PL244526B1 - Zestaw diagnostyczny do wykrywania komórek nowotworowych (CTC) oraz jego zastosowanie do identyfikacji komórek nowotworowych - Google Patents
Zestaw diagnostyczny do wykrywania komórek nowotworowych (CTC) oraz jego zastosowanie do identyfikacji komórek nowotworowych Download PDFInfo
- Publication number
- PL244526B1 PL244526B1 PL433746A PL43374620A PL244526B1 PL 244526 B1 PL244526 B1 PL 244526B1 PL 433746 A PL433746 A PL 433746A PL 43374620 A PL43374620 A PL 43374620A PL 244526 B1 PL244526 B1 PL 244526B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- cgb3
- primer
- cancer
- cgb1
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 123
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title abstract description 99
- 101000776619 Homo sapiens Choriogonadotropin subunit beta 3 Proteins 0.000 claims abstract description 179
- 102100031196 Choriogonadotropin subunit beta 3 Human genes 0.000 claims abstract description 164
- 102100031264 Choriogonadotropin subunit beta variant 1 Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 101000776621 Homo sapiens Choriogonadotropin subunit beta variant 1 Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 33
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101000776618 Homo sapiens Choriogonadotropin subunit beta variant 2 Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102100031199 Choriogonadotropin subunit beta 7 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101000776616 Homo sapiens Choriogonadotropin subunit beta 7 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 62
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 26
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 24
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 104
- 239000007858 starting material Substances 0.000 abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 82
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 57
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 52
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 44
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 29
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 20
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 13
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 13
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 13
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 13
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 9
- 102100031197 Choriogonadotropin subunit beta variant 2 Human genes 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 7
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 6
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 5
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 4
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 4
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 4
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 4
- 101150116275 CGB1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150061319 CGB2 gene Proteins 0.000 description 3
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150038069 CGB gene Proteins 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 210000004224 pleura Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700040618 BRCA1 Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010071980 BRCA1 gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- -1 CGB6 Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034228 Grainyhead-like protein 1 homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100034227 Grainyhead-like protein 2 homolog Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001069933 Homo sapiens Grainyhead-like protein 1 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101001069929 Homo sapiens Grainyhead-like protein 2 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101001069926 Homo sapiens Grainyhead-like protein 3 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101150016316 NBS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000008003 autocrine effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 101150104145 cga gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108091084619 miR-125b-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091063409 miR-125b-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091050014 miR-125b-3 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091057219 miR-1269a stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091058688 miR-141 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091024530 miR-146a stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091040069 miR-146a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091081537 miR-146a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091032392 miR-146a-3 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010057210 telomerase RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 208000029387 trophoblastic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
- G01N2800/7028—Cancer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do identyfikacji komórek nowotworowych oraz jego zastosowanie do diagnozowania in vitro nowotworów u ludzi. Zestaw diagnostyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera parę starterów specyficznych względem genów CGB3/CGB9, CGB5, CGB6/CGB7 i CGB8 (CGB3-9): startery o sekwencji CGB3-9 F: GTGTCSAGCTCACYCCAGCATCCTA, CGB3-9 R: AGCAGCCCCTGGAACATCT lub startery o sekwencji CGB3-9 F: TAGTGTCSAGCTCACYCCAGC, CGB3-9 R: CAGCCCCTGGAACATCTCC oraz - parę starterów specyficznych względem genów CGB1 i CGB2: startery o sekwencji CGB1/2 F: CCCCCACGGAGACTCAATTT, CGB1/2 R: ACATGTCTCTCTCTTAGCGGG lub startery o sekwencji CGB1/2 F: ACACCCCTCACTCCCTGTC, CGB1/2 R: ATATCTTCCGCAAGCACTGG i/lub - parę starterów specyficznych względem sekwencji mRNA katalitycznej podjednostki enzymu telomerazy hTERT: startery o sekwencji TERT F: CTTCATCCCCAAGCCTGAC, TERT R: GCCGATTGTGAACATGGACT lub startery o sekwencji TERT F: CGCTCGGCCCTCTTTTC, TERT R: CACCCTCGAGGTGAGACG.
Description
Przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do identyfikacji komórek nowotworowych oraz jego zastosowanie w medycynie, zwłaszcza podczas przeprowadzania wczesnej diagnostyki procesów nowotworzenia, przerzutowania i monitorowania leczenia.
Dotychczas głównym problemem profilaktyki i leczenia nowotworów pozostaje brak możliwości wystarczająco wczesnego wykrywania choroby - żadna z dotychczasowych strategii nie jest wystarczająco specyficzna i czuła. Stąd zaistniała potrzeba opracowania nowego zestawu diagnostycznego obejmującego najbardziej charakterystyczne i unikatowe, a jednocześnie uniwersalne markery choroby nowotworowej w postaci podjednostki beta hormonu gonadotropiny kosmówkowej oraz podjednostki enzymu telomerazy.
Podjednostka beta ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCGe) oraz katalityczna podjednostka enzymu telomerazy (hTERT) są markerami, które charakteryzują zarówno guzy pierwotne, przerzuty jak i komórki nowotworowe krążące we krwi pacjenta (CTC - ang. Circulating Tumor Cells). Stąd analiza obu jednocześnie może znaleźć zastosowanie w diagnostyce (pozwala na detekcję komórek nowotworowych z guzów, przerzutów oraz CTC), ocenie odpowiedzi na leczenie, długoterminowej obserwacji po leczeniu i prognozowaniu ewentualnej wznowy.
Ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG) jest hormonem zbudowanym z dwóch podjednostek: α (hCGa) i β (hCGe), produkowanym przez komórki łożyska.
Oprócz łożyska, rozrostów i nowotworów trofoblastu także szereg guzów różnego pochodzenia charakteryzuje zdolność wydzielania hCG, zwłaszcza jej podjednostki beta. Jej obecność wyróżnia przerzuty nowotworowe, w tym komórki raka krążące we krwi, oraz koreluje ze słabą odpowiedzią na leczenie i złym rokowaniem.
Przyjmuje się, że podstawowym efektem biologicznym działania hCGe w nowotworach jest zablokowanie procesów apoptozy, czyli programowanej śmierci komórek, co promuje ich wzrost i pozwala na rozwój guza. Wolna podjednostka beta przyczynia się także do neoangiogenezy tj. tworzenia nowych naczyń krwionośnych guza oraz prowadzi do uniewrażliwienia układu immunologicznego pacjenta na komórki nowotworowe. Ekspresja hCGe w komórkach nowotworowych promuje również tranzycję epitelialno-mezenchymalną (EMT - epithelialmesenchymal transition). Stransformowane komórki nabywają zdolności do inwazji i tworzenia przerzutów w odległych narządach. W trakcie EMT często dochodzi także do nabywania chemio- i radiooporności przez komórki odpowiedzialne za tworzenie przerzutów, co drastycznie zmniejsza szansę pacjentów na skorzystanie ze skutecznej terapii onkologicznej. Wolna podjednostka β ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej jest także biomarkerem komórek raka krążących we krwi pacjentów - CTC. Obecność wolnej podjednostki beta ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej we krwi lub moczu wykrywana jest wyłącznie w ciąży i w chorobie nowotworowej.
Biosynteza hCG wymaga ekspresji genów kodujących podjednostkę alfa i beta. Podjednostka alfa kodowana jest przez pojedynczy gen CGA, a podjednostka beta kodowana jest przez sześć allelicznych genów (CGB3, CGB5, CGB6, CGB7, CGB8, CGB9) znajdujących się w klastrze LHB/CGB. Ponadto, w rejonie LHB/CGB znajdują się jeszcze dwa geny CGB1 i CGB2, do niedawna uważane za pseudogeny. Produkty białkowe tych genów nie zostały dotychczas zidentyfikowane, jednak transkrypty CGB1 i CGB2 odnaleziono w tkankach prawidłowych takich jak: łożysko, jądra i przysadka mózgowa oraz zmienionych nowotworowo; do tej pory potwierdzono ich obecność w komórkach raka sutka, pęcherza moczowego oraz rakach jajnika.
Geny CGB cechuje różny poziom ekspresji. Najbardziej aktywnym transkrypcyjnie genem jest CGB5, z ekspresją wyższą nawet dwadzieścia razy, w porównaniu do pozostałych genów CGB. Poziom ekspresji CGB1 i CGB2 jest niższy niż ekspresja pozostałych genów aż tysiąc razy.
Mimo, że poziom ekspresji CGB1 i CGB2 jest nieproporcjonalnie niższy w porównaniu do całkowitej ekspresji pozostałych CGB, wykazano, że transkrypty tych genów odgrywają istotną rolę w procesie inwazji kosmówki i implantacji zarodka.
Związek ekspresji hCGe z nowotworzeniem jest dobrze udokumentowany, jednak dane literaturowe dotyczą najbardziej aktywnych transkrypcyjnie genów, takich jak CGB3, CGB5 i CGB8. Tymczasem najnowsze badania pokazują, że cząsteczką indukującą wzrost guza i zwiększającą potencjał metastatyczny komórek nowotworowych o działaniu autokrynnym może być produkt białkowy genów CGB1 i CGB2. O ile ekspresja CGB3-9 wydaje się cechować wszystkie rodzaje nowotworów, to aktywność transkrypcyjna CGB1-2 wyróżnia prawdopodobnie raki o podwyższonym potencjale metastatycznym.
Specyficzne zahamowanie ekspresji genów CGB1 i 2 in vitro jest znacznie bardziej skuteczne w zmniejszaniu liczby komórek rakowych niż wyciszanie pozostałych genów CGB. Dlatego to te geny można uznać za kluczowe dla rozwoju raka.
hTERT to katalityczna podjednostka enzymu telomerazy, której ekspresja jest charakterystyczna dla komórek nowotworowych. Ekspresja i aktywność telomerazy korelują z potencjałem proliferacyjnym oraz migracyjnym i adhezyjnym komórek nowotworowych.
Telomeraza jest złożonym kompleksem rybonukleoproteinowym utworzonym m.in. przez dwie kluczowe podjednostki - podjednostkę katalityczną (hTERT, ang. human telomerase reverse transcriptase) wykazującą aktywność odwrotnej transkryptazy oraz cząsteczkę RNA (hTR, z ang. human telomerase RNA) stanowiącą matrycę dla syntezy telomerów.
Telomeraza w ludzkich komórkach odpowiedzialna jest za syntezę wielokrotnie powtórzonej sześcionukleotydowej sekwencji telomerowej 5’-TTAGGG-3’ znajdującej się na końcach chromosomów. Enzym zapobiega tym samym skracaniu telomerów po każdym podziale komórkowym (wynik „problemu replikacji końca”); jego aktywność warunkuje zdolność do przeprowadzania podziałów komórkowych.
Ekspresja i aktywność telomerazy są ograniczone do bardzo niewielkiej liczby prawidłowych komórek człowieka (identyfikowana jest na niskim poziomie ekspresji w komórkach płodu w okresie rozwoju zarodkowego oraz w komórkach macierzystych: bazalnej warstwy naskórka, hematopoetycznych, krypt jelitowych oraz linii płciowej). Co najważniejsze jednak, telomeraza wykrywana jest w ponad 85% wszystkich nowotworów, wliczając w to komórki rakowe guza oraz komórki krążące we krwi.
Jak wykazano, aktywność telomerazy jest warunkowana między innymi przez obecność kluczowej podjednostki białkowej hTERT, stąd może ona stanowić dobry marker diagnostyczny, jak również potencjalny punkt uchwytu dla terapii przeciwnowotworowych.
W komórkach nowotworowych do znaczącego wzrostu biosyntezy telomerazy dochodzi dopiero po rozpoczęciu niekontrolowanych podziałów, już po znacznej utracie podjednostek telomeru. Z tego względu w komórkach nowotworowych, które w trakcie transformacji przeszły już szereg podziałów komórkowych, długość telomerów jest mniejsza niż w komórkach prawidłowych. Z kolei sam fakt skrócenia zakończeń chromosomów może powodować zmniejszenie stabilności genetycznej DNA, co może być kolejnym czynnikiem zaburzającym homeostazę komórki i prowadzącym do dalszych patologicznych zmian. Przywrócenie ekspresji i aktywności enzymatycznej telomerazy jest uznawane za krytyczny moment w procesie nowotworzenia. Zaktywowany kompleks telomerazy stabilizuje końce chromosomów, pozwalając tym samym na nabycie przez komórki nieśmiertelności (w kontekście nieograniczonej liczby podziałów). Samo unieśmiertelnienie nie oznacza fenotypu nowotworowego, jednakże sprzyja uzyskaniu przez komórkę cech nowotworowych. Wykrycie ekspresji i/lub aktywności telomerazy są możliwe już na wczesnym etapie rozwoju choroby nowotworowej, ale mogą również stanowić marker zmian resztkowych u chorych poddanych chemioterapii, dzięki czemu informują o skuteczności prowadzonego leczenia. Ekspresja katalitycznej podjednostki telomerazy hTERT jest także uznawana za charakterystyczną cechę komórek CTC.
Mimo odmienności nowotworów, a nawet różnorodności komórek w obrębie jednego guza, wszystkie typy raków aktywują określone geny, które zapewniają im przetrwanie, wzrost i rozprzestrzenianie się. Takimi genami są geny kodujące podjednostkę beta ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej i katalitycznej podjednostki telomerazy - CGB i hTERT. Dlatego zestaw diagnostyczny umożliwiający analizę ekspresji tych genów w komórkach nowotworowych, ze szczególnym uwzględnieniem CTC, stanowi podstawę przedmiotu wynalazku.
CTC to komórki nowotworowe, które odrywają się od pierwotnego ogniska już na wczesnych etapach tworzenia guza, a po przedostaniu się do krwioobiegu są przenoszone do odległych narządów. Wykazano, że nawet guzy bez klinicznie zaznaczonej metastazy uwalniają do krwiobiegu komórki nowotworowe.
To właśnie rozsiew komórek nowotworowych jest uważany za jedną z ważniejszych przyczyn postępu choroby, niepowodzeń leczenia i, w konsekwencji, zgonów pacjentów. Proces metastazy związany jest z pozyskiwaniem przez komórki nowotworowe zdolności do funkcjonowania niezależenie od masy guza. Uważa się, że komórkami posiadającymi potencjał do zasiedlania nowych nisz w organizmie są inwazyjne komórki nowotworowe krążące we krwi. Stąd przyjmuje się, że ich obecność jest wyznacznikiem zaawansowania choroby i rozsiewu nowotworu z ogniska pierwotnego do odległych narządów. Stwierdzenie obecności CTC ma zatem istotne znaczenie w diagnostyce choroby nowotworowej, ocenie stanu jej zaawansowania i ewentualnego rozsiewu komórek nowotworowych, dzięki czemu może pomóc w doborze odpowiedniej terapii. Identyfikacja CTC stwarza także możliwość monitorowania i modyfikacji prowadzonej terapii. Co równie istotne, monitoring taki może być prowadzony w mało inwazyjny dla pacjenta sposób - pozwala na identyfikację CTC wyizolowanych z krwi obwodowej pobranej od pacjenta. Dodatkowo, dzięki zaangażowaniu nowoczesnej metody opartej na łańcuchowej reakcji polimerazowej prezentowany wynalazek charakteryzuje się bardzo dużą czułością i wiarygodnością uzyskiwanych wyników.
Szacunkowo, już na wczesnych etapach nowotworzenia, z jednego grama tkanki nowotworowej do układu krążenia wydostaje się codziennie od 10 000 do 3 000 000 CTC. Zważywszy na fakt, że większość komórek CTC ginie, ich ostateczna liczba jest niewielka - jest to około 1-10 CTC na 1 ml pełnej krwi. Mimo to identyfikacja CTC jest możliwa, dzięki zastosowaniu metody qPCR, zapewniającej zwielokrotnienie sygnału pochodzącego z pojedynczej komórki. Sygnał ten stanowi ekspresja swoistych genów aktywnych w CTC.
Wykorzystanie markerów umożliwiających identyfikację CTC może stanowić przełom w diagnostyce nowotworów oraz monitorowaniu przerzutów nowotworowych i skuteczności terapii.
Opracowany nowy zestaw diagnostyczny pozwala na wczesną diagnostykę nowotworów, ze szczególnym uwzględnieniem procesów przerzutowania, opartą na identyfikacji CTC na podstawie badania aktywności genów CGB i hTERT.
Analiza ekspresji genów kodujących hCGe prowadzona jest dla dwóch grup genów CGB: (i) CGB3-9, najaktywniejszych transkrypcyjnie we wszystkich typach nowotworów oraz (ii) CGB 1-2, aktywnych w mniejszym odsetku guzów, charakteryzujących się podwyższonym potencjałem metastatycznym. Rozdzielenie badania tych grup genów może odegrać znaczącą rolę w diagnostyce raka, różnicując guzy agresywne od nieagresywnych.
Z europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP2994540 (A2) znany jest sposób badania raka, który obejmuje wykrywanie i/lub pomiar produktu ekspresji genu CGB2 i/lub CGB1. Metody te mają zastosowanie do badań przesiewowych, diagnozowania lub monitorowania innych powszechnych nowotworów nabłonka, w tym raka pęcherza, piersi, szyjki macicy, okrężnicy, endometrium, nerek, płuc (w tym raka drobnokomórkowego płuca - SCLC), nosa/gardła, jamy ustnej/twarzy, jajnika, prostaty, trzustki, pochwy i sromu. Ujawniono także sposoby leczenia nowotworów poprzez obniżenie poziomu ekspresji CGB2 i CGB1 lub ich produktów.
W europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP1108789 (A2) ujawniono natomiast metodę ilościowego wyrażania ekspresji mRNA, kodującego aktywne białko hTERT, które jest przydatne do diagnozowania i prognozowania raka.
Z kolejnego europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP0687898 (A2) znany jest immunocytochemiczny test analityczny dla beta hCG w ustalonej próbce tkanek lub komórek, który jednolicie i niezawodnie wykazuje obecność hCG beta we wszelkiego rodzaju komórkach nowotworowych.
Z polskiego opisu patentowego nr PL233963 (B1) znany jest zestaw starterów i sond do wykrywania mutacji w genie BRCA1 oraz zastosowanie starterów i sond do genotypowania mutacji genu BRCA1 oraz wykrywania raka sutka.
Polskie zgłoszenie patentowe nr P401271 (A1) ujawnia sposoby i produkty znajdujące zastosowanie w diagnozowaniu genetycznej predyspozycji do chorób u ludzi i polega na ocenie czy w materiale biologicznym badanej osoby występuje specyficzna zmiana konstytucyjna w genie NBS1. Wynalazek obejmuje nową metodę diagnostyczną wykrywającą predyspozycję do agresywnego raka prostaty o złym rokowaniu oraz sposób i zestaw diagnostyczny dotyczący opracowania nowego markera złego rokowania dla raka stercza.
W kolejnym polskim zgłoszeniu patentowym nr P405648 (A1) ujawniono sposób diagnozowania raka wątroby i różnicowania raka wątrobowokomórkowego od przerzutów raka z jelita grubego do wątroby u pacjenta. Sposób obejmuje: - dostarczanie pochodzącej od pacjenta próbki biologicznej, - określenie ilości jednego lub więcej miRNA wybranego z grupy obejmującej miR-146a-5p, miR-125b-5p, miR-141-3p, miR-1269a w próbce biologicznej, - porównanie ekspresji miRNA z poziomem ekspresji miRNA otrzymywanym w grupie kontrolnej, w którym to sposobie u pacjenta diagnozuje się wystąpienie nowotworu i różnicuje jego podłoże, jeśli poziom ekspresji miRNA w próbce biologicznej jest zmieniony względem poziomu ekspresji obserwowanej w próbkach płynów biologicznych pochodzących od zdrowych pacjentów. Wynalazek dotyczy również zastosowania markera miRNA oraz zestawu zawierającego markery.
Z polskiego opisu patentowego nr PL234915 (B1) znany jest sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki oraz zastosowania genotypowych wariantów genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3.
Pomimo istnienia w stanie techniki kompozycji czy testów diagnostycznych do identyfikacji komórek nowotworowych (w tym CTC), obejmujących zastosowanie analizy jednego genu czy markera nowotworowego celem wynalazku było opracowanie zestawu diagnostycznego, który łączyłby markery nowotworowe: hCGe i hTERT. Jednoczesna analiza markerów może znaleźć zastosowanie w diagnostyce, ocenie odpowiedzi na leczenie, długoterminowej obserwacji po leczeniu i prognozowaniu ewentualnej wznowy.
Nieoczekiwanie okazało się, że opracowany nowy zestaw diagnostyczny rozwiązuje następujące problemy techniczne:
1. niskiej wykrywalności CTC. Znane ze stanu techniki testy bazujące na wykrywaniu pojedynczych markerów nie pozwalają na identyfikację wszystkich komórek nowotworowych. Nie wszystkie komórki nowotworowe, przez wzgląd na dynamikę ich zmian morfologicznych i molekularnych, charakteryzuje ekspresja każdego z genów uważanych za markery nowotworowe, włączając w to CGB i hTERT. Dlatego zestaw diagnostyczny łączący dwa markery istotnie zwiększa szanse wykrycia komórek raka.
2. niskiej czułości. Zastosowanie metody ilościowego PCR, specyficznych starterów i sond umożliwiających wykrycie ekspresji badanych markerów na poziomie transkryptu znacznie podnosi czułość metody (w porównaniu do analiz opartych na pomiarach białka) i umożliwia wykrycie pojedynczej komórki nowotworowej.
3. niskiej specyficzności. Aktywność CGB i hTERT jest konieczna dla rozwoju nowotworu, ale poszczególne geny kontrolują odmienne funkcje komórkowe: CGB - blokowanie apoptozy, neoangiogenezę, utratę adhezyjności i migrację, unikanie rozpoznania przez komórki układu immunologicznego; hTERT - nieśmiertelność, tj. nieograniczoną proliferację, adhezyjność i migrację. Stąd panel obejmujący analizę aktywności genów CGB i hTERT pokrywa pełne spektrum procesów charakteryzujących nowotworzenie, na różnych etapach jego rozwoju.
4. braku uniwersalnych markerów nowotworzenia. Ze względu na fakt, że hCGe i hTERT kontrolują rozwój i metastazę różnych raków, niezależnie od pochodzenia, proponowana kompozycja umożliwia diagnostykę wszystkich typów złośliwych nowotworów.
5. braku możliwości przewidzenia przebiegu choroby i efektywności terapii. Proponowany zestaw diagnostyczny, dzięki badaniu obecności transkryptów genów CGB1-2, wyróżniającej raki o zwiększonym potencjale metastatycznym, pozwala na wyodrębnienie raków agresywnych, co z kolei wpłynie na dobór odpowiedniej, skutecznej terapii (zastosowanie leczenia bardziej agresywnego lub eksperymentalnego).
Istotę wynalazku stanowi zestaw diagnostyczny do wykrywania krążących komórek nowotworowych (CTC) charakteryzujący się tym, że zawiera: parę starterów specyficznych względem genów CGB3/CGB9, CGB5, CGB6/CGB7 i CGB8 (CGB3-9): startery o sekwencji CGB3-9 F nr 1, CGB3-9 R nr 2 lub startery o sekwencji CGB3-9 F nr 3, CGB3-9 R nr 4 oraz
- parę starterów specyficznych względem genów CGB1 i CGB2: startery o sekwencji CGB 1/2 F nr 5, CGB 1/2 R nr 6 lub startery o sekwencji CGB 1/2 F nr 7, CGB 1/2 R nr 8
- parę starterów specyficznych względem sekwencji mRNA katalitycznej podjednostki enzymu telomerazy hTERT: startery o sekwencji TERT F nr 9, TERT R nr 10 lub startery o sekwencji TERT F nr 11, TERT R nr 12.
Korzystnie, gdy zestaw dodatkowo zawiera sondę CGB1/2 o sekwencji nr 13 lub sondę CGB3-9 o sekwencji nr 14 lub sondę hTERT o sekwencji nr 15.
Korzystnie, gdy zestaw zawiera dodatkowo barwnik fluoroscencyjny wybarwiający dwuniciowy DNA.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie zestawu diagnostycznego określonego powyżej do diagnozowania in vitro nowotworów u ludzi poprzez identyfikację komórek CTC. Korzystnie diagnozowanie obejmuje nowotwory wybrane z grupy: rak piersi, rak jajnika, rak prostaty, rak jelita grubego, rak płuca.
Otrzymany według wynalazku zestaw diagnostyczny do identyfikacji komórek nowotworowych cechuje się: (i) wysoką wykrywalnością CTC - zważywszy na fakt, iż potwierdzenie ekspresji jednego z badanych genów jest już wskazówką obecności CTC oraz, że nie wszystkie CTC charakteryzuje ekspresja CGB i hTERT jednocześnie, to zestaw diagnostyczny łączący oba markery pozwala na istotne zwiększenie wykrywalności tych komórek we krwi pacjenta; (ii) wysoką czułością wynikającą z zastosowania metody ilościowego PCR, specyficznych sond i starterów, co umożliwia wykrycie badanych markerów na poziomie pojedynczej komórki nowotworowej; (iii) wysoką specyficznością wynikającą z faktu, że poszczególne markery kontrolują odmienne funkcje komórkowe niezbędne dla wzrostu nowotworu na różnych etapach jego rozwoju; (iv) uniwersalnością, jako że hCGe i hTERT kontrolują rozwój i metastazę różnych raków, niezależnie od pochodzenia, zatem proponowana kompozycja umożliwia wykrywanie i diagnostykę wszystkich typów nowotworów; (v) możliwością wyodrębnienia raków o zwiększonym potencjale metastatycznym, co wpłynie na dobór odpowiedniej terapii.
Proponowany zestaw diagnostyczny daje również możliwość wczesnego rozpoznania nowotworu w sposób szybki, precyzyjny, czuły i małoinwazyjny; badanie opiera się na molekularnej analizie ekspresji genów metodą ilościowego PCR w CTC wyizolowanych z krwi obwodowej pobranej od pacjenta.
Należy podkreślić, że nie ma w diagnostyce równie uniwersalnego, specyficznego i czułego zestawu jak prezentowany wynalazek, który pozwala na bardzo wczesne wykrycie ewentualnych zmian nowotworowych w organizmie pacjenta. Ponieważ hCGe i hTERT biorą udział w kontroli szeregu procesów na różnych etapach rozwoju nowotworu, stanowią one zarówno marker rozwijającej się choroby nowotworowej, jak i przerzutów, zmian resztkowych czy wznowy u chorych poddanych chemioterapii/radioterapii, dzięki czemu informują o skuteczności prowadzonego leczenia.
Dzięki zastosowaniu technik opartych o amplifikację, tj. powielenie nawet niewielkich ilości materiału biologicznego (PCR), wynalazek pozwala na analizę obecności komórek raka krążących we krwi z o wiele większą czułością niż dotychczas stosowane metody, wliczając w to cytometrię przepływową czy testy typu ELISA, które opierają się na wykrywaniu białkowych produktów ekspresji genów, a zatem wymagające znacznie większych ilości materiału badawczego. Ponadto, wymienione powyżej metody opierają się przede wszystkim na wykrywaniu obecności markerów komórek nabłonkowych; tymczasem komórki nowotworowe odrywające się od guza, aby móc zasiedlić nową niszę, przechodzą proces tranzycji epitelialno-mezenchymalnej (EMT), co wiąże się z utratą białek epitelialnych, na których obecności zasadza się zdecydowana większość testów mających na celu wykrywanie CTC.
Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania i na podstawie przeprowadzanych badań jednocześnie nie ograniczając jego zakresu oraz w wykazie sekwencji, w którym:
sekwencje 16, 17 i 18 przedstawiają sekwencje mRNA genów CGB1 i CGB2 (dwa warianty transkrypcyjne genu) kodujących podjednostkę beta ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej zdeponowane w bazie danych NCBI (ang. National Center for Biotechnology Information) oraz sekwencje, do których komplementarne są startery i sonda, sekwencje 19-23 przedstawiają sekwencje mRNA genów CGB3, CGB5 CGB7 (dwa warianty transkrypcyjne genu) i CGB8 kodujących podjednostkę beta ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej zdeponowane w bazie danych NCBI oraz pozycje starterów i sond, sekwencja 24 przedstawia sekwencję mRNA genu hTERT kodującego katalityczną podjednostkę enzymu telomerazy zdeponowaną w bazie danych NCBI oraz sekwencje, do których komplementarne są pary starterów i sonda.
Metodyka
Zestaw diagnostyczny według wynalazku opiera się na wykrywaniu przedstawionych poniżej markerów w jednej próbie za pomocą zestawu specyficznych starterów (i sond hydrolizujących) wykrywających ekspresję następujących genów: CGB1/CGB2 i CGB3-CGB9 i hTERT.
1. Identyfikacja transkryptów genów CGB1 i CGB2
Starter 1 CGB 1/2 F - sekwencja nr5
Starter 1 CGB 1/2 R - sekwencja nr6
LUB para starterów:
Starter 2 CGB 1/2 F - sekwencja nr7
Starter 2 CGB 1/2 R - sekwencja nr8
Sonda CGB1/2 - sekwencja nr 13
Obie pary starterów i sonda zostały zaprojektowane w sposób pozwalający na jednoczesne wykrycie mRNA obu genów, tj. CGB1 i CGB2. Dodatkowo ich specyfika umożliwia identyfikację obydwu znanych wariantów transkrypcyjnych genu CGB2.
2. Identyfikacja transkryptów genów CGB3-CGB9
Starter 1 CGB3-9 F - sekwencja nr 1
Starter 1 CGB3-9 R - sekwencja nr 2
LUB para starterów:
Starter 2 CGB3-9 F - sekwencja nr 3
Starter 2 CGB3-9 R - sekwencja nr 4
Sonda CGB3-9 R - sekwencja nr 14
Oznaczenie zdegenerowanych nukleotydów: S-G/C; Y-C/T (część starterów i sonda mają G lub C oraz C lub T w konkretnej lokalizacji podczas syntezy, tak by umożliwić detekcję obydwu wariantów transkrypcyjnych genu).
Startery zostały zaprojektowane w sposób pozwalający na jednoczesne wykrycie mRNA genów CGB3, CGB5 CGB7 (dwa warianty transkrypcyjne genu) i CGB8.
3. Identyfikacja transkryptu hTERT
Starter 1 TERT F - sekwencja nr 9
Starter 1 TERT R - sekwencja nr 10
LUB para starterów
Starter 2 TERT F - sekwencja nr 11
Starter 2 TERT R - sekwencja nr 12
Sonda: TERT P - sekwencja nr 15
Sekwencje par starterów i oligonukleotydowych sond dla poszczególnych markerów stanowiących zestaw służący do detekcji komórek nowotworowych zostały opracowane tak, by optymalne warunki reakcji były zbliżone do standardowo stosowanych w reakcji qPCR (PCR w czasie rzeczywistym).
Reakcja qPCR wykorzystuje polimerazę o aktywności egzonukleazy 5’ do 3’, co umożliwia detekcję sondy hydrolizującej.
Preferowaną metodą jest identyfikacja transkryptów za pomocą sondy, która hybrydyzuje do specyficznej sekwencji cDNA komplementarnej do mRNA badanego genu. Sonda od końca 5’ wyznakowana jest odpowiednią cząsteczką fluorescencyjną, z kolei od końca 3’ cząsteczką wygaszacza. Fluorochrom stanowi cząsteczka FAM 6-karboksyfluoresceina, cząsteczkę wygaszacza zaś BBQ BlackBerry Quencher.
Alternatywnym rozwiązaniem jest stosowanie wymienionych par starterów do amplifikacji fragmentów transkryptów badanych genów w obecności barwnika fluorescencyjnego, który wiąże dwuniciowe struktury DNA, np. SybrGreen.
Poziom ekspresji badanych genów może być określany względem genu referencyjnego i/lub krzywej standardowej w sposób odpowiednio względny lub bezwzględny.
W celu amplifikacji DNA badanego markera reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerach zapewniających odczyt fluorescencji.
Profil termiczny reakcji qPCR:
I aktywacja polimerazy - optymalnie: 95°C, 5 - 15 min
II 45 cykli:
1. 94 - 95°C, 10 - 20 s
2. 55 - 65°C, 10 - 30 s*
3. 72°C, 1 - 10 s**
III 4°C, 10 s lub bez ograniczenia; aż do schłodzenia próbek * zależne od zestawu odczynników i sekwencji zastosowanych starterów * * na tym etapie następuje pomiar fluorescencji
Ocena ekspresji badanego genu polega na wykryciu w mieszaninie reakcyjnej jego unikatowej sekwencji reprezentowanej przez specyficzny transkrypt czyli mRNA.
Aby prawidłowo ocenić ekspresję genu, najpierw należy przeprowadzić reakcję odwrotnej transkrypcji, w wyniku której na matrycy mRNA uzyskuje się tzw. DNA komplementarny, cDNA (ang. complementary DNA). Ocena obecności i ilości tego cDNA jest miarą ekspresji badanego genu.
Metoda qPCR pozwala obliczyć początkową liczbę kopii badanego cDNA. Reakcja przebiega w ten sposób, że z każdym kolejnym cyklem ilość powstającego specyficznego produktu (liczba kopii cDNA) ulega podwojeniu. Wynik testu jest prezentowany za pomocą oprogramowania komputerowego jako wartość Cq (ang. quantification cycle). Przyrost liczby kopii produktu jest monitorowany, ale dopiero od momentu osiągnięcia poziomu detekcji, czyli momentu, w którym, w trakcie powielania cDNA, poziom fluorescencji znacznika kwasu nukleinowego przekroczy próg nazywany Cq. Im wcześniej poziom fluorescencji wzrasta do poziomu, który umożliwia wiarygodny odczyt, tym większa jest początkowa liczba
PL 244526 Β1 kopii badanej sekwencji w próbce na początku reakcji. Tym samym, im mniejsza wartość Cq, tym wyższy poziom ekspresji badanego genu. Za próbę o zerowej ekspresji (Cq = 0 - brak ekspresji badanego genu) uznaje się taką, w której amplifikacja specyficznego cDNA nie zachodzi (poziom fluorescencji nie przekracza poziomu progowego) lub zachodzi dopiero po 40. cyklu reakcji qPCR.
Na bazie tego prostego algorytmu oznaczane są różnice w poziomie ekspresji poszczególnych genów między badanymi próbkami (Tab. 1).
Tabela 1. Ocena wyników reakcji qPCR
| Amplifikacja | Wynik | Ekspresja genu |
| Cq < 39. cyklu | pozytywny | stwierdzona* |
| Cq = 40. Cykl | wątpliwy | wątpliwa |
| Cq > 40. Cyklu | negatywny | Brak |
| brak fluorescencji (Cq = 0) | negatywny | Brak |
* im niższa wartość Cq, tym wyższa ekspresja genu
Przeprowadzono szereg reakcji sprawdzających poprawność działania poszczególnych par starterów i sond molekularnych pozwalających na identyfikację ekspresji genów CGB i hTERT w ludzkich tkankach. W każdym z przeprowadzonych eksperymentów matrycę do reakcji qPCR stanowił cDNA. cDNA otrzymano według standardowego protokołu reakcji syntezy, wykorzystując RNA wyizolowany z badanej tkanki. W każdym eksperymencie zastosowano kontrolę negatywną, którą stanowiła prawidłowa tkanka (pobierana podczas operacji wykonywanych z przyczyn innych niż złośliwy nowotwór). Jedynie w przykładzie 1 w kontroli negatywnej matrycę zastąpiono wodą.
Jak opisano w przykładach wykonania, wykrywanie transkryptów może się odbywać za pomocą różnych metod: z zastosowaniem sond hydrolizujących lub z wykorzystaniem fluorescencyjnych barwników DNA (np. Sybr Green).
Ocena ekspresji genów CGB (CGB1-2 i CGB3-9) oraz hTERT opierała się na wartości Cq. Im niższa wartość Cq, tym wyższa ekspresja danego genu.
W przedstawionych poniżej przykładach użycia wynalazku każdy wynik Cq < 40. cyklu świadczy o ekspresji badanego genu. Cq > 40. cyklu lub Cq = 0 jednoznacznie świadczy o braku ekspresji.
Przykład 1
Celem badania było stwierdzenie, czy za pomocą opracowanego zestawu diagnostycznego można wykryć mRNA genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w tkance guza piersi. Przygotowano standardową mieszaninę reakcyjną dla metody qPCR; dla oceny ekspresji badanych genów zastosowano startery i sondy, które przedstawiono w Tab. 2.
Tabela 2. Zestawienie starterów wykorzystanych w reakcji qPCRw przykładzie 1
| wykrywane geny | nazwa startera sensowego | nazwa startera antysensowego | metoda detekcji produktu qPCR |
| CGB 1-2 | Starter 1 CGB1/2 F sekwencja nr 5 | Starter 1 CGB1/2 R sekwencja nr 6 | Sonda CGB 1/2 sekwencja nr 13 |
| CGB3-9 | Starter 1 CGB3-9 F sekwencja nr 1 | Starter 1 CGB3-9 R sekwencja nr 2 | Sonda CGB3-9 sekwencja nr 14 |
| hTERT | Starter 1 TERT F sekwencja nr 9 | Starter 1 TERTR sekwencja nr 10 | Sonda hTERT sekwencja nr 15 |
Matrycę (czyli cDNA) do reakcji qPCR otrzymano wykorzystując całkowite RNA wyizolowane z tkanki złośliwego guza piersi. Kontrola negatywna reakcji zawierała wodę dodaną w miejsce matrycy. W wyniku przeprowadzonych reakcji potwierdzono aktywność genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w tkance guza piersi - wyniki przedstawiono w Tab. 3.
PL 244526 Β1
Tabela 3. Wyniki reakcji qPCR potwierdzające ekspresję genów markerowych. Badanie przeprowadzono na tkance raka piersi
| wartość Cq | ||
| ekspresja genu | badana tkanka: guz piersi | kontrola negatywna - H2O |
| CGB1-2 | 29 | 0 |
| CGB3-9 | 27 | 0 |
| hTERT | 29 | 0 |
Otrzymane wartości Cq potwierdzają obecność komórek nowotworowych, reprezentowanych przez transkrypty poszczególnych badanych genów w badanej tkance i mogą świadczyć o zwiększonym potencjale metastatycznym komórek guza piersi. Wartość Cq równa zero, która oznacza brak ekspresji badanych genów, w przypadku kontroli negatywnej, gdzie matrycę (cDNA) zastąpiła woda świadczy o prawidłowo przeprowadzonym eksperymencie.
Przykład 2
Celem badania było stwierdzenie, czy wykorzystując alternatywne warianty starterów można potwierdzić aktywność genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w tkance guza piersi. Postępowano tak jak w przykładzie 1 z tą różnicą, że użyto innego zestawu starterów (Tab. 4.); matrycą w reakcji qPCR, tak jak w przykładzie 1, było cDNA z tkanki złośliwego guza piersi.
Tabela 4. Zestawienie starterów wykorzystanych w reakcji qPCRw przykładzie 2
| wykrywane geny | nazwa startera sensowego | nazwa startera antysensowego | metoda detekcji produktu qPCR |
| CGB1-2 | Starter 2 CGB1/2 F sekwencja ni1 7 | Starter 2 CGB 1/2 R sekwencja nr 8 | Sonda CGB 1/2 sekwencja nr 13 |
| CGB3-9 | Starter 2 CGB3-9 F sekwencja nr 3 | Starter 2 CGB 3-9 R sekwencja nr 4 | Sonda CGB3-9 sekwencja nr 14 |
| hTERT | Starter 2 TERT F sekwencja nr 11 | Starter 2 TERT R sekwencja nr 12 | Sonda hTERT sekwencja nr 15 |
W wyniku reakcji qPCR przeprowadzonych z wykorzystaniem alternatywnego zestawu starterów uzyskano wyniki potwierdzające aktywność transkrypcyjną genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w tkance guza piersi (Tab. 5) na takim samym poziomie dla poszczególnych genów jak w przykładzie 1 (czego dowodzą wartości Cq). Pokazuje to, że oba zestawy starterów dla każdego z genów zostały zaprojektowane prawidłowo i wykazują ten sam poziom ekspresji dla poszczególnych genów.
Tabela 5. Wyniki reakcji qPCR. Badanie przeprowadzono na tkance guza piersi
| wartość Cq | ||
| ekspresja genu | badana tkanka: guz piersi | kontrola negatywna: H2O |
| CGB 1-2 | 29 | 0 |
| CGB3-9 | 27 | 0 |
| hTERT | 29 | 0 |
Przykład 3
Celem badania było stwierdzenie, czy za pomocą opracowanego zestawu diagnostycznego można potwierdzić aktywność transkrypcyjną genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w tkance guza jajnika. Zastosowano skład zestawu diagnostycznego podany w Tab. 6. Badaną próbę stanowiła tkanka raka jajnika. Kontrolę negatywną stanowiła tkanka jajnika niezmienionego nowotworowo.
PL 244526 Β1
Tabela 6. Zestawienie starterów wykorzystanych w reakcji qPCRw przykładzie 3
| wykrywane geny | nazwa startera sensowego | nazwa startera antysensowego | metoda detekcji produktu qPCR |
| CGB1-2 | Starter 2 CGB 1/2 F sekwencja nr 7 | Starter 2 CGB 1/2 R sekwencja nr 8 | Sonda CGB 1/2 sekwencja nr 13 |
| CGB3-9 | Starter 1 CGB3-9 F sekwencja nr 1 | Starter 1 CGB3-9 R sekwencja nr 2 | Sonda CGB 3-9 sekwencja nr 14 |
| hTERT | Starter 2 TERT F sekwencja nr 11 | Starter 2 TERT R sekwencja nr 12 | Sonda hTERT sekwencja nr 15 |
W wyniku przeprowadzonych reakcji uzyskano wyniki (Tab. 7) potwierdzające aktywność transkrypcyjną genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w tkance guza jajnika.
Tabela 7. Wyniki reakcji qPCR. Badanie przeprowadzono na tkance guza jajnika
| wartość Cq | ||
| ekspresja genu | badana tkanka: guz jajnika | kontrola negatywna: zdrowy jajnik |
| CGB 1-2 | 25 | 0 |
| CGB3-9 | 25 | 0 |
| hTERT | 30 | 0 |
Stosunkowo wysokie wartości Cq otrzymane w przypadku analizy ekspresji genów CGB mogą świadczyć o zwiększonej złośliwości komórek raka jajnika. Wykonany eksperyment nie wykazał aktywności transkrypcyjną genów CGB i hTERT w jajniku niewykazującym zmian nowotworowych. Wartość Cq=0 dla kontroli negatywnej, gdzie matrycę (cDNA) reakcji qPCR uzyskano z tkanki jajnika bez zmian nowotworowych potwierdza założenia wynalazku: w prawidłowej tkance jajnika brak ekspresji genów CGB i hTERT.
Przykład 4
Celem badania było stwierdzenie, czy za pomocą opracowanego zestawu diagnostycznego można potwierdzić aktywność transkrypcyjną genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w krwi pacjentki z rakiem piersi, wskazującą na obecność komórek raka krążących we krwi (CTC). Zastosowano skład zestawu diagnostycznego podany w Tab. 8. Badaną próbę stanowiły komórki krwi pacjentki z rakiem piersi. Kontrolę negatywną stanowiła krew zdrowej ochotniczki.
Tabela 8. Zestawienie starterów wykorzystanych w reakcji qPCRw przykładzie 4
| wykrywane geny | nazwa startera sensowego | nazwa startera antysensowego | metoda detekcji produktu qPCR |
| CGB 1-2 | Starter 1 CGB 1/2 F sekwencja nr 5 | Starter 1 CGB 1/2 R sekwencja nr 6 | Sonda CGB 1/2 sekwencja nr 13 |
| CGB3-9 | Starter 2 CGB3-9 F sekwencja nr 1 | Starter 2 CGB 3-9 R sekwencja nr 2 | Sonda CGB3-9 sekwencja nr 14 |
| hTERT | Starter 1 TERT F sekwencja nr 9 | Starter 1 TERT R sekwencja nr 10 | Sonda hTERT sekwencja nr 15 |
Wyniki reakcji qPCR przedstawiono w tabeli 9. Wykazują one aktywność genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz genu hTERT w krwi pacjentki z rakiem. Nie wykazano aktywności badanych genów w krwi zdrowej ochotniczki.
PL 244526 Β1
Tabela 9. Wyniki reakcji qPCR. Badanie przeprowadzono na krwi pacjentki z rakiem piersi
| wartość Cq | ||
| ekspresja genu | badana tkanka: krew pacjentki z rakiem piersi | kontrola negatywna: krew zdrowej ochotniczki |
| CGB 1-2 | 32 | 0 |
| CGB3-9 | 29 | 0 |
| hTERT | 32 | 0 |
Potwierdzenie ekspresji genów CGB i hTERT w krwi pacjentki z rakiem piersi świadczy o obecności komórek raka krążących we krwi (CTC). Obecność tych komórek jest z kolei wyznacznikiem metastazy. Wartość Cq=0 w kontroli negatywnej, gdzie matrycę (cDNA) do qPCR uzyskano z komórek krwi zdrowej ochotniczki potwierdza założenia wynalazku: w krwi zdrowej osoby brak ekspresji genów CGB i hTERT.
Przykład 5
Celem badania było stwierdzenie, czy za pomocą opracowanego zestawu diagnostycznego można potwierdzić aktywność transkrypcyjną genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w komórkach obecnych w wysięku z opłucnej pacjenta ze stwierdzonym drobnokomórkowym rakiem płuca. Zastosowano skład zestawu diagnostycznego podany w tabeli 10. Badaną próbę stanowiły komórki obecne w wysięku z opłucnej pacjenta ze stwierdzonym drobnokomórkowym rakiem płuca. Kontrolę negatywną reakcji stanowiło cDNA uzyskane na matrycy RNA wyizolowanego z komórek obecnych w wysięku z opłucnej pacjenta leczonego z przyczyn innych niż nowotwór.
Tabela 10. Zestawienie starterów wykorzystanych w reakcji qPCR w przykładzie 5
| wykrywane geny | nazwa startera sensowego | nazwa startera antysensowego | metoda detekcji produktu qPCR |
| CGB 1-2 | Starter 2 CGB 1/2 F sekwencja nr 7 | Starter 2 CGB 1/2 R sekwencja nr 8 | Sonda CGB 1/2 sekwencja nr 13 |
| CGB3-9 | Starter 2 CGB3-9 F sekwencja nr 3 | Starter 2 CGB3-9R sekwencja nr 4 | Sonda CGB3-9 sekwencja nr 14 |
| hTERT | Starter 1 TERT F sekwencja nr 9 | Starter 1 TERT R sekwencja nr 10 | Sonda hTERT sekwencja nr 15 |
W wyniku przeprowadzonych reakcji qPCR uzyskano wyniki (Tab. 11) potwierdzające aktywność transkrypcyjną genów CGB 1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w komórkach uzyskanych z wysięku z opłucnej pacjenta z rakiem płuca. W kontroli negatywnej - w komórkach obecnych w wysięku z opłucnej pacjenta leczonego z przyczyn innych niż nowotwór, geny CGB i hTERT nie były aktywne transkrypcyjnie (Tab. 11).
Tabela 11. Wyniki reakcji qPCR. Badanie przeprowadzono na komórkach izolowanych z wysięku z opłucnej pacjenta z rakiem płuca i pacjenta bez zmian nowotworowych
| wartość Cq | ||
| ekspresja | badana tkanka: wysięk z | kontrola negatywna: wysięk z |
| genu | opłucnej pacjenta z rakiem | opłucnej pacjenta bez raka |
| CGB1-2 | 34 | 0 |
| CGB3-9 | 28 | 0 |
| hTERT | 33 | 0 |
Potwierdzenie ekspresji genów CGB i hTERT w komórkach uzyskanych z wysięku z opłucnej pacj enta z rakiem płuca świadczy o obecności komórek raka w badanym płynie. Wartość Cq=0 w kon
PL 244526 Β1 troli negatywnej, gdzie matrycę (cDNA) do qPCR uzyskano z komórek pacjenta leczącego się z przyczyn innych niż nowotwór potwierdza założenia wynalazku: w wysięku pacjenta nie chorującego na nowotwór brak ekspresji genów CGB i hTERT.
Przykład 6
Celem badania było stwierdzenie, czy za pomocą opracowanego zestawu diagnostycznego można zaobserwować aktywność genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT bez użycia sond hydrolizujących. Zastosowano zestaw starterów identyczny jak przykładzie 1., różnicą było to, że do mieszanin reakcyjnych wykrywających aktywność transkrypcyjną genów CGB1-2, CGB3-9 i hTERT nie dodano odpowiednich sond (Tab. 12.); wyniki reakcji były identyfikowane dzięki zastosowaniu fluorescencyjnego barwnika Sybr Green. Badaną próbę stanowiła tkanka złośliwego guza jelita grubego. Kontrolę negatywną reakcji stanowiła tkanka jelita grubego bez zmian nowotworowych.
Tabela 12. Zestawienie starterów wykorzystanych w reakcji qPCRw przykładzie 6
| wykrywane geny | nazwa startera sensowego | nazwa startera antysensowego | metoda detekcji produktu qPCR |
| CGB 1-2 | Starter ł CGB 1/2 F sekwencja nr 5 | Starter 1 CGB 1/2 R sekwencja nr 6 | Sybr Green |
| CGB3-9 | Starter 1 CGB3-9 F sekwencja nr 1 | Starter 1 CGB 3-9 R sekwencja nr 2 | Sybr Green |
| hTERT | Starter 1 TERT F sekwencja nr 9 | Starter 1 TERT R sekwencja nr 10 | Sybr Green |
W wyniku przeprowadzonych reakcji qPCR uzyskano wyniki (Tab. 13.) wskazujące na aktywność genów CGB 1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w tkance guza jelita z wykorzystaniem zestawu starterów jak w przykładzie 1., jednak z zastosowaniem barwnika Sybr Green. W prawidłowej tkance jelita grubego nie stwierdzono aktywności transkrypcyjnej badanych genów.
Tabela 13. Wyniki reakcji qPCR. Badanie przeprowadzono na tkance guza jelita grubego
| wartość Cq | ||
| ekspresja genu | badana tkanka: guz jelita | kontrola negatywna: tkanka jelita niezmienionego nowotworowe |
| CGB1-2 | 26 | 0 |
| CGB3-9 | 23 | 0 |
| hTERT | 24 | 0 |
Potwierdzenie ekspresji genów CGB i hTERT w komórkach uzyskanych z tkanki guza jelita grubego świadczy o: (i) obecności komórek nowotworowych w badanym guzie jelita oraz fakcie, że (ii) ekspresję badanych genów można zidentyfikować również bez zastosowania sondy hydrolizującej, jedynie z użyciem specyficznych starterów i barwnika DNA. Ponadto, niskie wartości Cq otrzymane w przypadku analizy ekspresji badanych genów mogą świadczyć o zaawansowaniu i/lub zwiększonej złośliwości badanego nowotworu. Wartość Cq=0 w kontroli negatywnej, gdzie matrycę (cDNA) do qPCR uzyskano z komórek jelita bez zmian nowotworowych potwierdza założenia wynalazku: w tkance prawidłowego jelita brak ekspresji genów CGB i hTERT.
Przykład 7
Celem badania było stwierdzenie, czy za pomocą opracowanego zestawu diagnostycznego można zaobserwować aktywność transkrypcyjną genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w potencjalnym przerzucie regionalnym, tj. w pachowym węźle chłonnym pacjentki z rakiem piersi. Zastosowano skład zestawu diagnostycznego podany w tabeli 14. Badaną próbkę stanowiła tkanka pachowego węzła chłonnego pacjentki z rozsianym rakiem piersi. Kontrolę negatywną stanowiła tkanka prawidłowego węzła chłonnego.
PL 244526 Β1
Tabela 14. Zestawienie starterów wykorzystanych w reakcji qPCRw przykładzie 7
| wykrywane geny | nazwa startera sensowego | nazwa startera anty sensowego | metoda detekcji produktu qPCR |
| CGB 1-2 | Starter 1 CGB1/2 F sekwencja nr 5 | Starter 1 CGB 1/2 R sekwencja nr 6 | Sybr Green |
| CGB3-9 | Starter 2 CGB3-9 F sekwencja nr 3 | Starter 2 CGB3-9 R sekwencja nr 4 | Sybr Green |
| hTERT | Starter 2 TERT F sekwencja nr 11 | Starter 2 TERT R sekwencja nr 12 | Sybr Green |
W wyniku przeprowadzonych reakcji qPCR wykazano aktywność genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT w tkance węzła chłonnego pacjentki z rakiem piersi (Tab. 15). W węźle o prawidłowej budowie nie zaobserwowano aktywności badanych genów.
Tabela 15. Wyniki reakcji qPCR. Badanie przeprowadzono na tkance węzła chłonnego pacjentki z rakiem piersi
| wartość Cq | ||
| ekspresja genu | badana tkanka: węzeł chłonny pacjentki z rakiem piersi | kontrola negatywna: węzeł chłonny od pacjentki bez raka |
| CGB 1-2 | 28 | 0 |
| CGB3-9 | 30 | 0 |
| hTERT | 30 | 0 |
Potwierdzenie ekspresji genów CGB i hTERT w komórkach uzyskanych z tkanki węzła chłonnego pacjentki z rakiem piersi świadczy o inwazji komórek nowotworu i powstaniu przerzutu regionalnego. Ponadto, wyniki potwierdzają wynik badania histopatologicznego, wskazujący na zmiany nowotworowe w pachowym węźle chłonnym pacjentki z rakiem piersi. Wartość Cq w kontroli negatywnej, gdzie matrycę (cDNA) do qPCR uzyskano z komórek węzła chłonnego bez zmian nowotworowych potwierdza założenia wynalazku: w prawidłowej tkance brak ekspresji genów CGB i hTERT.
Przykład 8
Celem badania było stwierdzenie, czy rak jajnika dokonuje inwazji na sąsiadujące tkanki za pomocą opracowanego zestawu diagnostycznego wykazującego aktywność genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT. Zastosowano skład zestawu diagnostycznego podany w tabeli 16. Badaną próbę stanowiła tkanka otrzewnej pacjentki z rakiem jajnika. Kontrolę negatywną stanowiła tkanka otrzewnej uzyskana podczas operacji przeprowadzonej z przyczyn innych niż złośliwy nowotwór.
Tabela 16. Zestawienie starterów wykorzystanych w reakcji qPCR w przykładzie 8
| wykrywane geny | nazwa startera sensowego | nazwa startera anty sensowego | metoda detekcji produktu qPCR |
| CGB 1-2 | Starter 1 CGB 1/2 F sekwencja nr 5 | Starter 1 CGB 1/2 R sekwencja nr 6 | Sybr Green |
| CGB3-9 | Starter 1 CGB3-9 F sekwencja nr 1 | Starter 1 CGB3-9 R sekwencja nr 2 | Sybr Green |
| hTERT | Starter 2 TERT F sekwencja nr' 11 | Starter 2 TERT R sekwencja nr 12 | Sybr Green |
Wyniki reakcji qPCR przedstawiono w tabeli 17. Wskazują one, że w tkance otrzewnej pacjentki z rakiem jajnika geny CGB (CGB1-2 i CGB3-9) są aktywne; nie wykazano natomiast aktywności genu hTERT. Tkanka otrzewnej pacjentki bez raka nie wykazywała aktywności transkrypcyjnej badanych genów.
PL 244526 Β1
Tabela 17. Wyniki reakcji qPCR. Badanie przeprowadzono na tkance otrzewnej pacjentki z rakiem jajnika
| wartość Cq | ||
| ekspresja genu | badana tkanka: otrzewna pacjentki z rakiem jajnika | kontrola negatywna: otrzewna pacjentki bez raka |
| CGB 1-2 | 28 | 0 |
| CGB3-9 | 30 | 0 |
| hTERT | 0 | 0 |
Potwierdzenie ekspresji genów CGB w komórkach uzyskanych z tkanki otrzewnej pacjentki z rakiem jajnika świadczy o inwazji komórek raka w jamie brzusznej. Brak ekspresji genu hTERT nie wpływa na informatywność otrzymanego wyniku, ponieważ - jak zaznaczono powyżej - nie wszystkie komórki raka charakteryzują się ekspresją każdego z genów specyficznych dla złośliwego nowotworu. Wartość Cq w kontroli negatywnej, gdzie matrycę (cDNA) do qPCR uzyskano z komórek otrzewnej bez zmian nowotworowych potwierdza założenia wynalazku: w prawidłowej tkance brak ekspresji genów zarówno CGB jak i hTERT.
Przykład 9
Celem badania było stwierdzenie, czy zmiana w płucach pacjenta z rakiem prostaty jest zmianą nowotworową, np. potencjalnym przerzutem odległym. Wykorzystano opracowany zestaw diagnostyczny wykazujący aktywność genów CGB1-2 i CGB3-9 oraz hTERT.
Zastosowano skład kompozycji diagnostycznej podany w tabeli 18. Badaną próbę stanowiła pobrana podczas biopsji zmieniona tkanka płuca pacjenta z rakiem prostaty. Kontrolę negatywną stanowiła tkanka płuca niezmieniona nowotworowo.
Tabela 18. Zestawienie starterów wykorzystanych w reakcji qPCR w przykładzie 9
| wykrywane geny | nazwa startera sensowego | nazwa startera antysensowego | metoda detekcji produktu qPCR |
| CGB 12 | Starter 2 CGB 1/2 F sekwencja nr 7 | Starter 2 CGB 1/2 R sekwencja nr 8 | Sybr Grccn |
| CGB3-9 | Starter 1 CGB3-9 F sekwencja nr 1 | Starter 1 CGB3-9 R sekwencja nr 2 | Sybr Green |
| hTERT | Starter 1 TERT F sekwencja ni' 9 | Starter 1 TERT R sekwencja nr 10 | Sybr Green |
Wyniki reakcji qPCR przedstawiono w tabeli 19. W zmienionej nowotworowo tkance płuca geny CGB3-9 i hTERT były aktywne transkrypcyjnie; nie wykazano aktywności transkrypcyjnej genów CGB1-2. W prawidłowej tkance nie stwierdzono ekspresji badanych genów.
Tabela 19. Wyniki reakcji qPCR. Badanie przeprowadzono na tkance przerzutu do płuca z prostaty - ogniska pierwotnego nowotworu
| wartość Cq | ||
| ekspresja genu | badana tkanka: bioptat płuca u pacjenta z rakiem prostaty | kontrola negatywna: prawidłowa tkanka |
| CGB 1-2 | 0 | 0 |
| CGB3-9 | 33 | 0 |
| hTERT | 32 | 0 |
Potwierdzenie ekspresji genów CGB3-9 i hTERT w komórkach uzyskanych podczas biopsji zmiany w płucu pacjenta z rakiem prostaty świadczy o inwazji komórek nowotworu i powstaniu przerzutu
PL 244526 Β1 odległego. Na tej podstawie można stwierdzić, że w płucu pacjenta z rakiem prostaty doszło do powstania ogniska nowotworowego; badanie histopatologiczne potwierdziło, że jest to przerzut odległy. Brak ekspresji genów CGB1-2 nie zmienia informatywności wyniku, ponieważ - jak zaznaczono powyżej nie wszystkie komórki raka charakteryzują się ekspresją każdego z genów specyficznych dla złośliwego nowotworu. Wartość Cq w kontroli negatywnej, gdzie matrycę (cDNA) do qPCR uzyskano z komórek bez zmian nowotworowych potwierdza założenia wynalazku: w prawidłowej tkance brak ekspresji genów zarówno CGB jak i hTERT.
< 110> Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu < 120> Zestaw diagnostyczny do wykrywania krążących komórek nowotworowych (CTC) oraz jego zastosowanie do identyfikacji komórek nowotworowych <130 P.433746 <140 P.433746 < 141> 2023-11-07 <160 24 < 170> Patentln verslon 3.5 < 210> 1 <211> 25 < 212> DNA < 213> Homo sapiens < 400> 1 gtgtcsagct cacyccagca tccta 25 <210 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 2 agcagcccct ggaacatct <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 3 tagtgtcsag ctcacyccag c <210 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 4 cagcccctgg aacatctcc <210 5 <211> 20
PL 244526 Β1 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cccccacgga gactcaattt <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 acatgtctct ctcttagcgg g <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 acacccctca ctccctgtc <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atatcttccg caagcactgg <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cttcatcccc aagcctgac <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cgctcggccc tcttttc <210> 11
PL 244526 Β1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gccgattgtg aacatggact <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 caccctcgag gtgagacg <210> 13 <211> 21 < 212> DNA < 213> Homo sapiens < 400> 13
6FAM ctttccatgt ccacatyccc a BBQ 21 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14
6FAM ccgaggtyta aagccaggta cacsaggc BBQ <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15
6FAM cgtcgtggga gccagaacg BBQ <210> 16 <211> 732 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> primer bind <222> (124)..(143)
PL 244526 Β1 < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB1/2F nr 7 <220>
< 221> primer bind < 222> (149).,(169) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB1/2F nr 5 <220>
< 221> misc_binding < 222> (171)..(192) < 223> Miejsce hybrydyzacji sondy CGB1/2F Nr 13 <220>
< 221> primer bind < 222> (190)..(210) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB1/2R nr 8 <220>
< 221> primer bind < 222> (211) . . (230) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB1/2F nr 6 < 400> 1 ccccagggcc agtgagggcc ctgcgttccg tggcgccccc tggagggagg aaggggaact60 gcatctgaga gagagcagcc aattgggtcc gctgactctg gccaggttcc cgtgccgcgt120 ccaacacccc tcactccctg tctcactccc ccacggagac tcaatttact ttccatgtcc180 acattcccag tgcttgcgga agatatcccg ctaagagaga gacatgtcaa agaggctgct240 gctgttgctg ctgctgagca tgggcgggac atgggcatcc aaggagccgc ttcggccacg300 gtgccgcccc atcaatgcca ccctggctgt ggagaaggag ggctgccccg tgtgcatcac360 cgtcaacacc accatctgtg ccggctactg ccccaccatg acccgcgtgc tgcagggggt420 cctgccggcc ctgcctcagg tggtgtgcaa ctaccgcgat gtgcgcttcg agtccatccg480 gctccctggc tgcccgcgcg gcgtgaaccc cgtggtctcc tacgccgtgg ctctcagctg540 tcaatgtgca ctctgccgcc gcagcaccac tgactgcggg ggtcccaagg accacccctt600 gacctgtgat gacccccgct tccaggactc ctcttcctca aaggcccctc cccccagcct660 tccaagtcca tcccgtctcc cggggcccta ggacaccccg atcctcccac aataaaggct720 tctcaatccg ca732 <210> 17 <211> 732 <212> DNA
PL 244526 Β1 < 213> Homo sapiens <220>
< 221> primer_bind < 222> (1241 . . (143) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB1/2F nr 7 <220>
< 221> primer bind < 222> (149)..(169) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB1/2F nr 5 <220>
< 221> misc binding < 222> (171)..(192) < 223> Miejsce hybrydyzacji sondy CGB1/2 nr 13 <220>
< 221> primer_bind < 222> (190)..(210) < 223> Miejsce hybrydyzacji Startera CGB1/2R nr 8 <220>
< 221> primer_bind < 222> (211) . . (230) < 223> Miejsce hybrydyzacji Startera CGB1/2R nr 6 <400> 1
| ccccagggcc agtgagggcc | ctgcgttccg | tggcgccccc | tggagggagg | aaggggaact | 60 | |
| gtatctgaga | gagagcagcc | aattgggtcc | gctgactccg | gccgggttcc | cgtgccgcgt | 120 |
| ccaacacccc | tcactccctg | tctcactccc | ccacggagaG | tcaatttact | ttccatgtcc | 180 |
| acatccccag | tgcttgcgga | agatatcccg | ctaagagaga | gacatgtcaa | aggggctgct | 240 |
| gctgttgctg | ctgctgagca | tgggcgggac | atgggcatcc | aaggagccgc | ttcggccacg | 300 |
| gtgccgcccc | atcaatgcca | ccctggctgt | ggagaaggag | ggctgccccg | tgtgcatcac | 360 |
| cgtcaacacc | accatctgtg | ccggctactg | ccccaccatg | acccgcgtgc | tgcagggggt | 420 |
| cctgccggcc | ctgcctcagg | tggtgtgcaa | ctaccgcgat | gtgcgcttcg | agtccatccg | 480 |
| gctccctggc | tgcccgcgcg | gcgtgaaccc | cgtggtctcc | tacgccgtgg | ctctcagctg | 540 |
| tcaatgtgca | ctctgccgcc | gcagcaccac | tgactgcggg | ggtcccaagg | accacccctt | 600 |
| gacctgtgat | gacccccgct | tccaggcctc | ctcttcctca | aaggcccctc | cccccagcct | 660 |
| tccaagccca | tcccgactcc | cggggccctc | agacaccccg | atcctcccac | aataaaggct | 720 |
PL 244526 Β1 tctcaatccg ca
732 <210> 18 <211> 859 <212> DNA <213> Homo sapiens
| <220> <221> <222> <223> | primer bind (85) . . (104) Miejsce hybrydyzacji | startera | CGB1/2F nr | 7 |
| <220> <221> <222> <223> | primer_bind (108) . . (128) Miejsce hybrydyzacji | startera | CGB1/2F nr | 5 |
| <220> <221> <222> <223> | misc binding (130)..(151) Miejsce hybrydyzacji | sondy CGB1/2 nr 13 | ||
| <220> <221> <222> <223> | primer bind (147)..(167) Miejsce hybrydyzacji | startera | CGB1/2R nr | 8 |
| <220> <221> <222> <223> | primer_bind (165) . . (186) Miejsce hybrydyzacji | startera | CGB1/2R nr | 6 |
<400> 1
| ctggagggag | gaaggggaac | tg Latctgag | agagagcagc | caattgggtc | cgctgactcc | 60 |
| ggccgggttc | ccgtgccgcg | tccaacaccc | ctcactccct | gtctcactcc | cccacggaga | 120 |
| ctcaatttac | tttccatgtc | cacatcccca | gtgcttgcgg | aagatatccc | gctaagagag | 180 |
| agacatgtca | aaggtagggt | agatcgacat | ttccaggcac | caaagatgga | gatgttccag | 240 |
| gaaagactgc | agggcccctg | ggcaccttcc | acctgcttcc | aggccatcac | tggcatgaga | 300 |
| aggggcagac | cagtgtgagc | tgtggaagga | ggcctctttc | tggaggagcg | tgacccccag | 360 |
| ggctgctgct | gttgctgctg | ctgagcatgg | gcgggacatg | ggcatccaag | gagccgcttc | 420 |
| ggccacggtg | ccgccccatc | aatgccaccc | tggctgtgga | gaaggagggc | tgccccgtgt | 480 |
| gcatcaccgt | caacaccacc | atctgtgccg | gctactgccc | caccatgacc | cgcgtgctgc | 540 |
PL 244526 Β1
| agggggtcct | gccggccctg | cctcaggtgg | tgtgcaacta | ccgcgatgtg | cgcttcgagt | 600 |
| ccatccggct | ccctggctgc | ccgcgcggcg | tgaaccccgt | ggtctcctac | gccgtggctc | 660 |
| tcagctgtca | atgtgcactc | tgccgccgca | gcaccactga | ctgcgggggt | cccaaggacc | 720 |
| accccttgac | ctgtgatgac | ccccgcttcc | aggcctcctc | ttcctcaaag | gcccctcccc | 780 |
| ccagccttcc | aagcccatcc | cgactcccgg | ggccctcaga | caccccgatc | ctcccacaat | 840 |
| aaaggcttct | caatccgca | 859 |
<210> 19 <211> 933 <212> DNA < 213> Homo sapiens <220>
< 221> primer_bind < 222> (301)..(322) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 3 <220>
< 221> priiner_bind < 222> (301)..(326) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 1 <220>
< 221> misc_binding < 222> (361) .. (389) < 223> Miejsce hybrydyzacji sondy CGB3-9 nr 14 <220>
< 221> primer bind < 222> (406) . . (425) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 4 <220>
< 221> primer bind < 222> (408) . . (427) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 2 <400> 1
| tgcaggaaag cctcaagtag | aggagggttg | aggcttcagt | ccagcacctt | tctcgggtca | 60 |
| cggcctcctc ctggctccca | ggaccccacc | ataggcagag | gcaggccttc | ctacacccta | 12 0 |
| ctccctgtgc ctccagcctc | gactagtccc | tagcactcga | cgactgagtc | tctgaggtca | 180 |
| cttcaccgtg gtctccgcct | cacccttggc | gctggaccag | tgagaggaga | gggctggggc | 240 |
PL 244526 Β1
| gctccgctga | gccactcctg | cgcccccctg | gccttgtcta | cctattgccc | cccgaggggt | 300 |
| tagtgtcgag | ctcaccccag | catcctatca | cctcctggtg | gccttgccgc | ccccacaacc | 360 |
| ccgaggtata | aagccaggta | cacgaggcag | gggacgcacc | aaggatggag | atgttccagg | 420 |
| ggctgctgct | gttgctgctg | Gtgagcatgg | gcgggacatg | ggcatccaag | gagccgcttc | 480 |
| ggccacggtg | ccgccccatc | aatgccaccc | tggctgtgga | gaaggagggc | tgccccgtgt | 540 |
| gcatcaccgt | caacaccacc | atctgtgccg | gctactgccc | caccatgacc | cgcgtgctgc | 600 |
| agggggtcct | gucggccctg | cctcaggtgg | tgtgcaacta | ccgcgatgtg | cgcttcgagt | 660 |
| ccatccggct | ccctggctgc | ccgcgcggcg | tgaaccccgt | ggtctcctac | gccgtggctc | 720 |
| tcagctgtca | atgtgcactc | tgccgccgca | gcaccactga | ctgcgggggt | cccaaggacc | 780 |
| accccttgac | ctgtgatgac | ccccgcttcc | aggactcctc | ttcctcaaag | gcccctcccc | 840 |
| ccagccttcc | aagcccatcc | cgactcccgg | ggccctcgga | caccccgatc | ctcccacaat | 900 |
| aaaggcttct | caatccgcaa | aaaaaaaaaa | aaa | 933 |
<210> 20 <211> 877 <212> ΕΝΑ < 213> Homo sapiens <220>
< 221> primer_bind < 222> (259)..(284) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 3 <220>
< 221> primer_bind < 222> (261) . . (286) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 1 <220>
< 221> misc binding < 222> (319)..(347) < 223> Miejsce hybrydyzacji Sondy CGB3-9 nr 14 <220>
< 221> primerbind < 222> (364)..(385) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 2 <220>
< 221> primer_bind
PL 244526 Β1 <222> (364)..(383) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 4 <400 1
| agcactttgc | tcgggtcacg | gcctcctcct | ggctcccagg | accccaccat | aggcagaggc | 60 |
| aggccttcct | acaccctact | ccctgtgcct | ccaggctcga | ctagtcccta | gcactcgacg | 120 |
| actgagtctc | tgagatcact | tcaccgtggt | ctccgcctca | cccttggcgc | tggaccagtg | 180 |
| agaggagagg | gctggggcgc | tccgctgagc | cactcctgcg | cccccctggc | cttgtctacc | 240 |
| tcttgccccc | cgaagggtta | gtgtcgagct | caccccagca | tcctacaacc | tcctggtggc | 300 |
| cttgccgccc | ccacaacccc | gaggtataaa | gccaggtaca | cgaggcaggg | gacgcaccaa | 360 |
| ggatggagat | gttccagggg | ctgctgctgt | tgctgctgct | gagcatgggc | gggacatggg | 420 |
| catccaagga | gccgcttcgg | ccacggtgcc | gccccatcaa | tgccaccctg | gctgtggaga | 480 |
| aggagggctg | ccccgtgtgc | atcaccgtca | acaccaccat | ctgtgccggc | tactgcccca | 540 |
| ccatgacccg | cgtgctgcag | ggggtcctgc | cggccctgcc | tcaggtggtg | tgcaactacc | 600 |
| gcgatgtgcg | cttcgagtcc | atccggctcc | ctggctgccc | gcgcggcgtg | aaccccgtgg | 660 |
| tctcctacgc | cgtggctctc | agctgtcaat | gtgcactctg | ccgccgcagc | accactgact | 720 |
| gcgggggtcc | caaggaccac | cccttgacct | gtgatgaccc | ccgcttccag | gactcctctt | 780 |
| cctcaaaggc | ccctcccccc | agccttccaa | gtccatcccg | actcccgggg | ccctcggaca | 840 |
| ccccgatcct | cccacaataa | aggcttctca | atccgca | 877 |
<210 21 < 211> 880 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <220 < 221> primer_bind < 222> (262)..(283) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 3 <220 < 221> primer_bind < 222> (264)..(289) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 1 <220 < 221> misc binding
PL 244526 Β1 < 222> (322)..(350) < 223> Miejsce hybrydyzacji Sondy CGB3-9 nr 14 <220>
< 221> primer bind < 222> (367)..(386) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 4 <220>
< 221> primer_bind < 222> (369)..(388) <223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 2 <400> 1
| tccagcacct | ttctcgggtc | acggcatcct | cctggttccc | aagaccccac | cataggcaga | 60 |
| ggcaggcctt | cctacaecct | actctctgtg | cctccagcct | cgactagtcc | ctagcactcg | 120 |
| acgactgagt | ctcagaggtc | acttcaccgt | ggtctccgcc | tcatccttgg | cgctagacca | 180 |
| ctgaggggag | aggactgggg | tgctccgctg | agccactcct | gtgcctccct | ggccttgtct | 240 |
| acttctcgcc | ccccgaaggg | ttagtgtcca | gctcactcca | gcatcctaca | acctcctggt | 300 |
| ggccttgacg | cccccacaaa | cccgaggtat | aaagccaggt | acaccaggca | ggggacgcac | 360 |
| caaggatgga | gatgttccag | gggctgctgc | tgttgctgct | gctgagcatg | ggcgggacat | 420 |
| gggcatccag | ggagatgctt | cggccacggt | gccgccccat | caatgccacc | ctggctgtgg | 480 |
| agaaggaggg | ctgccccgtg | tgcatcaccg | tcaacaccac | catctgtgcc | ggctactgcc | 540 |
| ccaccatgac | ccgcgtgctg | cagggggtcc | tgccggccct | gcctcaggtg | gtgtgcaact | 600 |
| accgcgatgt | gcgcttcgag | tccatccggc | tccctggctg | ccogcgcggc | gtgaaccccg | 660 |
| tggtctccta | cgccgtggct | ctcagctgtc | aatgtgcact | ctgccgccgc | agcaccactg | 720 |
| actgcggggg | tcccaaggac | caccccttga | cctgtgatga | cccccgcttc | caggcctcct | 780 |
| cttecteaaa | ggcccctccc | cccagccttc | caagtćcatc | Ccgactcccg | gggccctcag | 840 |
| acaccccgat | ccteccacaa | taaaggcttc | tcaatccgca | 880 |
<210> 22 <211> 1863 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221>
primer_bind
PL 244526 Β1 <222> (1245) .. (1266) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 3 <220>
< 221> primer bind < 222> (1247) .. (1272) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 1 <220>
< 221> misc binding < 222> (1304)..(1332) < 223> Miejsce hybrydyzacji Sondy CGB3-9 nr 14 <220>
< 221> prirner_bind < 222> (1350) . . (1369) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 4 <220>
< 221> primer_bind < 222> (1352) .. (1371) <223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 2 <400>1 gctctaatcg cctgcacgaa gaaccccgcg ctgtctggcc cacccttcac agtatccgac60 cggggcgtcc tgaaccgccg ccagctctat ctgaccacct cggcgcggga ctttcggttc120 tatcccaaga cggagccgtc cggatacccc cgcaaggact acctgaccta ctggagctta180 gaagagacgc cccaactctg gagtcacgac ccgcagcggc agccctgtct ctgctcttcc240 aggccgcctc gagcgccgca cggcgggcca tgtctccggc tcaggaaacc tacagctcct300 cgccgcaccc gctccgccgg ctcgaccgct tccgcccgct ggaggcgact tggggtggcc360 cccactggaa gcccctgccg ggcatacaca gcgtcccgaa agcctacagc accgagaact420 cccgctcagg ccgctgtaag ccggggctag tgggagcctg ccgggccagc cccaccccag480 acacgccccc tggcgtgggg gcggagcaga gctctgggca gccgctcact acgcggtgtc540 ggacctaggt gggctcgcac tcattaagtc tatccgcagt gtggggacag gactagccca600 gacacgccca ctcagctgcg gctggatcgc ggggaaggga ctaagtccag acaatgtcct660 ccgaggctgc ggccccgcgg gcaggacaca cctcctgcgg gcctattcaa taatcagtta720 aatcacctga agcacacgca tttccgggga ccgctccggg catcctggct tgagggtagg780 gtgggcggag gttcctaagg gagaggtggg gctcgggctg aatccctcgt tggggggcat840 ctgggtcaag tggcttccct ggcagcacag tcacggggag accctctctc actgggcaga900
PL 244526 Β1
| agctaagtcc | gaagccgcgc | ccctcctgtt | aggttggact | gtggtgcagg | aatggctcaa | 960 |
| gtagaggagg | gttgaggctt | cagtccagca | cctttctcgg | gtcacggcct | cctcctggtt | 1020 |
| cccaagaccc | caccataggc | agaggcaggc | cttcctacac | cctactctct | gtgcctccag | 1080 |
| cctcgactag | tccctagcac | tcgacgactg | agtctcagag | gtcacttcac | cgtggtctcc | 1140 |
| gcctcatcct | tggcgctaga | ccactgaggg | gagaggactg | gggtgctccg | ctgagccact | 1200 |
| catgtgcctc | catggccttg | tctacttctc | gccccccgaa | gggttagtgt | ccagctcact | 1260 |
| ccagcatcct | acaacctcct | ggtggccttg | acgcccccac | aaacccgagg | tataaagcca | 1320 |
| ggtacaccag | gcaggggacg | caccaaggat | ggagatgttc | caggggctgc | tgctgttgct | 1380 |
| gctgctgagc | atgggcggga | catgggcatc | cagggagatg | cttcggccac | ggtgccgccc | 1440 |
| catcaatgcc | accctggctg | tggagaagga | gggctgcccc | gtgtgcatca | ccgtcaacac | 1500 |
| caccatctgt | gccggctact | gccccaccat | gacccgcgtg | ctgcaggggg | tcctgccggc | 1560 |
| cctgcctcag | gtggtgtgca | actaccgcga | tgtgcgcttc | gagtccatcc | ggctccctgg | 1620 |
| ctgcccgcgc | ggcgtgaacc | ccgtggtctc | ctacgccgtg | gctctcagct | gtcaatgtgc | 1680 |
| actctgccgc | cgcagcacca | ctgactgcgg | gggtcccaag | gaccacccct | tgacctgtga | 1740 |
| tgacccccgc | ttccaggcct | cctcttcctc | aaaggcccct | ccccccagcc | ttccaagtcc | 1800 |
| atcccgactc | ccggggccct | cagacacccc | gatcctccca | caataaaggc | ttctcaatcc | 1860 |
| gca | 1863 |
<210> 23 <211> 887 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> primer_bind <222> (269)..(290) <223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 3 <220>
<221> primerbind <222> (271) . . (296) <223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9F nr 1 <220>
PL 244526 Β1 < 221> primer_bind < 222> (374)..(393) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 4 <220 < 221> primer_bind < 222> (376)..(395) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera CGB3-9R nr 2 <220 < 221> misc binding < 222> (392)..(420) <223> Miejsce hybrydyzacji Sondy CGB3-9 nr 14 <400 1
| gcttcagtcc | agcacctttc | tcgggtcacg | gcctcctcct | ggctcccagg | accccaccat | 60 |
| aggcagaggc | aggccttcct | acaccctact | ccctgtgcct | ccaggctcga | ctagtcccta | 12 0 |
| gcactcgacg | actgagtctc | tgaggtcact | tcaccgtggt | ctccgcctca | cccttggcgc | 180 |
| tggaccagtg | agaggagagg | gctggggcgc | tccgctgagc | cactcctgcg | cccccctggc | 240 |
| cttgtctacc | tcttgcccoc | cgaagggtta | gtgtcgagct | cactccagca | tcctacaacc | 300 |
| tcctggtggc | cttgccgccc | ccacaacccc | gaggtttaaa | gccaggtaca | cgaggcaggg | 360 |
| gacacaccaa | ggatggagat | gttccagggg | ctgctgctgt | tgctgctgct | gagcatgggc | 420 |
| gggacatggg | catccaagga | gccgcttcgg | ccacggtgcc | gccccatcaa | tgccaccctg | 480 |
| gctgtggaga | aggagggctg | ccccgtgtgc | atcaccgtca | acaccaccat | ctgtgccggc | 540 |
| tactgcccca | ccatgacccg | cgtgctgcag | ggggtcctgc | cggccctgcc | tcaggtggtg | 600 |
| tgcaactacc | gcgatgtgcg | cttcgagtcc | atccggctcc | Gtggctgccc | gcgcggcgtg | 660 |
| aaccccgtgg | tctcctacgc | cgtggctctc | agctgtcaat | gtgcactctg | ccgccgcagc | 720 |
| accactgact | gcgggggtcc | caaggaccac | cccttgacct | gtgatgaccc | ccgcttccag | 780 |
| gactcctctt | cctcaaaggc | ccctcccccc | agccttccaa | gtccatcccg | actcccgggg | 840 |
| ccctcggaca | ccccgatcct | cccacaataa | aggcttctca | atccgca | 887 |
<210 24 <211> 3210 <212> DNA <213> Homo sapiens <220 <221> primer_bind <222> (1866) .. (1885)
PL 244526 Β1 < 223> Miejsce hybrydyzacji startera TERT F nr 9 <220>
< 221> primer bind < 222> (1893) .. (1913) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera TERT F nr 11 <220>
< 221> rtiisc_binding < 222> (1914) .. (1933) < 223> Miejsce hybrydyzacji sondy TERT nr 15 <220>
< 221> primerbind < 222> (1940) .. (1958) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera TERT R nr 10 <220>
< 221> primer bind < 222> (1956) .. (1974) < 223> Miejsce hybrydyzacji startera TERT R nr 12 < 400> 1 atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag60 gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag120 cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg180 gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg240 gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc300 ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc360 agctacctgc ccaacacggL gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgLg ggggctgctg420 ctgcgccgcg tgggogacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg480 ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct540 gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa600 cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt660 gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt720 ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc780 aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa840 gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc900
PL 244526 Β1
| cgccagcacc | acgagggccc | cccatacaca | tcgcggccac | cacgtccctg | ggacacgcct | 960 |
| tgtcccccgg | tgtacgccga | gaccaagcac | ttcctctact | cctcaggcga | caaggagcag | 1020 |
| ctgcggccct | ccttcctact | cagctctctg | aggcccagcc | tgactggcgc | tcggaggctc | 1080 |
| gtggagacca | tctttctggg | ttccaggccG | tggatgccag | ggactccccg | caggttgccc | 1140 |
| cgcctgcccc | agcgctactg | gcaaatgcgg | cccctgtttc | tggagctgct | tgggaaccac | 1200 |
| gcgcagtgcc | cctacggggt | gctcctcaag | acgcactgcc | cgctgcgagc | tgcggtcacc | 1260 |
| ccagcagccg | gtgtctgtgc | ccgggagaag | ccccagggct | ctgtggcggc | ccccgaggag | 1320 |
| gaggacacag | acccccgtcg | cctggtgcag | ctgctccgcc | agcacagcag | cccctggcag | 1380 |
| gtgtacggct | tcgtgcgggc | ctgcctgcgc | cggctggtgc | ccccaggcct | ctggggctcc | 1440 |
| aggcacaacg | aacgccgctt | cctcaggaac | accaagaagt | tcatctccct | ggggaagcat | 1500 |
| gccaagctct | cgctgcagga | gctgacgtgg | aagatgagcg | tgcgggactg | cgcttggctg | 1560 |
| cgcaggagcc | caggggttgg | ctgtgttccg | gccgcagagc | accgtctgcg | tgaggagatc | 1620 |
| ctggccaagt | tcctgcactg | gctgatgagt | gtgtacgtcg | tcgagctgct | caggtctttc | 1680 |
| ttttatgtca | cggagaccac | gtttcaaaag | aacaggctct | ttttctaccg | gaagagtgtc | 1740 |
| tggagcaagt | tgcaaagcat | tggaatcaga | cagcacttga | agagggtgca | gctgcgggag | 1800 |
| ctgtcggaag | cagaggtcag | gcagcatcgg | gaagccaggc | ccgccctgct | gacgtccaga | 1860 |
| ctccgcttca | tccccaagcc | tgacgggctg | cggccgattg | tgaacatgga | ctacgtcgtg | 1920 |
| ggagccagaa | cgttccgcag | agaaaagagg | gccgagcgtc | tcacctcgag | ggtgaaggca | 1980 |
| ctgttcagcg | tgctcaacta | cgagcgggcg | cggcgccccg | gcctcctggg | cgcctctgtg | 2040 |
| ctgggcctgg | acgatatcca | cagggcctgg | cgcaccttcg | tgctgcgtgt | gcgggcccag | 2100 |
| gacccgccgc | ctgagctgta | ctttgtcaag | gtggatgtga | cgggcgcgta | cgacaccatc | 2160 |
| ccccaggaca | ggctcacgga | ggtcatcgcc | agcatcatca | aaccccagaa | cacgtactgc | 2220 |
| gtgcgtcggt | atgccgtggt | ccagaaggcc | gcccatgggc | acgtccgcaa | ggccttcaag | 2280 |
| agccacgtct | ctaccttgac | agacctccag | ccgtacatgc | gacagttcgt | ggctcacctg | 2340 |
| caggagacca | gcccgctgag | ggatgccgtc | gtcatcgagc | agagctcctc | cctgaatgag | 2400 |
| gccagcagtg | gcctcttcga | cgtcttccta | cgcttcatgt | gccaccacgc | cgtgcgcatc | 2460 |
| aggggcaagt | cctacgtcca | gtgccagggg | atcccgcagg | gctccatcct | ctccacgctg | 2520 |
PL 244526 Β1
| ctctgcagcc | tgtgctacgg | cgacatggag | aacaagctgt | ttgcggggat | tcggcgggac | 2580 |
| gggctgctcc | tgcgtttggt | ggatgatttc | ttgttggtga | cacctcacct | cacccacgcg | 2640 |
| aaaaccttcc | tcagctatgc | ccggacctcc | atcagagcca | gtctcacctt | caaccgcggc | 2700 |
| ttcaaggctg | ggaggaacat | gcgtcgcaaa | ctctttgggg | tcttgcggct | gaagtgtcac | 2760 |
| agcctgtttc | tggatttgca | ggtgaacagc | ctccagacgg | tgtgcaccaa | catctacaag | 2820 |
| atcctcctgc | tgcaggcgta | caggtttcac | gcatgtgtgc | tgcagctccc | atttcatcag | 2880 |
| caagtttgga | agaaccccac | atttttcctg | cgcgtcatct | ctgacacggc | ctccctctgc | 2940 |
| tactccatcc | tgaaagccaa | gaacgcaggg | atgtcgctgg | gggccaaggg | cgccgccggc | 3000 |
| cctctgccct | ccgaggccgt | gcagtggctg | tgccaccaag | cattcctgct | caagctgact | 3060 |
| cgacaccgtg | tcacctacgt | gccactcctg | gggtcactca | ggacagccca | gacgcagctg | 3120 |
| agtcggaagc | tcccggggac | gacgctgact | gccctggagg | ccgcagccaa | cccggcactg | 3180 |
| ccctcagact | tcaagaccat | cctggactga | 3210 |
Claims (5)
1. Zestaw diagnostyczny do wykrywania krążących komórek nowotworowych (CTC), znamienny tym, że zawiera:
- parę starterów specyficznych względem genów CGB3/CGB9, CGB5, CGB6/CGB7 i CGB8 (CGB3-9): startery o sekwencji CGB3-9 F nr 1, CGB3-9 R nr 2 lub startery o sekwencji CGB3-9 F nr 3, CGB3-9 R nr 4 oraz
- parę starterów specyficznych względem genów CGB1 i CGB2: startery o sekwencji CGB1/2 F nr 5, CGB1/2 R nr 6 lub startery o sekwencji CGB1/2 F nr 7, CGB1/2 R nr 8 i
- parę starterów specyficznych względem sekwencji mRNA katalitycznej podjednostki enzymu telomerazy hTERT: startery o sekwencji TERT F nr 9, TERT R nr 10 lub startery o sekwencji TERT F nr 11, TERT R nr 12.
2. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sondę CGB1/2 o sekwencji nr 13 lub sondę CGB3-9 o sekwencji nr 14 lub sondę TERT o sekwencji nr 15.
3. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera barwnik fluoroscencyjny wybarwiający dwuniciowy DNA.
4. Zestaw diagnostyczny określony w zastrz. 1-3 do zastosowania w diagnozowaniu in vitro nowotworów u ludzi poprzez identyfikację komórek CTC.
5. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje diagnozowanie nowotworów wybranych z grupy: rak piersi, rak jajnika, rak prostaty, rak jelita grubego, rak płuca.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL433746A PL244526B1 (pl) | 2020-04-29 | 2020-04-29 | Zestaw diagnostyczny do wykrywania komórek nowotworowych (CTC) oraz jego zastosowanie do identyfikacji komórek nowotworowych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL433746A PL244526B1 (pl) | 2020-04-29 | 2020-04-29 | Zestaw diagnostyczny do wykrywania komórek nowotworowych (CTC) oraz jego zastosowanie do identyfikacji komórek nowotworowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL433746A1 PL433746A1 (pl) | 2021-11-02 |
| PL244526B1 true PL244526B1 (pl) | 2024-02-05 |
Family
ID=78595346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL433746A PL244526B1 (pl) | 2020-04-29 | 2020-04-29 | Zestaw diagnostyczny do wykrywania komórek nowotworowych (CTC) oraz jego zastosowanie do identyfikacji komórek nowotworowych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL244526B1 (pl) |
-
2020
- 2020-04-29 PL PL433746A patent/PL244526B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL433746A1 (pl) | 2021-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5117852B2 (ja) | 乳癌の予後診断方法およびキット | |
| JP6743056B2 (ja) | 前立腺がん予後判定の方法 | |
| CA2642331C (en) | Dna conformation (loop structures) in abnormal gene expression in cancer | |
| Reinholz et al. | Differential gene expression of TGFβ inducible early gene (TIEG), Smad7, Smad2 and Bard1 in normal and malignant breast tissue | |
| JP2010517536A (ja) | 原発不明がんの原発巣を同定するための方法および材料 | |
| CN108738329A (zh) | 前列腺癌预后方法 | |
| US20220229060A1 (en) | Gender-specific markers for diagnosing prognosis and determining treatment strategy for renal cancer patients | |
| BR112019011031A2 (pt) | Método para estratificação de risco, produto de programa de computador, kit de diagnóstico e uso de um perfil de expressão gênica para estratificação de risco | |
| US20060121477A1 (en) | Method for detection of micro-metastasis | |
| Baumann et al. | Association of high miR-182 levels with low-risk prostate cancer | |
| Bialkowska-Hobrzanska et al. | Comparison of human telomerase reverse transcriptase messenger RNA and telomerase activity as urine markers for diagnosis of bladder carcinoma | |
| MXPA05005039A (es) | Metodos y composiciones para detectar actividad telomerasa. | |
| PL244526B1 (pl) | Zestaw diagnostyczny do wykrywania komórek nowotworowych (CTC) oraz jego zastosowanie do identyfikacji komórek nowotworowych | |
| KR20210101179A (ko) | 신장암 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 성별 특이적 마커 | |
| RU2837879C1 (ru) | Способ прогнозирования привычной невынашиваемости беременности по экспрессии генов микроРНК в биопсийном материале эндометрия | |
| Kawashima et al. | TERT promotor region rearrangements analyzed in high-risk neuroblastomas by FISH method and whole genome sequencing | |
| KR101799152B1 (ko) | Pd-l1 다형성을 이용한 비소세포폐암 환자의 예후 진단방법 | |
| Martínez-Sanchíz et al. | Diagnostic and prognostic value of the detection of hTERT mRNA in renal tumors | |
| EP1071808A1 (en) | Telomerase assay of body fluids for cancer screening and assessment of disease stage and prognosis | |
| CN110904222B (zh) | 胎盘植入性疾病标志物 | |
| US7011950B2 (en) | Detecting recurrence and high stage bladder carcinoma | |
| PL244067B1 (pl) | Sposób wykrywania raka prostaty o złym rokowaniu | |
| WO2022051141A1 (en) | Methods for early detection of breast cancer | |
| 河島茉澄 | TERT promotor region rearrangements analyzed in high-risk neuroblastomas by FISH method and whole genome sequencing | |
| WO2012056033A1 (en) | Method for the analysis of a biological sample of a patient |