PL243900B1 - Warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru, sposób otrzymania warstwy, zastosowanie czujnika elektrochemicznego zawierającego warstwę do rozpoznawania inhibitora agregacji płytek krwi i jego metabolitu - Google Patents
Warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru, sposób otrzymania warstwy, zastosowanie czujnika elektrochemicznego zawierającego warstwę do rozpoznawania inhibitora agregacji płytek krwi i jego metabolitu Download PDFInfo
- Publication number
- PL243900B1 PL243900B1 PL438383A PL43838321A PL243900B1 PL 243900 B1 PL243900 B1 PL 243900B1 PL 438383 A PL438383 A PL 438383A PL 43838321 A PL43838321 A PL 43838321A PL 243900 B1 PL243900 B1 PL 243900B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cilostazol
- layer
- electrode
- carbazo
- thiophen
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 7
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 title claims abstract description 5
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 101000783577 Dendroaspis angusticeps Thrombostatin Proteins 0.000 title claims abstract description 4
- 101000783578 Dendroaspis jamesoni kaimosae Dendroaspin Proteins 0.000 title claims abstract description 4
- RRGUKTPIGVIEKM-UHFFFAOYSA-N cilostazol Chemical compound C=1C=C2NC(=O)CCC2=CC=1OCCCCC1=NN=NN1C1CCCCC1 RRGUKTPIGVIEKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 69
- 229960004588 cilostazol Drugs 0.000 claims abstract description 62
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- GHALECSGOJQOHW-UHFFFAOYSA-N 6-[4-(1-cyclohexyltetrazol-5-yl)butoxy]-1h-quinolin-2-one Chemical compound C=1C=C2NC(=O)C=CC2=CC=1OCCCCC1=NN=NN1C1CCCCC1 GHALECSGOJQOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 39
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 10
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- CDDFFMJAOKTPRF-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC CDDFFMJAOKTPRF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims description 4
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 3
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 72
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 description 19
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 17
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 15
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 13
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 11
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 7
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 7
- 208000030613 peripheral artery disease Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 101100112138 Mesembryanthemum crystallinum PPCA gene Proteins 0.000 description 5
- 101150012928 PPC1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100028851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PCK1 gene Proteins 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- PBLQSFOIWOTFNY-UHFFFAOYSA-N 3-methylbut-2-enyl 4-methoxy-8-(3-methylbut-2-enoxy)quinoline-2-carboxylate Chemical compound C1=CC=C2C(OC)=CC(C(=O)OCC=C(C)C)=NC2=C1OCC=C(C)C PBLQSFOIWOTFNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100382386 Arabidopsis thaliana PPC3 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 4
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000157 electrochemical-induced impedance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 150000003536 tetrazoles Chemical group 0.000 description 4
- -1 1,4-bis(3,6-di(thiophen-2-yl)-9H-carbazol-9-yl)benzene Chemical compound 0.000 description 3
- 206010022562 Intermittent claudication Diseases 0.000 description 3
- 101150060434 PPC2 gene Proteins 0.000 description 3
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical group C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 3
- 238000005421 electrostatic potential Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 208000021156 intermittent vascular claudication Diseases 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 125000002943 quinolinyl group Chemical group N1=C(C=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003775 Density Functional Theory Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010861 Type 3 Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases Human genes 0.000 description 2
- 108010037543 Type 3 Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases Proteins 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 150000001716 carbazoles Chemical class 0.000 description 2
- 125000000609 carbazolyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- UYNVMODNBIQBMV-UHFFFAOYSA-N 4-[1-hydroxy-2-[4-(phenylmethyl)-1-piperidinyl]propyl]phenol Chemical compound C1CC(CC=2C=CC=CC=2)CCN1C(C)C(O)C1=CC=C(O)C=C1 UYNVMODNBIQBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010026925 Cytochrome P-450 CYP2C19 Proteins 0.000 description 1
- 108010081668 Cytochrome P-450 CYP3A Proteins 0.000 description 1
- 102100029363 Cytochrome P450 2C19 Human genes 0.000 description 1
- 238000004057 DFT-B3LYP calculation Methods 0.000 description 1
- BYPFEZZEUUWMEJ-UHFFFAOYSA-N Pentoxifylline Chemical compound O=C1N(CCCCC(=O)C)C(=O)N(C)C2=C1N(C)C=N2 BYPFEZZEUUWMEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 208000037849 arterial hypertension Diseases 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- FYJJXENSONZJRG-UHFFFAOYSA-N bencyclane Chemical compound C=1C=CC=CC=1CC1(OCCCN(C)C)CCCCCC1 FYJJXENSONZJRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 229910052797 bismuth Inorganic materials 0.000 description 1
- JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N bismuth atom Chemical compound [Bi] JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003998 ifenprodil Drugs 0.000 description 1
- 229910021644 lanthanide ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002048 multi walled nanotube Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229960001476 pentoxifylline Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000007614 solvation Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- KBLZDCFTQSIIOH-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC KBLZDCFTQSIIOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
- B01J20/268—Polymers created by use of a template, e.g. molecularly imprinted polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G61/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carbon-to-carbon link in the main chain of the macromolecule
- C08G61/12—Macromolecular compounds containing atoms other than carbon in the main chain of the macromolecule
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru zbudowanego z pochodnych ditiofenu, wdrukowana molekularnie za pomocą cilostazolu, i elektrospolimeryzowana potencjodynamicznie, charakteryzująca się tym, że jej grubość wynosi od 63 do 111 nm, korzystnie 69 (±5) nm, i jest dobrana tak, aby cilostazol był w nią wdrukowany powierzchniowo, i zawierał polimer kwasu 4-[3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo]benzoesowego i 1,4-bis(3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo)benzenu, jak również wdrukowane luki molekularne. Zgłoszenie obejmuje również sposób otrzymania warstwy oraz zastosowanie warstwy jako elementu rozpoznającego czujnika elektrochemicznego do wykrywania i oznaczania inhibitora agregacji płytek krwi, którym jest cilostazol, i/lub jego główny aktywny metabolit, którym jest 3,4-dehydrocilostazol, w roztworach badanych próbek rzeczywistych, korzystnie próbek osocza krwi.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru utworzonego z pochodnych karbazolu, wdrukowana molekularnie za pomocą cilostazolu i elektrospolimeryzowana potencjodynamicznie. Wynalazek obejmuje również sposób otrzymania i osadzenia warstwy na elektrodzie i w ten sposób również wytworzenie czujnika elektrochemicznego zawierającego warstwę oraz zastosowanie tego czujnika elektrochemicznego do rozpoznania cilostazolu i/lub jego głównego, aktywnego metabolitu, 3,4-dehydrocilostazolu.
W ostatnich dziesięcioleciach znacznie wzrosła liczba pacjentów z chromaniem przestankowym (ang. intermittent claudication, IC), które jest pierwszym objawem choroby tętnic obwodowych (ang. peripheral artery disease, PAD) [T. Mueller et al., J. Vasc. Surg. 59 (2014) 1291; H. H. H. Feringa et al., Arch. Intern. Med. 167 (2007) 2482; C. B. Jsselmuiden and R. R. Faden, N. Engl. J. Med. 326 (1992) 381]. PAD to postępujące zaburzenie wywołane niedrożnością dużych lub średnich tętnic dolnych części ciała. W skali globalnej, ponad 200 mln ludzi choruje na PAD. Co więcej, IC 15-krotnie podwyższa śmiertelność z powodu zaburzeń sercowo-naczyniowych i cukrzycowych [J. Shu and G. Santulli, Atherosclerosis 275 (2018) 379],
W leczeniu PAD stosuje się wiele różnych leków w monoterapii lub terapii łączonej. Cilostazol jest jednym z nich. Ostatnio jest on intensywnie badany, ponieważ jest bardzo skuteczny w leczeniu PAD-u. Cilostazol to syntetyczna pochodna chinoliny, która hamuje aktywność fosfodiesterazy III (PDE3) i w ten sposób podwyższa hamujący wpływ cyklicznego monofosforanu adenozyny na agregację płytek krwi w komórkach i tkankach [J.-R. Kim et al., Biomed. Res. Int. 2019 (2019) 1; S. Take, Am. J. Card. 79 (1997) 1097]. Utleniający metabolizm enzymatyczny cilostazolu za pomocą enzymów wątrobowych CYP3A4 i CYP2C19 prowadzi do kilku metabolitów. Główny, 3,4-dehydrocilostazol, jest również odpowiedzialny za hamowanie agregacji płytek krwi [S. L. Bramer et al., Pharm. Res. 14 (1997) S612], To hamujące działanie cilostazolu i jego metabolitu jest znacznie silniejsze niż aspiryny, pentoksyfiliny, bencyklanu i ifenprodilu [S. Take et al., Am. J. Card. 79 (1997) 1097; Y. Okuda et al., Cardiovasc. Drug Rev. 11 (1993) 451; C. Stenting, et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 46 (2005) 162; E. M. Sorkin and A. Markham, Drugs Aging 14 (1999) 63; W. R. Hiatt et al., J. Vase. Surg. 47 (2008) 330; S. Saitoh et al., Arter. Thromb. Vase. Biol. 13 (1993) 563]. Przypuszczalnie wiąże się to z tym, że cilostazol obniża zarówno pierwotną, jak i wtórną agregację płytek.
Ponadto badane jest stosowanie cilostazolu w leczeniu choroby Alzheimera (ang. Alzheimer's disease, AD) [S. H. Park et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 408 (2011) 602; N. Hishikawa, et al., Geriatr. Gerontol. Int. 17 (2017) 1384], cukrzycy [W. S. Weintraub, Can. J. Cardiol. 22 (2006) 56B], udaru [M. Di Napoli et al., Expert Opinion Pharmacother. 21 (2020) 381] i nadciśnienia tętniczego [M. Sahin et al., Cardiovasc. Ther. 31 (2013) e88; Y. Shinohara et al., Cerebrovasc. Dis. 26 (2008) 63]. Cilostazol przeszedł szereg badań klinicznych [D. L. Dawson et al., Am. J. Med. 109 (2000) 523; M. E. O'Donnell et al., J. Vase. Surg. 49 (2009) 1226]. Ponadto, w badaniu długoterminowym (ang. Cilostazol: A Study in Long-term Effects, CASTLE) oceniono skuteczność cilostazolu i jego tolerancję u pacjentów z PAD. Badania CASTLE wykazały, że po doustnym podaniu 20-1200 μg cilostazolu, osiągnął on maksymalne stężenie w osoczu 799,8 μg/ml w ciągu 5 godz. [S. L. Bramer et al., Clin. Pharmacokinet. 37 (1999) 1]. Okazało się, że 3,4-dehydrocilostazol jest pięć razy bardziej aktywny niż jego prekursor, tj. cilostazol [H. Akiyama et al., Arzneimittelforschung. 35 (1985) 1124].
Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie, wykonanie i potwierdzenie działania czujnika elektrochemicznego, z elementem rozpoznającym w postaci warstwy polimeru molekularnie wdrukowanego cilostazolem, jako potencjalnego narzędzia do zastosowania w punkcie opieki (ang. point-of-care, PoC) do oznaczania cilostazolu w osoczu ludzkiej krwi. Urządzenia PoC służą diagnostyce, która z łatwością może być stosowana w szpitalach, jak również np. na lotniskach, a zwłaszcza u pacjenta w domu, z uwagi na ich niską dolną granicę wykrywalności (ang. Iow limit of detection, LOD), łatwość i prostotę obsługi, niski koszt i krótki czas wykonywania oznaczeń [Z. S. Ballard et al., Npj. Digit. Med. 3 (2020) 1; Y. Manmana et al., TrAC - Trends Anal. Chem. 135 (2021) 116160; J. Canals et al., Sensors (Switzerland) 19 (2019) 445]. W ostatniej dekadzie obserwuje się ogromny postęp w opracowaniu układów PoC do rozwiązywania wielu klinicznych problemów analitycznych, w tym długiego czasu oczekiwania na wyniki oznaczeń i konieczności posługiwania się skomplikowanymi przyrządami tradycyjnej analizy laboratoryjnej [J. Canals et al., Sensors (Switzerland) 19 (2019) 445]. W przypadku urządzeń PoC przyjęto zasadę ASSURED, która zakłada, że oznaczenia mają być tanie, czułe, selektywne, przyjazne dla użytkownika, szybkie i solidne, bez użycia drogiej aparatury. Co więcej, powinny mieć postać
PL 243900 Β1 przystępną dla pacjenta [C. S. Kosack et al., Buli. World Health Organ. 95 (2017) 639], Układy PoC ułatwiają oznaczenia, zwłaszcza w diagnostyce, w której oznacza się związki biologicznie czynne [E. Amalfitano et al., Nat. Commun. 12 (2021) 1; P. B. Luppa, J. Lab. Med. 44 (2020) 59; K. Ng et al., Sci. Rep. 11,1 (2021); S. Nayak et al., Anal. Chem. 89 (2017) 102; V. Gubała et al., Anal. Chem. 84 (2012) 487; Y. Tomonaga et al., BMC Fam. Pract. 12 (2011) 12], Ostatnio w urządzeniach PoC zastosowano polimery wdrukowane molekularnie (ang. molecularly imprinted polymers, MIPs) [J. G. Pacheco et al., Sens. Actuators, B 256 (2018) 905; D. J. Denmark et al., EuroBiotech J. 4 (2020) 184; F. Cui, Z. Zhou and H. S. Zhou, Sensors 20 (2020) 996; A. Garcia-Cruz et al., Microsyst. Nanoeng. 6 (2020) 83; K. Alanazi et al., Sens. Actuators, B 329 (2021) 129128],
ΜΙΡ-y to sztuczne receptory polimerowe z wdrukowanymi wnękami molekularnymi. Wytwarza się je, m.in. jako syntetyczne imitacje przeciwciał [R. Xing et al., Nat. Protoc. 12 (2017) 964; H. Dai et al., Microchim. Acta 182 (2015) 893]. W ostatnich dekadach wdrukowanie molekularne wzbudza coraz większe zainteresowanie. W procedurze tej kształt, wielkość i rozmieszczenie miejsc rozpoznających we wnęce MIP-u odpowiada kształtowi, wielkości i rozmieszczeniu miejsc wiążących cząsteczki szablonu. Jako szablon stosuje się analit lub jego bliski analog strukturalny. ΜΙΡ-y łatwo przygotować, są stosunkowo tanie, odporne chemicznie, wysoce selektywne i czułe. Sprawia to, że są atrakcyjne jako materiały do wykrywania i oznaczania zarówno związków o małej masie cząsteczkowej [O. S. Ahmad et al., Trends Biotechnol. 37 (2019) 294; S. A. Zaidi, Drug Deliv. 23 (2016) 2262], jak i związków wielkocząsteczkowych, takich jak na przykład białka i kwasy nukleinowe, m.in. w diagnostyce [S. A. Zaidi, Drug Deliv. 23 (2016) 2262; M. Peeters et al., in Mol. Imprinted Catal. - Princ. Synth. Appl., S. Li et al. (Eds.) (Elsevier, Amsterdam, 2016), pp. 253-271; Μ. H. Loghmani et al., J. Ind. Eng. Chem. 96 (2021) 98] i rozdzielaniu substancji czynnych [X. Liu et al., Anal. Chim. Acta 727 (2012) 26; R. Gao et al., Talanta 83 (2011) 757]. Jako polimery odniesienia stosuje się polimery niewdrukowane molekularnie (ang. non-imprinted polymers, NIPs).
Dotychczas do oznaczeń cilostazolu (1) i 3,4-dehydrocilostazolu (1a)
w ludzkim osoczu stosowano tandemową spektrometrię mas z jonizacją elektrorozpyleniową (ang. electrospray ionization, ESI), ESI-(tandem-ESIMS) (R. V. Ś. Nirogi et al., Anal. Bioanal. Chem. 384 (2006) 780; K. K. V. S. Varanasi et al., J. Chromatogr. B 865 (2008) 91; N. M. Bhatt et al., J. Pharm. Anal. (2015) 1], chromatografię cieczową z detekcją za pomocą tandemowej spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpyleniową, (LC-ESIMS)/MS [S. L. Bramer et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 26 (2001) 637], wysokosprawną chromatografię cieczową (ang. high-performance liquid chromatography, HPLC) [P. N. V. Tata et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 18 (1998) 441; A. D. Lestari et al., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 27 (2004) 2603; P. K. Basniwal et al., Indian J. Pharm. Sci. 70 (2008) 222; C. J. Fu et al., J. Chromatogr. B, Biomed. Appl. 728 (1999) 251; P. N. V. Tata et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 24 (2001) 381; M. L. S. Gomes et al., Lat. Am. J. Pharm. 34 (2015) 803] i spektrofluorometrię [F. Ibrahim et al., Br. J. Pharm. Res. 12 (2016) 1]. Chociaż metody wykorzystujące HPLC i (LC-ESIMS)/MS są czułe i selektywne, to wymagają pracochłonnego przygotowania próbek, zaangażowania wysoko wykwalifikowanych operatorów, drogiej aparatury i często czasochłonnego oznaczania analitu. Inne metody, np. wykorzystujące metody optyczne (emisja w zakresie widzialnym jonów lantanowców) wymagają stosowania spektrometrów. Opisane powyżej techniki nie umożliwiają bezpośredniego ich stosowania w punktach opieki medycznej (aparatura, personel techniczny i koszt z nimi związany) do wykrywania inhibitorów agregacji płytek krwi, zwłaszcza cilostazolu. Dlatego też wydaje się konieczne opracowanie taniego, łatwego i szybkiego sposobu wykrywania i oznaczania cilostazolu i jego głównego metabolitu, w punktach opieki medycznej, który nie wymaga ani stosowania kosztowych, czasochłonnych procedur czy specjalistycznej drogiej aparatury, ani zatrudnienia wysokokwalifikowanego personelu i może być stosowany samodzielnie przez pacjenta. Przede wszystkim konieczne jest opracowanie urządzenia, które sprosta opisanym powyżej ograniczeniom.
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru zbudowanego z pochodnych ditiofenu, wdrukowana molekularnie za pomocą cilostazolu, i elektrospolimeryzowana potencjodynamicznie, charakteryzująca się tym, że jej grubość wynosi od 63 do 111 nm, korzystnie 69 (±5) nm, i jest dobrana tak, aby cilostazol był w nią wdrukowany powierzchniowo, i zawierał polimer kwasu 4-[3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9 H-karbazo-9-ylo]benzoesowego i 1,4-bis(3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9 H-karbazo-9-ylo)benzenu, jak również wdrukowane luki molekularne.
Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania warstwy rozpoznającej przewodzącego polimeru zawierającego pochodną karbazolu określoną w pierwszym przedmiocie wynalazku, obejmujący jednoczesne wdrukowanie molekularne i elektropolimeryzację potencjodynamiczną, znamienny tym, że roztwór zawierający cilostazol, kwas 4-[3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo]benzoesowy i 1,4-bis(3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9 H-karbazo-9-ylo)benzen poddaje się elektropolimeryzacji potencjodynamicznej na powierzchni elektrody metalicznej, następnie usuwa się cilostazol, przez zanurzenie elektrody w roztworze alkalicznym, korzystnie wodorotlenku sodu, przy czym przykładany potencjał w trakcie elektropolimeryzacji potencjodynamicznej na powierzchni elektrody metalicznej, następnie usuwa się cilostazol, przez zanurzenie elektrody w roztworze wodorotlenku sodu, przy czym przykładany potencjał w trakcie elektropolimeryzacji potencjodynamicznej jest liniowo zmieniany w sposób cykliczny w dwóch cyklach, w zakresie od 0 do 1,00 V względem elektrody Ag/AgCI, ze stałą szybkością w zakresie od 50 mV/s do 2 V/s, przy czym stężenie monomeru sieciującego wynosi od 0,3 mM do 0,5 mM i proces elektropolimeryzacji prowadzi się przy stężeniu elektrolitu podstawowego w zakresie stężeń od 0,01 do 1,0 M, korzystnie wynoszącym 0,1 M, przy czym stężenie cilostazolu wynosi 0,01 do 1,0 mM, korzystnie 0,1 mM.
W korzystnej realizacji wynalazku do elektropolimeryzacji stosuje się roztwór zawierający cilostazol, kwas 4-[3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9 H- karbazo-9-ylo]benzoesowy jako monomer funkcyjny, i 1,4-bis(3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo)benzen jako monomer sieciujący, i chloran(VII) tetrabutyloamoniowy jako elektrolit podstawowy.
W następnej korzystnej realizacji wynalazku stosuje się 1,4-bis(3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo)benzen jako monomer sieciujący o stężeniu w zakresie od 0,03 do 3 mM, korzystnie 0,3 mM.
W innej korzystnej realizacji wynalazku przykładany potencjał jest w trakcie elektropolimeryzacji potencjodynamicznej przykładany potencjał jest liniowo zmieniany ze stałą szybkością w zakresie od 10 mV/s do 1 V/s, korzystnie 100 mV/s.
W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku polimer osadza się na przetworniku sygnału chemicznego, którym jest elektroda pracująca wybrana spośród grupy stałych elektrod przewodzących, korzystnie platynowej lub korzystnie w postaci warstwy korzystnie złotej lub srebrnej, o grubości od 10 do 1000 nm, korzystnie ~150 nm, na podłożu tytanowym o grubości od 1 do 100 nm, korzystnie ~15 nm, osadzonej na płytce szklanej.
W jeszcze innej korzystnej realizacji wynalazku pokrytą warstwą MlP-u zanurza się w roztworze wodorotlenku sodu o stężeniu w zakresie od 1 mM do 1,0 M, korzystnie 10 mM na 1 do 60 min, korzystnie 30 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć z niej szablon - cilostazol.
Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie warstwy rozpoznającej, zdefiniowanej w zastrz. 1 lub otrzymanej według zastrz. 2 jako element rozpoznający przetwornika elektrochemicznego, korzystnie złoconej płytki szklanej albo złoconej elektrody metalicznej, korzystnie elektrody metalowej, jeszcze korzystniej elektrody platynowej, do wykrywania i oznaczania inhibitora agregacji płytek krwi, którym jest cilostazol, i/lub jego główny aktywny metabolit, którym jest 3,4-dehydrocilostazol, w roztworach badanych próbek rzeczywistych, korzystnie próbek osocza krwi.
Przez elektrodę metaliczną, w odniesieniu do wynalazku, należy rozumieć elektrodę, która zawiera warstwę metaliczną, np. złotą, srebrną lub z innej substancji tworzącej warstwę o uporządkowanej strukturze zdolnej do przewodzenia prądu elektrycznego naniesioną na podłoże, np. płytkę szklaną, lub elektrodę wykonaną w całości z metalu, np. elektrodę platynową.
Przykłady realizacji wynalazku zobrazowano na rysunku, gdzie:
Figura 1 przedstawia wielocykliczne krzywe potencjodynamiczne dla (a) cilostazolu (1), (b) monomeru sieciującego 2 i (c) monomeru funkcyjnego 3 zarejestrowane za pomocą platynowej elektrody dyskowej o średnicy 0,75 mm przy szybkości zmian potencjału 100 mV s-1; krzywe (d) woltamperometrii cyklicznej (ang. cyclic voltammetry, CV) i (e) różnicowej woltamperometrii pulsowej (ang. differential pulse voltammetry, DPV) dla 10 mM ferrocenu i 0,1 M (TBA)CIO4 w dichlorometanie (ang. dichloromethane, DCM) na (1, 1') niepokrytej elektrodzie i (2, 2') elektrodzie pokrytej warstwą MlP-u;
Figura 2 przedstawia krzywe DPV zarejestrowane za pomocą platynowych elektrod dyskowych o średnicy 0,75 mm pokrytych warstwą (a) MIP-u i (b) NIP-u (1, 1') z wyekstrahowanym szablonem cilostazolu (1), w roztworze (2, 2') 50, (3, 3') 99,8, (4, 4') 134, (5, 5') 402, (6, 6') 665,9 i (7, 7') 923,6 nM 1, 10 mM ferrocenu i 0,1 M (TBA)CIO4 w DCM; (c) krzywe kalibracyjne DPV dla analitu 1 (cilostazolu) skonstruowane za pomocą elektrod pokrytych warstwą (1) MIP-u z wyekstrahowanym szablonem 1 i (2) NIP-u; (d) wykresy kalibracyjne DPV dla elektrody pokrytej warstwą MIP-u z wyekstrahowanym szablonem 1 dla (1) 3,4-dehydrocilostazolu (1a), (2) cholesterolu (6), (3) 3,4-dehydroaripiprazolu (7) w 10 mM ferrocenie i 0,1 M (TBA)CIO4 w DCM oraz (4) w ludzkim osoczu, które było 10 mM względem ferrocenu i 0,1 M względem (TBA)CIO4 w DCM; (e) wzory strukturalne badanych substancji przeszkadzających (6 - cholesterol; 7 - 3,4-dehydroaripiprazol) w oznaczaniu analitu 1 (cilostazol);
Figura 3 przedstawia wymodelowaną strukturę wnęki molekularnej wdrukowanej cilostazolem (1) (MIP-1); (a) model szkieletowy (b) rozkład molekularnego potencjału elektrostatycznego (ang. molecular electrostatic potential, MEP) na powierzchni wnęki: ładunek dodatni (po prawej stronie wejścia wnęki, na górze i na dole) i ujemny (po lewej stronie wejścia wnęki), (c) szkieletowy model wnęki z cząsteczką 1 wraz z symulacją oddziaływań tej wnęki z cząsteczką 1 oraz (d) model wnęki z cząsteczką 1 uwzględniający oddziaływania z dichlorometanem;
Figura 4 przedstawia modele szkieletowe wnęki molekularnej z uwidocznionymi oddziaływaniami międzycząsteczkowymi (zaznaczonymi liniami przerywanymi) z (a) 1a, (b) 7 i (c) 6 (struktury po stronie lewej). Ilustracja różnic konformacyjnych we wnęce nanoMIP-1 między cilostazolem (1) a substancjami przeszkadzającymi w jego oznaczaniu (struktury po stronie prawej), (d) 1a (e) 7 i (f) 6 (cząsteczkę cilostazolu zaznaczono na czarno a substancji przeszkadzających na szaro);
Figura 5 przedstawia wzory strukturalne monomeru sieciującego 1,4-bis (3,6-di(tiofen-2-yl)-9 H-karbazol-9-yl)benzenu (2) oraz monomerów funkcyjnych, tj. kwasu 4-[3,6-di(tiofen-2-ylo)-9 H-karbazo-9-ylo]benzoesowego (3), 3,6-di(tiofen-2-ylo)-9-(benzylo)-9H-karbazolu (4) i 3,6-bis(tiofen-2-yl)-9-(4-naftalen-2-ylo)-9H-karbazolu (5);
Figura 6 przedstawia dwucyklowe krzywe potencjodynamiczne osadzania warstw (a) MIP (b) NIP na elektrodach dyskowych Pt o średnicy 0,75 mm przy szybkości zmian potencjału 100 mV/s; do elektropolimeryzacji zastosowano roztwór DCM (a) 0,1 mM cilostazolu (1), (a, b) 0,3 mM monomeru funkcyjnego 2, 0,3 mM monomeru sieciującego 3 i 0,1 M (TBA)CIO4;
Figura 7 przedstawia zdjęcie mikroskopii sił atomowych (ang. atomic force microscopy, AFM) warstw (a, b) MIP-u i (c, d) NIP-u (a, c) naniesionych na elektrodę o strukturze: (szklana płytka)/warstwa Ti (grubość ~15 nm)/warstwa Au (grubość ~150 nm), (a, c) przed i (b, d) po 30-minutowej ekstrakcji 1 za pomocą 10 mM NaOH.
1. Materiały i metody
1.1. Odczynniki
Cilostazol (1) został zsyntetyzowany w Zakładzie Chemii Sieci Badawczej Łukasiewicz - Instytutu Farmaceutycznego, a ferrocen, nadchloran tetrabutyloamoniowy [(TBA)CIO4] i bezwodny dichlorometan (DCM) o czystości elektrochemicznej zakupiono w firmie Sigma-Aldrich. Analitycznie czysty NaOH zakupiono z firmy Chempur. Wzorce odniesienia do bioanalizy, tj. chlorowodorek 3,4-dehydroarypiprazolu, arypiprazol-d i 3,4-dehydrocilostazol 1a, pochodziły z Toronto Research Chemicals, Kanada.
1.2. Synteza monomerów
Synteza monomeru sieciującego, tj. 1,4-bis(3,6-di(tiofen-2-yl)-9H-karbazo-9-yl)benzenu (2), i monomeru funkcyjnego, tj. kwasu 4-[3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo]benzoesowego (3), jest opisana w literaturze [M. Gajda et al., Biosens. Bioelectron. 169 (2020) 112589].
1.3. Aparatura badawcza, techniki i procedury
Do pomiarów elektrochemicznych zastosowano skomputeryzowany zestaw elektrochemiczny, w skład którego wchodził potencjostat/galwanostat SP-300 firmy Bio-Logic SAS, sterowany oprogramowaniem EC-Lab V10.37 tego samego producenta. W pomiarach tych zastosowano trójelektrodowe jednokomorowe szklane mininaczynko elektrochemiczne w kształcie litery V. Platynowy dysk o średnicy 0,75 mm, zatopiony w rurce z miękkiego szkła oraz druty Ag i Pt służyły, odpowiednio, jako elektroda pracująca, quasi-odniesienia i pomocnicza. Naczynko oraz elektrodę pracującą, pomocniczą i quasi-odniesienia zaprojektowano i wykonano w IChF PAN.
Powierzchnie warstw MIP-1, NIP i MIP-1 z wyekstrahowanym 1 zostały zobrazowane za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) przy użyciu mikroskopu Nova NanoSEM 450 FEI Nova
PL 243900 Β1 i mikroskopii sił atomowych (AFM) przy użyciu mikroskopu MultiMode 8 AFM ze sterowaniem za pomocą kontrolera Nanoscope V, oba firmy Bruker. Do zobrazowania próbki w trybie Tapping Modę™ zastosowano ostrze krzemowe domieszkowane antymonem ze wspornikami (ang. cantilevers) o częstotliwości rezonansowej 376 kHz i stałej siłowej k = 60 N/m.
W symulacjach komputerowych wykorzystano program Discovery Studio 2017R2 z interfejsem wizualnym BIOVIA. W pierwszym etapie wszystkie cząsteczki będące składnikami testowanych układów zoptymalizowano w programie Gaussian 09 stosując teorię funkcjonału gęstości (ang. density functional theory, DFT) z funkcjonałem hybrydowym B3LYP/6-311G(d,p), w temperaturze standardowej z uwzględnieniem cząsteczek rozpuszczalnika, dichlorometanu (DCM). Elektrostatyczne potencjały (ang. electrostatic potentials, ESPs) ładunków cząstkowych zgromadzonych na poszczególnych atomach badanych cząsteczek wyznaczono stosując model Brenemana [C.M. Breneman et al., J. Comput. Chem. 11 (1990) 361]. W celu utworzenia modeli trzech kompleksów pre-polimeryzacyjnych cilostazolu (1), tj. kompleksu 1 z kwasem 4-[3,6-di(tiofen-2-ylo)-9/-/-karbazo-9-ylo]benzoesowym (3)- PPC1, z 3,6-di(tiofen-2-ylo)-9-(benzylo)-9/-/-karbazolem (4) - PPC2 i z 3,6-bis(tiofen-2-yl)-9-(4-naftalen-2-ylo)-9/-/-karbazolem (5) - PPC3, modelu wnęki w MIP-1 i analizy selektywności warstwy MIP-1 chemoczujnika wykonano obliczenia za pomocą dynamiki molekularnej (ang. molecular dynamics, MD) stosując pole siłowe CHARMM (ang. Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics, CHARMM). W symulacjach MD efekt solwatacji uwzględniono w modelu explicite dodając 550 cząsteczek DCM do wszystkich wymodelowanych układów za pomocą oprogramowania PACKMOL (zarówno syntezę polimeru jak i sorpcję analitu wymodelowano z zastosowaniem rozpuszczalnika, DCM).
Aby utworzyć modele kompleksów pre-polimeryzacyjnych PPC1, PPC2 i PPC3, szablon (cilostazol 1) otoczono, kolejno, sześcioma cząsteczkami monomeru funkcyjnego 3, 4 lub 5, rozmieszczonymi losowo, po czym po optymalizacji entalpii swobodnej układów, wybrano trzy cząsteczki monomeru funkcyjnego, które najsilniej oddziaływały, poprzez wiązania wodorowe i kontakty typu π-π z szablonem 1, tworząc układy o stosunku molowym 1:3. Tak zdefiniowane modele kompleksów szablonu z monomerem funkcyjnym zoptymalizowano na poziomie MD, a następnie wprowadzono do nich sześć cząsteczek monomeru sieciującego 2 w losowo wybranych miejscach. Wszystkie układy zoptymalizowano przy nałożeniu dodatkowych ograniczeń na cząsteczkę szablonu i cząsteczki monomeru funkcyjnego w celu zachowania zadanych struktur kompleksów (więzy o stałej siłowej 83,74 kJ/mol A2). Następnie wybrano trzy cząsteczki monomeru sieciującego 2 najsilniej oddziałujące z cząsteczkami układów i otrzymano kompleksy pre-polimeryzacyjne PPC1, PPC2 i PPC3 o stechiometrii zastosowanej w doświadczalnej procedurze syntetycznej (1:3: 3). Po optymalizacji metodą MD w obecności cząsteczek DCM wyznaczono zmiany entalpii swobodnej AGc związanej z tworzeniem kompleksów pre-polimeryzacyjnych według Równania 1
AGc — AGkompleks — AGszablan 3· AGmonomer funkcyjny 3-AGmonomer sieciujący (1) gdzie, AGkompleks OdnOSI Się do energii PPC a AGszablon AGmonomer funkcyjny i AG monomer sieciujący to Zmiana entalpii swobodnej towarzysząca tworzeniu, odpowiednio, wolnego szablonu, monomeru funkcyjnego i monomeru sieciującego.
Z zastosowaniem najtrwalszego kompleksu (PPC1) zbudowanego z monomeru funkcyjnego 3 i monomeru sieciującego 2, który przewidziano jako odpowiedni do utworzenia selektywnej warstwy polimerowej, skonstruowano model wnęki w warstwie MIP-1. Model ten umożliwia przeprowadzenie analizy sorpcji analitów i związków przeszkadzających w oznaczeniach analitów. Model ten zbudowano poprzez symulację elektropolimeryzacji, jak opisano w pracy M. Gajda et al., Biosens. Bioelectron. 169 (2020) 112589. Po usunięciu szablonu 1 z MIP-u, zoptymalizowaną strukturę kompleksu przyjęto jako model wnęki sorpcyjnej (Figura 3a i 3b). Przeanalizowano sorpcję dwóch docelowych substancji, tj. cilostazolu (1) i jego metabolitu 1a oraz dwóch potencjalnych składników próbek biologicznych, tj. cholesterolu (6) i 3,4-dehydroarypiprazolu (7), które mogą zakłócać oznaczanie 1 i 1a. Sorpcja była symulowana na poziomie MD, przy nałożeniu więzów o stałej siłowej 418,68 kJ/mol A2 na cząsteczki tworzące wdrukowaną wnękę molekularną. Natomiast cząsteczki oddziałujące z wnęką pozostawiono swobodne, w ten sposób naśladując proces sorpcji. Po przeprowadzeniu procedury MD, z uwzględnieniem rozpuszczalnika DCM, obliczono zmianę entalpii swobodnej (AGbind) sorpcji analitów za pomocą Równania 2.
AGbind — AGuktad AGwnęka AGanalit (2) gdzie ΔGukiad, ΔGwnęka, ΔGanaiit to zmiana entalpii swobodnej wskutek sorpcji, odpowiednio, analitu oddziałującego z wnęką, wolnej wnęki i wolnego analitu.
Wszystkie pomiary woltamperometrii cyklicznej (ang. cyclic voltammetry, CV) i różnicowej woltamperometrii pulsowej (ang. differential pulse voltammetry, DPV) przeprowadzono w temperaturze pokojowej, 20 (±1) °C, stosując mininaczynko elektrochemiczne z dichlorometanowym roztworem 10 mM ferrocenowego próbnika redoks i 0,1 M chloranu(VII) tetrabutyloamoniowego, (TBA)CIO4., elektrolitu podstawowego. W pomiarach DPV potencjał zmieniany był krokowo (ang. stepwise) od 0 do 0,70 V względem Ag/AgCI co 5 mV. Amplituda zastosowanych 50-ms pulsów napięcia wynosiła 25 mV.
1.4 Synteza i osadzenie warstwy MIP-u wdrukowanego cilostazolem (1) i warstwy NIP-u na elektrodach
MIP zsyntetyzowano i jednocześnie osadzono w postaci cienkiej warstwy na powierzchni elektrody w warunkach potencjodynamicznych (Figura 6a). Do elektropolimeryzacji zastosowano roztwór, w którym rozpuszczalnikiem był DCM, i który to roztwór był 0,1 mM względem szablonu 1, 0,3 mM względem monomeru funkcyjnego 3, 0,3 mM względem monomeru sieciującego 2 i 0,1 M względem elektrolitu podstawowego, (TBA)CIO4. Przeprowadzono dwa cykle potencjałowe od 0 do 1,0 V względem quasi-referencyjnej elektrody Ag przy szybkości zmian potencjału 100 mV/s (Figura 6a). W tych warunkach warstwa osadzonego polimeru osiągnęła pożądaną grubość ~100 nm. Następnie elektrodę dwukrotnie przepłukano rozpuszczalnikiem, DCM. W końcu szablon 1 wyekstrahowano z MIP-u za pomocą 10 mM NaOH przez 30 min w temperaturze pokojowej (Figura 2a). Warstwy NIP-u osadzono w nieobecności szablonu 1 (Figura 6b), ale poddano je takiemu samemu działaniu jak warstwy MIP-u. Warstwy polimerów osadzono na elektrodach dyskowych Pt o średnicy 0,75 mm lub na płytkach szklanych z naparowaną warstwą złota na podłożu tytanowym. Przed elektropolimeryzacją elektrody Pt oczyszczono roztworem „Pirania”. Następnie powierzchnię elektrod Pt zmatowiono papierem ściernym o uziarnieniu 1000. Przed użyciem, płytki szklane pokryte warstwą Au najpierw oczyszczono roztworem „Piranii”, następnie przemyto wodą, po czym izopropanolem i w końcu wysuszono na powietrzu.
1.5 Przygotowanie próbek rzeczywistych
Osocze pobrano od zdrowych ochotników. Roztwór podstawowy cilostazolu (1) w osoczu przygotowano przez dodanie 1 o znanym stężeniu do tego osocza, po czym rozcieńczono go za pomocą DCM. Otrzymaną mieszaninę wytrząsano za pomocą mieszacza wirowego (ang. vortex) przez kilka minut, po czym pozostawiono ją do rozdzielenia się fazy organicznej i wodnej. Następnie zebrano fazę organiczną zawierającą 1 wyekstrahowany z wodnej fazy osocza. W końcu fazę organiczną wirowano przez 10 min przy przeciążeniu 10 000 g, aby oddzielić, najprawdopodobniej białkową, stałą pozostałość. Z tak otrzymanego roztworu, do pięciu fiolek odpipetowano próbki o różnych objętościach i rozcieńczono DCM. W ten sposób otrzymano roztwory 1 w zakresie stężeń od 50 do 800 nM. Do każdego z nich dodano następnie ferrocen i (TBA)CIO4 tak, aby ich stężenie wynosiło, odpowiednio, 10 mM i 0,1 M. Po czym w tych roztworach oznaczono 1.
2.1. Charakterystyka elektrochemiczna cilostazolu oraz monomerów funkcjonalnych i sieciujących
Pomyślne osadzanie trwałej warstwy MIP-u na elektrodzie Pt potwierdzono za pomocą zmiany prądu faradajowskiego dla ferrocenowego próbnika redoks w DCM (Figura 1d i 1e). To znaczy, różnica potencjałów pików anodowych i katodowych CV zarejestrowanych za pomocą elektrody Pt pokrytej warstwą MIP-u (krzywa 2 na Figurze 1d) była znacznie większa niż za pomocą niepokrytej elektrody Pt (krzywa 1 na Figurze 1 d), a prąd piku DPV dla elektrody Pt pokrytej warstwą MIP-u (krzywa 2' na Figurze 1 e) był znacznie niższy niż dla niepokrytej elektrody Pt (krzywa 1' na Figurze 1e).
2.2. Potwierdzenie usunięcia szablonu cilostazolu z MIP-u
Z warstwy MIP-u szablon 1 usunięto za pomocą 30-min ekstrakcji roztworem 10 mM NaOH w temperaturze pokojowej. Po ekstrakcji prąd piku DPV ferrocenowego próbnika redoks znacznie zmalał (Figura 2a).
Wyznaczona za pomocą AFM (Figura 7) grubość i szorstkość warstwy MIP-u wynosiła, odpowiednio, 96 (±2) i 12,7 (±0,3) nm. Usunięcie 1 z MIP-u spowodowało zmniejszenie grubości warstwy do 69 (±5) nm, podczas gdy szorstkość wzrosła do 13,8 (±1) nm. Może to wskazywać albo na usunięcie najbardziej zewnętrznej części warstwy MIP-u, albo obkurczenie się warstwy w wyniku ekstrakcji 1. Grubość i szorstkość tak przygotowanej warstwy NIP-u wynosiły, odpowiednio, 44 (±6) i 9,5 (±0,1) nm. A po ekstrakcji 1, szorstkość warstwy NIP-u zmniejszyła się do 7,6 (±0,2) nm. Tak więc warstwa ta stała się bardziej jednorodna. Ogólnie, zarówno warstwa MIP-u, jak i NIP-u jest stosunkowo jednorodna, każda złożona z ziaren o nieregularnych kształtach. Średnia wielkość ziarna warstwy MIP-u i NIP-u jest podobna; wynosi bowiem, odpowiednio, 87 (±24) i 79 (±20) nm. Ekstrakcja szablonu 1 tylko w nieznacznym stopniu tę wielkość zmienia, prowadząc do wielkości 86 (±24) i 83 (±22) nm, odpowiednio, dla MIP-u i NIP-u. Zastosowano stosunkowo cienkie warstwy MIP-u i NIP-u. Ma to swoje uzasadnienie w tym, że współczynniki dyfuzji substancji w polimerze są o ok. trzy rzędy wielkości niższe niż w roztworach. Dlatego im cieńsza jest warstwa polimeru tym szybciej cząsteczki analitu obsadzają jego wdrukowane wnęki molekularne i odpowiedź analityczna czujnika jest szybsza. Innymi słowy, równowaga sorpcji osiągnięta jest szybciej. Ma to znaczenie zwłaszcza wówczas, jeżeli elektroda pokryta warstwą MIP-u jest zastosowana jako detektor w analitycznych układach przepływowych, np. analizie przepływowo-wstrzykowej (ang. - flow injection analysis, FIA).
2.3. Elektrochemiczne oznaczanie cilostazolu za pomocą elektrod pokrytych warstwą MIP-u
Po dodaniu 1 do roztworu ferrocenu w DCM, cząsteczki 1 oddziałują z komplementarnymi do nich molekularnymi lukami rozpoznającymi w warstwie MIP-u, z której wyekstrahowany jest szablon 1. To oddziaływanie prowadzi do obniżenia prądu piku DPV (Figura 2a). Obniżenie to jest tym wyraźniejsze, im wyższe jest stężenie 1 w roztworze (krzywe 1-7 na Figurze 2a). Znormalizowany prąd piku DPV [(/dpv,o - /dpv,s)//dpv,o, gdzie /dpv,o i /dpv,s to, odpowiednio, początkowy i aktualny, tj. przy danym stężeniu 1, prąd piku DPV] liniowo zależał od logarytmu stężenia 1 w rozpatrywanym zakresie stężeń. Za pomocą półlogarytmicznego równania regresji (/dpv,o - /dpv,s)//dpv,o = 0,32 (±0,03) [1/log μM] x C cilostazol [log μM] + 0,58(±0,02) opisany jest wykres kalibracyjny (krzywa 1 na Figurze 2c). Współczynnik korelacji i czułość wynosiły, odpowiednio, R2 = 0,927 i 0,32 (±0,03) [1/log μM]. Liniowy dynamiczny zakres stężeniowy (ang. linear dynamic concentration range) rozciągał się od 65 do 923,6 nM 1 przy LOD = 15 nM.
W przypadku elektrody pokrytej warstwą NIP-u, znormalizowane prądy pików DPV dla 1, przy podobnych stężeniach, były niższe (krzywa 2 na Figurze 2c). Czułość wyniosła 0,03 (±0,01) [l/log μM]. Wynik ten pośrednio potwierdza skuteczne wytworzenie wnęk molekularnych w MIP-ie. Pozorny współczynnik wdrukowania 1, obliczony ze stosunku nachyleń prostych kalibracyjnych dla elektrod pokrytych warstwami MIP-u i NIP-u, byt stosunkowo wysoki, wynosił bowiem IF = 10,6.
W celu oszacowania selektywności rozpoznawania molekularnego wdrukowanych w MIP-ie wnęk, przeprowadzono badania reaktywności konkurencyjnej (ang. cross-reactivity study) chemosensora względem typowych substancji przeszkadzających w oznaczaniu 1, występujących w próbkach biologicznych (Figura 2e). Korzystnie, selektywność względem strukturalnie podobnego analogu 1, takiego jak 3,4-dehydroaripiprazol 7 (krzywa 3' na Figurze 2d), była wysoka; wyniosła aż 8,0. Oznacza to, że 7 praktycznie nie przeszkadza w oznaczeniach 1. Korzystnie również, selektywność względem głównego metabolitu 1, tj. 3,4-dehydrocilostazolu (1a), była bardzo niska, wynosiła ~1,06 (krzywa 1' na Figurze 2d). Tak więc chemosensor, korzystnie, nie jest selektywny względem 1a. Dlatego, korzystnie, metabolit ten można oznaczyć razem z 1. Jednakże, niestety, wyznaczona niska selektywność, wynosząca 1,52, względem cholesterolu (6) (krzywa 2' na Figurze 2d) wskazuje, że chemosensor nie jest wysoce selektywny względem tej substancji przeszkadzającej. Wynika to przypuszczalnie stąd, że cząsteczka 6 jest mniejsza od cząsteczki 1. Dlatego łatwo może ona wnikać do wdrukowanej cilostazolem wnęki molekularnej MIP-u.
2.4. Sprawność oznaczania 1 w ludzkim osoczu za pomocą chemoczujnika MIP
Aby czujnik chemiczny można było zastosować do oznaczania analitu w próbce rzeczywistej należy oszacować wpływ matrycy tej próbki na to oznaczanie. W związku z tym w niniejszych badaniach elektrodę pokrytą warstwą MIP-u zastosowano do oznaczenia 1 w ludzkim osoczu. Do osocza (2 ml) dodano tyle 1, aby jego stężenie wynosiło 1 mM. Po czym tak otrzymaną mieszaninę wytrząsano wirowo aż do całkowitego rozpuszczenia 1. Następnie z roztworu tego wyekstrahowano 1 za pomocą DCM (2 ml) w temperaturze pokojowej. Warstwę organiczną zebrano do oddzielnej fiolki i odwirowano, aby usunąć szlam - przypuszczalnie pozostałości białka. Następnie roztwór znad osadu rozcieńczono roztworem ferrocenu w DCM tak, aby stężenie ferrocenu osiągnęło wartość 10 mM.
Chemosensor okazał się przydatny do oznaczania 1 w rzeczywistych próbkach ludzkiego osocza (krzywa 4' na Figurze 2d). Co więcej, nachylenie skonstruowanej krzywej kalibracyjnej, wynoszące 0,39 (±0,03) [1/log μM], było tylko nieznacznie niższe niż nachylenie krzywej 0,32 (±0,02) [1/log μM] w przypadku roztworu niezawierającego osocza (krzywa 1 na Figurze 2c).
PL 243900 Β1
Ponadto wyznaczono parametry oddziaływania analitu 1 z ΜΙΡ-em, z którego wyekstrahowano szablon 1. W przypadku oddziaływań MIP-u z analitem, najczęściej izoterma Langmuira, Freundlicha lub Langmuira-Freundlicha dokładnie opisuje te oddziaływania [R. J. Umpleby et al., J. Chromatogr. B 804 (2004) 141]. Dlatego wszystkie trzy izotermy zostały tutaj przetestowane w celu ilościowego opisania zależności znormalizowanego prądu piku DPV od stężenia 1 w ferrocenowym roztworze DCM. Okazało się, że izoterma Langmuira najlepiej pasowała do danych doświadczalnych. Oznacza to, że cząsteczka 1 silniej oddziałuje z wdrukowaną wnęką molekularną MIP-u niż z inną cząsteczką 1 znajdującą się w warstwie MIP- u.
2.5. Zdolność chemosensora do selektywnego oznaczania cilostazolu
Zastosowanie chemosensora do oznaczania analitu 1 w próbkach rzeczywistych wymaga określenia jego selektywności względem występujących w tych próbkach substancji przeszkadzających w jego oznaczaniu. Zagadnienie to można modelować symulując sorpcję analitu i substancji przeszkadzających przez wdrukowane wnęki MIP-u. W tym celu w niniejszych badaniach w modelu MIP-1 utworzono wnękę molekularną wykorzystując złożoną strukturę PPC1 (szczegóły są podane w Rozdziale 2.3). Obliczoną zmianę entalpii swobodnej (AGbind) i doświadczalnie wyznaczoną selektywność MIP-1 dla wszystkich badanych związków porównano w Tabeli 1.
Tabela 1. Wyznaczona selektywność wnęki MIP-1 względem metabolitu cilostazolu 1a i substancji przeszkadzających oraz obliczone zmiany entalpii swobodnej (AGbind) towarzyszące kompleksowaniu wnęki modelu MIP-1 przez metabolit 1a i substancje przeszkadzające.
| Związek | Selektywność | |
| Wyznaczona doświadczalnie, DPV | Obliczona AGbind, kJ/mol | |
| Cilostazol (1) | - | -159.29 |
| 3,4-Dehydrocilostazol (la) | -1.06 | -153.77 |
| Cholesterol (6) | 1.52 | -140.75 |
| 3,4-Dehydroarypiprazol (7) | 8.00 | -90.74 |
Przewidywane powinowactwo 1 i jego metabolitu lado MIP-1 jest, korzystnie, wysokie i podobne, podczas gdy przewidywane powinowactwa substancji przeszkadzających, 3,4-dehydroarylopiprazolu (7) są znacznie niższe. Natomiast cholesterol (6) może przeszkadzać w oznaczeniach 1 i 1a.
Oddziaływania wnęki z cząsteczką ulegającą sorpcji i umiejscowienie tej cząsteczki we wnęce mogą wyjaśnić przyczyny różnic w powinowactwie wnęki do różnych cząsteczek sorbowanych. Cząsteczki cilostazolu (1) i jego metabolitu 1a zajmują podobne miejsca we wnęce, a ich konformacje są prawie takie same. Stąd oddziaływania międzycząsteczkowe są podobne. Powstaje jedno silne wiązanie wodorowe pomiędzy pierścieniem tetrazolowym cząsteczki 1 i grupą karboksylową cząsteczki 2 (długość 2,62 A) oraz jedno nieklasyczne wiązanie wodorowe (π-donorowe) pomiędzy grupą NH cząsteczki 1 i pierścieniem tiofenowym cząsteczki monomeru 3 (długość 3,20 A); oba utrzymują cząsteczkę 1 we wnęce. Pomiędzy aromatycznymi pierścieniami chinolin cząsteczki 1 i aromatyczną strukturą trójpierścieniową karbazolu cząsteczki 3 występują oddziaływania π-π (długość 4,05 do 5,81 A). Ponadto, pomiędzy pierścieniem tetrazolowym cząsteczki 1 i trójcyklicznym pierścieniem karbazolowym lub benzenowym cząsteczek 2 lub 3 tworzą się hydrofobowe oddziaływania typu π-π w kształcie litery T (ang. π-π T-shaped) i π-π skumulowane (Figura 3c i 3d).
Podobnie jak cząsteczka cilostazolu (1), tak i cząsteczka jego metabolitu 1a oddziałuje z dwoma cząsteczkami monomeru funkcjonalnego i trzema cząsteczkami monomeru sieciującego (Figura 4a). Jednak niewielkie różnice orientacji cząsteczki 1 i cząsteczki 1a we wnęce sprawiają, że oddziaływania hydrofobowe cząsteczki 1a z pierścieniem tetrazolowym (długość 5,65 do 5,34 A) i ugrupowaniem chinolin (długość 4,65 do 5,99 A) wnęki są w przypadku cząsteczki 1a nieco słabsze. Ponadto cząsteczkę
PL 243900 Β1
1a utrzymuje we wnęce tylko jedno silne wiązanie wodorowe pomiędzy ugrupowaniem tetrazolowym cząsteczki 1a i grupą karboksylową cząsteczki 3 (długość 2,29 A).
Analiza sorpcji cholesterolu (6) przez MIP-1 wykazała, że cząsteczka 6 może do pewnego stopnia konkurować z cząsteczkami 1 i 1 a o miejsce we wnęce. Jednakże jej oddziaływania z wnęką są słabsze, ponieważ jest częściowo posadowiona poza wnęką. Cząsteczka 6 (Figury 4c i 4f) tworzy jedynie oddziaływania typu π-alkilowego (długość 4,16 do 5,42 A) natomiast nie tworzy wiązań wodorowych z wnęką MIP-u. Powinowactwo wnęki do 3,4-dehydroaripiprazolu (7) jest najniższe ze względu na wydłużoną konformację, którą cząsteczka 7 przyjmuje we wnęce. Cząsteczka 7 tworzy oddziaływania π-π typu stosu pomiędzy cząsteczką DCM (długość 3,97 do 4,60 A), ugrupowaniem chinolin (długość 4,31 do 5,53 A) i trójcyklicznym fragmentem ugrupowania karbazolowego cząsteczki 2 lub 3. Pomiędzy atomem azotu ugrupowania piperazyny cząsteczki 7 i pierścieniem aromatycznym monomeru 3 tworzy się jedno π-kationowe oddziaływanie elektrostatyczne (Figury 4b i 4e). A więc warstwa MIP-1 nadaje się jako element rozpoznający chemosensora elektrochemicznego do selektywnego oznaczania 1 i 1a w obecności substancji przeszkadzających 6 i 7.
3. Wnioski
Wybrane elektroaktywne monomery funkcyjne karbazolu modyfikowane tiofenem okazały się skuteczne w molekularnym wdrukowywaniu cilostazolu (1) w polimer otrzymany po ich spolimeryzowaniu. Osadzona na elektrodzie cienka warstwa MIP-u sprawdziła się jako jednostka rozpoznająca elektrochemicznego czujnika chemicznego do selektywnego oznaczenia 1. Zależność znormalizowanego prądu piku DPV próbnika ferrocenowego redoks od logarytmu stężenia 1 była liniowa w zakresie stężeń od 65 do 923 nM 1. Osiągnięta dolna granica wykrywalności LOD = 15 nM 1 jest znacznie niższa od wartości progowej 135 nM 1 przyjętej w analityce klinicznej (Tabela 2).
Tabela 2. Porównanie stosowanych w niniejszych badaniach metod analitycznych oznaczania cilostazolu (1) i jego głównego aktywnego metabolitu 1a z najważniejszymi metodami opisanymi w literaturze.
| Skład chemosensora lub jego zasada oznaczania | Liniowy dynamiczny zakres stężeniowy cilostazolu | Granica wykrywalności (LOD) | Metoda wykrywania | Odnośniki |
| Warstwa MIP-u | 50-923.6 nM | 65 nM | Elektrochemiczna (DPV) | Wg wynalazku |
| nanoMIPs@polityramina | 134 nM - 2.58 pM | 181 nM (DPV) 90.4 nM (EIS)n | Elektrochemiczna (DPV, EIS) | Stan techniki |
| Bizmut/wielościenne nanorurki węglowe | 2.1 - 33.8 pM | 2.057 pM | Elektrochemiczna (CV) | b |
| Wzmocnienie zielonej emisji Tb3+ | 1nM- 1pM | 0.75 nM | Optyczna (luminescencja) | c |
| Węglowa elektroda pastowa | 0.4 - 6.4 pM | 0.4 μΜ | Elektrochemiczna (DPV) | d |
Electrochemical impedance spectroscopy, EIS bR. Jain and R. Sharma, J. Appl. Electrochem. 42 (2012) 341.
CM. S. Attia et al., J. Fluoresc. 21 (2011) 2229.
°A. Wassel et al., Ana!. Bioanal. Electrochem. 4 (2012) 197.
Chemosensor według wynalazku może być zastosowany w praktyce klinicznej. Ponadto może być zastosowany w punktach opieki (PoC) ze względu na krótki czas (~5 min) oznaczenia 1, prostotę obsługi i niski koszt, oraz z uwagi na to, że spełnia wszystkie inne niezbędne funkcje monitorowania pacjenta w domu. Co więcej, odpowiedź chemoczujnika na aktywny główny metabolit 1, tj. 3,4-dehydrocilostazol (1a), jest prawie taka sama, jak odpowiedź na analit 1 (cilostazol). Symulacje komputerowe pozwoliły zinterpretować rozpoznawanie chemosensora i jego selektywność na poziomie molekularnym.
Claims (8)
- Zastrzeżenia patentowe1. Warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru pochodnych ditiofenu, wdrukowana molekularnie za pomocą cilostazolu, i elektrospolimeryzowana potencjodynamicznie, znamienna tym, że jej grubość wynosi od 63 do 111 nm, korzystnie 69 (±5) nm, i jest dobrana tak, aby cilostazol byt wdrukowany powierzchniowo, i zawiera polimer kwasu 4-[3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo]benzoesowego i 1,4-bis(3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo)benzenu, jak również wdrukowane luki molekularne.
- 2. Sposób wytwarzania warstwy rozpoznającej przewodzącego polimeru pochodnej ditiofenu określonej w zastrz. 1, obejmujący jednoczesne wdrukowywanie molekularne i elektropolimeryzację potencjodynamiczną, znamienny tym, że roztwór zawierający cilostazol, kwas 4-[3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo]benzoesowy i 1,4-bis(3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo)benzen poddaje się elektropolimeryzacji potencjodynamicznej na powierzchni elektrody metalicznej, następnie usuwa się cilostazol, przez zanurzenie elektrody w roztworze wodorotlenku sodu, przy czym przykładany potencjał w trakcie elektropolimeryzacji potencjodynamicznej jest liniowo zmieniany w sposób cykliczny w dwóch cyklach, w zakresie od 0 do 1,00 V względem elektrody Ag/AgCI, ze stałą szybkością w zakresie od 50 mV/s do 2 V/s, przy czym stężenie monomeru sieciującego wynosi od 0,3 mM do 0,5 mM i proces elektropolimeryzacji prowadzi się przy stężeniu elektrolitu podstawowego w zakresie stężeń od 0,01 do 1,0 M, korzystnie wynoszącym 0,1 M, przy czym stężenie cilostazolu wynosi 0,01 do 1,0 mM, korzystnie 0,1 mM.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do elektropolimeryzacji stosuje się roztwór zawierający cilostazol, kwas 4-[3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9 H-karbazo-9-ylo]benzoesowy jako monomer funkcyjny, i 1,4-bis(3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9 H-karbazo-9-ylo)benzen, jako monomer sieciujący, i chloran(VII) tetrabutyloamoniowy, jako elektrolit podstawowy.
- 4. Sposób według dowolnego z zastrz. 2-3, znamienny tym, że stosuje się 1,4-bis(3,6-di(tiofeno-2-ylo)-9H-karbazo-9-ylo)benzen jako monomer sieciujący o stężeniu w zakresie od 0,03 do 3 mM, korzystnie 0,3 mM.
- 5. Sposób według dowolnego z zastrz. 2-4, znamienny tym, że w trakcie elektropolimeryzacji potencjodynamicznej przykładany potencjał jest liniowo zmieniany ze stałą szybkością w zakresie od 10 mV/s do 1 V/s, korzystnie 100 mV/s.
- 6. Sposób według dowolnego z zastrz. 2-5 znamienny tym, że polimer osadza się na przetworniku sygnału chemicznego, którym jest elektroda pracująca wybrana spośród grupy stałych elektrod przewodzących, korzystnie platynowej lub korzystnie w postaci warstwy korzystnie złotej lub srebrnej, o grubości od 10 do 1000 nm, korzystnie ~150 nm, na podłożu tytanowym o grubości od 1 do 100 nm, korzystnie ~15 nm, osadzonej na płytce szklanej.
- 7. Sposób wg zastrz. 2, znamienny tym, że elektrodę pokrytą warstwą MlP-u zanurza się w roztworze wodorotlenku sodu o stężeniu w zakresie od 1 mM do 1,0 M, korzystnie 10 mM na 1 do 60 min, korzystnie 30 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć z niej szablon - cilostazol.
- 8. Zastosowanie warstwy rozpoznającej, zdefiniowanej w zastrz. 1 lub otrzymanej według zastrz. 2 jako element rozpoznający przetwornika elektrochemicznego, korzystnie złoconej płytki szklanej albo złoconej elektrody metalicznej, korzystnie elektrody metalowej, jeszcze korzystniej elektrody platynowej, do wykrywania i oznaczania inhibitora agregacji płytek krwi, którym jest cilostazol, i/lub jego główny aktywny metabolit, którym jest 3,4-dehydrocilostazol, w roztworach badanych próbek rzeczywistych, korzystnie próbek osocza krwi.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL438383A PL243900B1 (pl) | 2021-07-08 | 2021-07-08 | Warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru, sposób otrzymania warstwy, zastosowanie czujnika elektrochemicznego zawierającego warstwę do rozpoznawania inhibitora agregacji płytek krwi i jego metabolitu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL438383A PL243900B1 (pl) | 2021-07-08 | 2021-07-08 | Warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru, sposób otrzymania warstwy, zastosowanie czujnika elektrochemicznego zawierającego warstwę do rozpoznawania inhibitora agregacji płytek krwi i jego metabolitu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL438383A1 PL438383A1 (pl) | 2023-01-09 |
| PL243900B1 true PL243900B1 (pl) | 2023-10-30 |
Family
ID=84810922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL438383A PL243900B1 (pl) | 2021-07-08 | 2021-07-08 | Warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru, sposób otrzymania warstwy, zastosowanie czujnika elektrochemicznego zawierającego warstwę do rozpoznawania inhibitora agregacji płytek krwi i jego metabolitu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL243900B1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL446331A1 (pl) * | 2023-10-10 | 2025-04-14 | Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk | Elastyczna elektroda pokryta warstwą polimeru wdrukowanego molekularnie do selektywnego oznaczania metronizadolu, sposób otrzymywania elastycznej elektrody oraz jej zastosowanie |
-
2021
- 2021-07-08 PL PL438383A patent/PL243900B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL438383A1 (pl) | 2023-01-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kushwaha et al. | Epitope imprinting of Mycobacterium leprae bacteria via molecularly imprinted nanoparticles using multiple monomers approach | |
| Mintz Hemed et al. | On-demand, reversible, ultrasensitive polymer membrane based on molecular imprinting polymer | |
| Ionescu et al. | Impedimetric immunosensor for the specific label free detection of ciprofloxacin antibiotic | |
| Liu et al. | Three-dimensional electrochemical immunosensor for sensitive detection of carcinoembryonic antigen based on monolithic and macroporous graphene foam | |
| Sharma et al. | Disposable and portable aptamer functionalized impedimetric sensor for detection of kanamycin residue in milk sample | |
| Aghaei et al. | A novel capacitive biosensor for cholesterol assay that uses an electropolymerized molecularly imprinted polymer | |
| Hu et al. | A paper-based SERS test strip for quantitative detection of Mucin-1 in whole blood | |
| Gopalan et al. | Electrochemical determination of dopamine and ascorbic acid at a novel gold nanoparticles distributed poly (4-aminothiophenol) modified electrode | |
| Zhang et al. | Electrochemical dual-aptamer biosensors based on nanostructured multielectrode arrays for the detection of neuronal biomarkers | |
| Huynh et al. | Cytosine derivatized bis (2, 2′-bithienyl) methane molecularly imprinted polymer for selective recognition of 6-thioguanine, an antitumor drug | |
| Gonzato et al. | Molecularly imprinted polymer nanoparticles-based electrochemical chemosensors for selective determination of cilostazol and its pharmacologically active primary metabolite in human plasma | |
| Kurzątkowska et al. | Calix [4] arene derivatives as dopamine hosts in electrochemical sensors | |
| Roushani et al. | Fabrication of an electrochemical biodevice for ractopamine detection under a strategy of a double recognition of the aptamer/molecular imprinting polymer | |
| Lin et al. | Nanostructured indium tin oxide electrodes immobilized with toll-like receptor proteins for label-free electrochemical detection of pathogen markers | |
| Park et al. | Ultra-sensitive direct detection of silver ions via Kelvin probe force microscopy | |
| Siciliano et al. | Development of an MIP based electrochemical sensor for TGF-β1 detection and its application in liquid biopsy | |
| Wawrzyniak et al. | Gly‐Gly‐His Immobilized On Monolayer Modified Back‐Side Contact Miniaturized Sensors for Complexation of Copper Ions | |
| Arjun et al. | Alzheimer's diagnosis beyond cerebrospinal fluid: probe-free detection of tau proteins using MXene based redox systems and molecularly imprinted polymers | |
| Erdem et al. | Aptasensor platform based on carbon nanofibers enriched screen printed electrodes for impedimetric detection of thrombin | |
| PL243900B1 (pl) | Warstwa rozpoznająca przewodzącego polimeru, sposób otrzymania warstwy, zastosowanie czujnika elektrochemicznego zawierającego warstwę do rozpoznawania inhibitora agregacji płytek krwi i jego metabolitu | |
| Shi et al. | Facile fabrication of a three-dimensional gold nanowire array for high-performance electrochemical sensing | |
| Shervedani et al. | Electrochemical characterization of gold 6‐amino‐2‐mercaptobenzothiazole self‐assembled monolayer for dopamine detection in pharmaceutical samples | |
| Mozaffari et al. | Self-assembled monolayer as a pre-concentrating receptor for selective serotonin sensing | |
| Wang et al. | An electrochemical sensor of non-electroactive drug 6-thioguanine based on the dsDNA/AET/Au | |
| Li et al. | Ultrasensitive electrochemical immunosensor based on orderly oriented conductive wires for the detection of human monocyte chemotactic protein-1 in serum |