PL248004B1

PL248004B1 - Fermented protein extract from milk thistle - Sylibum marianum and method of obtaining it

Info

Publication number: PL248004B1
Application number: PL444467A
Authority: PL
Inventors: Mirosława Teleszko; Adam Lucjan Zając; Grzegorz Krzos
Original assignee: Univ Ekonomiczny We Wroclawiu
Priority date: 2023-04-18
Filing date: 2023-04-18
Publication date: 2025-09-29
Also published as: PL444467A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest fermentowany ekstrakt białkowy z ostropestu plamistego - Sylibum marianum znajdujący zastosowanie w przemyśle spożywczym. Fermentowany ekstrakt białkowy z ostropestu plamistego - Sylibum marianum zawiera od 3,87 do 8,19 g suchej masy/100 mL ekstraktu; od 0,77 do 2,3 g białka/100 mL ekstraktu; od 0,63 do 1,12 g węglowodanów przyswajalnych/100 mL ekstraktu; od 0,65 do 0,89 g cukrów ogółem/100 ml ekstraktu; od 1,19 do 3,32 g tłuszczu całkowitego/100 mL ekstraktu oraz od 0,03% do 0,06% soli. Zgłoszenie zawiera ponadto sposób otrzymywania fermentowanego ekstraktu białkowego z ostropestu plamistego - Sylibum marianum, który charakteryzuje się tym, że surowiec w postaci ostropestu plamistego rozdrabnia się przy prędkości obrotowej nie mniejszej niż 4400 obr./min przez 30 - 40 s, następnie do rozdrobnionego surowca dodaje się wodę o temperaturze 4°C - 20°C zachowując udział masowy surowca do wody między 1:5 a 1:15, całość intensywnie się miesza przez 15 - 20 s przy prędkości obrotowej min. 4400 obr./min, w kolejnym etapie do mieszaniny wody z rozdrobnionym surowcem dodaje się zasadę - bezwodny węglan sodu w takiej ilości, aby pH mieszaniny ekstrakcyjnej mieściło się w przedziale 7,8 - 8,2 przy temperaturze 37°C - 40°C i prowadzi się proces ekstrakcji białek ostropestu, po czym mieszaninę poddaje się wirowaniu przy 3500 - 4500 obr./min przez 5 - 10 min, do odwirowanego mleczka ostropestowego (supernatantu) dodaje się syrop buraczany w ilości 20 - 30 g syropu/1 L odwirowanego ekstraktu, a następnie mleczko poddaje się pasteryzacji lub sterylizacji, w końcowym etapie dodaje się liofilizowane szczepy bakterii kwasu mlekowego (LAB) i/lub bakterii probiotycznych w ilości 0,1 g liofilizatu/1 L mleczka, a następnie inkubuje się w temperaturze optymalnej dla wzrostu użytych w procesie bakterii kwasu mlekowego, przy czym proces fermentacji prowadzi się do momentu uzyskania pH fermentowanego mleczka ostropestowego w zakresie 4,50 – 4,70 otrzymując produkt finalny w postaci fermentowanego ekstraktu białkowego z ostropestu plamistego - Sylibum marianum.The subject of the invention is a fermented protein extract from milk thistle - Sylibum marianum for use in the food industry. Fermented protein extract from milk thistle - Sylibum marianum contains from 3.87 to 8.19 g dry matter/100 mL of extract; from 0.77 to 2.3 g protein/100 mL of extract; from 0.63 to 1.12 g digestible carbohydrates/100 mL of extract; from 0.65 to 0.89 g total sugars/100 ml of extract; from 1.19 to 3.32 g total fat/100 mL of extract and from 0.03% to 0.06% salt. The application also includes a method for obtaining a fermented protein extract from milk thistle - Sylibum marianum, which is characterized in that the raw material in the form of milk thistle is ground at a rotational speed of not less than 4400 rpm for 30 - 40 s, then water at a temperature of 4°C - 20°C is added to the ground raw material while maintaining the mass fraction of the raw material to water between 1:5 and 1:15, the whole is mixed intensively for 15 - 20 s at a rotational speed of min. 4400 rpm, in the next stage, anhydrous sodium carbonate is added to the mixture of water and crushed raw material in such an amount that the pH of the extraction mixture is in the range of 7.8 - 8.2 at a temperature of 37°C - 40°C and the milk thistle protein extraction process is carried out, after which the mixture is centrifuged at 3500 - 4500 rpm for 5 - 10 min, beet syrup is added to the centrifuged milk thistle (supernatant) in the amount of 20 - 30 g of syrup/1 L of centrifuged extract, and then the milk is pasteurized or sterilized, in the final stage, freeze-dried strains of lactic acid bacteria (LAB) and/or probiotic bacteria are added in the amount of 0.1 g of lyophilisate/1 L of milk, and then the incubation is carried out at the optimal temperature for the growth of the lactic acid bacteria used in the process lactic acid, wherein the fermentation process is carried out until the pH of the fermented milk thistle is in the range of 4.50 - 4.70, obtaining the final product in the form of a fermented protein extract from milk thistle - Sylibum marianum.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fermentowanego ekstraktu białkowego otrzymywanego z owoców, bielma, lub wytłoków ostropestu plamistego - Sylibum marianum.The subject of the invention is a method for obtaining a fermented protein extract obtained from the fruit, endosperm, or pomace of milk thistle - Sylibum marianum.

Wynalazek znajduje zastosowanie w przemyśle spożywczym i jest używany jako suplement diety lub dodatek do żywności.The invention finds application in the food industry and is used as a dietary supplement or food additive.

Owoce ostropestu plamistego Sylibum marianum nie były dotychczas uwzględniane w produkcji białek roślinnych i roślinnych substytutów produktów mlecznych, co zważywszy na wysoką wartość odżywczą tego surowca, wielowiekową tradycję bezpiecznego stosowania przez ludzi i niewymagający sposób uprawy, jest nieuzasadnione. W owocach ostropestu od 20 do 30% stanowi uważane za niealergenne dla człowieka białko o wysokiej strawności i wartości odżywczej, wynikającej z obecności wszystkich aminokwasów egzogennych [Apostoł L., lorga C.S., Moęoiu C., Mustatea G., Cucu §., 2017, Nutrient compisition of partially defatted milk thistle seeds, Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, XXI, 165-169; Kotecka-Majchrzak K., Sumara A., Fornal E., Montowska M., 2020, Oilseed proteins Properties and application as a food ingredient, Trends in Food Science & Technology, 106 (2020), 160-170; Zhu S., Dong Y., Tu J., Dai C., 2013, Amino acid composition and in vitro digestibility of protein isolates from Silybum marianum, Journal of Food, Agriculture & Environment, 11 (1), 136-140). Wskazane powyżej wartości są znacznie wyższe niż oznaczone dla ziarna pszenicy (11,6%), owsa (10,9%), kukurydzy (9,4%), ryżu (8,1%) i ziemniaków (8,4%), natomiast zbliżone do zawartości białka oznaczonej w bobie (26,1%), soczewicy (25,6%), grochu (22,1%) czy ciecierzycy (21,3%). Obecnie przemysłowe wykorzystanie Sylibum marianum ograniczone jest do procesu ekstrakcji kompleksu flawonolignanów zwanych sylimaryną oraz produkcji oleju. Bielmo ostropestu, powstałe po produkcji sylimaryny, stosowane jest powszechnie do celów paszowych. Mielone owoce ostropestu są dostępne w handlu detalicznym. Można je dodawać do wypieków, musli, sałatek oraz wykorzystać jako składnik naparu.Milk thistle (Sylibum marianum) fruits have not been used in the production of plant proteins and plant-based dairy substitutes to date, which is unjustified given the high nutritional value of this raw material, the centuries-old tradition of safe use by humans, and the undemanding cultivation method. Milk thistle fruits contain 20 to 30% protein, considered non-allergenic for humans, with high digestibility and nutritional value resulting from the presence of all exogenous amino acids [Apostoł L., lorga C.S., Moąoiu C., Mustatea G., Cucu §., 2017, Nutrient composition of partially defatted milk thistle seeds, Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, XXI, 165-169; Kotecka-Majchrzak K., Sumara A., Fornal E., Montowska M., 2020, Oilseed proteins Properties and application as a food ingredient, Trends in Food Science & Technology, 106 (2020), 160-170; Zhu S., Dong Y., Tu J., Dai C., 2013, Amino acid composition and in vitro digestibility of protein isolates from Silybum marianum, Journal of Food, Agriculture & Environment, 11 (1), 136-140). The values indicated above are much higher than those determined for wheat grain (11.6%), oats (10.9%), corn (9.4%), rice (8.1%) and potatoes (8.4%), while similar to the protein content determined in broad beans (26.1%), lentils (25.6%), peas (22.1%) or chickpeas (21.3%). Currently, the industrial use of Silybum marianum is limited to the extraction of the flavonolignan complex known as silymarin and the production of oil. The milk thistle endosperm, formed after silymarin production, is commonly used for animal feed. Ground milk thistle fruit is available in retail stores. It can be added to baked goods, muesli, salads, or used as an ingredient in herbal teas.

W produkcji roślinnych ekstraktów białkowych zasadnym jest wykorzystywanie procesu fermentacji mlekowej. Fermentacja jest jedną z najstarszych metod utrwalania żywności, stosowanych przez człowieka. Poprawia właściwości sensoryczne produktów oraz ich jakość odżywczą, zmniejszając zawartość cukrów, zwiększając poziom tiaminy, niacyny, lizyny [Jeske S., Zannini E., Arendt E.K., 2018; Past, present and future: The strength of plant-based dairy substitutes based on gluten-free raw materials, Food Research International, 110, 42-51; Rasika D., Vidanarachchi J., Balthazar C.F., Cruz A.G. i in., 2021, Plant-based milk substitutes as emerging probiotic carriers, Current Opinion in Food Science, 38, 8-20] oraz polepszając strawność białek [Ketnawa S., Ogawa Y., 2019, Evaluation of protein digestibility of fermented soybeans and changes in biochemical characteristics of digested fractions, Journal of Functional Foods, 52, 640-647].In the production of plant protein extracts, it is reasonable to use the lactic acid fermentation process. Fermentation is one of the oldest methods of food preservation used by humans. It improves the sensory properties of products and their nutritional quality by reducing the sugar content and increasing the levels of thiamine, niacin, and lysine [Jeske S., Zannini E., Arendt E.K., 2018; Past, present, and future: The strength of plant-based dairy substitutes based on gluten-free raw materials, Food Research International, 110, 42-51; Rasika D., Vidanarachchi J., Balthazar C.F., Cruz A.G. et al., 2021, Plant-based milk substitutes as emerging probiotic carriers, Current Opinion in Food Science, 38, 8-20] and by improving protein digestibility [Ketnawa S., Ogawa Y., 2019, Evaluation of protein digestibility of fermented soybeans and changes in biochemical characteristics of digested fractions, Journal of Functional Foods, 52, 640-647].

Tzw. mleczka roślinne (MR) można poddawać fermentacji przy użyciu bakterii kwasu mlekowego. Proces korzystnie wpływa na wartość odżywczą MR poprzez zwiększenie zawartości aminokwasów i witamin, jednocześnie w sposób istotny kształtując prozdrowotne walory produktu (m.in. właściwości przeciwdrobnoustrojowe, przeciwnowotworowe, przeciwrakotwórcze i immunomodulacyjne) [Grom L.C., Rocha R.S., Balthazar C.F., Guimaraes J.T. i in., 2020, Postprandial glycemia in healthy subjects: Which probiotic dairy food is more adequate?, Journal of Dairy Science, 103(2), 1110-1119; Myagmardorj B., Purev M.-E., Batdorj B., 2018, Functional properties of fermented soymilk by Lactobacillus fermentum BM-325, Mongolian Journal of Chemistry, 19(45), 32-27; Tangyu M., Muller J., Bolten C.J., Wittmann C., 2019, Fermentation of plant-based milk alternatives for improved flavour and nutritional value, Applied Microbiology and Biotechnology, 103, 9263-9275].So-called plant milks (MWs) can be fermented using lactic acid bacteria. The process positively affects the nutritional value of MWs by increasing the content of amino acids and vitamins, while significantly shaping the health-promoting properties of the product (including antimicrobial, anticancer, anticarcinogenic, and immunomodulatory properties) [Grom L.C., Rocha R.S., Balthazar C.F., Guimaraes J.T. et al., 2020, Postprandial glycemia in healthy subjects: Which probiotic dairy food is more adequate?, Journal of Dairy Science, 103(2), 1110-1119; Myagmardorj B., Purev M.-E., Batdorj B., 2018, Functional properties of fermented soymilk by Lactobacillus fermentum BM-325, Mongolian Journal of Chemistry, 19(45), 32-27; Tangyu M., Muller J., Bolten C.J., Wittmann C., 2019, Fermentation of plant-based milk alternatives for improved flavor and nutritional value, Applied Microbiology and Biotechnology, 103, 9263-9275].

W publikacji naukowej Fang Li, Xiangyang Wu, Ting Zhao, Feng Li, Jiangli Zhao & Liuqing Yang (2013) Extraction, Physicochemical, and Functional Properties of Proteins From Milk Thistle Silybum Marianum L. Gaernt Seeds, International Journal of Food Properties, 16:8, 1750-1763, DOI:In the scientific publication Fang Li, Xiangyang Wu, Ting Zhao, Feng Li, Jiangli Zhao & Liuqing Yang (2013) Extraction, Physicochemical, and Functional Properties of Proteins From Milk Thistle Silybum Marianum L. Gaernt Seeds, International Journal of Food Properties, 16:8, 1750-1763, DOI:

10.1080/10942912.2011.608176 opisano metodę frakcjonowania białek oraz otrzymywania izolatu białek z suszonych, rozdrobnionych do postaci proszku i odtłuszczonych heksanem nasion ostropestu plamistego (zwanych dalej DSSP). W przypadku frakcji albumin (SA), zawiesinę DSSP z wodą dejonizowaną (1:10, w/v) mieszano przez 1 h w 25°C i wirowano przy 13500 g przez 15 min. Po ekstensywnej dializie wodą dejonizowaną przez 24 h supernatant ponownie odwirowano i liofilizowano w celu uzyskania SA. Aby otrzymać frakcję globulin (SG), osad otrzymany po pierwszym wirowaniu ponownie zawieszono w roztworze 0,5 mol/L NaCl (1:5, w/v), a powstałą zawiesinę mieszano przez 1 h w 25°C. Po odwirowaniu w tych samych warunkach, jak opisano wcześniej, supernatant dializowano i ponownie odwirowano. Odpowiedni osad rozpuszczono w wodzie dejonizowanej, a następnie liofilizowano w celu uzyskania SG. Stałą pozostałość po ekstrakcji SG wykorzystano do sekwencyjnej ekstrakcji frakcji prolaminowej (SP) i frakcji glutelinowej (SGL) przy użyciu odpowiednio 75% roztworu etanolu i 0,05 mol/L NaOH mieszanych przez 1 h w 25°C. Etanol w SP usunięto przez odparowanie w 45°C. W przypadku SGL ekstrakt doprowadzono do pH 4,5 za pomocą 0,5 mol/L HCl, a następnie odwirowano przy 13500 g przez 15 min. Osad następnie ponownie zawieszono w pięciu objętościach dejonizowanej wody i doprowadzono do pH 7,0 za pomocą NaOH o stężeniu 0,5 mol/L. Następnie wirowany w tych samych warunkach supernatant dializowano wodą dejonizowaną przez 24 h, po czym liofilizowano w celu wytworzenia SGL. Odcięcie masy cząsteczkowej (MW) membrany dializacyjnej było powyżej 3500 Da. Izolat białka z nasion S. marianum (SPI) przygotowano z DSSP. Proszek całkowicie zdyspergowano w 10-krotnej objętości wody dejonizowanej przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie pH dyspersji doprowadzono do wartości 8,0 za pomocą NaOH (0,1 mol/L). Po odwirowaniu przy 13500 g przez 15 min, pH otrzymanego supernatantu doprowadzono do pH 4,5 przy użyciu HCl (0,5 mol/L) w celu wytrącenia białek. Osad ponownie zdyspergowano w wodzie dejonizowanej, następnie dializowano i liofilizowano w celu uzyskania SPI.10.1080/10942912.2011.608176 describes a method for protein fractionation and obtaining a protein isolate from dried, powdered, and hexane-defatted milk thistle seeds (DSSP). For the albumin fraction (SA), a suspension of DSSP with deionized water (1:10, w/v) was mixed for 1 h at 25°C and centrifuged at 13,500 g for 15 min. After extensive dialysis with deionized water for 24 h, the supernatant was again centrifuged and lyophilized to obtain SA. To obtain the globulin fraction (SG), the pellet obtained after the first centrifugation was resuspended in a 0.5 mol/L NaCl solution (1:5, w/v), and the resulting suspension was stirred for 1 h at 25°C. After centrifugation under the same conditions as described previously, the supernatant was dialyzed and centrifuged again. The corresponding pellet was dissolved in deionized water and then lyophilized to obtain SG. The solid residue from SG extraction was used for sequential extraction of the prolamin fraction (SP) and glutelin fraction (SGL) using 75% ethanol and 0.05 mol/L NaOH, respectively, stirred for 1 h at 25°C. The ethanol in SP was removed by evaporation at 45°C. For SGL, the extract was adjusted to pH 4.5 with 0.5 mol/L HCl and then centrifuged at 13,500 g for 15 min. The pellet was then resuspended in five volumes of deionized water and adjusted to pH 7.0 with 0.5 mol/L NaOH. The supernatant, centrifuged under the same conditions, was then dialyzed with deionized water for 24 h and then lyophilized to obtain SGL. The molecular weight cut-off (MW) of the dialysis membrane was above 3500 Da. S. marianum seed protein isolate (SPI) was prepared from DSSP. The powder was completely dispersed in 10 times its volume of deionized water for 2 h at room temperature, and then the pH of the dispersion was adjusted to 8.0 with NaOH (0.1 mol/L). After centrifugation at 13,500 g for 15 min, the pH of the obtained supernatant was adjusted to pH 4.5 with HCl (0.5 mol/L) to precipitate proteins. The pellet was redispersed in deionized water, dialyzed, and lyophilized to obtain SPI.

Z polskiego opisu patentowego nr PL213556 B1 znany jest sposób obróbki owoców ostropestu plamistego przez odtłuszczanie i ekstrakcję, przy czym wyjściowe owoce przygotowuje się i/lub wstępnie suszy się je, po czym oddziela się zanieczyszczenia mechaniczne i oddziela się zawierające tłuszcz bielmo z usunięciem pierwszej frakcji tłuszczowej, a przed ekstrakcją owoce poddaje się obróbce ciśnieniowej, charakteryzującej się tym, że owoce poddaje się działaniu ciśnienia kształtującego o wartości zmieniającej się w czasie w zakresie od 25 do 50 MPa, a temperaturę owoców utrzymuje się na poziomie temperatury otoczenia wynoszącej maksymalnie 35°C, z wyjątkiem podwyższonej temperatury w zakresie od 53°C do 60°C w etapie obróbki ciśnieniowej, przy czym podczas całego procesu owoce w minimalnym stopniu są narażone na szok cieplny. Zasadniczą cechą sposobu według wynalazku jest to, że zmienia się w czasie ciśnienie kształtujące, wpływające na poddawane obróbce owoce, zależnie od użytych jako surowiec konkretnych owoców ostropestu plamistego, dla uzyskania żądanej struktury i kształtu, wraz z usunięciem z owoców tłuszczu jako ubocznego składnika organicznego, przy minimalnej ekspozycji owoców na działanie ciepła podczas całego procesu.Polish patent description No. PL213556 B1 describes a method of processing milk thistle fruit by defatting and extraction, wherein the initial fruit is prepared and/or pre-dried, after which mechanical impurities are separated and the fat-containing endosperm is separated with the removal of the first fat fraction, and before extraction the fruit is subjected to pressure treatment, characterized in that the fruit is subjected to a forming pressure with a value varying over time in the range from 25 to 50 MPa, and the temperature of the fruit is maintained at an ambient temperature of maximum 35°C, with the exception of an elevated temperature in the range from 53°C to 60°C in the pressure treatment stage, wherein the fruit is exposed to a minimum degree of thermal shock during the entire process. The essential feature of the method according to the invention is that the shaping pressure acting on the processed fruit is varied over time, depending on the specific milk thistle fruit used as raw material, to obtain the desired structure and shape, together with the removal of fat from the fruit as an organic by-product, with minimal exposure of the fruit to heat during the entire process.

W polskim opisie patentowym nr PL196531 B1 ujawniono preparat peptydowy o działaniu przeciwbakteryjnym stanowi frakcja peptydowa o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 1000 do 2500 Da, zawierająca peptydy posiadające od 6 do 25 grup aminokwasowych w cząsteczce, będąca produktem enzymatycznej hydrolizy białka nasion ostropestu plamistego (Silybum marianum). Sposób otrzymywania preparatu peptydowego o działaniu przeciwbakteryjnym polega na tym, że bielmo nasion ostropestu plamistego (Silybum marianum) poddaje się hydrolizie przez 4-12 godzin, w temperaturze 30-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 7,4-8,3, z zastosowaniem jako katalizatora pankreatyny lub mieszaniny enzymów zawierającej trypsynę i chymotrypsynę, po czym z hydrolizatu wydziela się frakcję peptydową o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 1000 do 2500, zawierającą peptydy posiadające od 6 do 25 reszt aminokwasowych w cząsteczce.Polish patent description No. PL196531 B1 discloses a peptide preparation with antibacterial activity, which is a peptide fraction with an average molecular weight of 1000 to 2500 Da, containing peptides having from 6 to 25 amino acid groups in the molecule, being a product of enzymatic hydrolysis of milk thistle seed protein (Silybum marianum). The method of obtaining a peptide preparation with antibacterial activity consists in hydrolyzing the endosperm of milk thistle (Silybum marianum) seeds for 4-12 hours at a temperature of 30-50°C, at a solution pH of 7.4-8.3, using pancreatin or a mixture of enzymes containing trypsin and chymotrypsin as a catalyst, and then separating a peptide fraction with an average molecular weight of 1000 to 2500, containing peptides having 6 to 25 amino acid residues in the molecule, from the hydrolyzate.

Z kolejnego polskiego opisu patentowego nr PL215480 B1 znany jest sposób otrzymywania mieszaniny peptydów pozbawionej gorzkiego smaku, polegający na tym, że preparat białkowy poddaje się wstępnej hydrolizie enzymatycznej z zastosowaniem enzymu wybranego spośród: pepsyny, trypsyny lub chymotrypsyny, a następnie prowadzi się dalszą hydrolizę produktu wstępnej hydrolizy w procesie fermentacji drożdżowej z wykorzystaniem drożdży winnych uzyskując mieszaninę peptydów zasadniczo pozbawioną gorzkiego smaku, przy czym wyjściowy preparat białkowy wybiera się z grupy obejmującej: serwatkę, homogenizowane białka ryb, homogenizowane białka skorupiaków morskich, białka trudno poddające się bezpośredniej hydrolizie w procesie fermentacji drożdżowej, w tym białka rdzenia ssaków, mięso zwierzęce, kazeina lub białka roślinne, lub białka sinic.Another Polish patent description No. PL215480 B1 describes a method for obtaining a peptide mixture without a bitter taste, which consists in subjecting the protein preparation to preliminary enzymatic hydrolysis using an enzyme selected from: pepsin, trypsin or chymotrypsin, and then further hydrolysis of the preliminary hydrolysis product is carried out in the yeast fermentation process using wine yeast, obtaining a peptide mixture essentially without a bitter taste, wherein the initial protein preparation is selected from the group consisting of: whey, homogenized fish proteins, homogenized marine crustacean proteins, proteins that are difficult to hydrolyze directly in the yeast fermentation process, including mammalian core proteins, animal meat, casein or plant proteins, or cyanobacterial proteins.

Polski opis patentowy nr PL240559 B1 dotyczy fitofarmaceutyku w postaci tabletek, kapsułek, proszków, granulatów musujących do stosowania doustnego, zawierający kompozycję biologicznie aktywnych składników pochodzących z jednej rośliny, zawierający składniki podstawowe w postaci substancji wspomagających i smakowych oraz składniki aktywne w postaci witamin oraz ostropestu plamistego, charakteryzujący się tym, że składnik aktywny stanowi ekstrakt olejowy z bielma ostropestu plamistego, hydrolizat białkowy z bielma ostropestu plamistego w postaci liofilizatu i/lub wodnej dyspersji, przy czym zawartość łącznie składników aktywnych, w tym witamin, wynosi co najmniej 75% wagowych w stosunku do składników podstawowych, przy czym zawartość witamin wynosi od 10 do 63% wagowych w stosunku, do pozostałych składników aktywnych.Polish patent description No. PL240559 B1 concerns a phytopharmaceutical in the form of tablets, capsules, powders, effervescent granules for oral use, containing a composition of biologically active ingredients derived from one plant, containing basic ingredients in the form of adjuvants and flavoring substances and active ingredients in the form of vitamins and milk thistle, characterized in that the active ingredient is an oil extract from the endosperm of milk thistle, a protein hydrolysate from the endosperm of milk thistle in the form of a lyophilisate and/or an aqueous dispersion, wherein the total content of active ingredients, including vitamins, is at least 75% by weight in relation to the basic ingredients, wherein the content of vitamins is from 10 to 63% by weight in relation to the remaining active ingredients.

W polskim opisie patentowym nr PL235709 B1 ujawniono fitokosmetyk w postaci kremów, maści, emulsji, płynów, żeli do stosowania zewnętrznego, zawierający składniki podstawowe w postaci substancji bazowych, wspomagających, konserwujących, odżywczych oraz składniki aktywne z ostropestu plamistego, charakteryzuje się tym, że składnik aktywny stanowi ekstrakt olejowy z bielma ostropestu plamistego, hydrolizat białkowy z bielma ostropestu plamistego w postaci liofilizatu i/lub wodnej dyspersji, przy czym zawartość składników aktywnych łącznie wynosi co najmniej 10% wagowych w stosunku do składników podstawowych. Ekstrakt olejowy z bielma ostropestu plamistego stanowi frakcja olejowa zawierająca nienasycone kwasy tłuszczowe. Ekstrakt olejowy z bielma ostropestu plamistego stanowi frakcja niezmydlana zawierająca przeciwutleniacze.Polish patent description No. PL235709 B1 discloses a phytocosmetic in the form of creams, ointments, emulsions, liquids, and gels for external use, containing basic ingredients in the form of base, supporting, preservative, and nutritional substances, as well as active ingredients from milk thistle. The active ingredient is characterized in that the active ingredient is an oil extract from milk thistle endosperm, a protein hydrolysate from milk thistle endosperm in the form of a lyophilizate and/or an aqueous dispersion, wherein the total content of active ingredients is at least 10% by weight of the basic ingredients. The oil extract from milk thistle endosperm is an oil fraction containing unsaturated fatty acids. The oil extract from milk thistle endosperm is an unsaponifiable fraction containing antioxidants.

Wynalazek umożliwia otrzymanie ekstraktu ostropestowego zawierającego 0,7-2,5 g białka/100 mL ekstraktu oraz żywe kultury bakterii kwasu mlekowego i/lub bakterii probiotycznych. Sposób jego otrzymywania opiera się wyłącznie na zastosowaniu ekstrakcji wodnej materiału roślinnego bez użycia chlorku sodu (eliminacja procesu wysalania białek i dializowania ekstraktu), wodorotlenku sodu i kwasu solnego oraz alkoholi, z wyłączeniem hydrolizy enzymatycznej i fermentacji prowadzonej przez drożdże, co wykorzystywano w rozwiązaniach opisywanych we wcześniejszych zgłoszeniach patentowych i publikacjach naukowych. Nie ma konieczności prowadzenia procesu z wykorzystaniem wody dejonizowanej.The invention enables the production of milk thistle extract containing 0.7-2.5 g protein/100 mL of extract and live cultures of lactic acid bacteria and/or probiotic bacteria. The method of preparation relies solely on aqueous extraction of plant material without the use of sodium chloride (eliminating the process of protein salting out and dialyzing the extract), sodium hydroxide, hydrochloric acid, or alcohols, excluding enzymatic hydrolysis and yeast-driven fermentation, which were used in solutions described in earlier patent applications and scientific publications. The process does not require the use of deionized water.

Celem wynalazku jest opracowanie nowego ekstraktu białkowego z ostropestu plamistego oraz opracowanie nowego sposobu wytwarzania fermentowanego, ostropestowego ekstraktu białkowego, który składa się z głównych dwóch procesów: I pozyskiwanie surowego ekstraktu białkowego - tzw. mleczka ostropestowego; II fermentacji mleczka ostropestowego - otrzymanie fermentowanego ekstraktu białkowego.The aim of the invention is to develop a new protein extract from milk thistle and to develop a new method for producing fermented milk thistle protein extract, which consists of two main processes: I. obtaining raw protein extract - the so-called milk thistle; II. fermentation of milk thistle - obtaining fermented protein extract.

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania fermentowanego ekstraktu białkowego z ostropestu plamistego - Sylibum marianum, który polega na tym, że surowiec w postaci bielma, wytłoków oraz mielonych owoców ostropestu plamistego - Sylibum marianum w ilości 60-150 g rozdrabnia się przy prędkości obrotowej nie mniejszej niż 4400 obr/min. przez 30-40 s, następnie do rozdrobnionego surowca dodaje się wodę o temperaturze 4-20°C, zachowując udział masowy surowca do wody między 1:5 a 1:15, całość intensywnie się miesza przez 15-20 s przy prędkości obrotowej min. 4400 obr./min, w kolejnym etapie do mieszaniny wody z rozdrobnionym surowcem dodaje się zasadę - bezwodny węglan sodu lub potasu, lub wodorowęglan sodu w takiej ilości, aby pH mieszaniny ekstrakcyjnej mieściło się w przedziale 7,8-8,2 przy temperaturze 37-40°C i prowadzi się proces ekstrakcji białek ostropestu, po czym mieszaninę poddaje się wirowaniu przy 3500-4500 obr./min. przez 5-10 min, do odwirowanego mleczka ostropestowego (supernatantu) dodaje się syrop buraczany w ilości 20-30 g syropu/ 1 L odwirowanego ekstraktu, a następnie mleczko poddaje się pasteryzacji w temperaturze 80-85°C przez 20-30 min lub sterylizacji w temperaturze 120°C w czasie 20 minut i schładza do temperatury 35-40°C. W końcowym etapie dodaje się liofilizowane szczepy bakterii kwasu mlekowego (LAB) i/lub bakterii probiotycznych - Lactobacillus rhamnosus w ilości 0,1 g liofilizatu/1 L mleczka, a następnie inkubuje się w temperaturze optymalnej dla wzrostu użytych w procesie bakterii kwasu mlekowego, przy czym proces fermentacji prowadzi się do momentu uzyskania pH fermentowanego mleczka ostropestowego w zakresie 4,50-4,70, otrzymując produkt finalny w postaci fermentowanego ekstraktu białkowego z ostropestu plamistego - Sylibum marianum.The essence of the invention is a method for obtaining fermented protein extract from milk thistle - Sylibum marianum, which consists in grinding the raw material in the form of endosperm, pomace and ground milk thistle fruit - Sylibum marianum in the amount of 60-150 g at a rotational speed of not less than 4400 rpm for 30-40 s, then water at a temperature of 4-20°C is added to the ground raw material, maintaining the mass fraction of the raw material to water between 1:5 and 1:15, the whole is mixed intensively for 15-20 s at a rotational speed of min. 4400 rpm, in the next stage, a base is added to the mixture of water and the crushed raw material - anhydrous sodium or potassium carbonate, or sodium bicarbonate - in such an amount that the pH of the extraction mixture is in the range of 7.8-8.2 at a temperature of 37-40°C and the milk thistle protein extraction process is carried out, after which the mixture is centrifuged at 3500-4500 rpm for 5-10 min, beet syrup is added to the centrifuged milk thistle (supernatant) in the amount of 20-30 g of syrup/1 L of centrifuged extract, and then the milk is pasteurized at 80-85°C for 20-30 min or sterilized at 120°C for 20 minutes and cooled to 35-40°C. In the final stage, freeze-dried strains of lactic acid bacteria (LAB) and/or probiotic bacteria - Lactobacillus rhamnosus are added in the amount of 0.1 g of lyophilisate/1 L of milk, and then incubated at the optimal temperature for the growth of lactic acid bacteria used in the process, with the fermentation process being carried out until the pH of the fermented milk thistle is in the range of 4.50-4.70, obtaining the final product in the form of a fermented protein extract from milk thistle - Sylibum marianum.

Korzystnie, gdy przed dodaniem syropu buraczanego do ekstraktu białkowego, rozprowadza się go w wodzie o temperaturze 30-50°C przy zachowaniu stosunku syropu do wody w zakresie 1:2-1:3 (w/w).It is advantageous if, before adding the beetroot syrup to the protein extract, it is dispersed in water at a temperature of 30-50°C, maintaining a syrup to water ratio of 1:2-1:3 (w/w).

Korzystnie, gdy proces ekstrakcji białek ostropestu prowadzi się przy zachowaniu następujących parametrów procesu: czas mieszania 20-30 min, prędkość obrotowa mieszadła 500-1100 obr./min, temperatura: 37-40°C.It is advantageous if the milk thistle protein extraction process is carried out while maintaining the following process parameters: mixing time 20-30 min, stirrer rotational speed 500-1100 rpm, temperature: 37-40°C.

Korzystnie, gdy podczas użycia surowca w postaci całych owoców ostropestu poddaje się je 2-3-krotnie płukaniu w wodzie o temperaturze 4-20°C.It is advantageous when using raw material in the form of whole milk thistle fruits to rinse them 2-3 times in water at a temperature of 4-20°C.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania, jednocześnie nie ograniczając jego zakresu.The subject of the invention is presented in more detail in the following examples, without limiting its scope.

Przykład 1Example 1

150 g bielma ostropestu rozdrabniano w wielofunkcyjnym robocie kuchennym [Thermomix, TM6, Niemcy], stosując prędkość obrotową noży 5800 obr/min przez 30 s. Do rozdrobnionego bielma dodano 1000 g wody o temperaturze 8°C, dyspergując całość przez 20 s przy prędkości obrotowej noży identycznej, jak podczas rozdrabniania surowca. Do homogennej mieszaniny wody i bielma dodano 0,9 g bezwodnego węglanu sodu. W mieszaninie prowadzono ekstrakcję białek przez 20 minut w temperaturze 37°C (500 obr/min), uzyskując pH końcowe ekstraktu wynoszące 7,81. Otrzymany zasadowy ekstrakt białek ostropestowych rozlewano do naczyń wirówkowych o pojemności 250 mL i wirowano w wirówce laboratoryjnej MPW-351 przez 10 minut przy 4000 obr/min [MPW Instruments, Polska]. Uzyskany supernatant o pH 7,88 ponownie przelano do misy robota kuchennego. Do zlewki szklanej o pojemności 100 mL odważono 20 g syropu z buraków cukrowych o zawartości węglowodanów 70 g/100 g, dodano 60 g wody o temperaturze 40°C i wymieszano bagietką szklaną, aż do całkowitego rozpuszczenia syropu w wodzie. Tak przygotowany syrop buraczany przelano do odwirowanego ekstraktu białek ostropestowych. Zawierający dodatek syropu buraczanego ekstrakt białek ostropestu pasteryzowano w temperaturze 85°C przez 20 minut przy prędkości mieszadła wynoszącej 500 obr./min. Spasteryzowany ekstrakt ostropestowy przelano do sterylnej zlewki szklanej o pojemności 1500 mL, zabezpieczono folią aluminiową i chłodzono w łaźni wodnej do osiągnięcia temperatury 36°C. Do wystudzonego ekstraktu dodano zliofilizowane bakterie probiotyczne Lactobacillus rhamnosus w ilości 0,1 g liofilizatu/ 1 L ekstraktu, całość mieszając sterylną bagietką szklaną. Zlewkę przykryto folią aluminiową. Zaszczepiony ekstrakt inkubowano w temperaturze 36°C w urządzeniu Memmert typ UN30 (Memmert, Niemcy) do osiągnięcia pH = 4,55 (około 20 godzin). Uzyskany fermentowany ekstrakt białek ostropestu zawierał 8,19 g suchej masy/100 mL; 2,3 g białka/100 mL; 1,12 g węglowodanów przyswajalnych/100 mL; 0,89 g cukrów ogółem/100 mL; 3,32 g tłuszczu całkowitego/100 mL oraz 0,06% soli.150 g of milk thistle endosperm was ground in a multifunctional food processor [Thermomix, TM6, Germany] at a blade speed of 5800 rpm for 30 s. 1000 g of water at 8°C was added to the ground endosperm and dispersed for 20 s at the same blade speed as during grinding. 0.9 g of anhydrous sodium carbonate was added to the homogeneous mixture of water and endosperm. Proteins were extracted from the mixture for 20 minutes at 37°C (500 rpm), obtaining a final extract pH of 7.81. The obtained alkaline milk thistle protein extract was poured into 250 mL centrifuge vessels and centrifuged in an MPW-351 laboratory centrifuge for 10 minutes at 4000 rpm [MPW Instruments, Poland]. The resulting supernatant, with a pH of 7.88, was poured back into the food processor bowl. Twenty grams of sugar beet syrup with a carbohydrate content of 70 g/100 g was weighed into a 100 mL glass beaker, 60 g of water at 40°C was added, and stirred with a glass rod until the syrup was completely dissolved. The prepared beet syrup was poured into the centrifuged milk thistle protein extract. The milk thistle protein extract containing the added beet syrup was pasteurized at 85°C for 20 minutes at a stirrer speed of 500 rpm. The pasteurized milk thistle extract was poured into a sterile 1500 mL glass beaker, sealed with aluminum foil, and cooled in a water bath to 36°C. Freeze-dried probiotic bacteria Lactobacillus rhamnosus were added to the cooled extract at a rate of 0.1 g of lyophilisate/1 L of extract, and the mixture was mixed with a sterile glass rod. The beaker was covered with aluminum foil. The inoculated extract was incubated at 36°C in a Memmert UN30 apparatus (Memmert, Germany) until pH = 4.55 was reached (approximately 20 hours). The obtained fermented milk thistle protein extract contained 8.19 g of dry matter/100 mL; 2.3 g of protein/100 mL; 1.12 g of available carbohydrates/100 mL; 0.89 g of total sugars/100 mL; 3.32 g of total fat/100 mL, and 0.06% salt.

Przykład 2 g bielma ostropestu rozdrabniano w wielofunkcyjnym robocie kuchennym [Thermomix, TM6, Niemcy], stosując prędkość obrotową noży 5800 obr/min przez 30 s. Do rozdrobnionego bielma dodano 1000 g wody o temperaturze 10°C, dyspergując całość przez 20 s przy prędkości obrotowej noży identycznej, jak podczas rozdrabniania surowca. Do homogennej mieszaniny wody i bielma dodano 0,3 g bezwodnego węglanu sodu. W mieszaninie prowadzono ekstrakcję białek przez 20 minut w temperaturze 37°C (500 obr/min), uzyskując pH końcowe ekstraktu wynoszące 8,17. Otrzymany zasadowy ekstrakt białek ostropestowych rozlewano do naczyń wirówkowych o pojemności 250 ml i wirowano w wirówce laboratoryjnej przez 10 minut przy 4000 obr/min [MPW-351, MPW Instruments, Polska]. Uzyskany supernatant o pH 7,89 przelano ponownie do misy robota kuchennego. Do zlewki szklanej o pojemności 100 mL odważono 20 g syropu z buraków cukrowych o zawartości węglowodanów 70 g/100 g, dodano 60 g wody o temperaturze 50°C i wymieszano bagietką szklaną, aż do całkowitego rozpuszczenia syropu w wodzie. Tak przygotowany syrop buraczany przelano do odwirowanego ekstraktu białek ostropestowych i mieszano przez 30 s przy prędkości mieszadła 500 obr/min. Zawierający dodatek syropu buraczanego ekstrakt białek ostropestu przelewano do butelek szklanych o pojemności 500 ml i sterylizowano przez 20 min w temperaturze 121°C przy ciśnieniu 0,1 MPa. Sterylizowany ekstrakt ostropestowy chłodzono butelkach w łaźni wodnej do uzyskania temperatury 36°C, po czym przelano do sterylnej zlewki szklanej o pojemności 1500 ml. Dodano zliofilizowane bakterie jogurtowe w ilości 0,1 g liofilizatu/ 1 L ekstraktu, całość mieszając sterylną bagietką szklaną. Zlewkę nakryto folią aluminiową. Zaszczepiony ekstrakt inkubowano w temperaturze 36°C w urządzeniu Memmert typ UN30 (Memmert, Niemcy) do osiągnięcia pH = 4,55 (około 20 godzin). Uzyskany fermentowany ekstrakt białek ostropestu zawierał 4,66 g suchej masy/100 mL; 1,02 g białka/100 mL; 0,63 g węglowodanów przyswajalnych/100 mL; 0,65 g cukrów ogółem/100 mL; 1,53 g tłuszczu całkowitego/100 mL oraz 0,03% soli. Przykład 3 g owoców ostropestu trzykrotnie płukano wodą o temperaturze 20°C, po czym poddano procedurze ekstrakcji białek w sposób analogiczny, jak w Przykładzie 2 z tą różnicą, że do homogennej mieszaniny wody i owoców ostropestu dodano 0,5 g węglanu potasu, uzyskując pH końcowe ekstraktu 8,20 (temperatura ekstrakcji 40°C).Example: 2 g of milk thistle endosperm was ground in a multifunctional food processor [Thermomix, TM6, Germany] at a blade speed of 5800 rpm for 30 s. 1000 g of water at 10°C was added to the ground endosperm, dispersing the mixture for 20 s at a blade speed identical to that used for grinding the raw material. 0.3 g of anhydrous sodium carbonate was added to the homogeneous mixture of water and endosperm. Proteins were extracted from the mixture for 20 minutes at 37°C (500 rpm), obtaining a final extract pH of 8.17. The obtained alkaline milk thistle protein extract was poured into 250 ml centrifuge vessels and centrifuged in a laboratory centrifuge for 10 minutes at 4000 rpm [MPW-351, MPW Instruments, Poland]. The resulting supernatant, with a pH of 7.89, was poured back into the food processor bowl. Twenty grams of sugar beet syrup with a carbohydrate content of 70 g/100 g was weighed into a 100 mL glass beaker, 60 g of water at 50°C was added, and stirred with a glass rod until the syrup was completely dissolved. The prepared beet syrup was poured into the centrifuged milk thistle protein extract and mixed for 30 seconds at 500 rpm. The milk thistle protein extract containing the added beet syrup was poured into 500 mL glass bottles and sterilized for 20 minutes at 121°C and 0.1 MPa. The sterilized milk thistle extract was cooled in a water bath to 36°C and then poured into a sterile 1500 mL glass beaker. Freeze-dried yogurt bacteria were added at a rate of 0.1 g of lyophilisate/1 L of extract, and the mixture was stirred with a sterile glass rod. The beaker was covered with aluminum foil. The inoculated extract was incubated at 36°C in a Memmert UN30 apparatus (Memmert, Germany) until pH = 4.55 was reached (approximately 20 hours). The obtained fermented milk thistle protein extract contained 4.66 g dry matter/100 mL; 1.02 g protein/100 mL; 0.63 g available carbohydrates/100 mL; 0.65 g total sugars/100 mL; 1.53 g total fat/100 mL, and 0.03% salt. Example 3 g of milk thistle fruit were rinsed three times with water at 20°C and then subjected to the protein extraction procedure in a manner analogous to Example 2, with the difference that 0.5 g of potassium carbonate was added to the homogeneous mixture of water and milk thistle fruit, obtaining a final pH of the extract of 8.20 (extraction temperature 40°C).

Do 20 g syropu z buraków cukrowych o zawartości węglowodanów 70 g/100 g, dodano 60 g wody o temperaturze 30°C.To 20 g of sugar beet syrup with a carbohydrate content of 70 g/100 g, 60 g of water at 30°C was added.

Ekstrakt sterylizowano, jak w Przykładzie 2.The extract was sterilized as in Example 2.

Fermentację ekstraktu z udziałem Lactobacillus rhamnosus zakończono po 19 h, po osiągnięciu pH = 4,70.Fermentation of the extract with Lactobacillus rhamnosus was completed after 19 h, after reaching pH = 4.70.

Uzyskany fermentowany ekstrakt białek ostropestu zawierał 3,90 g suchej masy/100 mL; 0,77 g białka/100 mL; 0,96 g węglowodanów przyswajalnych/100 mL; 0,70 g cukrów ogółem/100 mL; 1,19 g tłuszczu całkowitego/100 mL oraz 0,03% soli.The obtained fermented milk thistle protein extract contained 3.90 g dry matter/100 mL; 0.77 g protein/100 mL; 0.96 g digestible carbohydrates/100 mL; 0.70 g total sugars/100 mL; 1.19 g total fat/100 mL and 0.03% salt.

Przykład 4 g owoców ostropestu dwukrotnie płukano wodą o temperaturze 4°C, po czym poddano procedurze ekstrakcji białek w sposób analogiczny, jak w Przykładzie 3 z tą różnicą, że do homogennej mieszaniny wody i owoców ostropestu dodano 1,5 g wodorowęglanu sodu, uzyskując pH końcowe ekstraktu 8,18 (temperatura ekstrakcji 40°C).Example 4 g of milk thistle fruit were rinsed twice with water at 4°C and then subjected to the protein extraction procedure in a manner analogous to Example 3, with the difference that 1.5 g of sodium bicarbonate was added to the homogeneous mixture of water and milk thistle fruit, obtaining a final pH of the extract of 8.18 (extraction temperature 40°C).

Do 20 g syropu z buraków cukrowych o zawartości węglowodanów 70 g/100 g, dodano 60 g wody o temperaturze 50°C.To 20 g of sugar beet syrup with a carbohydrate content of 70 g/100 g, 60 g of water at 50°C was added.

Ekstrakt pasteryzowano w temperaturze 80°C przez 30 minut.The extract was pasteurized at 80°C for 30 minutes.

Fermentację ekstraktu z udziałem bakterii jogurtowych zakończono po 20 h, osiągnięciu pH = 4,60.Fermentation of the extract with the participation of yogurt bacteria was completed after 20 h, reaching pH = 4.60.

Uzyskany fermentowany ekstrakt białek ostropestu zawierał 3,87 g suchej masy/100 mL; 0,78 g białka/100 mL; 0,89 g węglowodanów przyswajalnych/100 mL; 0,72 g cukrów ogółem/100 mL; 1,26 g tłuszczu całkowitego/100 mL oraz 0,03% soli.The obtained fermented milk thistle protein extract contained 3.87 g dry matter/100 mL; 0.78 g protein/100 mL; 0.89 g digestible carbohydrates/100 mL; 0.72 g total sugars/100 mL; 1.26 g total fat/100 mL and 0.03% salt.

Claims

Patent claims

1. A method for obtaining fermented protein extract from milk thistle - Sylibum marianum, characterized in that the raw material in the form of endosperm, pomace and ground milk thistle fruit c Sylibum marianum in the amount of 60-150 g is ground at a rotational speed of not less than 4400 rpm for 30-40 s, then water at a temperature of 4-20°C is added to the ground raw material, maintaining the mass fraction of the raw material to water between 1:5 and 1:15, the whole is mixed intensively for 15-20 s at a rotational speed of min. 4400 rpm, in the next stage, a base is added to the mixture of water and the crushed raw material - anhydrous sodium or potassium carbonate, or sodium bicarbonate in such an amount that the pH of the extraction mixture is in the range of 7.8-8.2 at a temperature of 37-40°C and the process of extracting milk thistle proteins is carried out, after which the mixture is centrifuged at 3500-4500 rpm. for 5-10 minutes, beetroot syrup is added to the centrifuged milk thistle (supernatant) in the amount of 20-30 g of syrup/1 L of centrifuged extract, and then the milk is pasteurized at a temperature of 80-85°C for 20-30 minutes or sterilized at a temperature of 120°C for 20 minutes and cooled to a temperature of 35-40°C, in the final stage, lyophilized strains of lactic acid bacteria (LAB) and/or probiotic bacteria - Lactobacillus rhamnosus are added in the amount of 0.1 g of lyophilisate/1 L of milk, and then incubated at the optimal temperature for the growth of lactic acid bacteria used in the process, the fermentation process is carried out until the pH of the fermented milk thistle is in the range of 4.50-4.70, obtaining the final product in the form of fermented protein extract from milk thistle - Silibum marianum.

2. A method according to claim 2, characterized in that before adding the beet syrup to the protein extract, it is dispersed in water at a temperature of 30-50°C, maintaining the syrup to water ratio in the range of 1:2-1:3 (w/w).

3. The method according to claim 2, characterized in that the milk thistle protein extraction process is carried out while maintaining the following process parameters: mixing time 20-30 min, stirrer rotational speed 500-1100 rpm, temperature: 37-40°C.

4. The method according to claim 2, characterized in that when using the raw material in the form of whole milk thistle fruits, they are rinsed 2-3 times in water at a temperature of 4-20°C.