PL246286B1

PL246286B1 - Sposób wytwarzania kompleksów białek z lipopolisacharydami bakteryjnymi, ich zastosowanie, szczepionka zawierająca immunogenny kompleks LPS/białko i sposób wytwarzania szczepionki

Info

Publication number: PL246286B1
Application number: PL438650A
Authority: PL
Inventors: Tomasz Lipiński; Ski Tomasz Lipi; Jakub Siednienko
Original assignee: Biovetika Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2024-12-30

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kompleksów lipopolisacharydów bakteryjnych (LPS) z białkami o właściwościach immunogennych i ich zastosowania do formulacji szczepionek przeciwbakteryjnych. Kompleksy LPS z białkiem nośnikowym stosowane są jako immunogeny tj. cząsteczki zdolne do indukcji odpowiedzi immunologicznej w organizmach kręgowców w celu wytworzenia odpowiedzi immunologicznej mającej na celu ochronę przed patogenami bądź w celu uzyskania przeciwciał specyficznych do użytego immunogenu. Koniugaty białek z LPS lub uzyskanymi z niego fragmentami cukrowymi stosowane są w szczepionkach przeciwbakteryjnych oraz do uzyskiwania surowic zawierających przeciwciała specyficzne wobec antygenów cukrowych oraz uzyskiwania przeciwciał monoklonalnych specyficznych do tych antygenów. Wynalazek dotyczy również szczepionki zawierającej immunogenny kompleks oraz sposobu wytwarzania szczepionki.

Zakażenia bakteriami gram-ujemnymi stanową znaczny odsetek infekcji bakteryjnych i zakażeń szpitalnych. Śmiertelność jest znaczna pomimo stosowania antybiotyków. Problem pogłębia się wraz ze wzrostem ilości szczepów wielolekoopornych, które są odpowiedzialne za szczególnie ciężkie przypadki bakteriemii, często kończące się sepsą i zgonem pacjenta. Terapia sepsy jest jednym z istotnych zagadnień medycznych, które wciąż jest dalekie od rozwiązania. Obecnie stosuje się i bada szereg strategii terapeutycznych, najważniejsze to: usuwanie endotoksyn bakteryjnych z krwioobiegu, terapie podtrzymujące funkcje życiowe kluczowych organów, hamowanie nadmiernej aktywacji układu immunologicznego, neutralizacja endotoksyn przeciwciałami. Innym podejściem jest wytworzenie odporności na patogeny i endotoksyny za pomocą odpowiednich szczepionek. Celem dla szczepionek tradycyjnie są antygeny białkowe, jednak ze względu na fakt, iż głównym składnikiem zewnętrznej błony ściany komórkowej bakterii gram-ujemnych jest lipopolisacharyd bakteryjny, podjęto szereg badań zmierzających do wykorzystania LPS jako celu dla szczepionek.

Lipopolisacharydy to grupa makrocząsteczek zbudowanych z komponentu lipidowego zwanego zwykle lipidem A oraz części cukrowej o zróżnicowanej budowie i strukturze. W skład LPS wchodzą też niskocząsteczkowe podstawniki wpływające na właściwości biologiczne i fizykochemiczne LPS. Są to np. grupy fosforanowe, difosforany, fosfoetanolamina, metylo-fosforoamidowe, aminokwasy, glicerol i jego pochodne i inne. LPS zawierające część cukrową zbudowaną z niewielkiej liczby reszt cukrowych określa się często jako LOS (lipooligosacharyd). Część cukrowa LPS typowo zbudowana jest z dwóch części: oligosacharydu rdzeniowego i polisacharydu zwanego też antygenem O. LPS silnie oddziałuje z komórkami układu immunologicznego odpowiadając za toksyczne efekty obserwowane w trakcie gramujemnej bakteriemii i sepsy. Za większość aktywności biologicznych odpowiedzialnych za toksyczność LPS odpowiada Lipid A. Cząsteczka LPS ze względu na swoją budowę jest amfifilowa, w wodzie tworzy skomplikowane układy micelarne, które mogą posiadać różną strukturę i wielkość. LPS można rozpuścić w niektórych rozpuszczalnikach np. dimetylosulfotlenku (DMSO) po odpowiednim przygotowaniu patent US 8,426,221. W środowisku kwaśnym i podwyższonej temperaturze LPS ulega rozpadowi z uwolnieniem lipidu A części cukrowej, która może być oczyszczona i wykorzystana do tworzenia szczepionek.

Schemat budowy LPS przedstawiono poniżej:

Lipid A

Rdzeń wewnętrzny Rdzeń zewnętrzny Antygen O

Koncepcja uzyskania odporności na patogeny gram-ujemne poprzez wzbudzenie przeciwciał skierowanych na antygen O-swoisty lipopolisacharydu została zaproponowana przez Robbins et al., 1992.

Ze względu na słabą immunogenność LPS i brak aktywacji limfocytów T, uzyskanie dobrej odpowiedzi wiąże się z koniecznością tworzenia koniugatów O-antygenów z białkiem nośnikowym podobnie jak w przypadku szczepionek już stosowanych u ludzi przeciwko /7. influenza, pneumococcus, meningococcus, które zawierają koniugaty polisacharydów kapsularnych z białkiem. Oligosacharydy uzyskane w wyniku enzymatycznej hydrolizy LPS z Salmonella thyphimurium skoniugowane z białkiem nośnikowym wzbudzały silną odpowiedź na antygeny cukrowe u myszy i królików (Swenson i Lindberg, 1981; Swenson i wsp., 1979).

Kolejne prace koncentrowały się na szczepionkach glikokoniugatowych opartych na antygenach O-swoistych, które dawały skuteczną protekcję w modelach zwierzęcych. Obecnie szereg szczepionek przeciwko patogenom gram-ujemnym opartych na powyższej koncepcji (S. paratyphiA, E. coliO157:H7, Pseudomonas aeruginosa, Shigella) przeszło lub jest w trakcie badań klinicznych (Konadu i wsp., 2000, Levine i wsp., 2007; Ahmed i wsp., 2006).

Wadą szczepionek opartych na antygenie O -swoistym jest ograniczona reaktywność uzyskiwanych przeciwciał - ograniczona do szczepów danego serotypu.

Zakażenia bakteriami gram-ujemnymi stanowią też duży problem dla hodowców zwierząt, zawłaszcza w produkcji drobiu, trzody chlewnej i bydła. Główne gatunki bakterii gram-ujemnych odpowiedzialnych za straty w produkcji zwierzęcej to E. coli, Salmonella, Listeria, Campylobacter. Obecnie globalny rynek szczepionek dla zwierząt w 2016 roku osiągnął wartość 5,81 mld USD i szacuje się, że jego wartość wzrośnie do poziomu 7,68 mld USD w 2021 roku. Skumulowany roczny wskaźnik wzrostu (CAGR) w latach 2016-2021 wyniesie 5,7%.

Szczepionki weterynaryjne w większości stanowią zabite bądź atenuowane komórki bakteryjne szczepów najczęściej powodujących zakażenia. Przykładowo szczepionka Coliprotect F4/F18 produkowana przez (Prevtec Microbia GmbH) składa się z dwóch szczepów żywych bakterii E. coli (O8:K87 oraz O141:K94), które nie produkują toksyn powodujących choroby. Inne zawierają białka bakteryjne stanowiące czynniki wirulencji takie jak adhezyny i toksoidy (Porcilis Porcoli Diluvac Forte produkowany przez Intervet International B.V.; Nobilis E.Coli produkowany przez: Intervet International B.V.). Szczepionki weterynaryjne koniugatowe są na razie w fazie badań laboratoryjnych, nie stosuje się też w weterynarii szczepionek opartych na LPS. Wadą aktualnych szczepionek jest ich swoistość serotypowa ograniczona do szczepów użytych do immunizacji. Zastosowanie LPS jako antygenu pozawala na uzyskanie szczepionek zarówno o wąskiej jak i szerszej swoistości.

Antygen O stanowi najbardziej zmienną część LPS, unikalną dla danego serotypu, w związku z czym jest jednym z kluczowych antygenów dla określania serotypów bakterii. Oligosacharydy rdzeniowe posiadają znacznie bardziej konserwatywną strukturę np. w obrębie gatunku E. coli, wszystkie serotypy posiadają jeden z pięciu typów oligosacharydu rdzeniowego zaś u bakterii z rodzaju Salmonella zidentyfikowano dotychczas 1 typ oligosacharydu rdzeniowego. LPS stanowi główny składnik zewnętrznej błony ściany komórkowej bakterii gram-ujemnych, jest zatem jednym z głównych antygenów na powierzchni komórki i potencjalnym celem dla szczepionek.

Szczepionki, w których wykorzystuje się wyizolowane, oczyszczone antygeny określa się mianem szczepionek podjednostkowych, ich zaletą jest silna indukcja odpowiedzi na wybrany antygen co w przypadku tak złożonego immunogenu jakim jest cała komórka bakteryjna nie zawsze jest możliwe ze względu na kompetycję antygenową między różnymi cząsteczkami na jej powierzchni. Inne zalety to ściśle określony, powtarzalny skład, mniejsza ilość reakcji ubocznych, ukierunkowanie odpowiedzi na antygeny zapewniające ochronę.

Lipopolisacharydy, podobnie jak polisacharydy i oligosacharydy są słabymi immunogenami, stanowią zatem hapteny, które dopiero po sprzęgnięciu z nośnikiem białkowym uzyskują zdolność do indukcji przeciwciał klasy IgG i pamięci immunologicznej niezbędnej dla uzyskania dobrej ochrony. Tworzenie koniugatów LPS białko wymaga częściowej dekompozycji LPS w celu uwolnienia rozpuszczalnej w wodze części cukrowej. W wyniku kwaśnej hydrolizy lipopolisacharydu dochodzi do jego rozszczepienia w miejscu połączenia wewnętrznej części oligosacharydu rdzeniowego zawierającego zwykle cząsteczki kwasu 3-deoksy-D-manno-oktulozonowego (KDO) z lipidem A. Uwolniona część cukrowa LPS jest następnie oczyszczana i sprzęgana z białkiem nośnikowym. Istnieje szereg sposobów sprzęgania oligo i polisacharydów z białkami znanych osobom biegłym w dziedzinie. Najczęściej sprzęganie przebiega w dwóch etapach: aktywacji sacharydu i koniugacji z białkiem. Często stosuje się sprzęganie poprzez reduktywną aminację pomiędzy terminalnymi grupami ketozowymi lub aldehydowymi sacharydu i grupami aminowymi białek w obecności czynnika redukującego, zwykle cyjanoborowodorku sodu. Bez względu na zastosowaną metodę kluczowym etapem jest hydroliza LPS w celu uwolnienia części cukrowej. Pomimo stosunkowo łagodnych warunków reakcji, degradacji ulega wewnętrzna część rdzenia zbudowana z KDO, dochodzi także do uwolnienia i utraty znacznej części podstawników niecukrowych, które są istotne dla właściwości antygenowych LPS jako elementy epitopów.

Sposób opisany w wynalazku umożliwia uzyskanie kompleksu w sposób nie powodujący degradacji i innych modyfikacji chemicznych LPS zachowując w pełni jego cechy antygenowe. Wynalazek opisuje sposób sprzęgania LPS z białkami, w którym nie ma konieczności częściowej degradacji LPS, sprzęganie nie wymaga wytworzenia kowalencyjnego połączenia pomiędzy LPS i białkiem co również może prowadzić do modyfikacji i utraty niektórych epitopów. Sprzęganie polega na wytworzeniu niekowalencyjnego kompleksu pomiędzy LPS i białkiem w kilkuetapowym procesie. W pierwszym etapie LPS podlega procedurze usuwania kationów metali z nim związanych i wymianie na protony przez co uzyskuje się kwaśną formę LPS, dobrze rozpuszczalną w DMSO, w analogicznym procesie uzyskuje się białko, w którym wszystkie jonowo związane kationy zostają zamienione na protony. Następnie LPS i białko rozpuszcza się w DMSO i miesza ze sobą oba roztwory, uzyskując mieszaninę LPS białko w DMSO w pożądanym stosunku wagowym. W dalszej kolejności DMSO stopniowo rozcieńcza się wodą i usuwa DMSO w procesie dializy, ultrafiltracji lub filtracji żelowej. Kompleks może następnie być użyty do formulacji immunogenu lub szczepionki z dowolnym adiuwantem.

Wynalazek charakteryzuje się tym, że powstały kompleks jest zdolny do indukcji odpowiedzi immunologicznej o charakterystyce typowej dla antygenów typu TH2 tj. z przełączaniem klas przeciwciał, w wyniku czego dochodzi do syntezy przeciwciał IgG, IgA podczas gdy odpowiedź pierwotna charakteryzuje się produkcją przeciwciał klasy IgM i pamięcią immunologiczną, zawiera kompletną cząsteczkę LPS, nie wywołuje efektów toksycznych u szczepionych zwierząt w dawkach stosowanych do immunizacji. Korzystnie, zawarty w kompleksie lipid A będący składnikiem LPS posiada własności immunostymulujące zapewniając silną odpowiedź immunologiczną.

Sposób uzyskiwania szczepionki składa się z następujących etapów:

a) hodowli komórek bakteryjnych;

b) izolacji LPS;

c) przeprowadzenia LPS w postać rozpuszczalną w DMSO;

d) wytworzeniu kompleksu poprzez zmieszanie roztworów LPS i białka w DMSO i zmiany rozpuszczalnika na wodę;

e) liofilizacji lub formulacji z adiuwantem.

Uzyskany kompleks można podawać iniekcyjnie bez adiuwanta lub w formulacji z dodatkowym adiuwantem zapewniającym efekt depozycji np. z olejem mineralnym. Wyniki eksperymentów wskazują, że uzyskiwane kompleksy są zdolne do indukcji wysokiego miana przeciwciał klasy IgG swoistych względem LPS-u zastosowanego do szczepienia oraz przeciwciał swoistych względem białka nośnikowego, co świadczy o odpowiedniej aktywacji limfocytów T. Ze względu na bardzo zbliżone właściwości fizykochemiczne LPS metoda jest uniwersalna i umożliwia przygotowanie immunogenu z LPS izolowanego z dowolnego szczepu bakterii gram-ujemnej. W reakcji na immunogen powstają również przeciwciała skierowane przeciwko zastosowanemu białku nośnikowemu, dzięki czemu można śledzić postęp immunizacji w przypadku występowania rezydualnego poziomu przeciwciał na LPS danej bakterii w wyniku ekspozycji środowiskowej i transferu przeciwciał z organizmu rodzicielskiego. Jest to istotne w przypadku szczepionek weterynaryjnych, gdzie wymagany jest tzw. marker.

Równocześnie stwierdzono brak toksyczności zastosowanych immunogenów w testach szczepienia myszy szczepu Balb/C. Dawka LPS-u wynosiła ok. 1,1 mg/kg masy ciała. Jest to dawka 5-krotnie niższa od dawki śmiertelnej dla świń (5 mg/kg masy ciała). Preparaty szczepionkowe były też testowane na liniach komórkowych, gdzie również nie wykazano ich toksyczności.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompleksów immunologicznych lipopolisacharyd bakteryjny (LPS)/białko, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:

a) izoluje się z bakterii LPS dowolną metodą, następnie przeprowadza w formę dobrze rozpuszczalną w DMSO poprzez usuwanie kationów metali związanych z LPS oraz ich wymianę na protony, przeprowadzając lipopolisacharyd bakteryjny w formę kwaśną;

b) uzyskuje się białko dobrze rozpuszczalne w DMSO, przy czym wszystkie jonowo związane kationy zostają zamienione na protony;

c) rozpuszcza się LPS i białko w DMSO i miesza ze sobą oba roztwory uzyskując mieszaninę LPS białko w DMSO w określonym stosunku wagowym; po czym

d) stopniowo rozcieńcza się i usuwa DMSO, przy czym nie doprowadza się do degradacji i modyfikacji chemicznej LPS, zachowując kompletną cząsteczkę LPS i jej właściwości antygenowe, a sprzęganie LPS z białkiem następuje w sposób nie kowalencyjny.

Korzystnie sposób charakteryzuje się tym, że LPS pochodzi z dowolnego szczepu bakterii Gram-ujemnych, takich jak Escherichia, Hafnia, Salmonella i Campylobacter.

Korzystnie sposób charakteryzuje się tym, że zastosowane w kompleksie białko może być dowolnym białkiem o właściwościach immunogennych, rozpuszczalnym w DMSO.

Korzystnie sposób charakteryzuje się tym, że zastosowane w kompleksie białko jest kazeiną lub albuminą surowicy bydlęcej.

Korzystnie sposób charakteryzuje się tym, że DMSO rozcieńcza się wodą.

Bardziej korzystnie sposób scharakteryzuje się tym, że DMSO usuwa się za pomocą dializy, ultrafiltracji lub filtracji żelowej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompleks lipopolisacharyd/białko wytworzony powyższym sposobem do zastosowania do indukcji odpowiedzi immunologicznej.

Korzystnie kompleks lipopolisacharyd/białko jest do zastosowania przy wytwarzaniu immunogenu lub przeciwbakteryjnej szczepionki weterynaryjnej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki weterynaryjnej zawierającej kompleks immunologiczny LPS/białko obejmujący następujące etapy: hoduje się komórki bakteryjne, izoluje się LPS, charakteryzujący się tym, że przeprowadza się LPS w formę rozpuszczalną w DMSO poprzez usuwanie kationów metali związanych z LPS i ich wymianę na protony, uzyskuje się białko rozpuszczalne w DMSO, w którym wszystkie jonowo związane kationy zostają zamienione na protony, przy czym rozpuszcza się LPS i białko w DMSO a następnie miesza otrzymane roztwory do wytworzenia niekowalencyjnego kompleksu wykazującego immunogenność, przy czym rozcieńczalnikiem zastosowanym do usunięcia DMSO z preparatu jest woda.

Korzystnie LPS izoluje się metodą ekstrakcji fenol - woda.

Korzystnie DMSO usuwa się w procesie dializy, ultrafiltracji lub filtracji żelowej.

Korzystnie uzyskany preparat poddaje się liofilizacji lub formułuje z dowolnym adiuwantem.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka weterynaryjna zawierająca kompleks wytworzony sposobem opisanym powyżej.

Korzystnie szczepionka jest w postaci zliofilizowanej.

Korzystnie, szczepionka jest w postaci formulacji z adiuwantem olejowym takim jak niekompletny adiuwant Freunda.

Korzystnie białko nośnikowe kompleksu stanowi marker pozwalający na śledzenie postępu immunizacji u osobnika.

Korzystnie szczepionka wykazuje szerokie spektrum działania wobec wszystkich wersji LPS (serotypów) spotykanych w szczepach Escherichia coli, Salmonella i Hafnia alvei.

Korzystnie szczepionka pobudza swoistą odpowiedź humoralną u osobnika powodując wzrost przeciwciał anty LPS klasy IgG.

Korzystnie osobnikami immunizowanymi mogą być ptaki i ssaki, takie jak kury i świnie.

Korzystnie immunizacja następuje przez podanie domięśniowo lub dootrzewnowo.

Korzystnie szczepionka nie wywołuje efektów toksycznych u szczepionych zwierząt.

Korzystnie szczepionka zawiera kompleks LPS z białkiem w PBS i opcjonalnie dowolny inny adiuwant.

Problemem technicznym rozwiązywanym przez wynalazek jest uzyskanie innowacyjnej szczepionki, która nie była dotychczas stosowana w weterynarii. Wynalazek wyróżnia się tym, że opisaną technologią można w łatwy sposób uzyskać immunogenne kompleksy LPS białko. Obecność białka w kompleksie zapewnia odpowiedź typu TH2 co jest pożądane w przypadku szczepionek. Przy tym do uzyskania kompleksu nie jest konieczne chemiczne sprzęganie LPS z białkiem jak ma to miejsce w przypadku znanych szczepionek. Nieoczekiwanie, odpowiedź na LPS po immunizacji takim kompleksem jest bardzo silna i przewyższa odpowiedź na LPS w przypadku immunizacji zabitymi komórkami bakterii. Szczepionki zawierające cały, niezmodyfikowany LPS wykazują szersze spektrum działania. Stanowi to ulepszenie w stosunku do szczepionek opartych na antygenie O, których reaktywność uzyskiwanych przeciwciał ograniczona jest do szczepów danego serotypu. W przypadku szczepionek ujawnionych w niniejszym wynalazku reaktywność przeciwciał uzyskanych w wyniku immunizacji kompleksami LPS/białko zastosowanymi w tych szczepionkach jest swoista do wszystkich wersji LPS spotykanych w szczepach E. coli co zapewnia skuteczność szczepionki w stosunku do wszystkich serotypów E. coli spotykanych w środowisku. Szeroka reaktywność jest uzyskiwana poprzez zastosowanie w kompleksach mieszaniny szorstkich lipopolisacharydów reprezentujących wszystkie 5 typów rdzenia znanych u E. coli. Podobnie w przypadku Salmonella, u której występuje 1 typ rdzenia, zastosowanie szorstkiego LPS zapewnia reaktywność na wszystkie serotypy Salmonella.

Załączone figury przedstawiają: Fig. 1 przedstawia krzywą standardową na LPS Salmonella R60 w zakresie 0-100 μg LPS, Fig. 2 przedstawia poziom przeciwciał IgG anty-LPS Salmonella w surowicy kur, zaś Fig. 3 przedstawia poziom przeciwciał IgG anty-białko nośnikowe w surowicy kur.

Wynalazek został przedstawiony szczegółowo w przykładach wykonania, które jednak nie ograniczają jego zakresu.

Przykłady wykonania

Przykład 1. Izolacja LPS

Lipopolisacharydy ze szczepów bakteryjnych: Hafnia alvei 1216, Hafnia alvei 1286, Eschericha coli: F470, F576, F653, F2513, W3100 i Eschericha coli K12 C600 (K-12) Salmonella minnesota R60, Campylobacter jejuni izolowano metodą ekstrakcji fenol-woda zgodnie z publikacją Westphala i Jann, New York: Academic Press Inc.; 1965(5):83-91.

Suchą masę bakteryjną zawieszano w wodzie w stosunku 5 g masy bakteryjnej na 100 ml wody, następnie zawiesinę mieszano z jednakową objętością 90% fenolu ogrzanego do temp. 65°C i mieszano w tej temperaturze w łaźni wodnej przez 15 min. Po ostygnięciu mieszaninę wirowano w celu separacji faz (5000 χ g, 20 min), fazę wodną zebrano, fazę fenolową uzupełniono czystą wodą do poprzedniej objętości i powtórnie ekstrahowano w temp. 65°C. Materiał wirowano tak jak poprzednio, zebrano fazę wodną i powtórzono proces ekstrakcji z kolejną porcją wody. Połączone fazy wodne dializowano w worku dializacyjnym (masa odcięcia 12 kDa) do utraty zapachu fenolu. Dializat poddano wirowaniu (5000 g, 10 min) w celu usunięcia wytrąconych cząstek, następnie LPS osadzono przez ultrawirowanie (100 000 χ g, 2 h). Osad LPS zawieszono w 0,2 M NaCl (25 mg LPS/ml) dodano nukleaz (RNaza i DNaza) w ilości 50 μg/ml, mieszaninę inkubowano przez 2 h w temp. 37°C. Następnie LPS poddano 2-krotnemu ultrawirowaniu w wodzie w celu usunięcia fragmentów kwasów nukleinowych i nukleotydów. Czystość preparatu (brak obecności kwasów nukleinowych) kontrolowano spektrofotometrycznie, nieobecność szczytu przy długości fali 260 i 280 nm świadczył o braku zanieczyszczeń białkami i kwasami nukleinowymi.

Przykład 2. Przygotowanie LPS rozpuszczalnego w DMSO mg LPS rozpuszczono w 2 ml 2% SDS z dodatkiem EDTA (50 μl 0,5 M r-ru), odwirowano w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń (16 000 χ g przez 5 min) i strącono 4 objętościami etanolu. Materiał odwirowano (16 000 χ g przez 30 min), supernatant zebrano i odrzucono, osad zawieszono w etanolu (95%) i odwirowano (16 000 χ g przez 30 min), krok powtórzono. Osad rozpuszczono w 2 ml wody i przepuszczono przez kolumienkę wypełnioną złożem jonowymieniacza Dowex 50Wx8 w formie kwaśnej. Kolumienkę płukano wodą, zebrano frakcje wykazujące kwaśne pH, połączono i zliofilizowano. Procedurę zastosowano w przypadku LPS z E. coli: F470, F576, F653, F2513, W3100 i E. coli K12 C600.

P r z y k ł a d 3. Przygotowanie LPS E. coli rozpuszczalnego w DMSO mg LPS z E. coli K12 C600 rozpuszczono w 4 ml 2% SDS, następnie przepuszczono przez kolumienkę wypełnioną złożem Chelex 100, kolumienkę płukano wodą, zebrano frakcję zawierającą LPS (obecność LPS wykrywano testem kolorymetrycznym fenol, kwas siarkowy). LPS strącono 4 obj. etanolu i odzyskano przez wirowanie (16 000 g przez 30 min), supernatant zebrano i odrzucono, osad zawieszono w etanolu (95%) i odwirowano (16 000 g przez 30 min), krok powtórzono. Osad rozpuszczono w 2 ml wody i przepuszczono przez kolumienkę wypełnioną złożem jonowymieniacza Dowex 50Wx8 w formie kwaśnej. Kolumienkę płukano wodą, zebrano frakcje LPS wykazujące kwaśne pH, połączono i zliofilizowano. Procedurę tę zastosowano także do uzyskania kwaśnych form LPS: Hafnia alvei 1216, Hafnia alvei 1286.

P r z y k ł a d 4. Przygotowanie LPS Salmonella minnesota rozpuszczalnego w DMSO mg LPS Salmonella minnesota R60 zawieszono w wodzie (10 ml) i dodano 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0. Materiał przeniesiono do worka dializacyjnego (masa odcięcia 12 kDa) i dializowano do wody w celu usunięcia EDTA. Materiał po dializie zebrano do probówki typu Falcon (50 ml) dodano 2 ml zawiesiny złoża Dowex 50Wx8 w formie kwaśnej, inkubowano przez 1 godzinę na rotatorze serologicznym po czym odwirowano na rotorze wychylnym (5000 χ g przez 5 min), zebrano fazę wodną i zliofilizowano.

Powyższe metody z przykładów 2-4 przedstawiające przygotowanie LPS z komórek bakteryjnych stanowią metody alternatywne i równoważne, podstawą ich zastosowania jest usunięcie z LPS jonów metali dwuwartościowych i następnie przeprowadzenie go w formę kwaśną, co jest niezbędnym etapem procedury. Metody te mogą być stosowane zamiennie dla dowolnych lipopolisacharydów izolowanych z różnych bakterii. Wybór techniki nie zależy od pochodzenia i budowy lipopolisacharydu.

Przykład 5. Przygotowanie kompleksu LPS Salmonella R60/kazeina z mleka krowiego mg LPS rozpuszczalnego w DMSO rozpuszczono w 2 ml DMSO. 10 mg kazeiny mleka krowiego rozpuszczono w 2 ml DMSO, zawiesinę lekko sonikowano, aż do uzyskania klarownego roztworu. Roztwory zmieszano i inkubowano przez noc z mieszaniem w temp. pokojowej. Następnie mieszaninę powoli rozcieńczano wodą stale mieszając. Tempo dodawania wody ustalono tak by uniknąć wzrostu temperatury mieszaniny o więcej niż 10°C. Po osiągnięciu stosunku 1 : 1 mieszaninę przeniesiono do worka dializacyjnego i dializowano do wody, aż do usunięcia DMSO.

Materiał przeniesiono do probówki wirówkowej i odwirowano celem odzyskania kompleksu LPS/białko (16 000 x g, przez 20 min). Kompleks zebrano i rozpuszczono w PBS. Następnie przeprowadzono badanie zwartości LPS w obu frakcjach: supernatancie i kompleksie metodą kolorymetryczną wykorzystującą fenol i kwas siarkowy jak opisano w DuBois M. i inni. „Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances” Anal. Chem., 1956, 28 (3), str. 350-356.

W tym celu wykonano krzywą standardową na LPS Salmonella R60 w zakresie 0-100 μg LPS (przedstawioną na Fig. 1) i oznaczono zawartość LPS w obu frakcjach, wykazano, że 66,2% LPS znajdowało się we frakcji zawierającej kompleks.

Przykład 6. Przygotowanie kompleksów LPS Salmonella R60/kazeina i H. alvei 1216/kazeina, H. alvei 1286/ kazeina z mleka krowiego

Każdą z próbek 10 mg LPS w formie rozpuszczalnej w DMSO, rozpuszczono w 1 ml DMSO i zmieszano z 1 ml DMSO zawierającym rozpuszczoną kazeinę mleka krowiego. Roztwory inkubowano przez noc z mieszaniem w temp. pokojowej. Następnie mieszaniny powoli rozcieńczano wodą stale mieszając, tempo dodawania wody ustalono tak by uniknąć wzrostu temperatury mieszaniny o więcej niż 10°C. Po osiągnięciu stosunku 1 : 1 mieszaniny przeniesiono do worków dializacyjnych i dializowano do wody, aż do usunięcia DMSO. Materiał przeniesiono do probówki wirówkowej i odwirowano celem odzyskania kompleksu LPS/białko (16 000 x g przez 20 min). Kompleksy zebrano i rozpuszczono w PBS, obecność LPS potwierdzono metodą kolorymetryczną.

Przykład 7. Przygotowanie kompleksów LPS E. coli: F470, F576, F653, F2513 i K12 z kazeiną z mleka krowiego

Próbki po 50 mg LPS E. coli: F470, F576, F653, F2513 i K12 rozpuszczono w 5 ml DMSO i zmieszano z 5 ml DMSO zawierającego 50 mg kazeiny mleka krowiego. Roztwory inkubowano przez noc z mieszaniem w temp. pokojowej. Następnie mieszaniny powoli rozcieńczano wodą stale mieszając, tempo dodawania wody ustalono tak by uniknąć wzrostu temperatury mieszaniny o więcej niż 10°C. Po osiągnięciu stosunku 1 : 1 mieszaniny przeniesiono do worków dializacyjnych i dializowano do wody, aż do usunięcia DMSO. Materiał przeniesiono do probówki wirówkowej i odwirowano celem odzyskania kompleksu LPS/białko (16 000g przez 20 min). Kompleksy zebrano i rozpuszczono w PBS, obecność LPS potwierdzono metodą kolorymetryczną.

Przykład 8. Przygotowane białka albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczalnego w DMSO 100 mg BSA rozpuszczono w 10 ml wody, dodano 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 i dializowano w worku dializacyjnym w celu usunięcia EDTA. Następnie roztwór białka przepuszczono przez kolumienkę upakowaną złożem Dowex 50Wx8, kolumienkę płukano wodą, zebrano frakcje zawierającą białko i zliofilizowano.

Przykład 9. Przygotowane kompleksu LPS Salmonella/BSA mg BSA uzyskanego w przykładzie 8 rozpuszczono w 2 ml DMSO, osobno rozpuszczono 10 mg LPS Salmonella R60 w 1 ml DMSO. Oba roztwory zmieszano i inkubowano przez noc z mieszaniem w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę stopniowo rozcieńczano wodą w stosunku 1 : 1 stale mieszając, tempo dodawania wody ustalono tak, aby uniknąć wzrostu temperatury mieszaniny o więcej niż 10°C. Rozcieńczoną mieszaninę przeniesiono do worka dializacyjnego i dializowano do wody aż do usunięcia DMSO i następnie do PBS.

Przykład 10. Immunizacja myszy kompleksem Hafnia alvei 1216/kazeina z mleka krowiego

Myszy szczepu Balb/c immunizowano kompleksem Hafnia alvei 1216/kazeina w PBS w ilości opowiadającej 20 μg LPS na dawkę. Kompleks podawano bez dodatkowego adiuwanta dootrzewnowo. Zwierzęta były immunizowane 3-krotnie w odstępach 3 tygodniowych. Grupom kontrolnym podano sam LPS albo samą kazeinę (20 μg na mysz). 10 dni po ostatnim szczepieniu pobrano próbki kr wi,

PL 246286 Β1 przygotowano surowicę, którą analizowano testem ELISA pod kątem reaktywności z antygenem użytym do immunizacji. Miano surowic na LPS Hafnia alvei 1216 przedstawiono w tabeli poniżej.

Miano przeciwciał przeciwko LPS Hafnia alvei w surowicy myszy przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1

	miano (rozcieńczenie surowicy przy którym odczyt OD450 wynosi 0.2 ponad poziom tła(IU/ml)
przed szczepieniem	po 1 szczepieniu	po 2 szczepieniu	po 3 szczepieniu
mysz 1	148	17442	34183	49149
mysz 2	304	11576	5757	10548
mysz 3	222	3124	6157	3961
mysz 4	219	14629	19108	97137
mysz 5	256	1301608	523436	1665934

Przykład 11. Badanie immunogenności kompleksu LPS Salmonella R60/kazeina z mleka krowiego u kur.

kur niosek immunizowano 2-krotnie w mięsień piersiowy kompleksem LPS Salmonella R60/kazeina w ilości 200 pg kompleksu w PBS bez dodatkowego adiuwanta. Przed immunizacją pobrano próbki krwi. Odstęp między szczepieniami wynosił 3 tygodnie. Po 14 dniach od 2 szczepienia pobrano ponownie próbki krwi. Surowice analizowano testem ELISA badając szereg rozcieńczeń surowicy, miano skalkulowano na podstawie uzyskanych krzywych, definiującjako największe rozcieńczenie, przy którym sygnał wynosi > 0,2 jednostki ponad poziom tła. Miano surowic przedstawiono w tabeli poniżej.

Miano przeciwciał IgG w surowicach kur w odpowiedzi na podanie kompleksu LPS Salmonella R60/kazeina przedstawiono w Tabeli 2.

Tabela 2

	miano IgG przed szczepieniem	miano IgG 2 tyg po drugim szczepieniu
Kura 1	1715	2696
Kura 2	898	1107
Kura 3	2234	2521
Kura 4	1148	2429
Kura 5	1392	5517
średnia	1477	2854

Przykład 12. Badanie efektywności szczepionki u kur zakażanych eksperymentalnie bakteriami Salmonella.

W badaniu immunizowano 6-tygodniowe kury kompleksem LPS Salmonella minnesota/kazema z zastosowaniem adiuwanta olejowego (niekompletny adiuwant Freunda). Kury były podzielone na grupy: kontrolną, grupa A (nieszczepiona) i dwie grupy badane szczepione różną ilością kompleksu: grupa B - 50 pg kompleksu, grupa C - 150 pg kompleksu. Zwierzęta immunizowano dwiema dawkami w odstępie 4 tygodni. Po drugim szczepieniu zwierzęta poddano eksperymentalnemu zakażeniu polowym izolatem Salmonella. Zakażenie wykonano 2-krotnie 28 i 62 dniu po drugim szczepieniu. Około tydzień po ostatnim zakażeniu zwierzęta poddano eutanazji i pobrano do badań mikrobiologicznych narządy: wątrobę, torebkę Fabrycjusza, śledzionę oraz próbki krwi i wymazu z kloaki.

PL 246286 Β1

Wyniki analizy organów zebrano w poniższej Tabeli 3. Wyniki badania mikrobiologicznego narządów immunizowanych kur. (-) - brak obecności bakterii Salmonella w narządzie, (+) - obecność bakterii Salmonella w narządzie.

Tabela 3

Tabela 3		Pobranie materiału w dniu zakończenia eksperymentów	Pobranie materału przed zakażeniem eksperymentalnym	Pobranie materiału po wprowadzeniu kurcząt do kurnika
		wątroba	śledziona	torba Fab. Kloaka	Kloaka	Kloaka
Kontrola Grupa A Grupa B	1		-	-	-	-
2		-	- ' -	-	-
3		-		-	-
4	+	-	-	-	-
5	+	-	-	-	-
6		-		-
7	+	+	-	-	-
8	+	+	+	-	-
9	+	-		-	-
10 11	+	+	---:-----------	--------------------------------------	-
12
13		-		--—....................	.............................—...............—
15		-	- · -	-	-
16 17	+	-	-	...................—————	......................—.
18		-	- : -	-	-
19		-		-	-
20	+	+		-	-
—...................	—	-	-	-
22 ~ 23	—.....r- ·-.......	-----------------------	.......................................-
24	+	-	+·	-	-
25		——	+·	-	-
27		-	- ' -	-	-
28		-		-	-
29		-	-	-
30	+	+	+

Wymazy z kloaki pobrane 1, 56 i 98 dnia nie wykazały obecności Salmonelli w tym narządzie. Testowano również obecność Salmonelli w organach pobranych od ptaków po uboju (dzień 98). W przypadku wątroby kur nieszczepionych obecność bakterii potwierdzono u 60% kur, w grupach kur szczepionych

PL 246286 Β1

20%. Podobnie, w przypadku testowania obecności Salmonelli w śledzionie - 30% u kur nieszczepionych a 10% w grupach kur zaszczepionych.

W celu sprawdzenia immunogenności przygotowanych preparatów, metodą ELISA wykonano analizę poziomu przeciwciał klasy IgG w surowicy kur po szczepieniu (Fig. 2 - LPS Salmonella oraz Fig. 3 - białko nośnikowe).

Potwierdzono istotny wzrost przeciwciał skierowanych przeciw LPS Salmonella oraz białku nośnikowemu.

Przykład 13. Badanie efektywności szczepionki na świniach

Badania miały na celu zbadanie aktywności opracowanej szczepionki przeciwko kolibakteriozie i potwierdzenie jej skuteczności w zapobieganiu tej chorobie u prosiąt. W badaniach wykorzystano ogółem 9 loch oraz 27 prosiąt będących potomkami tych loch (po 3 szt. z miotu). W eksperymencie utworzono 3 grupy doświadczalne po 3 szt. loch w każdej grupie.

W celu uzyskania materiału zwierzęcego do badań zakupiono 26 loszek hybrydowych DanBred z hodowli duńskiej. DanBred Hybrid jest pierwszą krzyżówką DanBred Landrace i DanBred Yorkshire. Jest to optymalna rasa mateczna, która zapewnia wysoką wydajność produkcji poprzez połączenie najlepszych cech.

Badane grupy:

Gr. D - lochy szczepione dwukrotnie szczepionką doświadczalną i ich prosięta zakażane dawką zakaźną E. coli szczep F4 (K88) produkujący toksynę Stx2e (1 x 10⁹ CFU/1 ml w objętości 5 ml/prosię).

Gr. K1 - lochy nieszczepione, zakażone prosięta identycznie jak prosięta z grupy D.

Gr. K2 - lochy i prosięta nieszczepione, lochy i prosięta tej grupy nie były zakażane celowo, do zakażeń w tej grupie dochodziło samoistnie podobnie jak ma to miejsce na fermach.

Szczepienie wykonywano preparatem (300 pg na dawkę) będącym równowagową mieszaniną kompleksów przygotowanych zgodnie z przykładem 5 zawierającą łącznie 150 pg LPS (całkowity LPS) na dawkę. Kompleks podawano z adiuwantem olejowym (niekompletny adiuwant Freunda).

Skład mieszaniny do immunizacji (pojedyncza dawka):

0,5 ml mieszaniny kompleksów LPS/kazeina w PBS zawierająca łącznie 150 pg LPS;

0,5 ml niekompletnego adiuwanta Freunda.

Ciężarne lochy szczepiono domięśniowo, w odstępach 3-tygodniowych (8 i 11 tydzień ciąży).

Prosięta zakażano w 7 dniu życia. Następnie prowadzono obserwacje kliniczne, pomiar temperatury, kontrolę zdrowia oraz oceniano wyniki produkcyjne na podstawie przyrostów masy ciała. Prosięta poddano eutanazji w 21 dniu życia, pobrano materiał do badań histopatologicznych: próbki jelita czczego, dwunastnicy, jelita biodrowego i okrężnicy. Te same próbki stanowiły materiał do badań mikrobiologicznych.

Poziom przeciwciał analizowano w surowicy szczepionych loch, prosiąt i siarze.

Wyniki badań

Najczęściej notowanym objawem zakażenia była biegunka obserwowana z rożnym nasileniem we wszystkich badanych grupach.

Tabela 4 poniżej przedstawia obserwacje kliniczne prosiąt poddanych eksperymentalnemu zakażeniu. Prosięta zostały zakażone w 7 dobie życia zawiesiną bakterii w dawce 1 χ 10⁶ CFU/1 ml w objętości 5 ml/prosię. Odsetek prosiąt z określonymi objawami i odsetek padnięć został wyliczony jako procent z liczby prosiąt wyjściowych tj. na dzień przed zanotowanym objawem. Objaśnienia skrótów: A - zesztywnienie ciała i apatia, brak apetytu; B - biegunka; C - utrata masy ciała; K - kulawizna; U - śmierć zwierzęcia (padnięcie).

Tabela 4

Grupa	Wyjściowa liczba prosiąt	kod objawu	Dni po zakażeniu eksper* mentalnym
1	2	3	4	5	G	7	8	9	10	11	12	13	1+
n(%)	n (%)	n(%)	(%)	O (%)	n<%)	n(%)	n(%)	n (%)	n(%)	O (%)	n(%)	O (%)	n(%)
KI	35	A B K U	0(0,00) 16(45,71) 7 (20,00) 0(0,00) 2(551)	0 (0,00) 5 (15,13)1 4(12,12) 0 (0,00) 0 (0,00)	0 (0,00) 6\|18,18) 4(12,12) 0 (0,00) 2 (6,06)	0(0,00) 11 (33,48) 6 (19,35) 0(0,00) 1(3,12)	0 (0,00) 9(30,00) 6 (20,00) 0 (0,00) 0 (0.00)	0(0,00) 8(26,66) 4(13,33) 0 (0,00) 4(12.9)	0(0,00) 4(15,38) 4(13,38) 0(0,00) 1 (3.84)	0 (0,00) 3 (12,00) 0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00)	0(0,00) 0(0,00) 1 (4,00) 0(0,00) 0(0,00)	0(0,00) 0 (0,00) 1 (4,00) 0 (0,00) 0 (0,00)	0(0,00) 0(0,00) 1 (4,00) 0(0,00) 0(0,00)	0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00) 1 (4.00)	0(0.00) 0(0,00) 0(0.00) 0(0,00) 0(0,00)	0 (0,00) 0 (0,00) 1 (4.16) 0 (0,00) 0 (0,00)
K2	37	B C K u	0(0,00) 25 (67,56) 26(70.27) 0(0,00) 0(0.00)	0 (0,00) 22 (59,45) 23 (62.16) 0 (0,00) 0 (0,00)	0 (0.00) 14(37,83) 24 (64.86) 0 (0,00) l (2,70)	0(0,00) 5(13,88) 16 (44.44) 0(0,00) 0(0,00)	0 (0,00) 1 (2.77) 8(22,22) 0 (0,00) 3 (8.33)	0(0,00) 0 (0,00) 7(21,21) 0 (0,00) 0(0,00)	0(0,00) 0(0,00) 7(21,21) 0(0,00) 0(0.00)	0 (0,00) 0 (0,00) 5(15,15) 0 (0,00) 0 (0,00)	0(0.00) 0(0,00) 3(9.09) 0(0,00) 1 (3.03)	0 (0,00) 0 (0,00) 2(6,25) 0 (0,00) 0 (0,00)	0(0.00) 0(0,00) 1(3.12) 0(0,00) 0(0,00)	0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0.00) 0 (0,00) 0 (0.00)	0(0.00) 0(0,00) 1(3.12) 0(0,00) 0(0,00)	0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0.00) 0 (0,00) 0 (0,00)
D	34	B c K u	0(0,00) 23(67.64) 15(44,11) 0(0,00) 0(0,00)	1 (2,94) 14 (41,17) 10 (29,41) 0 (0,00) 1 (2,94)	1 (3.03) 6 118,18) 10 (30^0) 0 (0,00) 0 (0,00)	3 (9,09) 4 (12,12) 4(12,12) 0(0,00) 2 (6.06)’	0 (0,00) 1 (3,03) 3 (9,09) 0 (0,00) 0 (0,00)	0(0.00) 1 (3,03) 3 (9,09) 0 (0,00) 0(0,00)	0(0,00) 2 (6,06) 2 (6,06) 0(0,00) 1 (3.03)	0 (0,00) 0 (0,00) 2 (6,25) 0 (0,00) 0 (0,00)	0(0.00) 0(0,00) 1 (3,12) 0(0,00) 0(0,00)	0 (0,00) 0 (0,00) 1(3,12) 0 (0,00) 0 (0,00)	0(0.00) 0(0,00) 1(3,12) 0(0,00) 0(0,00)	0 (0,00) 1(3,12) 2 (6,24) 1(3,12) 0 (0,00)	0(0.00) 1 (3.12) 2 (6,24) 1(3,12) 0(0,00)	0 (0,00) 1(3,12) 2 (6,24) 1(3.12) 0 (0,00)

PL 246286 Β1

Śmiertelność prosiąt po 7 dniu życia (czyli po zakażeniu eksperymentalnym) była najmniejsza w przypadku zwierząt będących potomstwem loch szczepionych (sumarycznie 5,88% bez uwzględniania prosiąt padłych na skutek manipulacji podczas pobrania krwi), a największa w przypadku prosiąt zakażanych eksperymentalnie i będących potomstwem loch nieszczepionych (34,28%). Śmiertelność prosiąt będących potomstwem loch nieszczepionych i niezakażanych w ciągu 14-dniowego okresu obserwacji wynosiła (13,51%). Oznacza to redukcję padnięć o około 28% w stosunku do prosiąt poddanych eksperymentalnemu zakażeniu.

Kolejne korzystne efekty szczepionki można było zaobserwować badając inne parametry, takie jak: masa i tempo przyrostu masy ciała, poziom przeciwciał, ilość bakterii w przewodzie pokarmowym.

Tabela 5 przedstawia masę ciała prosiąt doświadczalnych w poszczególnych etapach badań (kg). AB - a = 0,01 ab - a = 0,05; * średnie wartości cech w grupie D przyjęto za 100%.

Tabela 5

Wyszczególnienie	Miara stat.	Grupa
KI	K2	D
Masa ciała w 7 dniu życia	X	2,02	1,83^b	2,16^a
	SD	0,285	0,207	0,154
	%*	93,5	85,9	100
Masa ciała w 14 dniu życia	X	2,56^B	2,84^b	3,58^A
	SD	0,460	0,479	0,545
	%*	71,5	79,3	100
Masa ciał w 21 dniu życia	X	3,66^B	3,89	4,53^A
	SD	0,667	0,614	0,629
	%*	80,7	85,8	100

AB - a = 0.01 ab - a = 0,05; ^średnie wartości cech w grupie D przyjęto za 100%

Jak wynika z danych przedstawionych w Tabeli 5 prosięta z grupy D będące potomstwem zaszczepionych loch we wszystkich okresach badań charakteryzowały się istotnie (a = 0,05) i wysokoistotnie (a = 0,01) wyższą masą ciała w porównaniu do prosiąt pozostałych grup.

Z analizy tempa przyrostu wynika, że prosięta od zaszczepionych loch wykazują znacząco większe przyrosty niż prosięta innych grup.

Tabela 6 przedstawia tempo przyrostu masy ciała prosiąt pochodzących od loch immunizowanych (D) i loch kontrolnych (K1 i K2).

Tabela 6

tempo przyrostu		grupa		% więcej w grupie D
dzień pomiaru 7........;	KI 119	K2 1451	D 194	w stos, do KI 63	w stos, do K2
14	114 j	150 i	151
21	123	1481	173

Efekt ochronny koreluje z wysokim mianem przeciwciał w surowicy i siarze immunizowanych loch. Prosięta nabywały odporności biernej dzięki przeciwciałom przekazywanym w siarze co ma odzwierciedlenie w poziomie przeciwciał w surowicy prosiąt stanowiących potomstwo immunizowanych loch.

Tabela 7 przedstawia poziom przeciwciał IgG w siarze loch immunizowanych (D) i loch kontrolnych (K1 i K2).

PL 246286 Β1

Tabela 7

	siara
D	KI	K2
)	109653	8408	10754
	29282	7121	14023
	142077	6073	7863
mediana i	109653	7121	10754
średnia ;	93670	7201	10880
stosunek gr	D do KI i	K2dla:
mediany: t		15	10
średniej: i		13	9

Tabela 8 przedstawia poziom przeciwciał IgG w surowicy loch immunizowanych (D) i grupach kontrolnych (K1 i K2) na rożnych etapach eksperymentu.

Tabela 8

pobr. 1 lochy D KI \| K2		pobr.2 lochy D KI K2		pobr.3 I 0	lochy KI i K2
4231 3447 I 5552 _ _ . 2891 ; 3492 ' 3953 2725 ^; 5976 3721		: 49097 3083 6095 [ 15036 3205: 2798 20080 3746: 6348	--------------------	' 28825 i 9733 15276	2800: 4892 ___4566] _ 2253 : 3195
................-—i---------------------------------........—1 mediana 2891 3492 j 3953 średnia 3283 4305 Ϊ 4742		mediana 20080 3205Γ 6095 średnia 28071 3345] 5080		mediana 15276 średnia 17945	3683J 3195 3683' 3447
stosunek gr.D do KI i K2 dla: medianyH ___1,2] 0,7 średniej: 1,3 0,7	.................	stosunek gr. D do KI i K2 dla: mediany:_· _ \ 6,3___ 3,3 średniej: 8,4] 5,5	—......—	stosunek gr. D do Ki i mediany: I _ średniej:	K2dla: \| 4,9: 5,2

Tabela 9 przedstawia poziom przeciwciał IgG w surowicy prosiąt pochodzących od loch immunizowanych (D) i grupach kontrolnych (K1 i K2) na rożnych etapach eksperymentu.

Tabela 9

pobr 1	D	prosięta
KI	K2
	3949	769	2101
	6475:	5751:	2718
	8092	951’	975
	14011:	916:	895
	7891	726	576
	25976;	705:	603
			1651
			2276
			3870
mediana \|	7592	843	1651
średnia ]	11066	1636 i	1741
stosunek gr.	Odo KI i K2 dla: .
mediany: :		9,5'	4,8
średniej:		6,8.	6,4

pobr 2	D	prosięta KI	K2
	1003·	649:	803
	973 i	1800:	867
	1792	450	586
	4923:	492;	653
	1864:	409	989
	5984:	378:	702 1199 681 1328
mediana j	1828i	471:	803
średnia	2757	696_:	868
stosunek gr.	D do KI i K2 dla: i
mediany: ί		3,9	2,3
średniej: i		4,0:	3,2

Prosięta od loch immunizowanych wykazały też zmniejszenie zasiedlenia przez szczep E. coli użyty do zakażenia przede wszystkim w jelicie czczym i okrężnicy.

Tabela 10 przedstawia wyniki badania mikrobiologicznego odcinków przewodu pokarmowego prosiąt stanowiących potomstwo loch immunizowanych (D) i loch kontrolnych (K1 i K2).

PL 246286 Β1

Tabela 10

ilość bakterii			% redukcji i
	KI ’	K2	D i w stos, do KI	w stos, do K2
w jelicie czczym	; 3097744,44;	279222.22;	86455,55] 97,21	69,04
w okrężnicy	491277,77	292625;	73400: 85,06	74,92

Podsumowując przeprowadzony eksperyment stwierdzono, że:

Stosowany preparat pobudza swoistą odpowiedź humoralną u loch, powodując wzrost przeciwciał anty LPS E. coli klasy IgG. Prosięta stanowiące potomstwo immunizowanych loch nabywają odporności biernej poprzez transfer przeciwciał za pośrednictwem siary co skutkuje ich obecnością w surowicy prosiąt. Prosięta stanowiące potomstwo immunizowanych loch lepiej zniosły eksperymentalne zakażenie co ma odzwierciedlenie w szybszych przyrostach masy ciała i redukcji ilości bakterii w badanych odcinkach przewodu pokarmowego i mniejszej ilości padnięć w porównaniu do grup kontrolnych.

Przykład 14. Procedura testu ELISA na oznaczanie poziomu przeciwciał w próbkach surowicy i siary.

1) Płytkę 384-dołkową opłaszczono roztworem LPS (równowagowa mieszanina LPS E. coli obejmująca wszystkie 5 typów rdzenia: R1, R2, R3, R4, K12). Stężenie mieszaniny LPS - 5 pg/ml w buforze do opłaszczania, po 35 pl na dołek i inkubowano przez noc.

Bufor do opłaszczania:

Proporcje: 8 ml 0,2 M Na2COs + 17 ml 0,2 M NaHCCh - zmieszano 32 ml Na2COs i 68 ml NaHCCh

2) Następnie ręcznie usunięto cały bufor z płytki.

3) Płytkę trzykrotnie płukano roztworem TBS-T (TBS z 0,1% TWEEN 20) płuczką Tekan.

4) Następnie na płytkę nanoszono w szeregu rozcieńczeń surowicę rozcieńczoną w buforze TBS z 1% BSA, po 35 pl na dołek, pierwsze rozcieńczenie surowicy - 100x, każde kolejne: 2x.

5) Płytkę inkubowano w temp. 37°C przez 1 h.

6) Następnie ręcznie usunięto całość surowicy z płytki.

7) Płytkę trzykrotnie płukano roztworem TBS-T (TBS z 0,1% TWEEN 20) płuczką Tekan korzystając z programu ELISA_384_TL.

8) Na płytkę nanoszono koniugat przeciwciała anty IgG z HRP rozcieńczony w buforze TBS z 1 % BSA, po 35 pl na dołek.

W przypadku świń: przeciwciała kozie anty świńskie IgG z Jackson ImmunoResearch w rozcieńczeniu 5000x.

9) Płytkę inkubowano w temp. 37°C przez 1 h.

10) Po godzinie usunięto cały koniugat lub roztwór przeciwciał z płytki.

11) Płytkę sześciokrotnie płukano roztworem TBS-T (TBS z 0,1% TWEEN 20) płuczką Tekan korzystając z programu ELISA_384_TL.

12) Dodano po 35 pl/dołek roztworu substratu TMB w buforze cytrynianowym (205 mM kwas cytrynowy w H2O + KOH do pH 4,0) i rozwijano reakcję przez 20 min.

TMB (borowodorek tetrabutyloamoniowy -21,1 mg, tetrametylobenzydyna - 98,54 mg, N,N-dimetyloacetamid -10 ml).

13) Reakcję przerywano dodając po 35 pl na dołek roztworu 1 Μ H3PO4

14) Płytkę czytano w czytniku mikropłytek przy długości fali 450 nm

Publikacje:

1. Robbins, J.B., Chu, C., and Schneerson, R. (1992). Hypothesis for vaccine development: protective immunity to enteric diseases caused by nontyphoidal salmonellae and shigellae may be conferred by serum IgG antibodies to the O-specific polysacchańde oftheir lipopolysaccharides. Clin. Infect. Dis. 15, 346-361.

2. Svenson, S.B. and Lindberg, A.A. (1981). Artificial Salmonella vaccines: Salmonella typhimurium O-antigen-specific oligosaccharide-protein conjugates elicit protective antibodies in rabbits and mice. Infect. Immun. 32, 490-496.

3. Svenson, S.B., Nurminen, M., and Lindberg, A.A. (1979). Artificial Salmonella vaccines: O-antigenic oligosaccharide-protein conjugates induce protection against infection with Salmonella typhimurium. Infect. Immun. 25, 863-872.

4. Konadu, E.Y., Lin, F.Y., Ho, V.A., Thuy, N.T., Van Bay, P., Thanh, T.C., Khiem, H.B., Trach, D.D., Karpas, A.B., Li, J., et al. (2000). Phase 1 and phase 2 studies of Salmonella enterica serovar paratyphi A O-specific polysaccharide-tetanustoxoid conjugates in adults, teenagers, and 2- to 4-year-old children in Vietnam. Infect. Immun. 68, 1529-1534.

5. Levine, M.M., Kotloff K.L., Barry, E.M., Pasetti, M.F., and Sztein, M.B. (2007). Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat. Rev. Microbiol. 5, 540-553.

6. Ahmed, A., Li, J., Shiloach, Y., Robbins, J.B., and Szu, S.C. (2006). Safety and immunogenicity of Escherichia coli O157 O-specific polysaccharide conjugate vaccine in 2-5-year-old children. J. Infect. Dis. 193, 515-521.

7. Westphal O, Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure. In: Whistler RL, Wolfan ML, editors. Methods in Carbohydrate chemistry. New York Academic Press lnc.:1965(5):83-91

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kompleksów immunologicznych lipopolisacharyd bakteryjny (LPS)/białko, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) izoluje się z bakterii LPS dowolną metodą, następnie przeprowadza w formę dobrze rozpuszczalną w DMSO poprzez usuwanie kationów metali związanych z LPS oraz ich wymianę na protony, przeprowadzając lipopolisacharyd bakteryjny w formę kwaśną;

b) uzyskuje się białko dobrze rozpuszczalne w DMSO, przy czym wszystkie jonowo związane kationy zostają zamienione na protony;

c) rozpuszcza się LPS i białko w DMSO i miesza ze sobą oba roztwory uzyskując mieszaninę LPS białko w DMSO w określonym stosunku wagowym; po czym

d) stopniowo rozcieńcza się i usuwa DMSO, przy czym nie doprowadza się do degradacji i modyfikacji chemicznej LPS, zachowując kompletną cząsteczkę LPS i jej właściwości antygenowe, a sprzęganie LPS z białkiem następuje w sposób niekowalencyjny.
2. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że LPS pochodzi z dowolnego szczepu bakterii Gram-ujemnych, takich jak Escherichia, Hafnia, Salmonella i Campylobacter.
3. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że zastosowane w kompleksie białko może być dowolnym białkiem o właściwościach immunogennych, rozpuszczalnym w DMSO.
4. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że zastosowane w kompleksie białko jest kazeiną lub albuminą surowicy bydlęcej.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że DMSO rozcieńcza się wodą.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że DMSO usuwa się za pomocą dializy, ultrafiltracji lub filtracji żelowej.
7. Kompleks lipopolisacharyd/białko wytworzony sposobem według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 6 do zastosowania do indukcji odpowiedzi immunologicznej.
8. Kompleks lipopolisacharyd/białko według zastrz. 7 do zastosowania przy wytwarzaniu immunogenu lub przeciwbakteryjnej szczepionki weterynaryjnej.
9. Sposób wytwarzania szczepionki weterynaryjnej zawierającej kompleks immunologiczny LPS/białko obejmujący następujące etapy: hoduje się komórki bakteryjne i izoluje się LPS, znamienny tym, że przeprowadza się LPS w formę rozpuszczalną w DMSO poprzez usuwanie kationów metali związanych z LPS i ich wymianę na protony, uzyskuje się białko rozpuszczalne w DMSO, w którym wszystkie jonowo związane kationy zostają zamienione na protony, przy czym rozpuszcza się LPS i białko w DMSO a następnie miesza otrzymane roztwory do wytworzenia niekowalencyjnego kompleksu wykazującego immunogenność, przy czym rozcieńczalnikiem zastosowanym do usunięcia DMSO z preparatu jest woda.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że LPS izoluje się metodą ekstrakcji fenol - woda.
11. Sposób według zastrz. 9 znamienny tym, że DMSO usuwa się w procesie dializy, ultrafiltracji lub filtracji żelowej.
12. Sposób według zastrz. 9 znamienny tym, że uzyskany preparat poddaje się liofilizacji lub formułuje z dowolnym adiuwantem.
13. Szczepionka weterynaryjna zawierająca kompleks wytworzony sposobem według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 6.
14. Szczepionka według zastrz. 13 znamienna tym, że jest w postaci zliofilizowanej.
15. Szczepionka według zastrz. 13 znamienna tym, że jest w postaci formulacji z adiuwantem olejowym takim jak niekompletny adiuwant Freunda.
16. Szczepionka według zastrz. 13 znamienna tym, że białko nośnikowe kompleksu stanowi marker pozwalający na śledzenie postępu immunizacji u osobnika.
17. Szczepionka według zastrz. 13 znamienna tym, że wykazuje szerokie spektrum działania wobec wszystkich wersji LPS (serotypów) spotykanych w szczepach Escherichia coli, Salmonella i Hafnia alvei.
18. Szczepionka według zastrz. 13 znamienna tym, że pobudza swoistą odpowiedź humoralną u osobnika powodując wzrost przeciwciał anty LPS klasy IgG.
19. Szczepionka według zastrz. 13 znamienna tym, że osobnikami immunizowanymi mogą być ptaki i ssaki, takie jak kury i świnie.
20. Szczepionka według zastrz. 13 znamienna tym, że immunizacja następuje przez podanie domięśniowo lub dootrzewnowo.
21. Szczepionka według któregokolwiek z poprzednich zastrz. 13 do 20, znamienna tym, że nie wywołuje efektów toksycznych u szczepionych zwierząt.
22. Szczepionka według zastrz. 13 znamienna tym, że zawiera kompleks LPS z białkiem w PBS i opcjonalnie dowolny inny adiuwant.