PL247596B1

PL247596B1 - Sposób bioremediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi, poprawy jakości mikrobiologicznej gleby oraz promowania wzrostu roślin

Info

Publication number: PL247596B1
Application number: PL442546A
Authority: PL
Inventors: Klaudia Dębiec-Andrzejewska; Marta Zakrzewska; Łukasz DREWNIAK; Łukasz Drewniak
Original assignee: Univ Warszawski
Priority date: 2022-10-17
Filing date: 2022-10-17
Publication date: 2025-08-04
Also published as: PL442546A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest zastosowanie szczepu Ochrobactrum sp. POC9 i/lub kompozycji metabolitów wytwarzanych przez szczep Ochrobactrum sp. POC9 zawierających jony amonowe i węglanowe do bioremediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi i związkami organicznymi i/lub poprawy jakości mikrobiologicznej gleby i/lub promowania wzrostu roślin. Zgłoszenie obejmuje też sposób bioremediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi i związkami organicznymi i/lub poprawy jakości mikrobiologicznej gleby i/lub promowania wzrostu roślin, charakteryzujący się tym, że do gleby aplikuje się kompozycję metabolitów szczepu Ochrobactrum sp. POC9 zawierających jony amonowe i węglanowe.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób bioremediacji gleb zanieczyszczonych kadmem i innymi metalami ciężkimi, wykorzystujący kompozycję metabolitów pochodzenia bakteryjnego do immobilizacji kadmu oraz innych metali ciężkich w glebie. Przedmiotem wynalazku jest również sposób usuwania zanieczyszczeń organicznych, promowania wzrostu roślin i poprawy jakości mikrobiologicznej gleby przez szczep bakteryjny.

Kadm jest pierwiastkiem silnie toksycznym, a ze względu na jego łatwą rozpuszczalność w wodzie jest szkodliwy nawet w bardzo niskich stężeniach. Zanieczysz czenie kadmem ma poważne konsekwencje dla jakości wszystkich elementów środowiska, w tym gleby. Kadm negatywnie wpływa także na organizmy bytujące w środowiskach zanieczyszczonych, a także na zdrowie ludzi. Ze względu na swoją toksyczność, kadm został sklasyfikowany przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (IARC) jako jeden z najsilniejszych czynników rakotwórczych. Szkodliwość kadmu wynika w dużej mierze m.in. z łatwego wchłaniania z przewodu pokarmowego do krwi i łatwości przenikania przez łożysko. Po wniknięciu do krwi, kadm w łatwy sposób łączy się z grupami sulfhydrylowymi białek prowadząc do zaburzania ich funkcji czy niszczenia struktury łańcucha kwasu nukleinowego (DNA i RNA).

Najnowsze badania wskazują, że obecność kadmu jest coraz częściej obserwowana nie tylko w środowiskach i glebach poprzemysłowych, ale również w glebach przeznaczonych do celów rolniczych. Zawartość tego pierwiastka w glebach rolniczych jest zwykle znacząco niższa niż w glebach poprzemysłowych, jednak ze względu na wysoką toksyczność kadmu oraz jego zdolność do biomagnifikacji, stanowi to bardzo istotny problem środowiskowy. Coraz liczniejsze badania wykazują, że nawet śladowa zawartość kadmu w glebie (stanowiąca niekiedy tło geochemiczne dla gleb rolniczych) może być mobilizowana i pobierana przez rośliny w określonych warunkach środowiskowych, np. w okresach suszy. W przypadku braku dostatecznej zawartości wody w glebie, rośliny, w celu pobrania jak największej ilości składników odżywczych z gleby, zwiększają aktywność wydzielniczą korzeni. Wydzielają do gleby m.in. kwasy organiczne (np. cytrynowy, jabłkowy, winowy, szczawiowy, fenolowy), co umożliwia roślinom bardziej efektywne pobieranie związków makro i mikroskładników odżywczych z gleby, ale także przyczynia się do zwiększenia mobilności obecnych w niej metali ciężkich, w tym kadmu. W ten sposób, pomimo niewielkiego stężenia kadmu w glebie, nie przekraczającego dopuszczalnych prawnie zawartości tego pierwiastka w glebach rolniczych, następuje kumulacja tego pierwiastka w roślinach uprawnych.

Zgromadzony w tkankach roślin uprawnych kadm ulega procesowi biomagnifikacji, czyli kumulowaniu coraz większych zawartości tego pierwiastka w kolejnych poziomach troficznych. Oznacza to, że najbardziej narażonymi na toksyczne działania kadmu są konsumenci najwyższego rzędu czyli zwierzęta i ludzie. Z danych literaturowych wynika, że maksymalne dopuszczalne stężenie (MPC) kadmu w żywności powinno być ustalone na możliwie najniższym poziomie. Oznacza to, że należy podjąć wszelkie możliwe środki, aby zapobiec akumulacji tego pierwiastka przez producentów, czyli rośliny uprawne.

Opracowane i stosowane dotychczas metody remediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi, w tym kadmu, są często nieodpowiednie dla gleb rolniczych, ponieważ w znaczący sposób zmieniają ich właściwości fizyczne, fizyczno-chemiczne czy (mikro)biologiczne gleby. W zależności od stosowanej metody, techniki te mogą prowadzić do całkowitego zaburzenia fizycznej struktury gleby (np. wszelkie metody bazujące na remediacji ex situ), zmiany parametrów fizyczno-chemicznych gleby takich jak pH, przewodnictwo elektrolityczne czy potencjał oksydoredukcyjny (np. metody elektrochemiczne, chemiczna immobilizacja), zmiany chemizmu gleby polegające na wymywaniu makro- i mikroskładników odżywczych i/lub substancji humusowych i innych związków organicznych (np. metody kwaśnego lub alkalicznego ługowania metali),a także zaburzenia lub całkowitego zniszczenia mikrobiomu oraz flory i fauny glebowej (np. metody typu soil-washing, witryfikacja czy desorpcja termiczna, metody ługowania). Ze względu na liczne zmiany w strukturze, chemizmie i jakości biologicznej gleby pod wpływem stosowania wyżej wymieniowych metod remediacji, pomimo st osunkowo wysokiej skuteczności, żadna z nich nie może zostać uznana za bezpieczną w kontekście oczyszczania gleb rolniczych.

Cenną alternatywą dla tradycyjnych fizyczno-chemicznych metod remediacji, szczególnie w kontekście gleb rolniczych, są metody biologiczne, czyli tzw. procesy bioremediacji. Metody te zakładają wykorzystywanie potencjału mikroorganizmów i/lub roślin do zmniejszenia toksyczności zanieczyszczeń glebowych, zmniejszenia ich mobilności, czy redukcji zawartości. Wpływ biologicznych metod rem ediacji na właściwości fizyczno-chemiczne czy biologiczne gleby jest znacznie bardziej pozytywny niż w przypadku tradycyjnych metod fizyczno-chemicznych. Metody biologiczne są bardziej selektywne w stosunku do zanieczyszczeń glebowych, w tym metali ciężkich, przez co ich wpływ na pozostałe parametry glebowe jest zredukowany niemal do zera. Ponadto, większość z nich przyczynia się nie tylko do redukcji toksyczności zanieczyszczeń czy ich zawartości w glebie, lecz także dodatkowo poprawia właściwości fizyczno-chemiczne czy (mikro)biologiczne gleby, przy jednoczesnym nie zaburzaniu jej struktury fizycznej.

Ze względu na fakt, iż wszelkie metody fizyczne ekstrakcji kadmu z gleb rolniczych generują wiele niepożądanych skutków ubocznych, na szczególną uwagę zasługują metody oparte na immobilizacji i zmniejszaniu biodostępności tego pierwiastka. Znane i dostępne są metody chemicznej immobilizacji kadmu w glebie, jednakże stosowanie znacznej ilości odczynników chemicznych oraz ich negatywny wpływ na jakość biologiczną gleb rolniczych powoduje, że ich stosowanie także nie stanowi optymalnego rozwiązania. Alternatywą dla immobilizacji chemicznej jest zmniejszenie mobilności i biodostępności kadmu za pomocą rozwiązań biologicznych, prowadząc do tzw. biokonsolidacji gleb. Jedną z takich metod jest wytrącanie metali, w tym kadmu za pomocą jonów węglanowych wytwarzanych przez mikroorganizmy (MICP).

MICP prowadzony jest za pomocą mikroorganizmów ureolitycznych, czyli zdolnych do rozkładu mocznika. Proces ten opiera się na reakcji hydrolizy mocznika, w wyniku której powstają jony amonowe oraz w wyniku reakcji spontanicznych jony węglanowe. Jony amonowe przyczyniają się do lekkiej alkalizacji środowiska glebowego, co przyczynia się do zmniejszenia mobilności pierwiastków, natomiast jony węglanowe dodatkowo łączą się z jonami dwuwartościowymi obecnymi w glebie, np. z jonami kadmu, tworząc z nimi stabilne i nierozpuszczalne kompleksy. Oznacza to, że wytworzone za pomocą mikroorganizmów w odpowiedni sposób jony amonowe i węglanowe mogą być wykorzystywane do zmniejszenia mobilności i biodostępności kadmu w glebie.

Proces MICP badano pod kątem efektywnej immobilizacji miedzi, arsenu, kadmu, ołowiu i cynku (Zn) w zanieczyszczonych glebach. MICP może przyczyniać się nie tylko do immobilizacji kadmu i innych metali ciężkich w glebie, ale także poprzez właściwy sposób wytwarzania, za pomocą odpowiedniego szczepu bakterii i odpowiedniej metodyki suplementacji gleby, może dodatkowo stymulować mikrobiotę glebową oraz poprawiać wzrost i jakość roślin uprawnych. Wśród metabolitów współwytwarzanych podczas hydrolizy mocznika znajdują się nie tylko jony amonowe, które są najłatwiej przyswajalnym źródłem azotu dla mikroorganizmów glebowych i roślin, ale także różnego rodzaju metabolity wtórne, takie jak kwasy organiczne, ligandy, alkohole, peptydy krótkołańcuchowe i nienasycone kwasy tłuszczowe, które wzbogacają glebę w dodatkowe składniki odżywcze. Metabolity te, mogą mieć także pozytywny wpływ na liczebność i aktywność mikrobioty autochtonicznej gleb rolniczych, a także bezpośrednio przyczyniać się do biofortyfikacji roślin uprawnych. Oznacza to, że przy właściwym zastosowaniu metabolitów bakteryjnych uzyskanych w wyniku hydrolizy mocznika następuje nie tylko zmniejszenie mobilności metali ciężkich, w tym kadmu, w glebach rolniczych, ale także poprawa jakości mikrobiologicznej gleby oraz promowanie wzrostu roślin. Dodatkową cechą tej metody jest skuteczność działania nawet wobec bardzo niskich stężeń zanieczyszczeń, w tym kadmu, które zwykle występuje w glebach rolniczych.

Dokument PL 229447 ujawnia konsorcjum mikroorganizmów zdolnych do hydrolizy białek i tłuszczy w osadach ściekowych i/lub skażonych glebach, w skład którego wchodzi szczep Ochrobactrum sp. POC9.

Z publikacji Yang Z. i in. 2020. „Biochemical treatment of leachates from hydrometallurgical recycling of spent alkaline batteries”. Hydrometallurgy 191: 105223 znana jest kompozycja zawierająca jony węglanowe oraz jony amonowe wytwarzane przez szczep Ochrobactrum sp. POC9, a także sposób jej wytwarzania. Publikacja ujawnia zastosowanie tej kompozycji do neutralizacji kwaśnych odcieków pochodzących z procesów hydrometalurgicznych.

Yang Z. i in. 2021. „Biostimulation of sulfate-reducing bacteria used for treatment of hydrometallurgical waste by secondary metabolites of urea decomposition by Ochrobactrum sp. POC9”: From genome to microbiome analysis. Chemosphere 282: 131064, prezentuje skład i zastosowanie kompozycji metabolitów wytwarzanych przez Ochrobactrum sp. POC9 do stymulacji aktywności bakterii redukujących siarczany, użytecznych w bioremediacji odcieków hydrometalurgicznych.

Zastosowanie tego szczepu zostało także ujawnione w pracach naukowych dotyczących zwiększania efektywności produkcji biogazu (Poszytek K. i in. 2018. „Genome-guided characterization of

Ochrobactrum sp. POC9 enhancing sewage sludge utilization - biotechnological potential and biosafety considerations”. International Journal of Environmental Research and Public Health 15: 1501; Poszytek K. i in. 2019. „Genome-wide and functional view of proteolytic and lipolytic bacteria for efficient biogas production through enhanced sewage sludge hydrolysis”. Molecules 24: 2624).

Publikacja CN105670955 ujawnia szczep Ochrobactrum sp. MGJ11 zdeponowany pod numerem CGMCC No. 11385. Publikacja ujawnia sposób immobilizowania kadmu z wykorzystaniem powyższego szczepu, w którym szczep aplikuje się do części obejmującej ryzosferę rośliny lub miesza się sproszkowany szczep z ziarnami rośliny i wysadza się rośliny, przy czym stężenie mikroorganizmów jest nie mniejsze niż 10⁹ komórek bakteryjnych na roślinę. Bakterie hodowane są na podłożu zawierającym gotowy chemiczny suplement, którym jest węglan wapnia. Promocja wzrostu rośliny jest efektem zdolności szczepu MGJ11 do produkcji fitohormonów.

Publikacja US2011136199 dotyczy rozwiązania, w którym wykorzystuje się szczepy bakterii wybrane z grupy Ochrobactrum anthropi JHA60, Alcallgenes xylosoxidans JHB14, Alcallgenes faecaIis JHC10, Ralstonia mannltolilytica JHG2, Ralstonia mannltolilytica JHL8, Ralstonia pickettii JHP30, Ralstonia pickettii JHP55, Variovorax paradoxus JHP31 oraz Cupriavidus necator JHJ6 do kolonizacji korzeni roślin i tym samym ograniczenia pobierania metali przez rośliny. Mikroorganizmy nanoszone są bezpośrednio na korzenie roślin lub do gleby/roztworu hydroponicznego.

Celem wynalazku jest zapewnienie wysoce efektywnej biologicznej metody bioremediacji gleb zanieczyszczonych kadmem i innymi metalami ciężkimi jak arsen, miedź, ołów, cynk, zapewniającej jednocześnie poprawę jakości mikrobiologicznej gleby oraz promowanie wzrostu roślin, w tym roślin uprawnych. Celem wynalazku jest również sposób bioremediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi, np. ropopochodnymi.

Cel ten zrealizowano w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób bioremediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi i/lub poprawy jakości mikrobiologicznej gleby i/lub promowania wzrostu roślin, obejmujący następujące etapy:

(a) prowadzi się hodowlę szczepu Ochrobactrum sp. POC9 na podłożu zawierającym mocznik, przy czym stężenie mocznika w podłożu wynosi co najmniej 0,5%, (b) hodowlę odwirowuje się uzyskując kompozycję metabolitów, (c) kompozycję metabolitów uzyskaną w hodowli szczepu aplikuje się do gleby w proporcji objętościowej gleby do kompozycji metabolitów nie mniejszej niż 7:1.

Korzystnie, bioremediacji poddaje się gleby zanieczyszczone kadmem.

Korzystnie, bioremediacji poddaje się gleby zanieczyszczone cynkiem, niklem, ołowiem i miedzią.

Korzystnie, hodowlę szczepu Ochrobactrum sp. POC9 prowadzi się przez 72 godziny w temperaturze 23°C, z natlenianiem przez wytrząsanie, korzystnie przy 1500 obr./min.

Korzystnie, stężenie mocznika w podłożu wynosi 2%.

Korzystnie, podłoże zawiera pepton - 1 g/l, NaCI - 5 g/l, KH2PO4 - 2 g/l, mocznik - 2%, a pH początkowe podłoża wynosi 6,8.

Korzystnie, kompozycję metabolitów aplikuje się do gleby w proporcji objętościowej gleby do kompozycji 1:1.

Szczepem bakteryjnym wykorzystywanym w niniejszym wynalazku jest Ochrobactrum sp. POC9. Szczep ten został zdeponowany w dniu 23 września 2022 r. w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, Polska pod numerem B/00424.

Sekwencję 16s rDNA szczepu przedstawia SEKW NR 4 ujawniona w dokumencie PL 229447. Analizę genomu Ochrobactrum sp. POC9 zawiera baza NCBI GenBank, numer dostępu SAMN09237519.

Charakterystykę i opis taksonometryczny szczepu przedstawiono w publikacjach Poszytek K. i in. 2018. „Genome-guided characterization of Ochrobactrum sp. POC9 enhancing sewage sludge utilization - biotechnological potential and biosafety considerations”. International Journal of Environmental Research and Public Health 15: 150 oraz Poszytek K. i in. 2019. „Genome-wide and functional view of proteolytic and lipolytic bacteria for efficient biogas production through enhanced sewage sludge hydrolysis”. Molecules 24: 2624.

Nowe zastosowanie szczepu Ochrobactrum sp. POC9 oraz wytworzonych przez niego kompozycji metabolitów, w tym jonów amonowych i węglanowych, obejmuje ich pozytywne działanie w następujących aspektach:

a) zmniejszenia mobilności kadmu i innych metali ciężkich w zanieczyszczonych glebach w tym glebach rolniczych,

b) poprawy jakości mikrobiologicznej gleby,

c) promowania wzrostu roślin, w tym roślin uprawnych,

d) zwiększenia efektywności bioremediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi, np. ropopochodnymi.

Kompozycja metabolitów zawierająca jony amonowe i węglanowe wytwarzana przez szczep Ochrobactrum sp. POC9 może być suplementowana do różnych rodzajów gleb i wykazywać różne pozytywne działania:

a) w przypadku suplementacji gleb, następuje immobilizacja kadmu i/lub innych metali ciężkich, dzięki czemu zmniejsza się ich biodostępność dla mikroorganizmów i roślin,

b) w przypadku suplementacji gleb, następuje stymulacja liczebności i aktywności mikroorganizmów glebowych, co może mieć pozytywny wpływ na wzrost i rozwój roślin uprawnych,

c) w przypadku suplementacji gleb, następuje stymulacja liczebności i aktywności mikroorganizmów glebowych, co może mieć wpływ na zwiększenie efektywności biodegradacji zanieczyszczeń organicznych w glebie, np. związków ropopochodnych.

Kompozycja metabolitów zawierająca jony amonowe i węglanowe wytwarzana przez szczep Ochrobactrum sp. POC9 może także znaleźć zastosowanie w promowaniu wzrostu roślin uprawnych. Na podstawie uzyskanych danych wykazano, że właściwa aplikacja doglebowa kompozycji metabolitów zawierającej jony amonowe i węglanowe, przyczynia się do promowania wzrostu roślin uprawnych takich jak np. pietruszka.

Przykład 1

Zmniejszenie mobilności kadmu w glebach za pomocą kompozycji metabolitów zawierających jony amonowe i węglanowe, wytwarzanej przez szczep Ochrobactrum sp. POC9

Prezentowany przykład dotyczy wpływu kompozycji metabolitów zawierających jony amonowe i węglanowe, wyprodukowanej przez szczep Ochrobactrum sp. POC9 na mobilność kadmu w zanieczyszczonej glebie oraz sposobu aplikacji tej kompozycji do gleby.

W celu uzyskania kompozycji metabolitów zaszczepiano płynne podłoże LB (50 ml) kolonią szczepu Ochrobactrum POC9 pobraną z szalki zawierającej czystą kulturę. Hodowlę w LB prowadzono przez około 12-24 godzin w temperaturze pokojowej (18-25°C) z wytrząsaniem (około 150 rpm), aż do osiągnięcia logarytmicznej fazy wzrostu mikroorganizmów. Następnie uzyskana hodowla była dwukrotnie odwirowywana (8000 rpm, 5 minut), a powstały osad po odseparowaniu supernatantu zawieszano w roztworze soli fizjologicznej (0,85% NaCI), celem usunięcia pozostałości z pełnego podłoża LB.

Właściwą hodowlę wytwarzającą właściwą kompozycję metabolitów przygotowywano poprzez zaszczepienie 200 ml odpowiedniego podłoża stymulującego szczep POC9 do hydrolizy mocznika, w wyniku czego wytwarzane były jony amonowe i węglanowe. Właściwym podłożem było podłoże M-UREA o składzie: pepton - 1 g/l, NaCI - 5 g/l, KH2PO4 - 2 g/l, mocznik - 2%. Początkowe pH podłoża M-UREA wynosiło 6,8. Ilość inokulum dodawanego do podłoża M-UREA była dobierana w taki sposób, żeby uzyskać wartość początkowej gęstości optycznej hodowli równą OD600nm = 0,06, co odpowiadało około 106 JTK/ml. Hodowle prowadzono przez 72 godziny w kolbach szklanych, z natlenianiem przez wytrząsanie (150 rpm) w temperaturze 23°C. Po 72 godzinach, hodowle odwirowywano (8000 rpm, 5 min), a uzyskany supernatant wykorzystywano do dalszych badań. Jako kontrolę chemiczną wykorzystywano jałowe podłoża M-UREA.

W ramach eksperymentu przebadano także następujące stężenia mocznika: 0,1%, 0,5%, 1%, 2% i 5%, testując jego wpływ na hodowlę bakterii oraz immobilizację metali ciężkich, zwłaszcza kadmu. Hodowle szczepu Ochrobactrum sp. POC prowadzono przez 72 godziny w analogiczny sposób opisywany w Przykładzie 1. W prowadzonych hodowlach monitorowano wzrost mikroorganizmów, wartości pH i Ec oraz zawartość jonów amonowych i węglanowych. Wyniki uzyskane po 72 godzinach eksperymentu przedstawiono w Tabeli 1.

PL 247596 Β1

Tabela 1. Parametry hodowli szczepu Ochrobactrum sp. POC9 hodowanego przez godziny na podłożu M-UREA z różną zawartością mocznika (0,1%, 0,5%, 1% 2% i 5%). Litera H oznaczono hodowle bakteryjne, litera K - odpowiadające im warianty kontrolne (bez bakterii).

Wariant eksperymentalny	JTK/ml	PH	Ec [mV]	Zawartość jonów amonowych [mg/L]	Zawartość jonów węglanowych [mM]
0,1% mocznika H	1,3 ^Λ10⁴	8,33	13,98	54	421
0,1% mocznika K	0	6,97	8,87	0	0
0,5% mocznika H	2,7 MO⁷	9,11	22,13	116	698
0,5% mocznika K	0	6,73	7,45	0	0
1% mocznika H	3,1 ^Λ 10⁷	9,18	23,14	122	704
1% mocznika K	0	7,09	8,34	0	0
2% mocznika H	2,9 ^Λ10⁷	9,33	23,44	120	700
2% mocznika K	0	7,10	7,99	0	0
5% mocznika H	3,2 ^Λ 10⁷	9,54	24,98	139	723
5% mocznika K	0	7,03	9,12	0	0

Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że wzrost mikroorganizmów był jednakowo intensywny w hodowlach zawierających 0,5% mocznika i więcej. W wariancie zawierającym 0,1% mocznika wzrost był znacząco zahamowany. W hodowlach zawierających 0,5% mocznika i więcej liczebność mikroorganizmów była zbliżona i wynosiła ok. 10⁷ JTK/ml. Wartości pH oraz Ec po 72 godzinach hodowli także były podobne w hodowlach zawierających 0,5% mocznika i więcej. Wartości te wynosiły: pH powyżej 9 oraz Ec powyżej 20 mV. W przypadku wariantu z najniższą zawartością mocznika wartość zarówno wartość pH jak i Ec była znacznie niższa (odpowiednio pH 8,33 i Ec 13,98 mV) niż w wariantach o wyższej zawartości mocznika. Podobną korelację zaobserwowano w przypadku jonów amonowych i węglanowych, których zawartość była znacznie wyższa w hodowlach zawierających 0,5% mocznika i więcej niż w wariancie zawierającym 0,1% mocznika. Zawartość jonów amonowych na poziomie min. 120 mg/L oraz jonów węglanowych na poziomie min. 700 mM umożliwia skuteczną immobilizację kadmu w glebie, korzystnie przy zastosowaniu odpowiedniej suplementacji. Oznacza to, że minimalna zawartość mocznika w hodowli szczepu Ochrobactrum sp. POC9 do skutecznej immobilizacji kadmu w glebie powinna wynosić co najmniej 0,5%.

Uzyskana w ten sposób kompozycja metabolitów zawierała ok. 120 mg/l jonów amonowych oraz 700 mM jonów węglanowych. Kompozycja pozostałych metabolitów składała się z alkoholi, których całkowita zawartość wynosi 556,09 mg/L, kwasów organicznych (864,27 mg/L), nienasyconych węglowodorów (4333,36 mg/L), związków organicznych zawierających azot (625,42 mg/L) oraz związków organicznych zawierających siarkę (187,37 mg/L). Analizy jakościowe kompozycji metabolitów wykazały obecność takich alkoholi jak: 2-etylo-1-dekanol, 2-etylo-1-dodekanol, N-tetrakozanol-1, 1-heksakozanol, 1-dotriakontanol, cykloundekanometanol. Wśród kwasów organicznych zidentyfikowano kwas merkaptooctowy, kwas mirystynowy, kwas heksadekanowy, kwas cis-13-oktadecenowy, kwas oktadekanowy, kwas ehydroabietynowy oraz kwas 1,2-benzenodikarboksylowy. Wykazano także obecność nienasyconych węglowodorów takich jak 9-eikozen (e)-, 2-decen, 3-metylo- (z)-, 1-oktadecen, 5-eikozen (e)-, (9e,12e)-9,12-oktadekadienian metylu, (5e)-5-ikozen, cs-4-decen, (3e)-3-ikozen, 1-dokozen, (17e)-17-pentatrikonten oraz 17-pentatrikonten. Wśród związków organicznych zawierających azot zidentyfikowano mocznik, n,n’-bis(trimetylosililo)-formamid, n-metylotio 5h,10h-dipirolo[1,2-a:1',2'-d]pirazyno-5,10-dion, oktahydro- (5as-cis)-2-metylo-6-(5-metylo-2-tiazolin-2-yloamino) pirydyna, natomiast wśród związków zawierających siarkę zidentyfikowano chlorek 1-oktadekanosulfonylu, kwas siarkawy oraz ester oktadecylo-2-propylowy.

Uzyskaną kompozycję metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe aplikowano do gleby ogrodowej zanieczyszczonej kadmem o zawartości 2 mg/kg suchej masy gleby. Była to gleba przeznaczona do celów rolniczych. W ramach tego eksperymentu testowano aplikowanie różnych proporcji objętościowych kompozycji metabolitów w stosunku do gleby zanieczyszczonej kadmem (gleba : metabolity). Testowano 7 różnych proporcji gleby do kompozycji metabolitów: 1:0, 1:1, 2:1, 3:1, 7:1, 8:1, 10:1. Do siedmiu 350 ml zlewek laboratoryjnych odmierzono po 200 g powietrznie suchej gleby zanieczyszczonej kadmem, a następnie aplikowano do gleby odpowiednią objętościową porcję metabolitów. Do kolejnych siedmiu zlewek z glebą oddawano takie same objętości jałowego podłoża M-UREA. Celem

PL 247596 Β1 tych prac było zbadanie jaka objętość metabolitów będzie wystraczająca do skutecznej immobilizacji kadmu w glebie.

Próbki gleby do analiz mobilności kadmu pobierano na początku eksperymentu oraz po 14 dniach. Próbki te były pobierane i analizowane w następujący sposób: 3 g gleby umieszczano w flakonie i dodawano 30 ml 0,1 M CaCl2. Próbki intensywnie mieszano, a następnie inkubowano przez 5 godzin bez wytrząsania w celu uwolnienia związanego z glebą kadmu i migracji pierwiastka do ekstrahentu. Po zakończonej inkubacji próbki wirowano (8000 rpm, 5 minut, 4°C), a supernatant filtrowano przez papierowe sączki laboratoryjne (Whatman 41 Grade, 150 mm średnicy) umieszczone na szklanych lejkach. Przefiltrowane próbki ekstraktu glebowego utrwalano przez dodatek 69% kwasu azotowego, w stosunku objętościowym 1:4 (kwas : próbka) i przechowywano w temperaturze poniżej 4°C przed analizami chemicznymi. Oznaczanie zawartości kadmu w ekstraktach glebowych wykonano za pomocą atomowej spektrometrii absorpcyjnej (ASA) na spektrometrze Thermo Fisher ICE 3300 metodą płomieniową. Do przygotowania krzywej wzorcowej został użyty standardowy roztwór kadmu (1000 ppm) zawieszony w 3% HNO3. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 2.

Tabela 2. Całkowita zawartość kadmu w ekstraktach glebowych uzyskanych z gleby traktowanej różnymi porcjami objętościowymi kompozycji metabolitów zawierającej jony amonowe i węglanowe wyrażona w mg/l. Warianty oznaczone jako „M” oznaczają gleby z dodatkiem kompozycji metabolitów, warianty oznaczone jako „K” to warianty kontrolne z dodatkiem jałowego podłoża M-UREA.

„Woda” oznacza traktowanie gleby wodą - dodatkowa kontrola chemiczna.

..... μΊ:1	na początku eksperymentu (TO) [mg/l] 1,473	na końcu eksperymentu (T14) [mg/l] 0,110	__ j
M 2:1	1,414	0,097	-93,17090612
M3:1	1,442	0,163	-88,69071679
M7:1	1,385	0,645	-53,40486068 ..................__ ............
M10:1	1,399	0,876

I K1:1	1,535	0,757	-50,6881958 i
K2:1	1,504	0,852	-43,38822475
K3:1	1,444	1,268	-12,19155351
K7:1	1,459	1,311	-10,1132137
I K 10:1	1,356	1,214	-10,46887042

| Woda

1,422

1,399

-1,640100946 |

Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że uzyskana kompozycja metabolitów zawierająca jony amonowe i węglanowe w znaczący sposób przyczynia się do redukcji mobilności kadmu w glebie. Potwierdzają to znacząco niższe całkowite zawartości kadmu w ekstraktach glebowych po 14 dniach eksperymentu (T14) względem początku eksperymentu (TO). Dodatkowo stwierdzono, że im wyższa objętościowa zawartość metabolitów, tym wyższy poziom immobilizacji tego pierwiastka wgłębię. W przypadku suplementacji gleby największą objętościową porcją metabolitów (1:1), mobilność kadmu w glebie po 14 dniach zmniejszyła się o ponad 92% w stosunku do początku eksperymentu, natomiast w przypadku najmniejszej objętościowej suplementacji gleby kompozycją metabolitów zaobserwowano spadek mobilności kadmu o ponad 37%. Oznacza to, że im wyższa objętościowa zawartość metabolitów w glebie, tym wyższy poziom immobilizacji kadmu w glebie. Zmianę w mobilności kadmu

PL 247596 Β1 zaobserwowano także w wariantach kontrolnych (bez właściwej kompozycji metabolitów), jednakże poziom tej immobilizacji był znacząco mniejszy od wariantów z kompozycją metabolitów dla każdej badanej proporcji. Przyczyną zaobserwowanej immobilizacji kadmu w wariantach kontrolnych może być wpływ samego podłoża zawierającego mocznik oraz aktywności autochtonicznej mikrobioty glebowej.

Na podstawie uzyskanych wyników, stwierdzono także, że minimalną proporcją kompozycji metabolitów, wytwarzanej przez szczep POC9 do gleby zanieczyszczonej kadmem, jest proporcja 7:1 (gleba : metabolity). Jest to zawartość, która pozwala na znaczącą immobilizację tego pierwiastka w glebie, a dodatkowo jest optymalna pod kątem ekonomicznym i technologicznym.

Przykład 2

Zmniejszenie mobilności Zn, Ni, Pb i Cu w glebach za pomocą kompozycji metabolitów zawierającej jony amonowe i węglanowe, wytwarzanej w znany sposób przez szczep Ochrobactrum sp. POC9

Kolejny przykład dotyczy zastosowania kompozycji metabolitów wytwarzanej przez szczep Ochrobactrum POC9 do immobilizacji cynku, niklu, ołowiu oraz miedzi w zanieczyszczonych glebach. Kompozycja metabolitów została przygotowana w sposób opisany w Przykładzie 1. Suplementacja kompozycji metabolitów do gleby została przeprowadzona także w sposób przedstawiony w Przykładzie 1, z tym, że do tych testów zastosowano już tylko jedną wybraną proporcję 7:1. Próbki gleby do analiz mobilności cynku, niklu, ołowiu oraz miedzi pobierano na początku eksperymentu (TO) oraz po 14 dniach. Do analiz przygotowywano je w analogiczny sposób jak opisano w Przykładzie 1. Glebą wykorzystywaną w tych eksperymentach była gleba pochodzenia przemysłowego, która zawierała 1250 mg/kg Zn, 170 mg/kg Cu, 45 mg/kg Ni oraz 245 mg/kg Pb. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 3.

Tabela 3. Zmiana mobilności Zn, Ni, Pb oraz Cu w glebie traktowanej kompozycją metabolitów, zawierającą jony amonowe i węglanowe (w proporcji 7:1) po 14 dniach inkubacji gleby z metabolitami (T14) w stosunku do początku eksperymentu (TO). Wariant oznaczony jako „M” oznacza glebę z dodatkiem kompozycji metabolitów, wariant oznaczony jako „K” to wariant kontrolny z dodatkiem jałowego podłoża M-UREA.

Wariant eksperymentalny	Zmiana mobilności Zn [%]	Zmiana mobilności Ni [%]	Zmiana mobilności Pb [%]	Zmiana mobilności Cu [%]
M 7:1	-87,34%	-98,54%	-98,82%	-98,25%
K 7:1	-26,53%	-56,34%	-54,1%	-52,84%

Na podstawie uzyskanych wyników, stwierdzono, że uzyskana kompozycja metabolitów zawierająca jony amonowe i węglanowe wytwarzana przez szczep POC9 może znaleźć także zastosowanie w zmniejszaniu mobilności Zn, Ni, Pb oraz Cu w zanieczyszczonych glebach. Wykazano, że suplementacja gleby wytworzoną przez szczep POC9 kompozycją metabolitów w proporcji 7:1 przyczynia się w znaczącym stopniu do redukcji mobilności cynku (o ponad 87%), niklu (o ponad 98%), ołowiu (o ponad 98%) oraz miedzi (o ponad 98%).

Uzyskane wyniki wskazują także na możliwość zastosowania kompozycji metabolitów wytwarzanej przez szczep POC9 nie tylko w kontekście gleb rolniczych zawierających stosunkowo niskie zawartości metali ciężkich, ale także do gleb poprzemysłowych, w których zawartość metali ciężkich jest wielokrotnie wyższa.

Przykład 3

Poprawa jakości biologicznej gleby poprzez zwiększenie liczebności i aktywności mikroorganizmów za pomocą kompozycji metabolitów zawierającej jony amonowe i węglanowe, wytwarzanej w znany sposób przez szczep Ochrobactrum sp. POC9

Niniejszy przykład dotyczy zastosowania uzyskanej kompozycji metabolitów zawierającej jony amonowe i węglanowe do poprawy jakości mikrobiologicznej gleby w kontekście zwiększania liczebno

PL 247596 Β1 ści i aktywności mikroorganizmów glebowych. Suplementacja gleby w jony amonowe i węglanowe przyczynia się do redukcji toksyczności kadmu i innych metali ciężkich poprzez ich immobilizację jak wykazano w Przykładzie 1 i 2. Redukcja toksyczności przyczynia się z kolei do poprawy jakości mikrobiologicznej gleby. Dodatkowo, w kompozycji metabolitów wytwarzanych przez szczep POC9, oprócz jonów amonowych i węglanowych, znajdują się także metabolity współtowarzyszące takie jak np. kwasy organiczne, alkohole, estry czy aminokwasy. Związki te także mogą przyczyniać się do poprawy jakości mikrobioty glebowej poprzez dostarczenie dodatkowych substratów odżywczych dla mikroorganizmów glebowych.

W eksperymencie, którego opis przedstawiono w Przykładzie 1, pobierano także próbki gleby do analiz mikrobiologicznych - określenia liczebności mikroorganizmów heterotroficznych oraz oznaczania aktywności dehydrogenaz w glebie. Do tych analiz próbki pobierano nie tylko na początku i na końcu eksperymentu (TO i T14), ale także po 7 dniach (T7). Do określania liczebności mikroorganizmów heterotroficznych w glebie zastosowano metodę wysiewów rozcieńczeń ekstraktu glebowego na szalki ze stałym podłożem LB. 1 g pobranej próbki gleby umieszczano w szklanej kolbie i dodawano do niej 10 ml roztworu soli fizjologicznej (0,85% NaCI) i wytrząsano (150 rpm) przez 24 godziny. Następnego dnia z otrzymanego ekstraktu glebowego przygotowywano rozcieńczenia i wysiewano na szalki ze stałym podłożem LB. Po 2-dniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zliczano wyrosłe kolonie i obliczano liczebność mikroorganizmów heterotroficznych, wyrażoną jako JTK/ml. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 4.

Tabela 4. Liczebność mikroorganizmów heterotroficznych w glebie wyrażona jako JTK/ml na początku eksperymentu (TO), po 7 dniach (T7) oraz na końcu eksperymentu (T14). Warianty oznaczone jako „M” oznaczają gleby z dodatkiem kompozycji metabolitów, warianty oznaczone jako „K” to warianty kontrolne z dodatkiem jałowego podłoża M-UREA.

„Woda” oznacza traktowanie gleby wodą zamiast kompozycji metabolitów lub podłoża M-UREA - dodatkowa kontrola chemiczna.

। Warianty eksperymentalne	i ^T°	T7	T14
M 1:1	1.32E+08	1.54E+09	2.77E+09
^! M 2:1	। 1.23E+08	1,37E+09	1.90E+09
			....
M 3:1	. 1.18E+08	1.29E+09	1.55E+09
M 7:1	1.17E+08	5.92E+08	6,51 E+08
M 10:1	1,18E+08	5.80E+08	6.38E+08
			_...... J
K 1:1	। 1.19E+08	6.92E+08	1.33E+09
K2:1	\| 1.18E+08	5,08E+08	7.12E+08
\| K 3:1	1.22E+08	3.00E+08	3,60 E+08
I	1.17E+08	2,67E+08	3.56E+08
K10:1	1.28E+08	3.12E+08	3,43 E+08
j
Woda	I 1.18E+08	1.28E+08	2,28 E+08

Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że suplementacja gleby kompozycją metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe przyczynia się do zwiększenia liczebności bakterii heterotroficznych w glebie. Początkowa liczebność mikroorganizmów w glebie wynosiła ok. 1,2*10® JTK/ml, natomiast już po 7 dniach eksperymentu liczebność mikroorganizmów była wyższa od 0,5 do 1 rzędu wielkości, w zależności od badanej proporcji gleby do metabolitów. Stwierdzono, że im wyższa objętość kompozycji metabolitów dodawana do gleby, tym większa liczebność mikroorganizmów, np. w glebie o największej suplementacji kompozycji metabolitów (1:1) liczebność mikroorganizmów wzrosła o ponad 1 rząd wielkości w ciągu 7 dni eksperymentu, a po 14 dniach liczebność mikroorganizmów była

PL 247596 Β1 wyższa niemal dwukrotnie względem pomiaru po 7 dniach. W przypadku pozostałych badanych proporcji także zaobserwowano wzrost liczebności mikroorganizmów po 7 i 14 dniach, ale wzrost ten był już nieco mniej intensywny i proporcjonalny do objętości dodawanej do gleby kompozycji metabolitów. Uzyskane wyniki jasno wskazują, że suplementacja gleby kompozycją metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe, wytwarzaną przez szczep POC9 wprost przyczynia się do zwiększenia liczebności mikroorganizmów w glebie. W wariancie kontrolnym, z dodatkiem samego podłoża M-UREA, także zaobserwowano wzrost liczebności mikroorganizmów w glebie, jednak wzrost ten był znacząco niższy niż w przypadku suplementacji gleby kompozycją metabolitów wytwarzanych przez szczep POC9. Przyczyną zaobserwowanej korelacji w wariantach kontrolnych może być pozytywny wpływ samego podłoża zawierającego mocznik na wzrost liczebności mikrobioty glebowej, wywołany dostarczeniem wraz z podłożem M-UREA substratów odżywczych dla mikroorganizmów. Efekt tej biostymulacji był jednakże znacząco niższy względem suplementacji gleby kompozycją metabolitów.

Aktywność dehydrogenaz w glebie oznaczono za pomocą metody z zastosowaniem chlorku 2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazolu (INT). Próbkę gruntu (0,5 g) umieszczono w probówce, a następnie dodano do niej 2 ml 0,2% roztworu INT, po czym inkubowano w ciemności z wytrząsaniem przez 2 godziny. Po tym czasie dodano 4 ml roztworu ekstrakcyjnego (DMF : etanol 1:1 (v/v)) i inkubowano próbki przez kolejną godzinę w ciemności z wytrząsaniem. Po zakończeniu inkubacji próbki odwirowywano (2 minuty / 8000 rpm), po czym mierzono absorbancję supernatantu w spektrofotometrze przy długości fal 464 nm. Pomiarów dokonywano na początku i na końcu eksperymentu (po 14 dniach). Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 5.

Tabela 5. Aktywność mikroorganizmów heterotroficznych w glebie wyrażona jako nmol INTF/ml na początku eksperymentu (TO), po 7 dniach (T7) oraz na końcu eksperymentu (T14). Warianty oznaczone jako „M” oznaczają gleby z dodatkiem kompozycji metabolitów, warianty oznaczone jako „K” to warianty kontrolne z dodatkiem jałowego podłoża M-UREA. „Woda” oznacza traktowanie gleby wodą - dodatkowa kontrola chemiczna.

Warianty eksperymentalne	TO	T7	T14
M 1:1	14,602	43,706	54,675
M 2:1	13,148	38,373	44,618
M3:1	12,527	28,195	29,451
M 7:1	12,779	14,006	17,988
M 10:1	12,455	13,013	16,009

K 1:1	13,457	23,055	33,782
K2:1	12,576	14,431	22,215
K 3:1	11,045	12,887	16,471
K7:1	12,779	10,264	15,081
K 10:1	12,746	10,331	15,292
Woda	11,581	11,872	11,727
___________________________________J		_______________________________________	......._________________________

Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że suplementacja gleby kompozycją metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe przyczynia się do wzrostu aktywności dehydrogenaz

PL 247596 Β1 w glebie. Początkowa aktywność dehydrogenaz w glebie mieściła się w granicach 11-14,6 nmol INTF/ml, natomiast po 7 dniach eksperymentu aktywność mikroorganizmów była wyższa od 0,6 do ponad 29 nmol INTF/ml, w zależności od badanej proporcji gleby do metabolitów. Stwierdzono, że im wyższa objętość kompozycji metabolitów dodawana do gleby, tym większa aktywność mikroorganizmów, np. w glebie o największej suplementacji kompozycji metabolitów (1:1) aktywność mikroorganizmów wzrosła ponad 3-krotnie w ciągu 7 dni eksperymentu, a po 14 dniach liczebność mikroorganizmów była wyższa niemal 4-krotnie względem początku eksperymentu. W przypadku pozostałych badanych proporcji także zaobserwowano wzrost aktywności mikroorganizmów po 7 i 14 dniach, ale wzrost ten był już nieco mniej intensywny i proporcjonalny do objętości dodawanej do gleby kompozycji metabolitów. Uzyskane wyniki jasno wskazują, że suplementacja gleby kompozycją metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe wytwarzana przez szczep POC9 wprost przyczynia się do zwiększenia aktywności mikroorganizmów w glebie. W wariancie kontrolnym, z dodatkiem samego podłoża M-UREA, także zaobserwowano wzrost aktywności mikroorganizmów w glebie, jednak wzrost ten był znacząco niższy niż w przypadku suplementacji gleby kompozycją metabolitów wytwarzanych przez szczep POC9. Przyczyną zaobserwowanej korelacji w wariantach kontrolnych może być pozytywny wpływ samego podłoża zawierającego mocznik na wzrost aktywności mikrobioty glebowej, wywołany dostarczeniem wraz z podłożem M-UREA substratów odżywczych dla wzrostu liczebności i tym samym aktywności mikroorganizmów. Efekt tej biostymulacji był jednak znacząco niższy względem suplementacji gleby kompozycją metabolitów.

Przykład 4

Promowanie wzrostu roślin za pomocą kompozycji metabolitów zawierającej jony amonowe i węglanowe, wytwarzanej w znany sposób przez szczep Ochrobactrum sp. POC9.

Niniejszy przykład dotyczy wpływu kompozycji metabolitów wytwarzanej przez szczep POC9 na promowanie wzrostu roślin zarówno tych hodowanych w glebie niezanieczyszczonej, jak i tych uprawianych w glebie zanieczyszczonej kadmem. W celu weryfikacji tej hipotezy przeprowadzono eksperyment, w którym hodowano pietruszkę korzeniową w glebie ogrodowej oraz w glebie ogrodowej z dodatkiem kadmu o stężeniu 2 mg/kg suchej masy gleby. Oba rodzaje gleby zostały wzbogacone o kompozycję metabolitów wytwarzaną przez szczep POC9 w stosunku 7:1. Jako warianty kontrolne wykorzystano gleby wzbogacone w podłoże M-UREA. Eksperyment prowadzono przez 14 tygodni, a próbki roślin pobierano po 7 i 14 tygodniach. W pobranych próbkach roślin określono biomasę części korzeniowej oraz nadziemnej oraz procentową zawartość wody. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabelach 6, 7 i 8.

Tabela 6. Biomasa roślin - części nadziemnych oraz korzeni - wyhodowanych w czystej glebie ogrodowej. Pomiarów biomasy dokonano po 7 tygodniach uprawy (T1) oraz po 14 tygodniach (T2).

Rośliny hodowano w glebie z dodatkiem kompozycji metabolitów („Z metabolitami”) oraz bez dodatku kompozycji metabolitów („Bez metabolitów”).

Świeża masa roślin [g]
	T1 (7 tygodni)	T2 (14 tygodni)
Bez metabolitów	Z metabolitami	Bez metabolitów	Z metabolitami
Części nadziemne	0,5347	0,6735	0,5669	6,2046
Korzenie	0,0499	0,0275	0,2057	0,6475
Sucha masa roślin [g]
	T1	T2
Bez metabolitów	Z metabolitami	Bez metabolitów	Z metabolitami
Części nadziemne	0,0876	0,0879	0,1423	1,1993
Korzenie	0,0190	0,0112	0,0985	0,2737

PL 247596 Β1

Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że suplementacja gleby kompozycją metabolitów wytworzoną przez szczep POC9 w stosunku 7:1 przyczynia się w znaczący sposób do promowania wzrostu roślin (Tabela 6). Tę korelacje potwierdzają wyniki świeżej i suchej biomasy, zarówno części nadziemnej rośliny jak i części korzeniowej. Wykazano, że dodatek kompozycji metabolitów do gleby przyczynia się do zwiększenia biomasy nadziemnej części roślin już po 7 tygodniach (wzrost o ponad 20%), natomiast po 14 tygodniach ta różnica jest już ponad 10-krotna. W przypadku korzeni roślin, zaobserwowano niemal 10-krotny przyrost świeżej masy po traktowaniu gleby metabolitami w stosunku do gleby kontrolnej, jednak te różnice były widoczne dopiero po 14 tygodniach. Po 7 tygodniach nie stwierdzono większych różnic w świeżej biomasie roślin hodowanych w obu typach gleb. Podobne korelacje odnotowano w przypadku analizy suchej masy, zarówno części nadziemnych jak i korzeniowych.

Wykazano zatem, że właściwa suplementacja gleby kompozycją metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe wytwarzane przez szczep Ochrobactrum sp. POC9 w znaczącym stopniu przyczynia się do poprawy wzrostu roślin powodując przyrost biomasy części nadziemnych jak i korzeni roślin.

Tabela 7. Biomasa roślin - części nadziemnych oraz korzeni - wyhodowanych w glebie ogrodowej zanieczyszczonej kadmem. Pomiarów biomasy dokonano po 7 tygodniach uprawy (T1) oraz po 14 tygodniach (T2). Rośliny hodowano w glebie z dodatkiem kompozycji metabolitów („Z metabolitami”) oraz bez dodatku kompozycji metabolitów („Bez metabolitów”).

Świeża masa roślin [g]
	T1 (7 tygodni)	T2 (14 tygodni)
Bez metabolitów	Z metabolitami	Bez metabolitów	Z metabolitami
Części nadziemne	0,0357	0,2486	0,1327	2,0131
Korzenie	0,0034	0,0157	0,0390	0,3757
Sucha masa roślin [g]
	T1	T2
Bez metabolitów	Z metabolitami	Bez metabolitów	Z metabolitami
Części nadziemne	0,0004	0,0382	0,0373	0,3222
Korzenie	0,0002	0,0060	0,0218	0,0843

Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że suplementacja gleby zanieczyszczonej kadmem kompozycją metabolitów wytworzoną przez szczep POC9 w stosunku 7:1 przyczynia się w znaczący sposób do promowania wzrostu roślin uprawianych w środowisku zanieczyszczonym (Tabela 7). Tę korelacje potwierdzają wyniki świeżej i suchej biomasy zarówno części nadziemnej rośliny jak i części korzeniowej. Wykazano, że dodatek kompozycji metabolitów do gleby zanieczyszczonej kadmem przyczynia się do zwiększenia świeżej biomasy nadziemnej części roślin już po 7 tygodniach niemal 7-krotnie, natomiast po 14 tygodniach ta różnica jest już ponad 15-krotna. W przypadku korzeni roślin, po 7 tygodniach zaobserwowano 3-krotnie wyższą biomasę względem korzeni roślin uprawianych w glebie bez suplementacji metabolitami, natomiast po 14 tygodniach zaobserwowano już niemal 10-krotną różnicę w biomasie. Podobne korelacje odnotowano w przypadku analizy suchej masy, zarówno części nadziemnych jak i korzeniowych.

Wykazano zatem, że właściwa suplementacja gleby zanieczyszczonej kadmem kompozycją metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe wytwarzane przez szczep Ochrobactrum sp. POC9 w znaczącym stopniu przyczynia się do poprawy wzrostu roślin powodując przyrost biomasy, zarówno części nadziemnych jak i korzeni roślin.

PL 247596 Β1

Tabela 8. Procentowa zawartość wody w roślinach - w częściach nadziemnych oraz korzeniach - wyhodowanych w glebie ogrodowej niezanieczyszczonej („Gleba czysta”) oraz zanieczyszczonej kadmem („Gleba zanieczyszczona kadmem”).

Pomiarów dokonano na podstawie biomasy po 7 tygodniach uprawy (T1) oraz po 14 tygodniach (T2). Rośliny hodowano w glebie z dodatkiem kompozycji metabolitów („Z metabolitami”) oraz bez dodatku kompozycji metabolitów („Bez metabolitów”).

Gleba czysta
	T1	T2
Bez metabolitów	Z metabolitami	Bez metabolitów	Z metabolitami
Części nadziemne	84	87	74	81
Korzenie	60	61	52	58
Gleba zanieczyszczona kadmem
	T1	T2
Bez metabolitów	Z metabolitami	Bez metabolitów	Z metabolitami
Części nadziemne	86	85	72	84
Korzenie	40	62	29	77

Zwiększona zawartość wody w roślinach świadczy o jej lepszym turgorze i lepszej ogólnej kondycji. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, żesuplementacja gleby kompozycją metabolitów wytworzoną przez szczep POC9 w stosunku 7:1 przyczynia się w znaczący sposób do promowania wzrostu roślin, czego skutkiem jest zwiększona zawartość wody, zarówno w częściach nadziemnych jak i korzeniowych roślin (Tabela 8). Korelacje te zaobserwowano zarówno w przypadku roślin uprawianych w glebie ogrodowej (niezanieczyszczonej) jak i w glebie zanieczyszczonej kadmem. W przypadku gleby niezanieczyszczonej stwierdzono, że już po 7 tygodniach eksperymentu, odnotowano wyższą % zawartość wody w częściach nadziemnych roślin (o 3%), natomiast po 14 tygodniach ta różnica wynosiła już 7% na korzyść roślin uprawianych w glebie z dodatkiem kompozycji metabolitów. W przypadku korzeni, po 7 tygodniach, różnica w % zawartości wody pomiędzy wariantami badawczymi była nieznaczna, natomiast po 14 tygodniach, odnotowano wyższą % zawartość wody o 6% w przypadku roślin uprawianych w glebie z dodatkiem kompozycji metabolitów.

W przypadku gleb zanieczyszczonych kadmem, różnice w % zawartości wody pomiędzy roślinami uprawianymi w glebie bez dodatku kompozycji metabolitów a roślinami uprawianymi w glebie wzbogaconej w metabolity były jeszcze bardziej wyraźne (Tabela 8). Po 7 tygodniach eksperymentu, o ile w przypadku części nadziemnych różnica w turgorze była niewielka pomiędzy wariantami eksperymentalnymi, to w przypadku korzeni różnica była znacząca i wynosiła 22% na korzyść wariantu z kompozycją metabolitów. Po 14 tygodniach eksperymentu, różnice w turgorze roślin były jeszcze wyraźniejsze. W przypadku części nadziemnych odnotowano wyższą % zawartość wody w wariancie gleby wzbogaconej metabolitami o 12% względem wariantu kontrolnego, natomiast w przypadku korzeni ta różnica wynosiła już 48%. Oznacza to, że suplementacja gleby kompozycją metabolitów wytwarzaną przez szczep POC9 powoduje, że roślina wykazuje parametry zawartości wody niemal takie, jakby była uprawiana w glebie bez zanieczyszczeń.

Wykazano zatem, że właściwa suplementacja gleby zanieczyszczonej kadmem kompozycją metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe wytwarzane przez szczep Ochrobactrum sp. POC9 w znaczącym stopniu przyczynia się nie tylko do poprawy wzrostu roślin powodując przyrost biomasy, zarówno części nadziemnych jak i korzeni roślin, ale także powoduje znaczącą poprawę ogólnej kondycji roślin, właściwie niwelując wpływ czynnika toksycznego w postaci zanieczyszczenia kadmem.

PL 247596 Β1

Przykład 5

Zmniejszanie efektywności pobierania kadmu przez rośliny uprawne poprzez suplementację gleby kompozycją metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe, wytwarzaną przez szczep Ochrobactrum sp. POC9.

Niniejszy przykład dotyczy wpływu kompozycji metabolitów zawierającej jony amonowe i węglanowe, wytwarzanej przez szczep Ochrobactrum POC9 na efektywność pobierania kadmu przez rośliny uprawne. Ze względu na zmniejszanie mobilności kadmu oraz innych metali ciężkich w glebach poprzez suplementację gleby wspomnianą kompozycją metabolitów opisaną w Przykładzie 1 i 2, zbadano jaki wpływ ma ten proces na stopień pobierania kadmu przez rośliny uprawne. W eksperymencie, którego opis przedstawiono w Przykładzie 4, zweryfikowano tę hipotezę i zbadano całkowitą zawartość kadmu w próbkach roślin. Próbki do analiz pobrano po 7 i 14 tygodniach eksperymentu. W celu określenia całkowitego stężenia kadmu w tkankach roślin, wysuszone części nadziemne oraz korzeniowe roślin trawiono w 5 ml HNO3 (69%) w temperaturze 180°C przez 30 min. w zamkniętym układzie mikrofalowym (Milestone Ethos Plus). Strawione próbki przeniesiono do plastikowych probówek i przed pomiarem przechowywano w temperaturze poniżej 4°C. Następnie, w uzyskanych rozworach oznaczano całkowitą zawartość kadmu za pomocą atomowej spektrometrii absorpcyjnej (ASA) na spektrometrze Thermo Fisher ICE 3300 metodą płomieniową. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 9.

Tabela 9. Całkowita zawartość kadmu w nadziemnych i korzeniowych częściach roślin uprawianych w glebie zanieczyszczonej tym pierwiastkiem. Pomiarów dokonano po 7 tygodniach uprawy (T1) oraz po 14 tygodniach (T2). Rośliny hodowano w glebie z dodatkiem kompozycji metabolitów („Z metabolitami”) oraz bez dodatku kompozycji metabolitów („Bez metabolitów”).

Zawartość kadmu w roślinach [mg/kg suchej masy]
	T1	T2
	Bez metabolitów	Z metabolitami	Bez metabolitów	Z metabolitami
Części nadziemne	11,7705	3,3605	11,7865	1,5892
Korzenie	54,1519	27,7480	30,4998	7,9093

Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że suplementacja gleby kompozycją metabolitów wytwarzaną przez szczep POC9 w znaczący sposób przyczyniała się do zmniejszenia efektywności pobierania kadmu przez rośliny. Stwierdzono to na podstawie wyraźnie niższej zawartości kadmu, zarówno w nadziemnych częściach roślin jak i w ich korzeniach uprawianych w glebie wzbogaconej w kompozycję metabolitów względem gleby kontrolnej. Tę korelację zaobserwowano już po 7 tygodniach eksperymentu, która znacząco się pogłębiała po 14 tygodniach uprawy. Wykazano, że po 14 tygodniach uprawy, zawartość kadmu w części nadziemnej była 7-krotnie niższa w roślinach uprawianych w glebie z dodatkiem kompozycji metabolitów względem wariantu kontrolnego, natomiast w przypadku korzeni odnotowano ponad 4-krotnie niższą zawartość tego pierwiastka.

Wykazano zatem, że właściwa suplementacja gleby zanieczyszczonej kadmem kompozycją metabolitów zawierającą jony amonowe i węglanowe wytwarzane przez szczep Ochrobactrum sp. POC9 w znaczącym stopniu przyczynia się nie tylko do poprawy wzrostu roślin i poprawy ich ogólnej kondycji, kiedy hodowane były w glebie zanieczyszczonej kadmem, ale także przyczyniała się w znaczący sposób do zmniejszenia efektywności pobierania tego pierwiastka z gleby przez rośliny. Na tej podstawie można także wnioskować, że kompozycja metabolitów może mieć także zastosowanie do zmniejszania efektywności pobierania innych metali ciężkich przez rośliny uprawne.

Przykład 6

Zwiększenie efektywności remediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi za pomocą kompozycji metabolitów zawierającej jony amonowe i węglanowe, wytwarzanej w znany sposób przez szczep Ochrobactrum sp. POC9.

W prezentowanym przykładzie wykorzystano wyniki uzyskane w Przykładzie 3.

Efektywność mikrobiologicznej bioremediacji gruntów zanieczyszczonych związkami organicznymi jest bezpośrednio i pozytywnie związana z liczebnością oraz aktywnością mikrobioty glebowej. Odpowiednia stymulacja mikroorganizmów, np. na drodze suplementacji gruntu, wpływa na zwiększenie liczebności autochtonicznych bakterii, co skutkuje zwiększeniem tempa biodegradacji związków organicznych, które stanowią źródła ważnych biopierwiastków, np. węgla. Zwiększone tempo biodegradacji znajduje odzwierciedlenie w aktywności dehydrogenaz, ponieważ są to enzymy istotne w rozkładzie związków organicznych. Tak jak to pokazano w Przykładzie 3, suplementacja gleb zanieczyszczonych kadmem kompozycją metabolitów zawierającą jony węglanowe i amonowe wytworzoną przesz szczep POC9 wpływa zarówno na zwiększenie liczebności mikroorganizmów w gruntach, jak również stymuluje ich aktywność. Z tego względu metabolity mogą zostać zastosowane w różnych zabiegach bioremediacyjnych jako środek wspomagający efektywną biodegradację zanieczyszczeń organicznych w glebie.

Claims

1. Sposób bioremediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi i/lub poprawy jakości mikrobiologicznej gleby i/lub promowania wzrostu roślin, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bioremediacji poddaje się gleby zanieczyszczone kadmem.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bioremediacji poddaje się gleby zanieczyszczone cynkiem, niklem, ołowiem i miedzią.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlę szczepu Ochrobactrum sp. POC9 prowadzi się przez 72 godziny w temperaturze 23°C, z natlenianiem przez wytrząsanie, korzystnie przy 1500 obr./min.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie mocznika w podłożu wynosi 2%.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podłoże zawiera pepton - 1 g/l, NaCI - 5 g/l, KH2PO4 - 2 g/l, mocznik - 2%, a pH początkowe podłoża wynosi 6,8.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kompozycję metabolitów aplikuje się do gleby w proporcji objętościowej gleby do kompozycji 1:1.