PL248029B1 - Method of bioremediation of soils contaminated with creosote oil - Google Patents

Method of bioremediation of soils contaminated with creosote oil

Info

Publication number
PL248029B1
PL248029B1 PL446351A PL44635123A PL248029B1 PL 248029 B1 PL248029 B1 PL 248029B1 PL 446351 A PL446351 A PL 446351A PL 44635123 A PL44635123 A PL 44635123A PL 248029 B1 PL248029 B1 PL 248029B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
weight
soil
medium
parts
amount
Prior art date
Application number
PL446351A
Other languages
Polish (pl)
Other versions
PL446351A1 (en
Inventor
Olga Marchut-Mikołajczyk
Piotr Drożdżyński
Jadwiga Zabielska-Matejuk
Mateusz Sydow
Anna Stangierska
Mateusz Warkocki
Filip Perkiewicz
Original Assignee
Nasycalnia Podkladow Spolka Akcyjna
Politechnika Lodzka
Politechnika Poznanska
Siec Badawcza Lukasiewicz Poznanski Instytut Tech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nasycalnia Podkladow Spolka Akcyjna, Politechnika Lodzka, Politechnika Poznanska, Siec Badawcza Lukasiewicz Poznanski Instytut Tech filed Critical Nasycalnia Podkladow Spolka Akcyjna
Priority to PL446351A priority Critical patent/PL248029B1/en
Publication of PL446351A1 publication Critical patent/PL446351A1/en
Publication of PL248029B1 publication Critical patent/PL248029B1/en

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
    • A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Business, Economics & Management (AREA)
  • Emergency Management (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Processing Of Solid Wastes (AREA)

Abstract

Sposób bioremediacji gruntów zanieczyszczonych olejem kreozotowym charakteryzuje się tym, że do gleby wprowadza się poprzez zraszanie biopreparat bakteryjny Bacillus pumilus 2A o gęstości optycznej OD600 2,4, w ilości 2 - 3 l/m2 skażonego gruntu, następnie homogenizuje się grunt i prowadzi proces bioremediacji w okresie 160 - 180 dni, utrzymując wilgotność gruntu na poziomie 25% - 30%, dokonując napowietrzania co 10 - 14 dni, kolejno po 30 dniach powtarza się wprowadzenie biopreparatu bakteryjnego Bacillus pumilus 2A o gęstości optycznej OD600 2,4 w takiej samej dawce jak pierwotnie. Następnie w okresie 50 - 60 dni wprowadza się poprzez zraszanie biopreparatem enzymatycznym enzymów Mucor racemosus A37 w postaci zawiesiny w wodzie o stężeniu 8 - 10g/l, w ilości 2 - 3 l/m2 gruntu i przeprowadza homogenizację gruntu i kontynuuje proces bioremediacji.The method of bioremediation of soil contaminated with creosote oil is characterized by the introduction of the bacterial biopreparation Bacillus pumilus 2A with an optical density of OD600 2.4 into the soil by sprinkling it in the amount of 2 - 3 l/m2 of contaminated soil, then the soil is homogenized and the bioremediation process is carried out for a period of 160 - 180 days, maintaining the soil moisture at the level of 25% - 30%, aerating every 10 - 14 days, then after 30 days the introduction of the bacterial biopreparation Bacillus pumilus 2A with an optical density of OD600 2.4 is repeated in the same dose as the original. Then, within a period of 50 - 60 days, the enzymatic biopreparation of Mucor racemosus A37 enzymes is introduced by spraying in the form of a suspension in water at a concentration of 8 - 10 g/l, in the amount of 2 - 3 l/m2 of soil, and the soil is homogenized and the bioremediation process is continued.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób bioremediacji gleby zanieczyszczonej olejem kreozotowym w miejscu skażenia (in situ) z wykorzystaniem mikroorganizmów.The subject of the invention is a method of bioremediation of soil contaminated with creosote oil at the site of contamination (in situ) using microorganisms.

Znane są sposoby bioremediacji gleby z zanieczyszczeń za pomocą różnych metod biologicznych, wykorzystujących potencjał metaboliczny mikroorganizmów, przyswajających zanieczyszczenia jako źródło węgla i przekształcających je do prostych związków chemicznych, a w końcowej fazie do dwutlenku węgla i wody.There are known methods of bioremediation of soil pollutants using various biological methods that utilize the metabolic potential of microorganisms, absorbing pollutants as a carbon source and transforming them into simple chemical compounds, and ultimately into carbon dioxide and water.

W czasopiśmie World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2003, vol. 19, 571-581, opisano bioremediację gleby zanieczyszczonej olejem kreozotowym metodą landfarmingu, z wykorzystaniem technik biostymulacji i bioagmentacji.The World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2003, vol. 19, 571-581, describes the bioremediation of soil contaminated with creosote oil by landfarming, using biostimulation and bioagmentation techniques.

W czasopiśmie International Biodeterioration & Biodegradation, 2016, vol. 106, 117-126 opisano metodę bioremediacji gleby skażonej historycznie olejem kreozotowym, w warunkach laboratoryjnych i próbach polowych, wykorzystując technikę biostymulacji mikroflory atochtonicznej.The journal International Biodeterioration & Biodegradation, 2016, vol. 106, 117-126 describes a method of bioremediation of soil historically contaminated with creosote oil, in laboratory conditions and field trials, using the technique of biostimulation of atochthonous microflora.

W czasopiśmie „Inżynieria ekologiczna”, 2018, vol 19 (5)):47-52 opisano metodę bioremediacji gruntów poprzemysłowych zanieczyszczonych olejem kreozotowym z zastosowaniem biopreparatu opartego na bazie mikroorganizmów autochtonicznych. Metoda biologiczna in situ została zastosowana w połączeniu z metodami fizycznymi (płukania gruntów) i dalszego oczyszczania biologicznego na pryzmie technologicznej usytuowanej w obrębie terenu, na którym prowadzono prace.The journal "Ecological Engineering", 2018, vol. 19 (5)):47-52 describes a method for bioremediation of post-industrial soils contaminated with creosote oil using a biopreparation based on indigenous microorganisms. The in situ biological method was used in combination with physical methods (soil flushing) and further biological treatment in a technological pile located within the area where the work was carried out.

W polskim zgłoszeniu patentowym P.380007 oraz w czasopiśmie Ochrona Środowiska, 2011, vol. 33,2:31-32 opisano technologię oczyszczania (bioaugmentacji) gruntu zanieczyszczonego olejem kreozotowym z wykorzystaniem drożdży Yarrowia lipolytica w postaci immobilizowanej.The Polish patent application P.380007 and the journal Ochrona Środowiska, 2011, vol. 33,2:31-32 describe the technology of purification (bioaugmentation) of soil contaminated with creosote oil using the Yarrowia lipolytica yeast in an immobilized form.

W amerykańskim opisie patentowym US 5242825 ujawniono sposób remediacji środowiska zanieczyszczonego kreozotem z zastosowaniem bakterii szczepu Pseudomonas paucimobilis EPA 505 cs, natomiast w zgłoszeniu US 5614410 opisano stosowanie bakterii Psudomonas paucimobilis.US patent description US 5242825 discloses a method for remediating an environment contaminated with creosote using the Pseudomonas paucimobilis EPA 505 cs strain of bacteria, while application US 5614410 describes the use of Psudomonas paucimobilis bacteria.

Z opisu polskiego zgłoszenia patentowego P.446333, znany jest sposób otrzymywania biopreparatu do degradacji węglowodorów oleju kreozotowego polegający na tym, że szczep endofitycznych bakterii Bacillus pumilus 2A przeszczepia się na skosy zawierające aktywujące wysterylizowane podłoże stałe o składzie w częściach wagowych: 0,5 części ekstraktu drożdżowego, 1 część tryptonu, 1 część chlorku sodu, 2,5 części agaru, wodę redestylowaną, o pH 6,7, kolejno nanosi się na skosy 20 μ! oleju kreozotowego typu C i inkubuje w temperaturze 30°C - 32°C przez 24 godziny. Następnie czynność powtarza się, po czym pożywkę płynną zawierającą w 1 l : 0,5 części wagowych ekstraktu drożdżowego, 1 część wagową tryptonu, 1 część wagową chlorku sodu, wodę redestylowaną, po doprowadzeniu pH do wartości 6,5-6,7 umieszcza się w kolbach płaskodennych w ilości 8% v/v pożywki i sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 15 minut. Kolejno otrzymaną pożywkę szczepi się kulturą bakterii Bacillus pumilus 2A pochodzącą ze skosu, aktywowanego podwójnie olejem kreozotowym typu C, w ilości 0,4 ml kultury zawierającej 109 komórek/ml i prowadzi hodowlę przez 24 godziny na wytrząsarce mimośrodowej, przy szybkości obrotów 180 rpm i amplitudzie 4,5 cm, w warunkach tlenowych, w temperaturze 30-32°C, po czym pożywkę płynną zawierająca w 1 l : 0,5 części wagowych ekstraktu drożdżowego, 1 część wagową tryptonu, 1 część wagową chlorku sodu, wodę redestylowaną, po doprowadzeniu pH do wartości 6,5-6,7 umieszcza się w fermentorze laboratoryjnym, sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 20 minut i szczepi zawiesiną bakterii Bacillus pumilus 2A zawierającą 109 komórek/ml w ilości 2%/1 l pożywki otrzymanej w czasie 24-godzinnej prehodowli, przy czym hodowle w fermentorze prowadzi się w czasie 24-48 godzin dozując odpieniacz w ilości 0,1-1 ml/1 l podłoża.From the description of the Polish patent application P.446333, a method of obtaining a biopreparation for the degradation of creosote oil hydrocarbons is known, consisting in that a strain of endophytic bacteria Bacillus pumilus 2A is transplanted onto slants containing an activating sterilized solid medium with the composition in parts by weight: 0.5 parts of yeast extract, 1 part of tryptone, 1 part of sodium chloride, 2.5 parts of agar, redistilled water, pH 6.7, 20 μl of type C creosote oil is subsequently applied onto the slants and incubated at 30°C - 32°C for 24 hours. Then the operation is repeated, after which the liquid medium containing in 1 l: 0.5 parts by weight of yeast extract, 1 part by weight of tryptone, 1 part by weight of sodium chloride, redistilled water, after adjusting the pH to the value of 6.5-6.7 is placed in flat-bottomed flasks in the amount of 8% v/v of the medium and sterilized at 121°C for 15 minutes. The obtained medium is then inoculated with a culture of Bacillus pumilus 2A bacteria from a slant, double activated with creosote oil type C, in the amount of 0.4 ml of the culture containing 109 cells/ml and cultivated for 24 hours on an eccentric shaker, at a rotation speed of 180 rpm and an amplitude of 4.5 cm, in aerobic conditions, at a temperature of 30-32°C, after which a liquid medium containing in 1 l: 0.5 parts by weight of yeast extract, 1 part by weight of tryptone, 1 part by weight of sodium chloride, redistilled water, after adjusting the pH to 6.5-6.7 is placed in a laboratory fermenter, sterilized at a temperature of 121°C for 20 minutes and inoculated with a suspension of Bacillus pumilus 2A bacteria containing 109 cells/ml in the amount of 2%/1 l of the medium obtained in during the 24-hour pre-cultivation, wherein the culturing in the fermenter is carried out for 24-48 hours by dosing the skimmer in the amount of 0.1-1 ml/1 l of substrate.

Z opisu polskiego zgłoszenia patentowego P.446335, znany jest sposób otrzymywania preparatu enzymów wspomagającego biodegradację oleju kreozotowego, polegający na tym, że szczep pleśni Mucor racemosus A37 uaktywnia się na skosach agarowych zawierających w % wagowych: 0,5-1,5% oleju kreozotowego, 3% agaru, reszta brzeczki piwowarskiej, następnie hoduje się na tym podłożu inokulum w temperaturze 30°C w czasie 72 godzin, zmywa się wyhodowane zarodniki wodnym roztworem niejonowego surfaktanta użytego w ilości 0,01-0,03% v/v, zaszczepia się otrzymanym inokulum płynne podłoże hodowlane, wysterylizowane w temperaturze 121°C, w czasie 20 minut, zawierające w procentach wagowych: 0,2 3% oleju kreozotowego, 1-5% oleju rzepakowego, 2-6% namoku kukurydzianego, 0,5-1% glukozy, 0,2% KH2PO4, 0,05% KCI, 0,05% NaNOs i wodę do 100%, o wyjściowym pH 4,6-5,0, stosując inokulum w ilości 2-5% v/v płynnego podłoża hodowlanego i prowadzi hodowlę wstrząsaną w temperaturze 27-32°C, w czasie 72-84 godziny przy stopniu napełnienia kolb 10-20% objętościo wych na wytrząsarce o szybkości obrotowej 160-200 minut'1, a następnie dokonuje separacji wyhodowanej biomasy, płucze ją wodą destylowaną, odwadnia mieszaniną heksan: aceton w proporcjach 1:3, a następnie osusza ją i rozdrabnia.From the description of the Polish patent application P.446335, there is known a method of obtaining an enzyme preparation supporting the biodegradation of creosote oil, consisting in that the Mucor racemosus A37 mold strain is activated on agar slopes containing in % by weight: 0.5-1.5% creosote oil, 3% agar, the rest of brewing wort, then the inoculum is cultivated on this medium at a temperature of 30°C for 72 hours, the cultivated spores are washed off with an aqueous solution of a non-ionic surfactant used in the amount of 0.01-0.03% v/v, the obtained inoculum is inoculated into a liquid culture medium, sterilized at a temperature of 121°C for 20 minutes, containing in % by weight: 0.2-3% creosote oil, 1-5% rapeseed oil, 2-6% corn steep liquor, 0.5-1% glucose, 0.2% KH2PO4, 0.05% KCl, 0.05% NaNOs and water to 100%, with an initial pH of 4.6-5.0, using an inoculum of 2-5% v/v of liquid culture medium and carrying out a shaking culture at a temperature of 27-32°C, for 72-84 hours with the flasks filled to 10-20% by volume on a shaker with a rotational speed of 160-200 minutes' 1 , and then separating the grown biomass, washing it with distilled water, dehydrating it with a hexane: acetone mixture in the proportions of 1:3, and then drying and grinding it.

Olej kreozotowy stanowi mieszaninę niezwykle trudno-degradowalnych wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, przez co utrudnione jest jego całkowite usunięcie ze skażonego gruntu. Celem wynalazku jest opracowanie sposobu bioremediacji gruntów zanieczyszczonych olejem kreozotowym, pozwalającego na efektywne usunięcie zanieczyszczeń w miejscu skażenia, poprzez połączenie degradacji mikrobiologicznej z enzymatyczną biotransformacją.Creosote oil is a mixture of extremely difficult-to-degradate polycyclic aromatic hydrocarbons, making its complete removal from contaminated soil difficult. The aim of the invention is to develop a method for bioremediation of soils contaminated with creosote oil, enabling effective removal of contaminants at the site of contamination by combining microbiological degradation with enzymatic biotransformation.

Sposób bioremediacji gruntów zanieczyszczonych olejem kreozotowym, charakteryzuje się tym, że do gleby wprowadza się poprzez zraszanie biopreparat bakteryjny Bacillus pumilus 2A o gęstości optycznej ODsoo 2,4, w ilości 2-3 l/m2 skażonego gruntu, następnie homogenizuje się grunt i prowadzi proces bioremediacji w okresie 160-180 dni, utrzymując wilgotność gruntu na poziomie 25-30%, dokonując napowietrzania co 10-14 dni, kolejno po 30 dniach powtarza się wprowadzenie biopreparatu bakteryjnego Bacillus pumilus 2A o gęstości optycznej OD600 2,4 w takiej samej dawce jak pierwotnie, następnie w okresie 50-60 dni wprowadza się poprzez zraszanie biopreparat enzymatyczny enzymów Mucor racemosus A 37 w postaci zawiesiny w wodzie o stężeniu 8-10 g/l, w ilości 2-3 l/m2 gruntu i przeprowadza homogenizację gruntu i kontynuuje proces bioremediacji.The method of bioremediation of soils contaminated with creosote oil is characterized in that the bacterial biopreparation Bacillus pumilus 2A with an optical density of OD600 2.4 is introduced into the soil by sprinkling it in the amount of 2-3 l/ m2 of contaminated soil, then the soil is homogenized and the bioremediation process is carried out for a period of 160-180 days, maintaining the soil moisture at the level of 25-30%, aerating every 10-14 days, then after 30 days the introduction of the bacterial biopreparation Bacillus pumilus 2A with an optical density of OD600 2.4 is repeated in the same dose as the original, then in the period of 50-60 days the enzymatic biopreparation of enzymes Mucor racemosus A 37 is introduced by sprinkling it in the form of a suspension in water at a concentration of 8-10 g/l, in the amount of 2-3 l/ m2 soil and homogenizes the soil and continues the bioremediation process.

Korzystnie sposób prowadzi się go w warunkach tlenowych, w temperaturze 20-30°C.Preferably, the method is carried out under aerobic conditions at a temperature of 20-30°C.

Korzystnie biopreparat bakteryjny Bacillus pumilus 2A otrzymuje się przeszczepiając szczep endofitycznych bakterii Bacillus pumilus 2A na skosy zawierające aktywujące wysterylizowane podłoże stałe o składzie w częściach wagowych: 0,5 części ekstraktu drożdżowego, 1 część tryptonu, 1 część chlorku sodu, 2,5 części agaru, wodę redestylowaną, o pH 6,7, kolejno nanosi się na skosy 20 μl oleju kreozotowego typu C i inkubuje w temperaturze 30°C - 32°C przez 24 godziny, następnie czynność powtarza się, po czym pożywkę płynną zawierającą w 1 l : 0,5 części wagowych ekstraktu drożdżowego, 1 część wagową tryptonu, 1 część wagową chlorku sodu, wodę redestylowaną, po doprowadzeniu pH do wartości 6,5-6,7 umieszcza się w kolbach płaskodennych w ilości 8% v/v pożywki i sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 15 minut, kolejno otrzymaną pożywkę szczepi się kulturą bakterii Bacillus pumilus 2A pochodzącą ze skosu, aktywowanego podwójnie olejem kreozotowym typu C, w ilości 0,4 ml kultury zawierającej 109 komórek/ml i prowadzi hodowlę przez 24 godziny na wytrząsarce mimośrodowej, przy szybkości obrotów 180 rpm i amplitudzie 4,5 cm, w warunkach tlenowych, w temperaturze 30-32°C, po czym pożywkę płynną zawierająca w 1 l : 0,5 części wagowych ekstraktu drożdżowego, 1 część wagową tryptonu, 1 część wagową chlorku sodu, wodę redestylowaną, po doprowadzeniu pH do wartości 6,5-6,7 umieszcza się w fermentorze laboratoryjnym, sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 20 minut i szczepi zawiesiną bakterii Bacillus pumilus 2A zawierającą 109 komórek/ml w ilości 2%/1 l pożywki otrzymanej w czasie 24-godzinnej prehodowli, przy czym hodowle w fermentorze prowadzi się w czasie 24-48 godzin dozując odpieniacz w ilości 0,1-1 ml/1 l podłoża.Preferably, the Bacillus pumilus 2A bacterial biopreparation is obtained by transplanting a strain of endophytic Bacillus pumilus 2A bacteria onto slants containing an activating sterilized solid medium with the following composition in parts by weight: 0.5 parts of yeast extract, 1 part of tryptone, 1 part of sodium chloride, 2.5 parts of agar, redistilled water, pH 6.7, 20 μl of creosote oil type C is subsequently applied onto the slants and incubated at 30°C - 32°C for 24 hours, then the operation is repeated, after which the liquid medium containing in 1 l: 0.5 parts by weight of yeast extract, 1 part by weight of tryptone, 1 part by weight of sodium chloride, redistilled water, after adjusting the pH to 6.5-6.7 is placed in flat-bottomed flasks in the amount of 8% v/v medium and sterilized at 121°C for 15 minutes, then the obtained medium is inoculated with a culture of Bacillus pumilus 2A bacteria from a slant, double activated with creosote oil type C, in the amount of 0.4 ml of culture containing 109 cells/ml and cultivated for 24 hours on an eccentric shaker, at a rotation speed of 180 rpm and an amplitude of 4.5 cm, in aerobic conditions, at a temperature of 30-32°C, then the liquid medium containing in 1 l: 0.5 parts by weight of yeast extract, 1 part by weight of tryptone, 1 part by weight of sodium chloride, redistilled water, after adjusting the pH to 6.5-6.7 is placed in a laboratory fermenter, sterilized at 121°C for 20 minutes and inoculated with a suspension of Bacillus pumilus 2A bacteria containing 10 9 cells/ml in the amount of 2%/1 l of the medium obtained during the 24-hour pre-culture, while the cultures in the fermenter are carried out for 24-48 hours with the skimmer dosed in the amount of 0.1-1 ml/1 l of the medium.

Korzystnie biopreparat bakteryjny Bacillus pumilus 2A otrzymuje się przeszczepiając szczep endofitycznych bakterii Bacillus pumilus 2A, na skosy zawierające aktywujące wysterylizowane podłoże stałe zawierające w częściach wagowych: 0,2 części siarczanu magnezu siedmiowodnego, 0,02 części chlorku wapnia, 1 część diwodorofosforanu potasu, 1 część wodorofosforanu dipotasu, 1 część azotanu amonu, 0,05 części chlorku żelaza (III), o pH 6,7, kolejno nanosi się 20 μl oleju kreozotowego typu C i inkubuje w temperaturze 30°C przez 24 godziny, następnie czynność powtarza się, po czym pożywkę płynną zawierającą w 1 l : 0,5 części wagowych ekstraktu drożdżowego, 1 część wagową tryptonu, 1 część wagową chlorku sodu, wodę redestylowaną, po doprowadzeniu pH do wartości 6,5 umieszcza się w kolbach płaskodennych w ilości 8% v/v pożywki i sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 15 minut, kolejno otrzymaną pożywkę szczepi się kulturą bakterii Bacillus pumilus 2A pochodzącą ze skosu, aktywowanego podwójnie olejem kreozotowym typu C, w ilości 0,4 ml kultury zawierającej 109 komórek/ml i prowadzi hodowlę przez 16 godzin na wytrząsarce mimośrodowej, przy szybkości obrotów 180 rpm i amplitudzie 4,5 cm, w warunkach tlenowych, w temperaturze 31°C, po czym pożywkę płynną zawierającą w 1 l : 0,02 części wagowych chlorku wapnia, 1 część wagową diwodorofosforanu potasu, 1 część wagową wodorofosforanu dipotasu, 1 część wagową azotanu amonu, 0,05 części chlorku żelaza (III), po doprowadzeniu pH do wartości 6,5 umieszcza się w fermentorze laboratoryjnym, sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 20 minut i szczepi zawiesiną bakterii Bacillus pumilus 2A zawierającą 109 komórek/ml w ilości 2% na litr pożywki otrzymanej w czasie 24-godzinnej prehodowli, przy czym hodowle w fermentorze prowadzi się w czasie 36 godzin dozując odpieniacz w ilości 0,5 ml/1 l podłoża.Preferably, the Bacillus pumilus 2A bacterial biopreparation is obtained by transplanting a strain of endophytic Bacillus pumilus 2A bacteria onto slants containing an activating sterilized solid medium containing in parts by weight: 0.2 parts of magnesium sulfate heptahydrate, 0.02 parts of calcium chloride, 1 part of potassium dihydrogen phosphate, 1 part of dipotassium hydrogen phosphate, 1 part of ammonium nitrate, 0.05 parts of iron (III) chloride, with pH 6.7, 20 μl of type C creosote oil is subsequently applied and incubated at 30°C for 24 hours, then the operation is repeated, after which a liquid medium containing in 1 l: 0.5 parts by weight of yeast extract, 1 part by weight of tryptone, 1 part by weight of sodium chloride, redistilled water, after adjusting the pH to 6.5 is placed in flat-bottomed flasks in the amount of 8% v/v of the medium and sterilized at 121°C for 15 minutes, then the obtained medium is inoculated with a culture of Bacillus pumilus 2A bacteria from a slant, double activated with creosote oil type C, in the amount of 0.4 ml of culture containing 109 cells/ml and cultivated for 16 hours on an eccentric shaker, at a rotation speed of 180 rpm and an amplitude of 4.5 cm, in aerobic conditions, at a temperature of 31°C, then a liquid medium containing in 1 l: 0.02 parts by weight of calcium chloride, 1 part by weight of potassium dihydrogen phosphate, 1 part by weight of dipotassium hydrogen phosphate, 1 part by weight of ammonium nitrate, 0.05 parts of iron (III) chloride, after adjusting the pH to 6.5 is placed in a laboratory fermenter, sterilized in at 121°C for 20 minutes and inoculated with a suspension of Bacillus pumilus 2A bacteria containing 109 cells/ml in the amount of 2% per liter of medium obtained during 24-hour pre-culture, while the cultivation in the fermenter is carried out for 36 hours with the skimmer dosed in the amount of 0.5 ml/1 liter of medium.

Korzystnie biopreparat enzymatyczny enzymów Mucor racemosus A 37 otrzymuje się uaktywniając szczep pleśni Mucor racemosus A37 na skosach agarowych zawierających w % wagowych: 0,5-1,5% oleju kreozotowego, 3% agaru, reszta brzeczki piwowarskiej, następnie hoduje się na tym podłożu inokulum w temperaturze 30°C w czasie 72 godzin, zmywa się wyhodowane zarodniki wodnym roztworem niejonowego surfaktanta użytego w ilości 0,01-0,03% v/v, zaszczepia się otrzymanym inokulum płynne podłoże hodowlane, wysterylizowane w temperaturze 121°C, w czasie 20 minut, zawierające w procentach wagowych: 0,2-3% oleju kreozotowego, 1-5% oleju rzepakowego, 2-6% namoku kukurydzianego, 0,5-1% glukozy, 0,2% KH2PO4, 0,05% KCI, 0,05% NaNO3 i wodę do 100%, o wyjściowym pH 4,6-5,0, stosując inokulum w ilości 2-5% v/v płynnego podłoża hodowlanego i prowadzi hodowlę wstrząsaną w temperaturze 27-32°C, w czasie 72-84 godziny przy stopniu napełnienia kolb 10-20% objętościowych na wytrząsarce o szybkości obrotowej 160-200 minut-1, a następnie dokonuje separacji wyhodowanej biomasy, płucze ją wodą destylowaną, odwadnia mieszaniną heksan:aceton w proporcjach 1:3, a następnie osusza ją i rozdrabnia.Preferably, the enzymatic biopreparation of Mucor racemosus A 37 enzymes is obtained by activating the Mucor racemosus A37 mold strain on agar slants containing in weight percent: 0.5-1.5% creosote oil, 3% agar, the rest brewing wort, then the inoculum is cultivated on this medium at a temperature of 30°C for 72 hours, the cultivated spores are washed off with an aqueous solution of a non-ionic surfactant used in an amount of 0.01-0.03% v/v, the obtained inoculum is inoculated into a liquid culture medium sterilized at a temperature of 121°C for 20 minutes, containing in weight percent: 0.2-3% creosote oil, 1-5% rapeseed oil, 2-6% corn steep liquor, 0.5-1% glucose, 0.2% KH2PO4, 0.05% KCl, 0.05% NaNO3 and water to 100%, with an initial pH of 4.6-5.0, using an inoculum of 2-5% v/v of liquid culture medium and carrying out a shaking culture at a temperature of 27-32°C, for 72-84 hours with the flask filling degree of 10-20% by volume on a shaker with a rotational speed of 160-200 min-1, and then separating the grown biomass, washing it with distilled water, dehydrating it with a hexane:acetone mixture in a proportion of 1:3, and then drying and grinding it.

Zastosowanie w procesie bioremediacji połączenia bioaugumentacji prowadzonej przy użyciu biopreparatu bakterii Bacillus pumilus 2A z bioremediacją enzymatyczną preparatem enzymatycznym Mucor racemosus A37, powoduje zwiększenie efektywności degradacji oleju kreozotowego w glebie do poziomu średnio 75-85%, w porównaniu z wydajnością 60-70% odnotowaną w wariancie bez użycia preparatu enzymatycznego.The use of a combination of bioaugumentation carried out using the Bacillus pumilus 2A bacterial biopreparation with enzymatic bioremediation using the Mucor racemosus A37 enzymatic preparation in the bioremediation process increases the efficiency of creosote oil degradation in the soil to an average level of 75-85%, compared to the efficiency of 60-70% recorded in the variant without the use of the enzymatic preparation.

Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady.The method according to the invention is illustrated by the following examples.

Przykład IExample I

Przygotowano biopreparat szczepu bakterii Bacillus pumilus 2A otrzymanego znanym, opisanym wyżej sposobem. Do gleby zanieczyszczonej olejem kreozotowym wprowadzono poprzez zraszanie biopreparat bakteryjny o gęstości optycznej ODsoo 2,4, w ilości 2 I na 1 m2 skażonego gruntu, wykonano homogenizację gruntu poprze wymieszanie koparką i prowadzono proces bioremediacji przez 160 dni, utrzymując wilgotność gruntu na poziomie 25%, dokonując napowietrzania z użyciem koparki co 10 dni. Po 30 dniach procesu ponownie przeprowadzono inokulację oczyszczanego gruntu poprzez jego zraszanie biopreparatem Bacillus pumilus 2A, w ilości 2 I na 1 m2 gruntu. W 50 dniu bioremediacji wprowadzono do oczyszczanego gruntu poprzez zraszanie wieloenzymowy preparat Mucor racemosus A37, otrzymany znanym sposobem w postaci zawiesiny preparatu w wodzie o stężeniu 8 g/l, w ilości 2 I na 1 m2 gruntu i przeprowadzono homogenizacje gruntu przy użyciu koparki i kontynuowano proces bioremediacji.A biopreparation of the Bacillus pumilus 2A bacterial strain was prepared using the known method described above. A bacterial biopreparation with an optical density of 2.4 (ODsoo) was applied to soil contaminated with creosote oil by spraying at a rate of 2 I per m² of contaminated soil. The soil was homogenized by mixing with an excavator, and the bioremediation process was conducted for 160 days, maintaining soil moisture at 25% and aerating with an excavator every 10 days. After 30 days, the treated soil was re-inoculated by spraying with the Bacillus pumilus 2A biopreparation at a rate of 2 I per m² of soil. On the 50th day of bioremediation, the multi-enzyme preparation Mucor racemosus A37, obtained by a known method in the form of a suspension of the preparation in water at a concentration of 8 g/l, was introduced into the purified soil by spraying, in the amount of 2 l per 1 m2 of soil, and the soil was homogenized using an excavator and the bioremediation process was continued.

Stwierdzono 75% ubytek sumy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA), wchodzących w skład oleju kreozotowego, tj. o 10% większy niż w przypadku prowadzenia bioremediacji jedynie przy użyciu biopreparatu bakteryjnego B. pumilus 2A i o 35% wyższy niż w przypadku prowadzenia procesu bioremediacji bez wprowadzania biopreparatów.A 75% reduction in the total polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) contained in creosote oil was observed, i.e. 10% higher than in the case of bioremediation conducted only with the use of the bacterial biopreparation B. pumilus 2A and 35% higher than in the case of bioremediation conducted without the introduction of biopreparations.

Przykład IIExample II

Przygotowano biopreparat szczepu bakterii Bacillus pumilus 2A otrzymanego znanym, opisanym wyżej sposobem. Do gleby zanieczyszczonej olejem kreozotowym wprowadzono poprzez zraszanie biopreparat bakteryjny o gęstości optycznej ODsoo 2,4, w ilości 2,5 I na 1 m2 skażonego gruntu, wykonano homogenizację gruntu poprzez wymieszanie koparką i prowadzono proces bioremediacji przez 170 dni, utrzymując wilgotność gruntu na poziomie 25%, dokonując napowietrzania z użyciem koparki co 12 dni. Po 30 dniach procesu ponownie przeprowadzono inokulację oczyszczanego gruntu poprzez jego zraszanie biopreparatem Bacillus pumilus 2A, w ilości 2,5 I na 1 m2 gruntu. W 55 dniu bioremediacji wprowadzono do oczyszczanego gruntu poprzez zraszanie wieloenzymowy preparat Mucor racemosus A37, otrzymany znanym sposobem w postaci zawiesiny preparatu w wodzie o stężeniu 9 g/l, w ilości 2,5 I na 1 m2 gruntu i przeprowadzono homogenizację gruntu przy użyciu koparki i kontynuowano proces bioremediacji.A biopreparation of the Bacillus pumilus 2A bacterial strain was prepared using the known method described above. A bacterial biopreparation with an optical density of 2.4 (ODsoo 2.4) was sprayed onto soil contaminated with creosote oil, at a rate of 2.5 L per m² of contaminated soil. The soil was homogenized by mixing with an excavator, and the bioremediation process continued for 170 days, maintaining soil moisture at 25% and aerating with an excavator every 12 days. After 30 days of the process, the treated soil was re-inoculated by spraying with the Bacillus pumilus 2A biopreparation at a rate of 2.5 L per m² of soil. On the 55th day of bioremediation, the multi-enzyme preparation Mucor racemosus A37, obtained by a known method in the form of a suspension of the preparation in water at a concentration of 9 g/l, was introduced into the cleaned soil by spraying, in the amount of 2.5 l per 1 m2 of soil, and the soil was homogenized using an excavator and the bioremediation process was continued.

Stwierdzono 79% ubytek sumy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA), wchodzących w skład oleju kreozotowego, tj. o 15% większy niż w przypadku prowadzenia bioremediacji jedynie przy użyciu biopreparatu bakteryjnego B. pumilus 2A i o 37% wyższy niż w przypadku prowadzenia procesu bioremediacji bez wprowadzania biopreparatów.A 79% reduction in the total polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) contained in creosote oil was observed, i.e. 15% higher than in the case of bioremediation conducted only with the use of the bacterial biopreparation B. pumilus 2A and 37% higher than in the case of bioremediation conducted without the introduction of biopreparations.

Przykład IIIExample III

Przygotowano biopreparat szczepu bakterii Bacillus pumilus 2A otrzymanego znanym, opisanym wyżej sposobem. Do gleby zanieczyszczonej olejem kreozotowym wprowadzono poprzez zraszanie biopreparat bakteryjny o gęstości optycznej ODsoo 2,4, w ilości 3 I na 1 m2 skażonego gruntu, wykonano homogenizację gruntu poprzez wymieszanie koparką i prowadzono proces bioremediacji przez 180 dni, utrzymując wilgotność gruntu na poziomie 25%, dokonując napowietrzania z użyciem koparki co 14 dni. Po 30 dniach procesu ponownie przeprowadzono inokulację oczyszczanego gruntu poprzez jego zraszanie biopreparatem Bacillus pumilus 2A, w ilości 3 L na 1 m2 gruntu. W 60 dniu bioremediacji wprowadzono do oczyszczanego gruntu poprzez zraszanie wieloenzymowy preparat Mucor racemosus A37, otrzymany znanym sposobem w postaci zawiesiny preparatu w wodzie o stężeniu 10 g/l, w ilości 3 I na 1 m2 gruntu i przeprowadzono homogenizację gruntu przy użyciu koparki i kontynuowano proces bioremediacji.A biopreparation of the Bacillus pumilus 2A bacterial strain was prepared using the known method described above. A bacterial biopreparation with an optical density of 2.4 (ODsoo) was applied to the soil contaminated with creosote oil by spraying at a rate of 3 L per m² of contaminated soil. The soil was homogenized by mixing with an excavator, and the bioremediation process was conducted for 180 days, maintaining soil moisture at 25% and aerating with an excavator every 14 days. After 30 days of the process, the treated soil was re-inoculated by spraying with the Bacillus pumilus 2A biopreparation at a rate of 3 L per m² of soil. On the 60th day of bioremediation, the multi-enzyme preparation Mucor racemosus A37, obtained by a known method in the form of a suspension of the preparation in water at a concentration of 10 g/l, was introduced into the purified soil by spraying, in the amount of 3 l per 1 m2 of soil, and the soil was homogenized using an excavator and the bioremediation process was continued.

Stwierdzono 85% ubytek sumy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA), wchodzących w skład oleju kreozotowego, tj. o 20% większy niż w przypadku prowadzenia bioremediacji jedynie przy użyciu biopreparatu bakteryjnego B. pumilus 2A i o 40% wyższy niż w przypadku prowadzenia procesu bioremediacji bez wprowadzania biopreparatów.An 85% reduction in the total polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) contained in creosote oil was observed, i.e. 20% higher than in the case of bioremediation conducted only with the use of the bacterial biopreparation B. pumilus 2A and 40% higher than in the case of bioremediation conducted without the introduction of biopreparations.

Claims (5)

1. Sposób bioremediacji gruntów zanieczyszczonych olejem kreozotowym, znamienny tym, że do gleby wprowadza się poprzez zraszanie biopreparat bakteryjny Bacillus pumilus 2A o gęstości optycznej OD600 2,4, w ilości 2-3 l/m2 skażonego gruntu, następnie homogenizuje się grunt i prowadzi proces bioremediacji w okresie 160-180 dni, utrzymując wilgotność gruntu na poziomie 25-30%, dokonując napowietrzania co 10-14 dni, kolejno po 30 dniach powtarza się wprowadzenie biopreparatu bakteryjnego Bacillus pumilus 2A o gęstości optycznej OD600 2,4 w takiej samej dawce jak pierwotnie, następnie w okresie 50-60 dni wprowadza się poprzez zraszanie biopreparat enzymatyczny enzymów Mucor racemosus A 37 w postaci zawiesiny w wodzie o stężeniu 8-10 g/l, w ilości 2-3 l/m2 gruntu i przeprowadza homogenizację gruntu i kontynuuje proces bioremediacji.1. A method of bioremediation of soil contaminated with creosote oil, characterized in that a bacterial biopreparation Bacillus pumilus 2A with an optical density of OD600 2.4 is introduced into the soil by sprinkling it in the amount of 2-3 l/ m2 of contaminated soil, then the soil is homogenized and the bioremediation process is carried out for a period of 160-180 days, maintaining the soil moisture at the level of 25-30%, aerating every 10-14 days, then after 30 days the introduction of the bacterial biopreparation Bacillus pumilus 2A with an optical density of OD600 2.4 is repeated in the same dose as the original, then in a period of 50-60 days the enzymatic biopreparation of enzymes Mucor racemosus A 37 is introduced by sprinkling it in the form of a suspension in water at a concentration of 8-10 g/l, in the amount of 2-3 l/m2 of contaminated soil. l/m 2 of soil and homogenizes the soil and continues the bioremediation process. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się go w warunkach tlenowych, w temperaturze 20-30°C.2. The method according to claim 1, characterized in that it is carried out under aerobic conditions, at a temperature of 20-30°C. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biopreparat bakteryjny Bacillus pumilus 2A otrzymuje się przeszczepiając szczep endofitycznych bakterii Bacillus pumilus 2A na skosy zawierające aktywujące wysterylizowane podłoże stałe o składzie w częściach wagowych: 0,5 części ekstraktu drożdżowego, 1 część tryptonu, 1 część chlorku sodu, 2,5 części agaru, wodę redestylowaną, o pH 6,7, kolejno nanosi się na skosy 20 μl oleju kreozotowego typu C i inkubuje w temperaturze 30°C - 32°C przez 24 godziny, następnie czynność powtarza się, po czym pożywkę płynną zawierającą w 1 l : 0,5 części wagowych ekstraktu drożdżowego, 1 część wagową tryptonu, 1 część wagową chlorku sodu, wodę redestylowaną, po doprowadzeniu pH do wartości 6,5-6,7 umieszcza się w kolbach płaskodennych w ilości 8% v/v pożywki i sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 15 minut, kolejno otrzymaną pożywkę szczepi się kulturą bakterii Bacillus pumilus 2A pochodzącą ze skosu, aktywowanego podwójnie olejem kreozotowym typu C, w ilości 0,4 ml kultury zawierającej 109 komórek/ml i prowadzi hodowlę przez 24 godziny na wytrząsarce mimośrodowej, przy szybkości obrotów 180 rpm i amplitudzie 4,5 cm, w warunkach tlenowych, w temperaturze 30-32°C, po czym pożywkę płynną zawierająca w 1 l : 0,5 części wagowych ekstraktu drożdżowego, 1 część wagową tryptonu, 1 część wagową chlorku sodu, wodę redestylowaną, po doprowadzeniu pH do wartości 6,5-6,7 umieszcza się w fermentorze laboratoryjnym, sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 20 minut i szczepi zawiesiną bakterii Bacillus pumilus 2A zawierającą 109 komórek/ml w ilości 2%/1 l pożywki otrzymanej w czasie 24-godzinnej prehodowli, przy czym hodowle w fermentorze prowadzi się w czasie 24-48 godzin dozując odpieniacz w ilości 0,1-1 ml/1 l podłoża.3. The method according to claim The method of claim 1, characterized in that the bacterial biopreparation Bacillus pumilus 2A is obtained by transplanting a strain of endophytic bacteria Bacillus pumilus 2A onto slants containing an activating sterilized solid medium with the composition in parts by weight of: 0.5 parts of yeast extract, 1 part of tryptone, 1 part of sodium chloride, 2.5 parts of agar, redistilled water, pH 6.7, 20 μl of creosote oil type C is subsequently applied onto the slants and incubated at a temperature of 30°C - 32°C for 24 hours, then the operation is repeated, after which the liquid medium containing in 1 l: 0.5 parts by weight of yeast extract, 1 part by weight of tryptone, 1 part by weight of sodium chloride, redistilled water, after adjusting the pH to 6.5-6.7 is placed in flat-bottomed flasks in the amount of 8% v/v of the medium and sterilized at 121°C for 15 minutes, then the obtained medium is inoculated with a culture of Bacillus pumilus 2A bacteria from a slant, double activated with creosote oil type C, in the amount of 0.4 ml of culture containing 109 cells/ml and cultivated for 24 hours on an eccentric shaker, at a rotation speed of 180 rpm and an amplitude of 4.5 cm, in aerobic conditions, at a temperature of 30-32°C, then the liquid medium containing in 1 l: 0.5 parts by weight of yeast extract, 1 part by weight of tryptone, 1 part by weight of sodium chloride, redistilled water, after adjusting the pH to 6.5-6.7 is placed in a laboratory fermenter, sterilized at 121°C for 20 minutes and inoculated with a suspension of Bacillus pumilus 2A bacteria containing 109 cells/ml in the amount of 2%/1 l of medium obtained during 24-hour pre-culture, wherein the cultures in the fermenter are carried out for 24-48 hours by dosing the skimmer in the amount of 0.1-1 ml/1 l of medium. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biopreparat bakteryjny Bacillus pumilus 2A otrzymuje się przeszczepiając szczep endofitycznych bakterii Bacillus pumilus 2A, na skosy zawierające aktywujące wysterylizowane podłoże stałe zawierające w częściach wagowych: 0,2 części siarczanu magnezu siedmiowodnego, 0,02 części chlorku wapnia, 1 część diwodorofosforanu potasu, 1 część wodorofosforanu dipotasu, 1 część azotanu amonu, 0,05 części chlorku żelaza (III), o pH 6,7, kolejno nanosi się 20 μl oleju kreozotowego typu C i inkubuje w temperaturze 30°C przez 24 godziny, następnie czynność powtarza się, po czym pożywkę płynną zawierającą w 1 l : 0,5 części wagowych ekstraktu drożdżowego, 1 część wagową tryptonu, 1 część wagową chlorku sodu, wodę redestylowaną, po doprowadzeniu pH do wartości 6,5 umieszcza się w kolbach płaskodennych w ilości 8% v/v pożywki i sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 15 minut, kolejno otrzymaną pożywkę szczepi się kulturą bakterii Bacillus pumilus 2A pochodzącą ze skosu, aktywowanego podwójnie olejem kreozotowym typu C, w ilości 0,4 ml kultury zawierającej 109 komórek/ml i prowadzi hodowlę przez 16 godzin na wytrząsarce mimośrodowej, przy szybkości obrotów 180 rpm i amplitudzie 4,5 cm, w warunkach tlenowych, w temperaturze 31°C, po czym pożywkę płynną zawierającą w 1 l : 0,02 części wagowych chlorku wapnia, 1 część wagową diwodorofosforanu potasu, 1 część wagową wodorofosforanu dipotasu, 1 część wagową azotanu amonu, 0,05 części chlorku żelaza (III), po doprowadzeniu pH do wartości 6,5 umieszcza się w fermentorze laboratoryjnym, sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 20 minut i szczepi zawiesiną bakterii Bacillus pumilus 2A zawierającą 109 komórek/ml w ilości 2% na litr pożywki otrzymanej w czasie 24-godzinnej prehodowli, przy czym hodowle w fermentorze prowadzi się w czasie 36 godzin dozując odpieniacz w ilości 0,5ml/1 l podłoża.4. The method according to claim The method of claim 1, characterized in that the Bacillus pumilus 2A bacterial biopreparation is obtained by transplanting a strain of endophytic Bacillus pumilus 2A bacteria onto slants containing an activating sterilized solid medium containing in parts by weight: 0.2 parts of magnesium sulfate heptahydrate, 0.02 parts of calcium chloride, 1 part of potassium dihydrogen phosphate, 1 part of dipotassium hydrogen phosphate, 1 part of ammonium nitrate, 0.05 parts of iron (III) chloride, with pH 6.7, 20 μl of type C creosote oil is subsequently applied and incubated at 30°C for 24 hours, then the operation is repeated, after which a liquid medium containing in 1 l: 0.5 parts by weight of yeast extract, 1 part by weight of tryptone, 1 part by weight of sodium chloride, redistilled water, after adjusting the pH to the value 6.5 is placed in flat-bottomed flasks in the amount of 8% v/v of the medium and sterilized at 121°C for 15 minutes, then the obtained medium is inoculated with a culture of Bacillus pumilus 2A bacteria from a slant, double activated with creosote oil type C, in the amount of 0.4 ml of culture containing 109 cells/ml and cultivated for 16 hours on an eccentric shaker, at a rotation speed of 180 rpm and an amplitude of 4.5 cm, in aerobic conditions, at a temperature of 31°C, then the liquid medium containing in 1 l: 0.02 parts by weight of calcium chloride, 1 part by weight of potassium dihydrogen phosphate, 1 part by weight of dipotassium hydrogen phosphate, 1 part by weight of ammonium nitrate, 0.05 parts of iron (III) chloride, after adjusting the pH to 6.5 is placed in a fermenter The culture medium is sterilized at 121°C for 20 minutes and inoculated with a suspension of Bacillus pumilus 2A bacteria containing 109 cells/ml in the amount of 2% per liter of medium obtained during 24-hour pre-culture, while the cultures in the fermenter are carried out for 36 hours with the skimmer dosed at the amount of 0.5 ml/1 liter of medium. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biopreparat enzymatyczny enzymów Mucor racemosus A37 otrzymuje się uaktywniając szczep pleśni Mucor racemosus A37 na skosach agarowych zawierających w % wagowych: 0,5-1,5% oleju kreozotowego, 3% agaru, reszta brzeczki piwowarskiej, następnie hoduje się na tym podłożu inokulum w temperaturze 30°C w czasie 72 godzin, zmywa się wyhodowane zarodniki wodnym roztworem niejonowego surfaktanta użytego w ilości 0,01-0,03% v/v, zaszczepia się otrzymanym inokulum płynne podłoże hodowlane, wysterylizowane w temperaturze 121°C, w czasie 20 minut, zawierające w procentach wagowych: 0,2-3% oleju kreozotowego, 1-5% oleju rzepakowego, 2-6% namoku kukurydzianego, 0,5-1% glukozy, 0,2% KH2PO4, 0,05% kCi, 0,05% NaNOs i wodę do 100%, o wyjściowym pH 4,6-5,0, stosując inokulum w ilości 2-5% v/v płynnego podłoża hodowlanego i prowadzi hodowlę wstrząsaną w temperaturze 27-32°C, w czasie 72-84 godziny przy stopniu napełnienia kolb 10-20% objętościowych na wytrząsarce o szybkości obrotowej 160-200 minut, a następnie dokonuje separacji wyhodowanej biomasy, płucze ją wodą destylowaną, odwadnia mieszaniną heksan:aceton w proporcjach 1:3, a następnie osusza ją i rozdrabnia.5. The method according to claim The enzymatic biopreparation of Mucor racemosus A37 enzymes is obtained by activating the Mucor racemosus A37 mould strain on agar slants containing in weight percentages: 0.5-1.5% creosote oil, 3% agar, the rest brewing wort, then the inoculum is cultivated on this medium at a temperature of 30°C for 72 hours, the cultivated spores are washed off with an aqueous solution of a non-ionic surfactant used in an amount of 0.01-0.03% v/v, the obtained inoculum is inoculated into a liquid culture medium sterilized at a temperature of 121°C for 20 minutes, containing in weight percentages: 0.2-3% creosote oil, 1-5% rapeseed oil, 2-6% corn steep liquor, 0.5-1% glucose, 0.2% KH2PO4, 0.05% kCi, 0.05% NaNOs and water to 100%, with an initial pH of 4.6-5.0, using an inoculum of 2-5% v/v of liquid culture medium and carrying out a shaking culture at a temperature of 27-32°C, for 72-84 hours with the flask filling degree of 10-20% by volume on a shaker with a rotational speed of 160-200 minutes, and then separating the grown biomass, washing it with distilled water, dehydrating it with a hexane:acetone mixture in a proportion of 1:3, and then drying and grinding it.
PL446351A 2023-10-11 2023-10-11 Method of bioremediation of soils contaminated with creosote oil PL248029B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL446351A PL248029B1 (en) 2023-10-11 2023-10-11 Method of bioremediation of soils contaminated with creosote oil

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL446351A PL248029B1 (en) 2023-10-11 2023-10-11 Method of bioremediation of soils contaminated with creosote oil

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL446351A1 PL446351A1 (en) 2025-04-14
PL248029B1 true PL248029B1 (en) 2025-10-06

Family

ID=95337866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL446351A PL248029B1 (en) 2023-10-11 2023-10-11 Method of bioremediation of soils contaminated with creosote oil

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL248029B1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0404466A1 (en) * 1989-06-21 1990-12-27 United States Environmental Protection Agency Biological remediation of creosote- and similarly-contaminated sites
WO1994022605A1 (en) * 1993-03-26 1994-10-13 Sbp Technologies, Inc. Process for bioremediation of contaminated soil or groundwater
KR20140065326A (en) * 2012-11-21 2014-05-29 인제대학교 산학협력단 Novel strain bacillus pumilus ij-1 being able to degrade oil and use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0404466A1 (en) * 1989-06-21 1990-12-27 United States Environmental Protection Agency Biological remediation of creosote- and similarly-contaminated sites
WO1994022605A1 (en) * 1993-03-26 1994-10-13 Sbp Technologies, Inc. Process for bioremediation of contaminated soil or groundwater
KR20140065326A (en) * 2012-11-21 2014-05-29 인제대학교 산학협력단 Novel strain bacillus pumilus ij-1 being able to degrade oil and use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FISSEHA ANDUALEM BEZZA, EVANS M. NKHALAMBAYAUSI CHIRWA: "Chemosphere, Vol. 144, 2016, 635-644", „BIOSURFACTANT-ENHANCED BIOREMEDIATION OF AGED POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS (PAHS) IN CREOSOTE CONTAMINATED SOIL" *

Also Published As

Publication number Publication date
PL446351A1 (en) 2025-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20150352610A1 (en) Microbial compositions for hydrocarbon remediation and methods of use thereof
Bashan et al. Environmental uses of plant growth-promoting bacteria
WO2019245986A1 (en) Bacterial compositions and methods of polymer degradation using the same
RU2378060C2 (en) Biological preparation for cleaning of soils from contaminations with oil and oil products, method of its production and application
Al-Dossary et al. Biodegradation of crude oil using Aspergillus species
Chang et al. Biodegradation of alkylphenols by rhizosphere microorganisms isolated from the roots of Hosta undulata
Andrey et al. Removal of oil spills in temperate and cold climates of Russia experience in the creation and use of biopreparations based on effective microbial consortia
Obuekwe et al. Bioremediation of crude oil pollution in the Kuwaiti desert: the role of adherent microorganisms
FR2904248A1 (en) PROCESS FOR BIO-ASSISTED TREATMENT OF CONTAMINATED SOIL BY HYDROCARBONS
RU2509150C2 (en) Association of strains of bacteria-oil decomposers, and remediation method of oil-contaminated objects
PL248029B1 (en) Method of bioremediation of soils contaminated with creosote oil
RU2414313C2 (en) Method to clean land from oil and oil products and to recultivate agricultural soils
Godjevargova et al. Cell immobilization of Trichosporon cutaneum strain with phenol degradation ability on new modified polymer carriers
CN108728387A (en) The complex microbial inoculum and its preparation and application of the degradation water base cuttings contamination object of shale gas
RU2705290C1 (en) Microbial preparation for bioremediation of soil contaminated with oil and oil products
Zhen et al. Biodegradation of PAHs by Trametes hirsuta zlh237 and effect of bioaugmentation on PAHs-contaminated soil
US9962747B2 (en) Biomolecular zonal compositions and methods
CA2641482A1 (en) Mixed bacterial culture for atrazine degradation
RU2735870C1 (en) Method of extracting microorganisms for purification and recovery of oil-contaminated soil and soil by phyto-bioremediation
RU2402495C2 (en) Method of processing acid tar (versions)
RU2298033C2 (en) Composition for production of carrier for immobilized carbohydrate cleaving microorganisms, and method for carrier production
RU2270805C2 (en) Method of freeing waste waters of phenol compounds
KR20220160964A (en) Novel Novosphingobium sp. strain, and uses thereof
Jabbar et al. Bioremediation of soil contaminated with diesel using biopile system
Shalini et al. Recent advancement in microbial remediation of heavy metals from industrial effluents