PL247857B1 - Sposób wytwarzania materiału polisacharydowego do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania materiału polisacharydowego do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych, który polega na tym, że sporządza się mieszaninę składników w postaci gumy gellan, fosfatazy alkalicznej i chlorku wapnia. Najpierw przygotowuje się roztwór gumy gellan poprzez rozpuszczanie jej w wodzie w temperaturze powyżej 90°C przez co najmniej 30 minut, w takiej ilości, aby jej końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło od 0,4 do 1,6% wagowych. Następnie roztwór ten chłodzi się do temperatury 50 - 65°C i dodaje do niego roztwór wodny fosfatazy alkalicznej w takiej ilości, aby jej końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło od 0,1 do 5 mg/ml po czym dodaje się roztwór chlorku wapnia podgrzany do takiej samej temperatury, do jakiej został schłodzony roztwór gumy gellan, w takiej ilości, aby jego końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło 0,01 do 0,06% wagowych. Po wymieszaniu składniki wlewa do cylindrycznej zamykanej formy oraz pozostawia do żelowania w temperaturze poniżej 20°C przez 5 - 30 min. Wytworzony materiał hydrożelowy razem z formą, w której się znajduje, zanurza się w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia o stężeniu 0,5 - 2,5% wagowych, przy czym otwiera się formę z jednej strony i prowadzi proces mineralizacji od 1 do 7 dni. Wytworzony materiał inkubuje się w wodzie destylowanej, aż do usunięcia produktów ubocznych reakcji oraz pozostałości substratu, przy czym cały proces prowadzi się w warunkach sterylnych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania materiału polisacharydowego do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych, przeznaczonego do regeneracji ubytków w obszarze obejmującym zarówno chrząstkę jak i kość. Materiał ten zawiera część zmineralizowaną mającą za zadanie integrować się z tkanką kostną oraz część niezmineralizowaną umożliwiającą regenerację chrząstki.

Uszkodzenia i zwyrodnienia chrząstki są jednym z głównych wyzwań ortopedii. Na świecie wykonuje się rocznie 1,2 mln zabiegów leczenia chrząstki. Szacuje się, że rynek globalny związany z naprawą chrząstki wynosił w roku 2017 9,5 mld dolarów a do roku 2025 osiągnie wartość 14,7 mld dolarów (wg Transparency Market Research). Ze statystyk wynika, że w Polsce zwyrodnienie stawów dotyka blisko 2 mln osób.

Popularna technika leczenia ubytków kostno-chrzęstnych obejmuje stymulację komórek szpiku kostnego poprzez nawiercanie otworów dochodzących do kości podchrzęstnej lub wytworzenie mikrozłamań. Spontaniczna regeneracja po takim zabiegu skutkuje zazwyczaj wytworzeniem tkanki włóknistej o słabych właściwościach biomechanicznych, co prowadzi do postępu zwyrodnienia.

Do metod leczenia zalicza się także przeszczepy autologiczne i allogenicznie. Przeszczepy autologiczne fragmentu kostno-chrzęstnego (OAT - ang. osteochondral autograft transfer), polegają na pobraniu cylindrycznych fragmentów chrząstki wraz z kością podchrzęstną z obszarów, które nie są objęte zwyrodnieniem (najczęściej niepoddawanych obciążeniu fragmentów kości udowej) i przeniesieniu ich w obręb defektu. Ograniczeniem przeszczepów autologicznych jest konieczność uszkodzenia tkanek w obszarze, z którego pobierany jest przeszczep. Ograniczaniem przeszczepów allogenicznych jest natomiast ryzyko przeniesienia chorób oraz odrzucenia przeszczepu.

Stosuje się także przeszczepy autologiczne komórek chrzęstnych (chondrocytów). Procedura polega na pobraniu fragmentu tkanki chrzęstnej z mało obciążonego obszaru i wyizolowaniu z niej chondrocytów. Następnie komórki te są namnażane w warunkach in vitro przez okres 2-3 tygodni, po czym implantowane są w obręb ubytku i zamykane łatką z okostnej pobranej z górnego fragmentu kości piszczelowej.

Wzrastające zapotrzebowanie kliniczne na nowe metody leczenia uszkodzeń kostno-chrzęstnych, znajduje swoje odbicie w coraz większej liczbie publikacji i patentów. Opisywane w nich metody łączą ze sobą użycie biomateriału (rusztowania), komórek oraz specyficznych związków biologicznie aktywnych np. czynników wzrostu.

Połączenie kostno-chrzęstne ma zróżnicowaną budowę, zmieniającą się w sposób ciągły od elastycznej tkanki chrzęstnej zawierającej kolagen i glikozaminoglikany wytwarzane przez chondrocyty, do sztywnej, zmineralizowanej tkanki kostnej, która składa się głównie z kolagenu i hydroksyapatytu. Taka budowa zapewnia właściwe z punktu widzenia biomechanicznego przenoszenie naprężeń w obszarach poddawanych dynamicznym obciążeniom i powinna być odwzorowana przez materiały implantacyjne używane do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych. Materiały do leczenia ubytków kostno-chrzęstnych powinny swoją budową przypominać naturalne struktury tkankowe a ponadto modyfikuje się je substancjami zapewniającymi właściwą odpowiedź biologiczną.

Częstym postępowaniem w przypadku leczenia ubytków kostno-chrzęstnych jest naniesienie chondrocytów na część porowatego rusztowania odpowiadającego chrząstce zaraz przed implantacją.

Między innymi w publikacji Guo X, Wang C, Di in. pt.: Repair of osteochondral defects with autologous chondrocytes seeded onto bioceramic scaffoldin sheep, Tissue Eng. 2004; 10 (11-12): 1830-40, opisano testy wykonywane z użyciem rusztowania z porowatego β-TCP z naniesionymi autologicznymi chondrocytami pobranymi z główki kości udowej owcy. Po 24 tygodniach od wszczepienia doszło do utworzenia nowej niedojrzałej tkanki chrzęstnej na powierzchni rusztowania.

Zgłoszenie patentowe US20060036331 A1 dotyczy materiałów do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych zawierających chondrocyty. Materiały te są zbudowane z trzech warstw: z hydrożelu agarozowego (2%), z warstwy zbudowanej z mikrosfer PLAGA-BG (polilaktyd-co-glikolid + bioszkło) zawieszonych w hydrożelu oraz z warstwy zbudowanej z samych mikrosfer PLAGA-BG. Hydrożel wraz z chondrocytami w ilości 60 χ 106 komórek/ml zostaje zintegrowany z częścią kostną w formie. Następnie na część kostną, porowatą, pozbawioną hydrożelu nanoszone są komórki kostne (osteoblasty).

W patencie US8641774 B2 opisano metodę wytworzenia konstruktu poprzez użycie porowatego rusztowania z komórkami, w które wtłaczany jest hydrożel. Powoduje to mechaniczne zakleszczenie części chrzęstnej zbudowanej z hydrożelu w porowatej części kostnej. Patent ujawnia także procedurę leczenia ubytku kostnego z użyciem wytworzonego rusztowania.

W zgłoszeniu US20170112961 A1 dotyczącym produktu do regeneracji ubytków chrzęstnych ujawniono metodę wytwarzania materiału składającego się z matakrylowanej gumy gellan (o stopniu metakrylacji 1,5 do 6%) połączonego z komórkami chrzęstnymi oraz roztworem fizjologicznym, który może być aplikowany w operacjach leczenia ubytków chrząstki.

W patencie US9155818B2 ujawniono wynalazek, który dotyczy wielowarstwowej (do 10 warstw) struktury kostno-chrzęstnej składającej się z kolagenu i kolagenu zawierającego cząstki hydroksyapatytu. Górne warstwy struktury zostały zbudowane z samego kolagenu, a w kolejnych dolnych warstwach kolagenu zwiększała się zawartość cząstek hydroksyapatytu. Do łączenia warstw i jednoczenie sieciowania kolagenu używano aldehydu glutarowego oraz bis-epoksydów.

Opis patentowy US8613943 B2 odnosi się do metody wytwarzania wielowarstwowego rusztowania kolagenowego, przeznaczonego do leczenia ubytków kostno-chrzęstnych. Metoda polega na wytworzeniu roztworu kolagenu, wylaniu go do formy i jego liofilizacji. W ten sposób otrzymywana jest pierwsza warstwa. Po uwodnieniu na warstwę nanoszona jest kolejna porcja roztworu kolagenu i proces liofilizacji jest powtarzany kilkukrotnie.

Przedmiotem wynalazku PL210783 B1 jest wyrób wszczepialny do naprawy chrząstki metodą implantacji u zwierzęcia, charakteryzujący się tym, że zawiera macierz nośnikową, komórki chrzęstne i spoiwo biokompatybilne, korzystnie autologiczną fibrynę, przylegające do brzegu macierzy nośnikowej. W korzystnym rozwiązaniu macierz nośnikowa jest elementem w kształcie arkusza i jest wytworzona z kolagenu.

Z opisu patentowego PL216702 B1 znany jest sposób wytwarzania biomateriału o właściwościach chrząstki, przeznaczonego na implanty dla chirurgii rekonstrukcyjno-odtwórczej, który polega na tym, że celulozę mikrobiologiczną wytworzoną w hodowli stacjonarnej bakterii Gluconacetobacter xylinus prowadzonej w płaskim bioreaktorze lub w rurkach polietylenowych, po oddzieleniu od cieczy pohodowlanej i oczyszczeniu, modeluje się w konstrukcję przestrzenną o pożądanym kształcie i poddaje modyfikacji polegającej na działaniu 30% wodnym roztworem ługu sodowego, płukaniu w wodzie destylowanej, następnie działaniu 10% wodnym roztworem kwasu octowego i powtórnym płukaniu w wodzie destylowanej, aż do uzyskania przez materiał celulozowy pH 5,6-6,8.

Z publikacji K. Pietryga i in., „The influence of mineralization conditions on the effectiveness of enzymatic mineralization of hydrogels”, Engineering of Biomaterials 131 (2015) 2-7 (D1), znany jest sposób wytwarzania materiału polisacharydowego do leczenia ubytków kostnych, polegający na mineralizacji enzymatycznej hydrożelu z gumy gellan, w celu poprawy jego sztywności i wytrzymałości. Celem badań opisanych w publikacji było uzyskanie monolitycznych, zmineralizowanych próbek o wysokiej zawartości fosforanu wapnia. Proces polegał na tym, że sporządzono mieszaninę składników w postaci gumy gellan (GG), fosfatazy alkalicznej (ALP) i chlorku wapnia (CaCL). Roztwór GG przygotowano poprzez rozpuszczanie jej w wodzie w temperaturze 90°C, przez co najmniej 30 minut. Następnie roztwór ten schłodzono do temperatury 50°C i dodano do niego roztwór wodny ALP oraz roztwór CaCl2 podgrzany do takiej samej temperatury, do jakiej został schłodzony roztwór GG. Po wymieszaniu, wszystkie składniki wlano do formy oraz pozostawiono do żelowania, po czym próbki w całości zanurzono w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia (CaGP). W czasie procesu mineralizacji po 1, 3 i 5 dniu wymieniano roztwór wodny CaGP na świeży. Mineralizacja enzymatyczna przy użyciu fosfatazy alkalicznej (ALP) przypomina naturalne procesy zachodzące podczas gojenia się kości. Badania wykazały, że proces mineralizacji zachodził na całej powierzchni próbki i postępował do jej wnętrza, przy czym był niejednorodny i powierzchnia materiału mineralizowała się silniej niż jego wnętrze, a dla dużych stężeń ALP obserwowano blokowanie procesu.

Znane ze stanu techniki metody wytwarzania materiałów przeznaczonych do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych posiadają pewne niedogodności, takie jak np. skomplikowana procedura przygotowania wielowarstwowych rusztowań oraz konieczność chemicznego lub mechanicznego łączenia obu warstw, czy też trudności w kontrolowaniu procesu mineralizacji w hydrożelu. Użycie substancji chemicznych może niekorzystnie wpływać na biozgodność materiału, a łączenie mechaniczne warstw przez zakleszczenie może powodować ryzyko delaminicji na granicy faz po implantacji. Słabe połączenie warstw jest czynnikiem niesprzyjającym prawidłowemu wytworzeniu ściśle do siebie przylegających substytutów tkanek. Z drugiej strony materiały jednowarstwowe nie odzwierciedlają swoją budową połączenia chrzęstno-kostnego, przez co nie stwarzają wystarczających warunków do leczenia ubytków kostno-chrzęstnych. Z kolei dodatki w postaci modyfikujących cząstek mineralnych takich jak hydroksyapatyt, mogą wpływać niekorzystnie na wytrzymałość materiału.

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania materiału polisacharydowego do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych, odzwierciedlającego swoją budową połączenie kostno-chrzęstne, który zawiera część zmineralizowaną przeznaczoną do integrowania się z tkanką kostną oraz część J Ł (I i \J i i i i niezmineralizowaną umożliwiającą regenerację chrząstki. Sposób jest pozbawiony niedogodności wskazanych w ww. stanie techniki i nie wymaga ani użycia klejących substancji chemicznych, ani łączenia mechanicznego do połączenia obu ww. części.

Istota sposobu wytwarzania materiału polisacharydowego do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych, posiadającego część zmineralizowaną przeznaczoną do integrowania się z tkanką kostną oraz część niezmineralizowaną umożliwiającą regenerację chrząstki, polegającego na tym, że sporządza się mieszaninę składników w postaci gumy gellan, fosfatazy alkalicznej i chlorku wapnia, przy czym najpierw przygotowuje się roztwór gumy gellan poprzez rozpuszczanie jej w wodzie w temperaturze powyżej 90°C przez co najmniej 30 minut, następnie roztwór ten chłodzi się do temperatury 50-65°C i dodaje do niego roztwór wodny fosfatazy alkalicznej, po czym dodaje się roztwór chlorku wapnia podgrzany do takiej samej temperatury, do jakiej został schłodzony roztwór gumy gellan, miesza wszystkie składniki, wlewa do formy oraz pozostawia do żelowania, po czym próbki zanurza w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia, a w czasie procesu mineralizacji po 1 i 3 dniu wymienia się roztwór wodny glicerofosforanu wapnia na świeży, charakteryzuje się tym, że mieszanina zawiera gumę gellan w takiej ilości, aby jej końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło od 0,4 do 1,6% wagowych, roztwór wodny fosfatazy alkalicznej w takiej ilości, aby jej końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło od 0,1 do 5 mg/ml oraz roztwór chlorku wapnia w takiej ilości, aby jego końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło 0,01 do 0,06% wagowych. Wszystkie składniki miesza się w czasie nie przekraczającym 1 minutę, po czym wlewa do cylindrycznej zamykanej formy oraz pozostawia do żelowania w temperaturze poniżej 20°C przez 5-30 min. Wytworzony materiał hydrożelowy razem z formą, w której się znajduje, zanurza się w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia o stężeniu 0,5-2,5% wagowych, przy czym otwiera się formę z jednej strony i prowadzi proces mineralizacji od 1 do 7 dni, uzyskując materiał polisacharydowy, z jednej strony zmineralizowany wydzieleniami fosforanów wapnia powstałymi na skutek rozkładu glicerofosforanu wapnia pod wpływem fosfatazy alkalicznej, przeznaczony do integrowania się z tkanką kostną oraz z drugiej strony niezmineralizowany, umożliwiający regenerację chrząstki, który to materiał inkubuje się w wodzie destylowanej, aż do usunięcia produktów ubocznych reakcji oraz pozostałości substratu, przy czym cały proces prowadzi się w warunkach sterylnych.

Korzystnie stosuje się roztwór chlorku wapnia w takiej ilości, aby jego końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło 0,02 do 0,05% wagowych.

Korzystnie proces żelowania prowadzi się w temperaturze 4°C.

Korzystnie forma jest w postaci płytki zawierającej cylindryczne dołki i po napełnieniu mieszaniną składników przykrywa się ją sztywną płaską płytką, którą przed procesem mineralizacji zdejmuje się.

Najlepiej, gdy płytkę zanurza się w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia w ułożeniu do góry dnem.

Korzystnie forma jest w postaci strzykawki, którą napełnia się mieszaniną składników, a przed procesem mineralizacji usuwa ściankę strzykawki od strony mocowania igły.

Sposób wytwarzania materiału polisacharydowego do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych pozwala uzyskać jeden produkt, który jednocześnie zawiera część zmineralizowaną mającą za zadanie integrować się z tkanką kostną oraz część niezmineralizowaną umożliwiającą regenerację chrząstki. Wytworzenie części zmineralizowanej opiera się na procesie mineralizacji enzymatycznej, w której fosfataza alkaliczna (ALP, z ang. alkaline phosphatase) rozkłada dyfundujący do hydrożelu glicerofosforan wapnia (CaGP), przez co tworzą się wydzielenia fosforanu wapnia wewnątrz hydrożelu. Ponadto dyfuzja CaGP zostaje ograniczona przestrzennie dzięki zastosowaniu otwartej tylko z jednej strony formy, w której przeprowadzany jest proces mineralizacji hydrożelu. Mineralizacji ulega część hydrożelu sąsiadująca z roztworem CaGP a fragment hydrożelu znajdujący się głębiej w formie nie ulega mineralizacji.

Uzyskany dwufunkcyjny materiał nie wymaga chemicznego, czy też mechanicznego łączenia części znajdujących się na jego dwóch końcach, przeznaczonych do stosowania dla obu rodzajów tkanki, każdy innej, ani stosowania modyfikujących cząstek mineralnych, jak ma to miejsce w wielu dotychczas stosowanych metodach znanych ze stanu techniki. Dzięki temu nie występuje problem ewentualnego rozwarstwienia materiału w czasie oraz po implantacji. Materiał ten zapewnia ścisły kontakt w obszarze obejmującym zarówno tkankę kostną jak i chrzęstną, co ma korzystny wpływ na proces regeneracji.

Dodatkowo materiał jest elastyczny, przez co łatwo dopasowuje się do miejsca ubytku.

Sposób wytwarzania materiału polisacharydowego do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych, według wynalazku, objaśniono poniżej w praktycznych przykładach realizacji oraz na załączonym rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat procesu mineralizacji enzymatycznej materiału hydrożelowego, a fig. 2 - materiał polisacharydowy wytworzony sposobem według wynalazku, w ujęciu schematycznym.

Przykładów tych nie należy uważać za ograniczające istotę lub zawężające zakres ochrony, gdyż stanowią one jedynie ilustrację wynalazku.

Przykład 1

W pierwszej kolejności sporządzono mieszaninę zawierającą gumę gellan, fosfatazę alkaliczną i chlorek wapnia.

W tym celu przygotowano roztwór gumy gellan (Gelzan G1910, Sigma) poprzez rozpuszczenie jej w wodzie w temperaturze 90°C przez 30 minut, w takiej ilości, aby końcowe stężenie gumy gellan w mieszaninie wynosiło 0,7% wagowych.

Uzyskany roztwór gumy gellan schłodzono do temperatury 65°C i dodano do niego roztwór wodny fosfatazy alkalicznej (ALP, P7640 Sigma, izolowana ze śluzówki jelita cielęcego) w takiej ilości, aby jej końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło od 0,5 mg/ml.

Następnie dodano roztwór chlorku wapnia podgrzany do temperatury 65°C, w takiej ilości, aby jego końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło 0,03% wagowego.

Wszystkie składniki wymieszano w czasie 20 sekund, po czym wlano przy pomocy pipety automatycznej o pojemności 10 ml do cylindrycznej formy w postaci płytki zawierającej 48 cylindrycznych dołków, każdy o wymiarach: średnica d = 11 mm, wysokość h = 3,6 mm i przykryto szklaną płytką oraz pozostawiono do żelowania w temperaturze poniżej 4°C przez 10 min.

Po tym czasie zdjęto płytkę, a wytworzony materiał hydrożelowy razem z formą, w której się znajdował, zanurzono w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia (CaGP, G6626, Sigma) o stężeniu 2,1% wagowych znajdującym się w kuwecie o pojemności 200 ml zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne. Płytkę układano do góry dnem na podstawkach o wysokości 1 cm (aby nie dotykała mieszadła) i prowadzono proces mineralizacji w temperaturze pokojowej przez 3 dni, przy czym po 1 dniu wymieniono roztwór wodny glicerofosforanu wapnia na świeży.

Proces mineralizacji zobrazowano na fig. 1, gdzie 1 oznacza roztwór substratu CaGP, 2 - hydrożel niezmineralizowany, a 3 - wydzielenia mineralne fosforanu wapnia.

W procesie mineralizacji, CaGP dyfunduje do środka żelu, po czym zachodzi reakcja enzymatyczna (defosforylacja) z udziałem znajdującego się w hydrożelu ALP. W wyniku reakcji defosforylacji z substratu odłącza się grupa ortofosforanowa, która wraz ze znajdującymi się w hydrożelu jonami Ca²⁺ tworzy osad (wydzielenia) fosforanów wapnia. Produktem ubocznym jest glicerol dyfundujący na zewnątrz.

Po zakończeniu procesu mineralizacji, płytkę inkubowano w wodzie destylowanej przez czas 24 h do usunięcia produktów ubocznych reakcji oraz pozostałości substratu. Cylindryczne hydrożele usuwano z formy poprzez wypchnięcie sprężonym powietrzem stosując sterylną igłę i strzykawkę. Igłę wprowadzano do samego dna dołka w miejscu styku próbki i ścianki dołka. Cały proces prowadzono w warunkach sterylnych.

Uzyskano materiał polisacharydowy, z jednej strony zmineralizowany wydzieleniami fosforanów wapnia powstałymi na skutek rozkładu glicerofosforanu wapnia pod wpływem fosfatazy alkalicznej, przeznaczony do integrowania się z tkanką kostną oraz z drugiej strony niezmineralizowany, umożliwiający regenerację chrząstki, który w ujęciu schematycznym przedstawiono na fig. 2, gdzie 2 oznacza hydrożel niezmineralizowany, 3 - wydzielenia mineralne fosforanu wapnia, a 4 - hydrożel zmineralizowany.

Głębokość wytworzonej części zmineralizowanej wynosiła około 5 mm, a zawartość fazy mineralnej stanowi około 2,5% masy hydrożelu.

Przykład 2

W pierwszej kolejności sporządzono mieszaninę zawierającą gumę gellan, fosfatazę alkaliczną i chlorek wapnia.

W tym celu przygotowano roztwór gumy gellan (Gelzan G1910, Sigma) poprzez rozpuszczenie jej w wodzie w temperaturze 90°C przez 30 minut, w takiej ilości, aby jej końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło 1,6% wagowych.

Uzyskany roztwór gumy gellan schłodzono do temperatury 65°C i dodano do niego roztwór wodny fosfatazy alkalicznej (ALP, P7640 Sigma, izolowana ze śluzówki jelita cielęcego) w takiej ilości, aby jej końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło 0,1 mg/ml.

Następnie dodano roztwór chlorku wapnia podgrzany do temperatury 65°C, w takiej ilości, aby jego końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło 0,03% wagowego.

Wszystkie składniki wymieszano w czasie 20 sekund, po czym roztworem napełniono strzykawki o nominalnej objętości 10 ml do objętości 5 ml i pozostawiono do żelowania w temperaturze poniżej 4°C przez 30 min. Następnie przy pomocy skalpela usunięto ściankę strzykawki od strony mocowania igły, pozostawiając wyeksponowaną powierzchnię hydrożelu. Materiał hydrożelowy razem z formą w postaci strzykawki, zanurzono w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia (CaGP, G6626, Sigma) o stężeniu 2,1% wagowych znajdującym się w sterylnym zakręcanym pojemniku o pojemności 50 ml. Strzykawkę ułożono do dołu odsłoniętą powierzchnią hydrożelu jednak pod takim kątem, aby hydrożel nie dotykał dna i aby o dno opierała się ścianka strzykawki. Proces mineralizacji prowadzono w warunkach sterylnych, pod komorą laminarną, w temperaturze pokojowej przez 7 dni, bez mieszania. Po 1 i 3 dniu wymieniono roztwór wodny glicerofosforanu wapnia na świeży.

Po zakończeniu procesu mineralizacji, materiał inkubowano w wodzie destylowanej przez czas 24 h do usunięcia produktów ubocznych reakcji oraz pozostałości substratu.

Uzyskano materiał polisacharydowy, z jednej strony zmineralizowany wydzieleniami fosforanów wapnia powstałymi na skutek rozkładu glicerofosforanu wapnia pod wpływem fosfatazy alkalicznej, przeznaczony do integrowania się z tkanką kostną oraz z drugiej strony niezmineralizowany, umożliwiający regenerację chrząstki.

Głębokość wytworzonej części zmineralizowanej wynosiła około 1 mm, a zawartość fazy mineralnej stanowi około 5% masy hydrożelu.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania materiału polisacharydowego do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych, posiadającego część zmineralizowaną przeznaczoną do integrowania się z tkanką kostną oraz część niezmineralizowaną umożliwiającą regenerację chrząstki, polegający na tym, że sporządza się mieszaninę składników w postaci gumy gellan, fosfatazy alkalicznej i chlorku wapnia, przy czym najpierw przygotowuje się roztwór gumy gellan poprzez rozpuszczanie jej w wodzie w temperaturze powyżej 90°C przez co najmniej 30 minut, następnie roztwór ten chłodzi się do temperatury 50-65°C i dodaje do niego roztwór wodny fosfatazy alkalicznej, po czym dodaje się roztwór chlorku wapnia podgrzany do takiej samej temperatury, do jakiej został schłodzony roztwór gumy gellan, miesza wszystkie składniki, wlewa do formy oraz pozostawia do żelowania, po czym próbki zanurza w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia, a w czasie procesu mineralizacji po 1 i 3 dniu wymienia się roztwór wodny glicerofosforanu wapnia na świeży, znamienny tym, że mieszanina zawiera gumę gellan w takiej ilości, aby jej końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło od 0,4 do 1,6% wagowych, roztwór wodny fosfatazy alkalicznej w takiej ilości, aby jej końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło od 0,1 do 5 mg/ml oraz roztwór chlorku wapnia w takiej ilości, aby jego końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło 0,01 do 0,06% wagowych, a miesza się wszystkie składniki w czasie nie przekraczającym 1 minutę, po czym wlewa do cylindrycznej zamykanej formy oraz pozostawia do żelowania w temperaturze poniżej 20°C przez 5-30 min, natomiast wytworzony materiał hydrożelowy razem z formą, w której się znajduje, zanurza się w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia o stężeniu 0,5-2,5% wagowych, przy czym otwiera się formę z jednej strony i prowadzi proces mineralizacji od 1 do 7 dni, uzyskując materiał polisacharydowy, z jednej strony zmineralizowany wydzieleniami fosforanów wapnia powstałymi na skutek rozkładu glicerofosforanu wapnia pod wpływem fosfatazy alkalicznej, przeznaczony do integrowania się z tkanką kostną oraz z drugiej strony niezmineralizowany, umożliwiający regenerację chrząstki, który to materiał inkubuje się w wodzie destylowanej, aż do usunięcia produktów ubocznych reakcji oraz pozostałości substratu, przy czym cały proces prowadzi się w warunkach sterylnych.
2. 2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roztwór chlorku wapnia w takiej ilości, aby jego końcowe stężenie w mieszaninie wynosiło 0,02 do 0,05% wagowych.

   PL 247857 BI
3. 3. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że proces żelowania prowadzi się w temperaturze 4°C.
4. 4. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że forma jest w postaci płytki zawierającej cylindryczne dołki i po napełnieniu mieszaniną składników przykrywa sieją sztywną płaską płytką, którą przed procesem mineralizacji zdejmuje się.
5. 5. Sposób, według zastrz. 4, znamienny tym, że płytkę zanurza się w roztworze wodnym glicerofosforanu wapnia w ułożeniu do góry dnem.
6. 6. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że forma jest w postaci strzykawki, którą napełnia się mieszaniną składników, a przed procesem mineralizacji usuwa ściankę strzykawki od strony mocowania igły.