PL247645B1

PL247645B1 - Zastosowanie 8-glukozydu emodyny w leczeniu raka piersi

Info

Publication number: PL247645B1
Application number: PL445383A
Authority: PL
Inventors: Anna Wawruszak; Wirginia Kukuła-Koch; Estera Okoń; Andrzej Stepulak
Original assignee: Univ Medyczny W Lublinie
Priority date: 2023-06-28
Filing date: 2023-06-28
Publication date: 2025-08-18
Also published as: PL445383A1

Abstract

Celem rozwiązania według wynalazku jest zastosowanie glikozylowanej formy emodyny o działaniu przeciwnowotworowym jako związku z grupy pochodnych antracenu w leczeniu nowotworów piersi. Istotą rozwiązania według wynalazku jest 8-glukozyd emodyny do zastosowania w leczeniu nowotworów piersi. Wynalazek daje możliwość wykorzystania przeciwnowotworowej aktywności glukozydu emodyny i stosowania go jako potencjalnego leku lub składnika preparatów farmaceutycznych w przemyśle farmaceutycznym do terapii chorych z nowotworami piersi.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie 8-glukozydu emodyny w leczeniu raka piersi.

Przeprowadzone badania dotyczą ważnego zagadnienia, jakim jest efektywna terapia raka piersi przy zastosowaniu związków pochodzenia naturalnego. W raporcie World Health Organization (WHO) podkreślono, że liczba nowozdiagnozowanych przypadków raka piersi wśród kobiet wynosiła aż 2,3 miliona w 2020 roku. W tym samym roku na nowotwór piersi chorowało ponad 7,8 miliona kobiet, a 685 tys. zmarło z jego powodu [1]. Rak piersi to główna przyczyna śmierci spośród wszystkich chorób nowotworowych, przez co stanowi on ogromny problem społeczny. W związku z powyższym jedną z kluczowych potrzeb badawczych jest zwiększenie skuteczności istniejących oraz opracowanie nowych strategii terapeutycznych mogących znaleźć zastosowanie w leczeniu raka piersi.

Obiecującą grupę związków o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym stanowią związki aktywne pochodzenia roślinnego, w tym polifenole, alkaloidy, związki z grupy polisacharydów roślinnych i inne. Charakteryzują się one często znacznie niższą toksycznością względem komórek prawidłowych niż standardowo stosowane chemioterapeutyki.

Ważną grupę wtórnych metabolitów roślinnych stanowią pochodne antracenu. Te trójcykliczne związki występują w roślinach najczęściej w postaci utlenionej - jako antrachinony. Substancje te syntetyzowane są przez rośliny z acetylokoenzymu A oraz z malonylokoenzymu A w szlaku prowadzącym do powstania poliketydów. Metabolity te są szeroko rozpowszechnione w królestwie roślin wśród gatunków reprezentujących następujące rodziny botaniczne: Polygonaceae, Rhamnaceae, Fabaceae, Rubiaceae czy Liliaceae. Spotykane są także w matrycy grzybów i u zwierząt. Wiodącą podgrupą antrazwiązków są emodyny - pochodne 1,8-dihydroksyantrachinonu, do których zalicza się badana tu pochodna: 8-glukozyd emodyny.

Istniejące dane literaturowe wskazują, że glukozyd emodyny (glikozylowana pochodna emodyny) może wykazywać działanie terapeutyczne [2] [3]. Dotychczas potwierdzono, że związek ten hamował migrację, indukował zmiany potencjału mitochondrialnego, a także zwiększał fragmentację DNA oraz ekspresję białek proapoptotycznych w innym typie nowotworu - raku płuc [3]. Brakuje jednak doniesień nad wpływem tego związku na komórki raka piersi. Aktualnie większość badań w kontekście raka piersi skupia się na aktywności samej emodyny [4] [5] natomiast wciąż brakuje doniesień na temat działania jej glikozylowanej formy.

Celem rozwiązania według wynalazku jest zastosowanie glikozylowanej formy emodyny z grupy pochodnych antracenu jako związku o działaniu przeciwnowotworowym. Okazało się, że substancja ta może być stosowana jako lek lub istotny składnik preparatów w przemyśle farmaceutycznym w terapii chorych cierpiących na raka piersi.

Istotą rozwiązania według wynalazku jest 8-glukozyd emodyny o wzorze, jak przedstawiono poniżej, do zastosowania w leczeniu nowotworów piersi.

W korzystnym wykonaniu rakiem piersi jest luminalny rak piersi typu A albo potrójnie negatywny rak piersi.

Zaletą rozwiązania według wynalazku jest możliwość wykorzystania przeciwnowotworowej aktywności 8-glukozydu emodyny i stosowania go jako potencjalnego leku lub składnika preparatów w przemyśle farmaceutycznym w terapii chorych z nowotworami piersi.

W związku z powyższym autorzy osiągnięcia przeprowadzili po raz pierwszy badania przeciwnowotworowej aktywności 8-glukozydu emodyny w modelach in vitro raka piersi, tj. liniach komórkowych T47D (HTB-133™) i MCF7 (HTB-22™) podtypu luminalnego A, a także podtypu potrójnie negatywnego raka piersi, tj. liniach komórkowych MDA-MB-468 (HTB-132™) oraz BT549 (HTB-122™). Żywotność komórek nowotworowych raka piersi traktowanych 8-glukozydem emodyny została oceniona w testach CellTiter-Glo® oraz MTT ((4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), z kolei proliferacja komórek nowotworowych w teście ELISA BrdU (bromodeoxyuridine).

Materiał biologiczny

Materiał do badań stanowiły linie komórkowe T47D (ATCC® HTB-133™), MCF7 (ATCC® HTB-22™) raka piersi podtypu luminalnego A, a także linie MDA-MB-468 (ATCC® HTB-132™) oraz BT549 (ATCC® HTB-122™) potrójnie negatywnego raka piersi uzyskane z kolekcji szczepów ATTC (American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA)). Komórki nowotworowe utrzymywano w pożywce hodowlanej DMEM/HAM F12 (Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO, USA), wzbogaconej o płodową surowicę bydlęcą (10% FBS, Sigma-Aldrich) oraz antybiotyki: penicylinę - 100 IU/ml i streptomycynę 100 μg/ml (Sigma-Aldrich).

a) Ocena żywotności komórek raka piersi w teście MTT

Żywotność komórek nowotworowych raka piersi traktowanych 8-glukozydem emodyny oceniono eksperymentalnie za pomocą testu MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy). W tym celu komórki nowotworowe linii T47D, MCF7, MDA-MB-468 oraz BT549 w ilości 2 x 10⁴/ml wysiano na płytki 96-dołkowe, a następnie traktowano 8-glukozydem emodyny (5-200 μM) przez 96 godzin. Następnie komórki inkubowano przez 3 godziny z roztworem MTT (5 mg/ml, Sigma-Aldrich). W tym czasie MTT metabolizowany był przez żywe komórki do purpurowych kryształów formazanu, które później rozpuszczano w buforze SDS (10% SDS w 0,01 N HCl). Absorbancję powstałego produktu mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika płytek Infinite M200 Pro (Tecan, Mannedorf, Szwajcaria).

Wyniki

8-Glukozyd emodyny hamował w sposób dawkozależny w teście MTT żywotność wszystkich analizowanych komórek raka piersi (zarówno podtypu luminalnego A, jak też potrójnie negatywnego raka piersi) w dawkach 5-200 μM. Największą aktywność wykazywał w stosunku do komórek linii MDA-MB-468 raka potrójnie negatywnego gdzie IC50 (stężenie hamujące wzrost komórek w 50%) wynosiło 20,24 μM. IC50 dla komórek linii T47D, MCF7 oraz BT549 wynosiło odpowiednio 24,97 μM, 28,16 μM oraz 30,2 μM.

Na rysunku na Fig. 1 wskazano wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μM) na żywotność komórek linii T47D raka piersi po 96 godzinach inkubacji w teście MTT. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Zaś na Fig. 2. wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μM) na żywotność komórek linii MCF7 raka piersi po 96 godzinach inkubacji w teście MTT. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Natomiast na Fig. 3. przedstawiono wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μM) na żywotność komórek linii MDA-MB-468 raka piersi po 96 godzinach inkubacji w teście MTT. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Z kolei na Fig. 4. Wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μM) na żywotność komórek linii BT549 raka piersi po 96 godzinach inkubacji w teście MTT. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

b) Ocena żywotności komórek raka piersi w teście CellTiter-Glo®

Zahamowanie żywotności komórek raka piersi traktowanych 8-glukozydem emodyny oceniono eksperymentalnie za pomocą testu CellTiter-Glo®. CellTiter-Glo® to luminescencyjny test żywotności komórek ocenianych w oparciu o ilościowe oznaczenie ATP (adenozynotrifosforan) będącego wskaźnikiem aktywnych metabolicznie komórek. Zawiesinę komórek nowotworowych linii T47D, MCF7, MDA-MB-468 oraz BT549 w ilości 2 x 10⁴/ml wylano na płytki 96-dołkowe, po czym traktowano 8-glukozydem emodyny w zakresie stężeń 1-150 μM przez 48 godzin. Następnie dodano po 100 μl na dołek reagenta CTG, wytrząsano przez 2 minuty oraz inkubowano przez 15 minut. Luminescencję powstałego produktu mierzono przy 1/minutę za pomocą czytnika płytek Infinite M200 Pro (Tecan).

Wyniki

8-Glukozyd emodyny w dawkach 1-150 μΜ hamował w sposób dawkozależny żywotność wszystkich analizowanych komórek nowotworowych raka piersi w teście CellTiter-Glo® hamując produkcję ATP w komórkach.

Na rysunku na Fig. 5. przedstawiono wpływ 8-glukozydu emodyny (1-100 μΜ) na żywotność komórek linii T47D raka piersi po 96 godzinach inkubacji w teście CellTiter-Glo®. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Zaś na Fig. 6. wpływ 8-glukozydu emodyny (1-100 μΜ) na żywotność komórek linii MCF7 raka piersi po 96 godzinach inkubacji w teście CellTiter-Glo®. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Natomiast na Fig. 7. przedstawiono wpływ 8-glukozydu emodyny (1-75 μΜ) na żywotność komórek linii MDA-MB-468 raka piersi po 96 godzinach inkubacji w teście CellTiter-Glo®. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Z kolei na Fig. 8. wpływ 8-glukozydu emodyny (1-75 μΜ) na żywotność komórek linii BT549 raka piersi po 96 godzinach inkubacji w teście CellTiter-Glo®. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

c) Ocena zahamowania proliferacji komórek raka piersi w teście ELISA BrdU

Zahamowanie proliferacji komórek raka piersi traktowanych 8-glukozydem emodyny oceniono eksperymentalnie za pomocą testu ELISA BrdU. Test BrdU polega na pomiarze inkorporacji znakowanego nukleozydu bromodeoksyurydyny (BrdU) do nowopowstającej nici DNA dzielących się komórek. Poziom wbudowanej BrdU oceniono kolorymetrycznie dokonując pomiaru barwnego produktu powstałego na skutek reakcji enzymatycznej z substratu - tetrametylobenzydyny (TMB). Komórki linii T47D, MCF7, MDA-MB-468 oraz BT549 o gęstości 2x104 wylano na płytkę 96-dołkową (100 μl/dołek), a następnie inkubowano 24 godziny w temperaturze 37°C. Po tym czasie podłoże hodowlane usunięto, a komórki traktowano 8-glukozydem emodyny w zakresie stężeń 5-200 μM, po czym przeprowadzono komercyjny test Cell Proliferation ELISA BrdU Kit (Roche, Bazylea, Szwajcaria) zgodnie z instrukcją producenta. Pomiaru absorbancji dokonano przy użyciu Infinite Μ200 Pro plate reader przy długości fali 450 nm (Tecan).

Wyniki

8-Glukozyd emodyny w dawkach 5-200 μΜ hamował w sposób dawkozależny proliferację wszystkich analizowanych komórek nowotworowych układu nerwowego w teście Cell Proliferation ELiSa BrdU Kit (Roche). W przypadku linii komórkowej T47D, MCF7 oraz BT549 istotność statystyczną uzyskano przy stężeniach 50, 100, 200 μM. Z kolei w przypadku linii MDA-MB-468 jedynie w przypadku stężeń 100 i 200 gM.

Na rysunku na Fig. 9. przedstawiono wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μΜ) na proliferację komórek linii T47D po 96 godzinach inkubacji w teście BrdU. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p 0,01, *** p < 0,001. Zaś na Fig. 10. wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μΜ) na proliferację komórek linii MCF7 po 96 godzinach inkubacji w teście BrdU. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Natomiast na Fig. 11. przedstawiono wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μΜ) na proliferację komórek linii MDA-MB-468 po 96 godzinach inkubacji w teście BrdU. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Z kolei na Fig. 12. wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μΜ) na proliferację komórek linii BT549 po 96 godzinach inkubacji w teście BrdU. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Wnioski

8-Gluzkozyd emodyny hamuje żywotność komórek nowotworowych raka piersi linii T47D (ATCC® HTB-133™) oraz MCF7 (ATCC® HTB-22™) podtypu luminalnego A, a także linii komórkowych MDA-MB-468 (ATCC® HTB-132™) oraz BT549 (ATCC® HTB-122™) potrójnie negatywnego raka piersi w testach MTT oraz CellTiter-Glo®, a także proliferację komórek nowotworowych w teście ELISA BrDU (bromodeoxyuridine) w badanym zakresie stężeń, tj. 5-200 pM. Wykazanie przeciwnowotworowej aktywności 8-glukozydu emodyny daje możliwość wykorzystania tego związku w przyszłości jako potencjalnego leku lub składnika preparatów farmaceutycznych w przemyśle farmaceutycznym do terapii chorych z luminalnym lub potrójnie negatywnym rakiem piersi.

Uzyskane wyniki pozwalają na potwierdzenie działania przeciwnowotworowego 8-glukozydu emodyny w modelach in vitro raka piersi i kwalifikację do dalszych badań farmakologicznych.

Literatura

[1] https ://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/breast-cancer

[2] Lee W, Ku SK, Lee D et al. Emodin-6-O-e-D-glucoside inhibits high-glucose-induced vascular inflammation. Inflammation. 2014; 37(2):306-313.

[3] Kim HJ, Choi JW, Lim JS et al. Aloe emodin 3-O-glucoside inhibits cell growth and migration and induces apoptosis of non-small-cell lung cancer cells via suppressing MEK/ERK and Akt signalling pathways. Life Sci. 2022; 1;300:120495.

[4] Zou G, Zhang X, Wang L et al. Herb-sourced emodin inhibits angiogenesis of breast cancer by targeting VEGFA transcription. Theranostics. 2020;10(15):6839-6853.

[5] Liu Q, Hodge J, Wang J et al. Emodin reduces Breast Cancer Lung Metastasis by suppressing Macrophage-induced Breast Cancer Cell Epithelial-mesenchymal transition and Cancer Stem Cell formation. Theranostics. 2020; 10( 18):8365-8381.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. 8-Glukozyd emodyny do zastosowania w leczeniu raka piersi.
2. 8-Glukozyd emodyny do zastosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że rakiem piersi jest luminalny rak piersi typu A albo potrójnie negatywny rak piersi.