor MT (122 μl), po czym próbki homogenizowano w aparacie FastPrep24 w warunkach: 40 s, 6 m/s. Próbki następnie wirowano (15 minut, 14 000 x g), a supernatant przenoszono do nowych probówek zawierających bufor PPS (250 μl). Próbki mieszano poprzez odwracanie i inkubowano (10 minut w temperaturze 4°C). Mieszaninę wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie supernatant przenoszono do nowej probówki o pojemności 5 ml, zawierającej odczynnik Binding Matrix Solution (1 ml). Próbki następnie mieszano na rotatorze (5 minut), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Osad płukano buforem płuczącym (Wash Buffer #1, 1 ml). Otrzymaną zawiesinę dwukrotnie przenoszono na kolumnę separacyjną (SPIN Filter), wirowano (1 minutę, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr następnie płukano drugim buforem płuczącym (Wash Buffer #2, 500 μl), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr ponownie wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie przenoszono filtr do nowej probówki. Na filtr nanoszono bufor elucyjny (TES, 100 μl) i wirowano (2 minuty, 14 000 x g). Uzyskany przesącz, zawierający wyekstrahowane DNA, rozcieńczano 10-krotnie wodą dejonizowaną wolną od nukleaz.
B. Przygotowanie próbek do amplifikacji
DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji LAMP. Do probówki o pojemności 0,1 ml dodano 1 μl wyizolowanego DNA. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze 7500 FAST (AppliedBiosystems) w objętości 10 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną wolną od nukleaz, master mix Isothermal MasterMix (ISO-001, OptiGene), zestaw oligonukleotydowych starterów o sekwencjach nr 1 i 2 (0,2 μM), 3 i 4 (0,8 μM) oraz 5 i 6 (0,4 μM). Ponadto, ze względu na wykorzystany termocykler, mieszanina reakcyjna zawierała barwnik referencyjny ROX (30 nM). Probówki wprowadzono na blok termocyklera stosując następujący profil termiczny: 90 cykli: 65°C przez 30 sekund, odczyt fluorescencji w 65°C przez 30 sekund.
C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą detekcji fluorescencji w trakcie trwania reakcji
W trakcie trwania reakcji, aparat zbierał dane dotyczące fluorescencji mieszaniny reakcyjnej. Pozytywny wynik reakcji obserwowano jako wystąpienie wzrostu fluorescencji ponad poziom bazowy i pojawienie się krzywej amplifikacji. Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.
PL 242988 Β1
Lista sekwencji starterów
| Numer | Nazwa | Sekwencja (5’—>3’) |
| 1. | Psp_Efla_F3 | GTACTTCTTCACGGTCATTGA |
| 2. | Psp_Efla_B3 | GTACATGACAGACGAGTCG |
| 3. | Psp Efla FIP | AGCAACCACCAGrATGGCCACCGTGACTTCATCAAGAA |
| 4. | Psp Efla BIP | TyGArGCTGGTATCTCCAAGGAACrATCATCTGCTTCACAC |
| 5. | Psp_Efla_LoopF | CTGCGAGGTrCCCGTAATC |
| 6. | Psp_Efla_LoopB | TGCTTGCCTTCACyCTGG |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (2)
1. Zestaw starterów oligonukleotydowych do wykrywania patogenów należących do rodzaju Phytophthora o sekwencjach nr 1,2, 3, 4, 5 i 6 przedstawionych na liście sekwencji.
2. Sposób wykrywania fitopatogenicznego organizmu z rodzaju Phytophthora, w którym w reakcji LAMP z zastosowaniem zestawu starterów dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, objawiającej się pojawieniem się krzywej amplifikacji, potwierdzając detekcję powstałego produktu, znamienny tym, że zestaw starterów stanowią startery oligonukleotydowe o sekwencjach nr 1,2, 3, 4, 5, 6, przedstawione na liście sekwencji.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437111A PL242988B1 (pl) | 2021-02-24 | 2021-02-24 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437111A PL242988B1 (pl) | 2021-02-24 | 2021-02-24 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL437111A1 PL437111A1 (pl) | 2022-08-29 |
| PL242988B1 true PL242988B1 (pl) | 2023-05-29 |
Family
ID=83723955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL437111A PL242988B1 (pl) | 2021-02-24 | 2021-02-24 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL242988B1 (pl) |
-
2021
- 2021-02-24 PL PL437111A patent/PL242988B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL437111A1 (pl) | 2022-08-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Böhm et al. | Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants | |
| KR101624026B1 (ko) | 사과갈색무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| CN113430296B (zh) | 一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重pcr引物及检测方法 | |
| RU2720255C1 (ru) | Способы и наборы для выявления мучнистой росы | |
| PL242988B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania | |
| KR20060004246A (ko) | 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 진단용 디엔에이표지인자 | |
| Ijaz et al. | Molecular phytopathometry | |
| PL242987B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora cactorum oraz sposób ich wykrywania | |
| KR101457275B1 (ko) | 사탕무황화바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 | |
| PL239140B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| WO2016114675A1 (en) | Method and kit for identification of nematodes, forest plant pests, by real-time pcr | |
| PL238698B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Cyp51 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| CN105039331A (zh) | 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法和应用 | |
| CN112359131B (zh) | 一种检测青稞条纹病的lamp引物组及其应用 | |
| PL248973B1 (pl) | Para starterów oligonukleotydowych do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum acutatum oraz sposób jego wykrywania | |
| Mohammed et al. | Molecular detection of fungal plant pathogens: emphasizing recent advancement | |
| CN114592079B (zh) | 检测马铃薯疮痂病致病菌的lamp检测引物组、试剂和检测方法及应用 | |
| PL239141B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Phytophthora sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239135B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239137B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239142B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| CN107574259A (zh) | 检测菜用大豆炭疽病菌的环介导等温扩增引物及应用 | |
| PL239138B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania | |
| CN118979113A (zh) | 用于检测麦秆蝇的lamp引物组、试剂盒及其应用 | |
| PL239136B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania |