PL245564B1 - Zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych do jednoczesnego wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej oraz sposób wykrywania tych patogenów - Google Patents
Zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych do jednoczesnego wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej oraz sposób wykrywania tych patogenów Download PDFInfo
- Publication number
- PL245564B1 PL245564B1 PL439154A PL43915421A PL245564B1 PL 245564 B1 PL245564 B1 PL 245564B1 PL 439154 A PL439154 A PL 439154A PL 43915421 A PL43915421 A PL 43915421A PL 245564 B1 PL245564 B1 PL 245564B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- nosema
- vairimorpha
- pathogens
- apis
- ceranae
- Prior art date
Links
- 241001126829 Nosema Species 0.000 title claims abstract description 39
- 241000243216 Vairimorpha Species 0.000 title claims abstract description 39
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims abstract description 23
- 241000256836 Apis Species 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 title claims abstract description 14
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- 241001492486 Nosema apis Species 0.000 description 3
- 241000122990 Nosema ceranae Species 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000256837 Apidae Species 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000243190 Microsporidia Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001126844 Nosematidae Species 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002683 reaction inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiot wynalazku stanowi zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych do jednoczesnego wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej o sekwencjach — pierwsza para nr 1 i 2 oraz druga para: nr 3 i 4, umieszczonych na liście sekwencji. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania i różnicowania ww. patogenów z zastosowaniem zestawu par starterów.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych do jednoczesnego wykrywania oraz różnicowania mikrosporydiów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema ) ceranae z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy, a także sposób wykrywania obecności tych patogenów w pszczołach miodnych (Apis mellifera) oraz próbach środowiskowych.
Ochrona populacji pszczoły miodnej jest szczególnie istotna ze względu na pandemiczny, przewlekły charakter zakażeń oraz znaczne straty powodowane przez te patogeny, prowadzące do zamierania całych rodzin pszczelich. Obserwowane są zarówno zakażenia jednym z wymienionych patogenów, jak również infekcje mieszane. Metody molekularne charakteryzują się dużą specyficznością i czułością, identyfikują mikroorganizmy poprzez wykrycie obecności ich materiału genetycznego w pszczołach nie wykazujących jeszcze objawów chorobowych. Wczesne wykrycie infekcji umożliwia podjęcie szybszych i skuteczniejszych działań oraz zapobiega intensywnemu rozprzestrzenianiu się zakażenia, co jest bardzo istotne ze względu na dużą liczebność i ścisłą współegzystencję pszczół w obrębie jednej rodziny pszczelej. Vairimorpha (Nosema) ceranae jest uznawany za patogen o wyższej wirulentności niż Vairimorpha (Nosema) apis, dlatego właściwa identyfikacja zakażenia do gatunku jest bardzo ważna, gdyż wpływa na sposób leczenia pszczół.
Identyfikowane patogeny Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae należą do grupy mikrosporydiów - wewnątrzkomórkowych mikroorganizmów eukariotycznych, które są blisko spokrewnione z grzybami. Dotychczas określane były one jako Nosema apis oraz Nosema ceranae, ale ich pozycja taksonomiczna została w ostatnim czasie zredefiniowana (Tokarev YS, Huang W-F, Solter LF, Malysh JM, Becnel JJ, Vossbrinck CR. 2020. A formal redefinition of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) and reassignment of species based on molecular phylogenetics. J Invertebr Pathol. 169: 107279). Jedną z najczęściej stosowanych molekularnych metod identyfikacji patogenów V. apis i V. ceranae opartą na dwóch reakcjach PCR jest metoda wykorzystująca dwie pary gatunkowo-specyficznych starterów 321APIS-FOR/321APIS-REV dające produkt o długości 321 pz w obecności DNA Vairimorpha (Nosema) apis oraz 218MITOC-FOR/218MITOC-REV dające produkt o długości 218-219 pz dla Vairimorpha (Nosema) ceranae, (Martin-Hernandez R, Meana A, Prieto L, Salvador AM, Garrido-Bailón E, Higes M, 2007. Outcome of colonization of Apis mellifera by Nosema ceranae. Appl Environ Microbiol. 73(20): 6331-8). Były one stosowane zarówno w celu stwierdzenia obecności V. apis i/lub V. ceranae, jak również w analizach udziału ilościowego obu patogenów w badanych próbach. Z przeprowadzonych badań wynika jednak, że w przypadku pary 321APISFOR/321APIS-REV występują trudności z optymalizacją reakcji PCR, co w rezultacie uniemożliwia skuteczną identyfikację N. apis.
W identyfikacji omawianych patogenów stosowano także dwie inne pary starterów: N. apis-sense i N. apis-antisense umożliwiające uzyskanie amplikonu o długości 269 pz dla Vairimorpha (Nosema) apis oraz N. ceranae-sense i N. ceranae-antisense flankujące fragment o długości 250 pz dla Vairimorpha (Nosema) ceranae (Chen Y, Evans JD, Zhou L, Boncristiani H, Kimura K, Xiao T, Litkowski AM, Pettis JS. 2009. Asymmetrical coexistence of Nosema ceranae and Nosema apis in honey bees. J Invertebr Pathol. 101(3): 204-209). Jednak bardzo zbliżona długość produktów PCR uzyskiwanych za pomocą obu par starterów może znacząco obniżyć skuteczność właściwej identyfikacji gatunkowej patogenu.
Ze względu na istniejące ww. trudności, związane z przeprowadzeniem reakcji PCR, czy też skuteczną identyfikacją patogenu, nadal istnieje potrzeba poszukiwania starterów oligonukleotydowych, które rozwiązywałyby wyżej wskazane problemy.
Istotę wynalazku stanowi zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych do wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej o sekwencjach - pierwsza para: nr 1 i 2 oraz druga para: nr 3 i 4, przedstawionych na liście sekwencji.
Istotą sposobu wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej, w którym w reakcji PCR z zastosowaniem zestawu dwóch par starterów jednocześnie dochodzi do amplifikacji określonych, specyficznych gatunkowo fragmentów DNA, po czym dokonuje się detekcji powstałego produktu/produktów jest to, że stosuje się zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych o sekwencjach - pierwsza para: nr 1 i 2 oraz druga para: nr 3 i 4, przedstawionych na liście sekwencji.
W wyniku reakcji PCR z zastosowaniem zestawu par starterów oligonukleotydowych według wynalazku dochodzi do amplifikacji określonego specyficznego dla danego gatunku fragmentu DNA patogenu Vairimorpha (Nosema) apis i/lub Vairimorpha (Nosema) ceranae. Następnie dokonuje się detekcji otrzymanych produktów amplifikacji poprzez rozdział elektroforetyczny. Zastosowanie wyżej wymienionych par starterów do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy przebiegającej w ściśle określonych według wynalazku warunkach umożliwia amplifikację fragmentów DNA o długościach ok. 200 oraz ok. 400 par zasad. Istotna różnica w długości otrzymywanych produktów PCR umożliwia jednoznaczną identyfikację patogenów, rozróżnienie obecności Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae oraz wykrycie infekcji mieszanych. Zaletą opracowanego, systemu identyfikacji jest, fakt, że został on zwalidowany na dużej liczbie próbek (ok. 2000). W szczególności na korzyść niniejszej metody przemawia jej walidacja również na próbach środowiskowych o stwierdzonej obecności patogenów i zróżnicowanym poziomie infekcji Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae oraz próbach niezakażonych.
Wynalazek przedstawiony na przykładzie wykonania i na rysunku, na którym:
Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA Vairimorpha (Nosema) apis amplifikowanego w reakcji PCR przeprowadzonej z zastosowaniem pary starterów oligonukleotydowych nr 1 i 2 (AmVairA-F i AmVairA-R);
Fig. 2 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA Vairimorpha (Nosema) ceranae amplifikowanego w reakcji PCR przeprowadzonej z zastosowaniem pary starterów oligonukleotydowych nr 3 i 4 (AmVairC-F i AmVairC-R);
Fig. 3 przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji przeprowadzonej w obecności par starterów nr 1 i 2 (nr studzienki/prążka 1-7) oraz starterów nr 3 i 4 (nr studzienki/prążka 8-14): nr studzienki/prążka 1,8 - kontrola negatywna (woda dejonizowana), nr studzienki/prążka 2-3, 9-10 próby izolowane z pszczół zdrowych, nr studzienki/prążka 4-7, 11-14 - próby izolowane z pszczół porażonych patogenem Vairimorpha (Nosema) apis i/lub Vairimorpha (Nosema) ceranae;
Fig. 4 przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji przeprowadzonej w jednoczesnej obecności zestawu dwóch par starterów nr 1, 2 oraz nr 3 i 4: M - marker wielkości, nr studzienki/prążka, 1-3 - próby izolowane z pszczół porażonych - stwierdzona obecność infekcji mieszanej Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae, nr studzienki/prążka 4-5 - próby izolowane z pszczół: porażonych - stwierdzona obecność infekcji wyłącznie Vairimorpha (Nosema) apis, nr studzienki/prążka 6 - kontrola negatywna (woda dejonizowana).
Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie identyfikacji stanowiły rozdrobnione fragmenty tkanek pszczoły miodnej pozyskane na dowolnym etapie rozwojowym oraz z dowolnej części ciała osobnika. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. PCR przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana, standardowy master mix do reakcji PCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA, kofaktor enzymu - jony Mg2+, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz dwie pary specyficznych starterów oligonukleotydowych (0,5 μM): AmVairA-F/Am VairA-R i AmVairC-F/AmVairC-R. Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego: wstępna denaturacja - 95-98°C przez 5 minut, następnie 35-40 cykli: denaturacja - 95-98°C przez 30 sekund, annealing - 53-58°C przez 30-45 sekund, elongacja - 72°C przez: 1 minutę, ostatni etap reakcji stanowi końcowa elongacja w 72°C przez 5 minut, lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA z oligonukleotydowymi starterami stanowiącymi przedmiot wynalazku. Sekwencja zamplifikowanych fragmentów DNA przedstawiona jest na Fig. 1 i Fig. 2.
Obecność oczekiwanego produktu o długości około 200 i/lub 400 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnej metody rozdziału i identyfikacji fragmentów kwasów nukleinowych. Sposób stwierdzania, obecności materiału genetycznego mikrosporydiów Vairimorpha (Nosema) apis i/lub Vairimorpha (Nosema) ceranae w badanej próbie według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.
A. Izolacja DNA z fragmentów tkanek pszczoły miodnej.
Izolację DNA przeprowadzono z wykorzystaniem komercyjnego zestawu dedykowanego do śladów biologicznych (Sherlock AX, A&A Biotechnology), umożliwiającego ekstrakcję DNA Vairimorpha (Nosema) nawet przy zakażeniu, o niskiej intensywności (niewielkiej zawartości DNA patogenu w próbie). Fragmenty tkanki pszczelej rozdrabniano mechanicznie za pomocą narzędzi chirurgicznych. Otrzymane w ten sposób homogenaty przenoszono do probówek 2 ml typu Eppendorf i dodawano 300 μl wody jałowej, 300 μl roztworu lizującego, 20 μl proteinazy K oraz 20 μl DTT. Mieszaniny po dokładnym
PL 245564 Β1 zworteksowaniu inkubowano w temperaturze 50°C do całkowitego strawienia tkanki. Lizały przenoszono na kolumny filtracyjne a następnie selektywne kolumny oczyszczające. Związane na membranie kolumny oczyszczającej DNA płukano dwukrotnie dodając po 600 μΙ buforu płuczącego a następnie wirując. W kolejnych etapach dokonano elucji dodając dwukrotnie po 350 μΙ buforu elucyjnego, inkubując próby w temperaturze pokojowej a następnie wirując. Uzyskany po dwukrotnym wirowaniu (1 min., 8 000 RPM) supernatant przenoszono do nowych probówek. Następnie dodawano po 5 μΙ wzmacniacza precypitacji oraz 600 μΙ izopropanolu. Całość mieszano i wirowano 10 min przy 10 000 RPM. Ostrożnie usunięto supernatanty, uważając aby nie usunąć niebieskich osadów DNA a następnie dodano po 500 μΙ 70% etanolu, całość wymieszano i wirowano 5 min przy 10 000 RPM. Następnie usunięto supernatanty, a osady DNA wysuszono przez odwrócenie probówek przez 10 min w temperaturze pokojowej. Osady zawieszono w buforze TE. Dla określenia stężenia i jakości wyizolowanego DNA przeprowadzono pomiar spektrofotometryczny przy użyciu spektrofotometru BioPhotometer (Eppendorf).
B. Przygotowanie prób do amplifikacji.
DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji PCR. Do każdej probówki o pojemności 0,2 ml dodano od 20 do 30 ng DNA. PCR przeprowadzono w objętości 25 μΙ mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną, standardowy master mix PCR Mix Plus (A&A Biotechnology) uwzględniający optymalne stężenie polimerazy DNA Taq, bufor PCR, MgCb, mieszaninę wolnych nukleotydów i stabilizatory wyłapujące inhibitory reakcji polimeryzacji oraz barwnik ułatwiający obserwację elektroforezy, dwie pary specyficznych starterów oligonukleotydowych (0,5 μΜ). Amplifikację prowadzono w termocyklerze LabCycler (Sensoquest) stosując następujący profil termiczny: wstępna denaturacja - 95-98°C przez 5 minut, następnie 35-40 cykli: denaturacja - 95-98°C przez 30 sekund, annealing - 53-58°C przez 30-45 sekund, elongacja - 72°C przez 1 minutę, ostatni etap reakcji stanowiła końcowa elongacja w 72°C przez 5 minut.
Wyniki amplifikacji wizualizowano za pomocą elektroforezy agarozowej.
Produkty reakcji PCR rozdzielano na 2% żelu agarozowym w obecności barwnika do wizualizacji DNA SimplySafe (EURx) w buforze TBE, przy napięciu 90 V, w czasie 2 godzin. Otrzymane wzory rozdziałów obserwowano w świetle UV i archiwizowano przy pomocy programu Scion Image.
Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 3 i Fig. 4.
Lista sekwencji
Sekwencja nr 1
AmVairA-F:5’-GAGACGGCTACTAAGTCTAAGGATTG-3’
Sekwencja nr 2
AmVairA-R; 5’-CATCTCATATCACATCGTCGGCATA-3’
Sekwencja nr 3
AmVairC-F: 5’- CTGCACGCGCAATACAATAGATA -3’
Sekwencja nr 4
AmVairC-R: S^CAGCAACCATGTTACGACTTATATC^’
Claims (2)
1. Zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych do jednoczesnego wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej o sekwencjach - pierwsza para nr 1 i 2 oraz druga para: nr 3 i 4, umieszczonych na liście sekwencji.
2. Sposób wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej, w którym w reakcji PCR z zastosowaniem zestawu dwóch par starterów jednocześnie dochodzi do amplifikacji określonych, specyficznych gatunkowo fragmentów DNA, po czym dokonuje się detekcji powstałego produktu/produktów, znamienny tym, że zestaw dwóch par starterów stanowią startery oligonukleotydowe jak określono w zastrz. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL439154A PL245564B1 (pl) | 2021-10-07 | 2021-10-07 | Zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych do jednoczesnego wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej oraz sposób wykrywania tych patogenów |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL439154A PL245564B1 (pl) | 2021-10-07 | 2021-10-07 | Zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych do jednoczesnego wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej oraz sposób wykrywania tych patogenów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL439154A1 PL439154A1 (pl) | 2023-04-11 |
| PL245564B1 true PL245564B1 (pl) | 2024-09-02 |
Family
ID=85983099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL439154A PL245564B1 (pl) | 2021-10-07 | 2021-10-07 | Zestaw dwóch par starterów oligonukleotydowych do jednoczesnego wykrywania i różnicowania patogenów Vairimorpha (Nosema) apis i Vairimorpha (Nosema) ceranae pszczoły miodnej oraz sposób wykrywania tych patogenów |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL245564B1 (pl) |
-
2021
- 2021-10-07 PL PL439154A patent/PL245564B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL439154A1 (pl) | 2023-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lodh et al. | Point of care diagnosis of multiple schistosome parasites: Species-specific DNA detection in urine by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) | |
| Babaei et al. | Giardia intestinalis: DNA extraction approaches to improve PCR results | |
| Almasi et al. | Development of colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of the tomato yellow leaf curl virus | |
| Prusty et al. | Visual detection of Brucella spp. in spiked bovine semen using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay | |
| Van Lith et al. | A real-time assemblage-specific PCR assay for the detection of Giardia duodenalis assemblages A, B and E in fecal samples | |
| RU2385943C2 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса блютанга методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации | |
| Nooratiny et al. | DNA extraction from ghee and beef species identification using polymerase chain reaction (PCR) assay | |
| Kim et al. | Rapid detection of deformed wing virus in honeybee using ultra-rapid qPCR and a DNA-chip. | |
| Takano et al. | An ultra-simplified protocol for PCR template preparation from both unsporulated and sporulated Eimeria oocysts | |
| JP3449961B2 (ja) | マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法 | |
| Das et al. | Standardization of a two-step real-time polymerase chain reaction based method for species-specific detection of medically important Aspergillus species | |
| RU2620944C1 (ru) | Способ выявления экспансии тринуклеотидных CGG-повторов в 5'-нетранслируемой, промоторной области гена FMR1 при заболевании синдрома атаксии/тремора, ассоциированного с ломкой Х-хромосомы (FXTAS) | |
| PL238698B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Cyp51 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| Lee et al. | Development of in-field-diagnosis of Aspergillus flavus by Loop-Mediated Isothermal Amplification in Honeybee | |
| US20230340619A1 (en) | Methods of detecting trichomonas tenax | |
| RU2732448C1 (ru) | Способ идентификации штаммов VIBRIO CHLERAE O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара ЭльТор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с учетом результатов в режиме "реального времени" | |
| PL239142B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL238696B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Rpb2 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| RU2653435C1 (ru) | Способ дифференциации ключевых пород медоносных пчел в россии на основе мутагенной пцр-пдрф | |
| PL238697B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu SdhB do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| WO2023002505A1 (en) | Assay for detection of epidemiologically important sars- cov-2 variants | |
| CN106939356A (zh) | 一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 | |
| Kim JungMin et al. | Rapid detection of deformed wing virus in honeybee using ultra-rapid qPCR and a DNA-chip. | |
| RU2520742C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОСТЕЙШИХ BLASTOCYSTIS spp. С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ ВИРУЛЕНТНОСТИ | |
| RU2556810C1 (ru) | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia pseudomallei |