PL248026B1 - Preparat oligosacharydowy pozyskiwany z owocników żółciaka siarkowego (Laetiporus sulphureus) do zastosowania w zapobieganiu i zwalczaniu nosemozy u pszczół - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest preparat oligosacharydowy pozyskiwany na drodze kwaśnej hydrolizy grzybowych α(1→3)-glukanów z owocników żółciaka siarkowego (Laeliporus sulphureus), znajdujący zastosowanie w zapobieganiu i zwalczaniu nosemozy u pszczół, wywołanej zakażeniem grzybami z rodzaju Nosema (Vairimorpha). Wynalazek mający postać frakcji glukooligosacharydów o stopniu polimeryzacji od 2 do 10, jest bezpiecznym i skutecznym preparatem dedykowanym pszczołom miodnym, o działaniu zapobiegającym i zwalczającym nosemozę.

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat oligosacharydowy pozyskiwany z owocników żółciaka siarkowego (Laetiporus sulphureus) na drodze hydrolizy grzybowych a-(1^3)-glukanów, znajdujący zastosowanie w zapobieganiu i zwalczaniu nosemozy u pszczół, wywołanej zakażeniem grzybami z rodzaju Nosema (Vairimorpha).

Nosemoza, będąca groźną zakaźną chorobą pszczoły miodnej, wywoływanej przez wewnątrzkomórkowe pasożyty, które swój cykl rozwojowy przechodzą w komórkach jelita, powoduje wymieranie całych rodzin pszczelich.

Mimo wielu dostępnych na rynku preparatów, w chwili obecnej nie ma skutecznego leku weterynaryjnego zwalczającego tę wyniszczającą pszczoły chorobę.

Z opisu patentowego KR 20140017291 znany jest preparat zawierający Aspergillus fumigatus, szczep wytwarzający fumagillinę, której działanie polega jedynie na hamowaniu aktywności enzymu aminopeptydazy metioninowej MetAP-2, bez niszczenia zarodników Nosema spp., co w konsekwencji prowadzi do rozwijania się oporności grzyba na ten antybiotyk. W opisie patentowym WO 2016135655, ujawniono preparat zawierający bakterie Lactobacillus buchneri oraz inne mikroorganizmy należące do gatunku wybranego z grapy: Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis i Lactobacillus plantarum, a także prebiotyki. Preparat, ten zawiera ogólnodostępne mikroorganizmy, dopuszczone jako bezpieczne, do stosowania dla zwierząt, ale nie dedykowane pszczołom. Z opisu patentowego KR 20130101370, znany jest preparat zawierający bakterie Lactobacillus plantarum YML001, Lactobacillus plantarum YML004 i Leuconostoc citreum KM20W wraz z materiałem wybranym z grupy obejmującej pyłki, sacharyd, drożdże, odtłuszczone mleko w proszku i kazeinę jako ciasto pyłkowe, mający na celu dostarczenie pszczołom składników odżywczych i zwiększenie ich odporności na pasożytnicze owady. Preparat ten nie wpływa na grzyby pasożytnicze z rodzaju Nosema porażające pszczoły. W opisie patentowym KR 20130005052 ujawniono także skład preparatu zawierającego ekstrakt z Stevia spp. oraz bakterie Lactobacillus spp., takie jak: Lactobacillus leuteri, L. buchneri, L bifidobacterium, L. bnuteri lub L. plantarum, mającego na celu zapobieganie i leczenie chorób pszczół miodnych oraz zapewnienie silniejszej tolerancji na choroby, takie jak grzybica otorbielakowa oraz zgnilec złośliwy. Preparat ten nie wpływa na grzyby pasożytnicze z rodzaju Nosema porażające pszczoły.

Z opisu patentowego PL 231692, znany jest preparat do leczenia mikrosporydioz, a zwłaszcza nosemozy u pszczół, zawierający jedną z rozprowadzonych homogenicznie, amidowych pochodnych protoporfiryny. Z uwagi na fakt, iż miód i inne produkty pszczele wykorzystywane są przez człowieka jako produkty żywnościowe, lecznicze czy suplementy diety, leczenie pszczół powinno opierać się o dobrze poznane, bezpieczne preparaty, łatwo degradowalne, które nie powodują zmian genetycznych w organizmach pszczół.

Z kilku opisów patentowych, takich jak, PL 232685, PL 241494, PL 241380, PL 241381 czy też ze zgłoszenia patentowego P.441003, znane są preparaty przeznaczone do stosowania w leczeniu nosemozy u pszczół i poprawy ich odporności, jednakże nie gwarantują one dostatecznej skuteczności zwalczania tej choroby, albowiem zakaźne patogeny w odpowiedzi na stosowane preparaty, uruchamiają mechanizmy obronne i uodparniające, które nie bronią gospodarza przed rozwojem choroby.

Z opisu patentowego PL 434201, znane jest otrzymywanie a-(1^3)-glukooligosacharydów z a-(1^3)-glukanu izolowanego z owocników żółciaka siarkowego i ich zastosowanie do stymulacji wzrostu bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. Nie znane jest zastosowanie tego typu glukooligosacharydów do stymulacji fruktofilnych bakterii kwasu mlekowego (FLAB, ang. Fructophilic Lactic Acid Bacteria), charakterystycznych dla metabolizmu pszczół.

Celem wynalazku było opracowanie skutecznego i nie powodującego skutków ubocznych, preparatu zapobiegającego i zwalczającego nosemozę u pszczół miodnych.

Nieoczekiwanie okazało się, że frakcja glukooligosacharydów wyselekcjonowanych w wyniku kwaśnej hydrolizy a-(1^3)-glukanów pozyskanych z owocników żołdaka siarkowego (Laetiporus sulphureus ), wykazuje działanie zwalczające chorobotwórcze patogeny grzybowe z rodzaju Nosema (Vairimorpha), przez co znajduje zastosowanie w preparatach poprawiających dobrostan pszczół, zapobiegając i zwalczając ich groźną chorobę.

Istotą wynalazku jest preparat oligosacharydowy, pozyskiwany z owocników żółciaka siarkowego (Laetiporus sulphureus), znajdujący zastosowanie w zapobieganiu i zwalczaniu nosemozy u pszczół, zawierający frakcję glukooligosacharydów o stopniu polimeryzacji od 2 do 10, wyselekcjonowanych w wyniku kwaśnej hydrolizy a-(1^3)-glukanów z owocników żółciała siarkowego (Laetiporus sulphureus).

Preparat według wynalazku wykazuje najkorzystniejsze działanie gdy stosowany jest w zakresie od 0,1 g do 400 g preparatu na 1 L lub 1 kg pokarmu dla pszczół, co odpowiada zawartości od 0,01 do 40% wagowych tego produktu.

Wynalazek rozwiązuje problem techniczny w postaci wskazania bezpiecznego i skutecznego preparatu, dedykowanego pszczołom miodnym, o działaniu zapobiegającym i zwalczającym nosemozę.

Wynalazek i jego skuteczne działanie przedstawiono w poniższych przykładach wykonania.

Przykład 1. Otrzymywanie preparatu w postaci frakcji a-(1^3)-glukooligosacharydów.

g wysuszonych i zmielonych owocników żółciaka siarkowego (Laetiporus sulphureus), zawieszano w 2 L wody destylowanej i gotowano przez 60 min w autoklawie w temp. 121°C, po czym pozostawiono na 12 godz. w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu i przepłukaniu wodą destylowaną, czynność tę powtarzano jeszcze 2-krotnie, po czym osad zawieszano w 2 L 1M NaOH i mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego (300 obr./min) przez 24 godziny. Uzyskany po odwirowaniu supernatant, neutralizowano przy użyciu 1M HCl. Wtrącony biały, amorficzny precypitat a-(1^3)-glukany) przepłukiwano 3-krotnie wodą destylowaną, zamrażano i suszono w Iiofilizatorze. 40 g otrzymanych a-(1^3)-glukanów poddano hydrolizie przy użyciu 100 ml 0,1 M H2SO4 w ciągu 1 godz. w temp. 100°C. Pozostałości usunięto przez odwirowanie w ciągu 20 min, przy 12000 obr./min. Otrzymany supernatant zneutralizowano za pomocą CaCO3. Po ponownym odwirowaniu w warunkach jak wyżej, supernatant poddano odsoleniu, a odsolony roztwór zawierający a-(1^3)-glukooligosacharydy zagęszczono za pomocą wyparki próżniowej i zliofilizowano. Weryfikacja jakościowa i ilościowa preparatu została wykonana w oparciu o analizę HPLC z użyciem kolumny Rezex RSO-Oligosaccharide Ag+. Otrzymany preparat zawierał glukozę oraz a-(1^3)-glukooligosacharydy o stopniu polimeryzacji DP od 2 do 10. Skład otrzymanego preparatu przedstawiono w tabeli 1. Tak otrzymany preparat można podawać bezpośrednio w wodzie do picia dla pszczół, jak również jako dodatek do pokarmów pszczelich płynnych i w formie stałej, podawane jako tzw. ciasto dla pszczół.

Przykład 2. Badanie toksyczności preparatów według wynalazku na organizmy pszczół.

Preparat oligosacharydowy podawano zdrowym pszczołom, umieszczonym po 40 osobników w 24 standardowych klatkach i poddano obserwacji w ciągu 20 dni.

Grupy badawcze to:

1. Kontrola - 4 klatki ze zdrowymi pszczołami dokarmianymi przez cały czas eksperymentu tylko czystym pokarmem.

2. Grupa 1-4 klatki ze zdrowymi pszczołami dokarmianymi przez cały czas eksperymentu pokarmem z dodatkiem 0,01 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, do 1 L cukrowo-wodnego syropu otrzymanego przez wymieszanie 500 g cukru i 500 ml przegotowanej wody.

3. Grupa 2-4 klatki ze zdrowymi pszczołami dokarmianymi przez cały czas eksperymentu pokarmem z dodatkiem 0,5 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, dodanego do 999,5 g ciasta pszczelego.

4. Grupa 3-4 klatki ze zdrowymi pszczołami dokarmianymi przez cały czas eksperymentu pokarmem z dodatkiem 1 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, dodanego do 999 ml pokarmu dla pszczół - inwertowanego syropu,

5. Grupa 4-4 klatki ze zdrowymi pszczołami dokarmianymi przez cały czas eksperymentu pokarmem z dodatkiem 100 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, dodanego do 900 g ciasta dla pszczół.

6. Grupa 5-4 klatki ze zdrowymi pszczołami dokarmianymi przez cały czas eksperymentu pokarmem z dodatkiem 400 g preparatu przygotowanych wg. wynalazku, dodanego do 600 ml syropu cukrowo-wodnego otrzymanego przez wymieszanie 400 g cukru i 200 ml przegotowanej wody.

Po 20 dniach porównano liczbę żywych pszczół w poszczególnych klatkach z kontrolą. Liczba żywych pszczół w grupach badawczych dokarmianych preparatem według wynalazku, była porównywalna z liczbą żywych pszczół z grupy kontrolnej, co przedstawiono w tabeli 2.

Mając na względzie naturalną umieralność pszczół, należy stwierdzić, iż preparat białkowy według wynalazku to substancja nietoksyczna i w pełni bezpieczna jako dodatek do pszczelich pokarmów.

Przykład 3. Działanie preparatu według wynalazku zapobiegające zakażeniom zarodnikami Nosema (Vairimorpha) spp.

Z uwagi na fakt, iż do zarażenia nosemozą dochodzi w trakcie pobierania przez pszczoły pokarmu, nektaru, pyłku, wody czy też zapasów miodu i pierzgi, preparat otrzymany według wynalazku, podawano z pokarmem. Pszczoły umieszczone po 40 osobników w 24 standardowych klatkach, poddawano obserwacji w ciągu 20 dni. Preparat, podawano w początkowej fazie pszczołom zdrowym, a następnie sztucznie zakażonym Nosema (Vairimorpha) spp.

Pszczoły dokarmiano tworząc następujące grupy badawcze:

1. Kontrola - 4 klatki z zakażonymi pszczołami, dokarmianymi przez cały czas eksperymentu tylko czystym pokarmem.

2. Grupa 1-4 klatki, w których zdrowe pszczoły dokarmiano przez 6 dni pokarmem z dodatkiem z dodatkiem 0,01 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, do 1 L cukrowo-wodnego syropu otrzymanego przez wymieszanie 500 g cukru i 500 ml przegotowanej wody. Następnie pszczoły zakażano zarodnikami Nosema (Vairimorpha) spp. i do końca eksperymentu dokarmiano syropem cukrowo-wodnym z preparatem jak wyżej.

3. Grupa 2-4 klatki, w których zdrowe pszczoły dokarmiano przez 6 dni pokarmem z dodatkiem 0,5 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, dodanego do 999,5 g ciasta pszczelego. Następnie pszczoły zakażano zarodnikami Nosema (Vairimorpha) spp. i do końca eksperymentu dokarmiano ciastem pszczelim z preparatem jak wyżej.

4. Grupa 3-4 klatki, w których zdrowe pszczoły dokarmiano przez 6 dni pokarmem z dodatkiem 1 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, dodanego do 999 ml pokarmu dla pszczół inwertowanego syropu. Następnie pszczoły zakażano zarodnikami Nosema (Vairimorpha) spp. i do końca eksperymentu dokarmiano syropem cukru inwertowanego z preparatem jak wyżej.

5. Grupa 4- klatki, w których zdrowe pszczoły dokarmiano przez 6 dni pokarmem z dodatkiem 100 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, dodanego do 900 g ciasta dla pszczół. Następnie pszczoły zakażano zarodnikami Nosema (Vairimorpha) spp. i do końca eksperymentu dokarmiano ciastem dla pszczół z preparatem jak wyżej.

6. Grupa 5-3 klatki, w których zdrowe pszczoły dokarmiano przez 6 dni pokarmem z dodatkiem 400 g preparatu przygotowanych wg. wynalazku, dodanego do 600 ml syropu cukrowo-wodnego otrzymanego przez wymieszanie 360 g cukru i 240 ml przegotowanej wody. Następnie pszczoły zakażano zarodnikami Nosema (Vairimorpha) spp. i do końca eksperymentu dokarmiano ciastem z preparatem jak wyżej.

W końcowej fazie, z każdej grupy pszczół poddawanych eksperymentom, wykonywano standardowe rozciery do sporządzenia preparatów mikroskopowych. Obecne w preparatach zarodniki Nosema (Vairimorpha) spp. liczono w komorze Burkera obserwowanej w mikroskopie optycznym Olympus BX61 i porównywano z preparatem sporządzonym z rozciera z pszczół zakażonych z grupy kontrolnej.

Wyniki przeprowadzonych eksperymentów, przedstawione na rysunku jako fig. 1 oraz w tabeli 3, wskazują znacznie zmniejszoną ilość zarodników Nosema (Vairimorpha) spp. pozostałych w organizmach, zakażonych pszczół, którym na wstępie podawano preparat według wynalazku. Podczas gdy w grupie pszczół kontrolnych, zakażenie rozwinęło się do poziomu 610000 zarodników Nosema (Vairimorpha) spp./pszczołę, to w grupie pszczół którym podawano preparat, liczba zarodników zmalała w zakresie od 265000 zarodników/pszczołę w grupie 1 do 59450 zarodników/pszczołę w grupie 4.

Podawanie preparatu przed zakażeniem powodowało wyraźną ochronę pszczół przed zakażeniem nosemozą. Wyniki jednoznacznie wskazują na dużą skuteczność preparatu jako środka zapobiegającego nosemozie według wynalazku.

Wykazano, że otrzymany sposobem według wynalazku, innowacyjny preparat oligosacharydowy, w sposób znaczący zabezpiecza pszczoły miodne przed zakażeniem mikrosporydiami Nosema (Vairimorpha) spp.

Przykład 4. Działanie preparatu według wynalazku zwalczające patogeny nosemozy.

Skuteczność preparatu jako środka zwalczającego chorobotwórcze patogeny nosemozy udowodniono zakażając pszczoły mikrosporydiami Nosema (Vairimorpha) spp., a następnie po rozwinięciu zakażenia, podając preparat w różnych stężeniach kilku grupom badawczym. Pszczoły umieszczono po 40 osobników w 16 standardowych klatkach i poddawano obserwacji w ciągu 20 dni.

Pszczoły dokarmiano tworząc następujące grupy badawcze:

1. Kontrola - 4 klatki z zakażonymi pszczołami, dokarmianymi przez cały czas eksperymentu tylko czystym pokarmem.

2. Grupa A - 4 klatki, w których pszczoły były zakażane Nosema (Vairimorpha) spp., a następnie karmione pokarmem z dodatkiem 0,1 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, do 1 L cukrowo-wodnego syropu otrzymanego przez wymieszanie 500 g cukru i 500 ml przegotowanej wody.

3. Grupa B - 4 klatki, w których pszczoły były zakażane Nosema (Vairimorpha) spp., a następnie karmione pokarmem z dodatkiem 5 g preparatu, przygotowanego wg. wynalazku, dodanego do 995 g ciasta pszczelego.

4. Grupa C - 4 klatki, w których pszczoły były zakażane Nosema (Vairimorpha) spp., a następnie karmione pokarmem z dodatkiem 2 g preparatu przygotowanego wg. wynalazku, dodanego do 998 ml pokarmu dla pszczół - inwertowanego syropu.

W końcowej fazie, z każdej grupy pszczół poddawanych eksperymentom, wykonywano standardowe rozciery do sporządzenia preparatów mikroskopowych. Obecne w preparatach zarodniki Nosema (Vairimorpha) spp. liczono w komorze Burkera obserwowanej w mikroskopie optycznym Olympus BX61 i porównywano z preparatem sporządzonym z rozciera z pszczół zakażonych z grupy kontrolnej.

Wyniki przeprowadzonych eksperymentów, przedstawione na rysunku jako fig. 2 oraz w tabeli 4, wskazują znacznie zmniejszoną ilość zarodników Nosema (Vairimorpha) spp. pozostałych w organizmach zakażonych pszczół, którym podawano preparat według wynalazku po zakażeniu. Podczas gdy w grupie pszczół kontrolnych, zakażenie rozwinęło się do poziomu 725000 zarodników Nosema (Vairimorpha) spp./pszczołę, to w grupie pszczół którym podawano preparat, liczba zarodników zmalała do 250000 zarodników/pszczołę (grupa C).

Wyniki jednoznacznie wskazują na skuteczność preparatu według wynalazku do zwalczania nosemozy.

Claims (2)

1. Preparat oligosacharydowy, zawierający frakcję glukooligosacharydów o stopniu polimeryzacji od 2 do 10, wyselekcjonowanych w wyniku kwaśnej hydrolizy a-(1^3)-glukanów z owocników żółciaka siarkowego (Laetiporus sulphureus) do zastosowania w zapobieganiu i zwalczaniu nosemozy u pszczół.

2. Preparat do zastosowania według zastrz. 1 znamienny tym, że wykazuje najkorzystniejsze działanie gdy jest stosowany jest w zakresie od 0,1 g do 400 g preparatu na 1 L lub 1 kg pokarmu dla pszczół, co odpowiada zawartości od 0,01 do 40% wagowych tego produktu.