PL248105B1 - Związek, marker diagnostyczny raka piersi, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka piersi, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku - Google Patents

Związek, marker diagnostyczny raka piersi, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka piersi, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku

Info

Publication number
PL248105B1
PL248105B1 PL445390A PL44539023A PL248105B1 PL 248105 B1 PL248105 B1 PL 248105B1 PL 445390 A PL445390 A PL 445390A PL 44539023 A PL44539023 A PL 44539023A PL 248105 B1 PL248105 B1 PL 248105B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
compound
gln
breast cancer
formula
abz
Prior art date
Application number
PL445390A
Other languages
English (en)
Other versions
PL445390A1 (pl
Inventor
Adam LESNER
Adam Lesner
Natalia Gruba
Original Assignee
Urteste Spolka Akcyjna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Urteste Spolka Akcyjna filed Critical Urteste Spolka Akcyjna
Priority to PL445390A priority Critical patent/PL248105B1/pl
Priority to PCT/PL2024/050044 priority patent/WO2025005815A1/en
Publication of PL445390A1 publication Critical patent/PL445390A1/pl
Publication of PL248105B1 publication Critical patent/PL248105B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy związek chemiczny, marker diagnostyczny, do zastosowania medycznego, dokładniej w diagnostyce nowotworowej, w szczególności w diagnostyce raka piersi. Przedmiotem zgłoszenia jest także sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka piersi, z użyciem takiego związku. Przedmiotem zgłoszenia jest ponadto sposób in vitro diagnozowania raka piersi, z użyciem takiego związku, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowanie takiego związku do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi i zastosowanie takiego związku do diagnozowania raka piersi. Przedmiotem zgłoszenia jest także taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny raka piersi oraz sposób leczenia raka piersi obejmujący etap przeprowadzania sposobu diagnozowania raka piersi jak określono powyżej z zastosowaniem takiego związku.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy związek chemiczny, marker diagnostyczny, do zastosowania medycznego, dokładniej w diagnostyce nowotworowej, w szczególności w diagnostyce raka piersi. Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika pochodzącej z komórek raka piersi, z użyciem takiego związku, sposób in vitro diagnozowania raka piersi, z użyciem takiego związku, zestaw zawierający taki związek, taki związek do zastosowania medycznego, dokładniej do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi, taki związek do zastosowania do diagnozowania raka piersi oraz taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny raka piersi.
Stan techniki
Rak piersi (ang. breast cancer, BC) jest obecnie odpowiedzialny za około 2 261 491 przypadków zachorowań i powoduje 484 996 zgonów na całym świecie. Pomimo ogromnych postępów wbadaniach nad rakiem piersi i wprowadzaniu nowych metod leczenia, liczba przypadków wzrasta. Prognozuje się, że w 2040 roku pojawi się 3 600 000 nowych przypadków i nastąpi 1 040 000 zgonów z tego powodu. Rak piersi wykazuje zróżnicowany profil histologiczny i molekularny. Głównym podtypem histologicznym jest rak przewodowy inwazyjny (70-80%), a następnie rak płaskonabłonkowy (ok. 10%, związany z mutacją kadheryny nabłonkowej i charakterystycznym wzorcem wzrostu). Istnieją również rzadsze typy, takie jak rak śluzowy, krybrystyczny, brodawkowaty, mikropapilarny, cewkowy, metaplazjalny, śródmiąższowy i apokrynowy. Nowotwory nieinwazyjne opisuje się jako rak wewnątrzprzewodowy (np. rak wewnątrzprzewodowy, rak płaskonabłonkowy in situ). Istnieje również klasyfikacja kliniczna dzieląca raka piersi według receptorów hormonalnych (ER i PR) i statusu HER2. Nowotwory o ujemnym wyrażeniu ER, PR i HER2 określa się jako potrójnie ujemne raki piersi. Ta klasyfikacja określa możliwe opcje leczenia i ma kluczowe znaczenie dla prognozy. Rak piersi występuje tylko u 1% przypadków u mężczyzn.
Czynniki ryzyka raka piersi obejmują starszy wiek (częstość występowania raka piersi podwaja się co 10 lat do menopauzy), geografię (7-krotnie więcej przypadków w krajach wysokiego ryzyka w porównaniu do krajów o niskim ryzyku, niskie wskaźniki na Dalekim Wschodzie), historię rodzinną (szczególnie występowanie raka piersi, jajnika, trzustki lub prostaty), zmiany w obrębie piersi i promieniowanie klatki piersiowej w wywiadzie medycznym, gęstość piersi, wczesne miesiączkowanie i późna menopauza (po 55. roku życia ryzyko wzrasta dwukrotnie), brak dzieci lub późny wiek przy pierwszej ciąży, stosowanie doustnych środków antykoncepcyjnych przez ponad 4 lata przed pierwszą ciążą, prenatalne narażenie na dietylostilbestrol, stosowanie samodzielnych estrogenów.
Wiele badań klinicznych wykazuje, że mammografia zmniejsza śmiertelność z powodu raka piersi (co najmniej o 20%) i stanowi podstawę programów przesiewowych dla raka piersi na całym świecie. Z drugiej strony, największe badania epidemiologiczne po pełnej skali wprowadzenia mammografu w krajach wysoko rozwiniętych wykazują, że nie było żadnego lub ograniczonego spadku przypadków zaawansowanego raka piersi i śmiertelności, co są głównymi powodami przesiewowego badania. Mammografia wiąże się również z bólem, lękiem i ekspozycją na promieniowanie. Jest przydatna u młodych, ciężarnych i karmiących piersią kobiet. Obecnie metodą stosowaną w badaniach przesiewowych u pacjentów o wysokim ryzyku (np. z mutacjami BRCA1 lub BRCA2 lub wieloma przypadkami w wywiadzie rodzinnym) jest również rezonans magnetyczny (MRI). W porównaniu z mammografią i ultrasonografią łączoną, ma bardzo wysoką czułość (90-93% w porównaniu z 48-63%) i podobną swoistość. Obecnie istnieje również nadzieja związaną z alternatywnymi, nowymi metodami, takimi jak skrócona MRI lub mammografia spektralna z kontrastem. Te metody mogą zastąpić obecne „złote standardy”.
Biomarkery odgrywają coraz ważniejszą rolę w diagnostyce i leczeniu raka piersi. Biomarkery pomagające w diagnozowaniu, prognozowaniu i przewidywaniu raka piersi są niezbędne do szybkiej identyfikacji i odpowiedniej kontroli choroby w trakcie leczenia. Badania w zakresie odkrywania biomarkerów doprowadziły do zidentyfikowania i opracowania kilku prognostycznych i predykcyjnych biomarkerów, w tym sygnatur wielogenowych. Niektóre z nich są już dostępne na rynku i zatwierdzone do użytku klinicznego, podczas gdy inne wymagają jeszcze walidacji klinicznej. Pomimo tych postępów nadal istnieje istotna kliniczna potrzeba opracowania i walidacji nowych biomarkerów charakteryzujących się większą czułością, specyficznością i użytecznością kliniczną. Większe cząsteczki, takie jak kwasy nukleinowe, zmiany genetyczne i cząsteczki białek, a także nienaruszone komórki, są wykorzystywane jako biomarkery w diagnostyce raka. Można je zaobserwować np. we krwi w postaci krążących komórek nowotworowych, DNA i RNA, co umożliwia płynną biopsję jako użyteczną technikę kliniczną.
Zmiana w metylacji DNA jest jedną z głównych znaczących zmian molekularnych w karcynogenezie. Promotory metylowanej polipowatości jelita grubego (APC) i receptora kwasu retinowego-2 (RARb2) wykryto odpowiednio w 93,4% i 95,6% próbek krwi kobiet z rakiem piersi, ale nie u zdrowych osób. Wszystkie warianty metylacji przewyższały konwencjonalne markery CEA i CA 15-3 w wykrywaniu wczesnego raka piersi, guzów o niskim stopniu złośliwości i potrójnie ujemnego raka piersi (NBC). Badania wykazują, że nieprawidłowa metylacja DNA jest istotnie powiązana z rakiem piersi i sugeruje, że testy metylacji DNA mogą pomóc w przewidywaniu rokowania pacjentów z rakiem piersi. MAST1, PRDM14 i ZNF177 nieregularne warianty metylacji DNA zostały znalezione i zweryfikowane jako prospektywne wskaźniki molekularne raka piersi przez X Mao i in. X Mao i in. wykazał również, że zakres metylacji DNA ADCY4, CPXM1, DNM3, PRDM14, PRKCB i ZNF177. Zasadniczo odkrycia te wskazują na rozwój nowych epigenetycznych systemów prognozowania, które mogą pomóc w wykrywaniu i przewidywaniu terapii raka piersi. Wyjątkowo czuły mobilny system wolnego od komórek DNA (cfDNA) z biomarkerami epigenetycznymi i cyfrową PCR specyficzną dla metylacji kropelkowej (ddMSP) został stworzony do wczesnej diagnostyki raka piersi. Specyficzny dla Ras czynnik uwalniający nukleotydy guaniny 1 (ang. Ras protein specific guanine nucleotide releasing factor 1, RASGRF1), karboksypeptydaza X (ang. carboxypeptidase X, M14 family member 1, CPXM1), Hox-A10 (ang. Homeobox A10, HOXA10) i homolog jamnika 1 (ang. Dachshund homolog 1, DACH1) były czterema markerami metylacji zastosowanymi w wydajnej metodzie przesiewowej. Ta technika oparta na markerach epigenetycznych była w stanie wiarygodnie odróżnić kobiety z rakiem piersi od zdrowych kobiet z grupy kontrolnej, co sugeruje, że może być wykorzystana do badań przesiewowych i terapii raka piersi.
Krążące białka są kolejną kategorią biomarkerów. Krążące białka zostały uznane za drugi wybór jako marker biologiczny do rozpoznawania i analizy raka piersi (BC). Proteomika krwi i spektrometria mas pozwalają na analizę systemową i wszechstronną wizualizację proteomiki krwi pod względem patologicznym i fizjologicznym, co doprowadziło do znalezienia wielu biomarkerów białkowych we krwi, które można wykorzystać jako skuteczne biomarkery diagnostyczne w wykrywaniu raka piersi. Panel czynników trefoil (TFF) 1, TFF2 i TFF3 został uznany za obiecujące biomarkery do badań przesiewowych BC, ponieważ mogą one w różny sposób wyrażać określone białka w surowicy pacjentów z BC, które nie mogą być wytwarzane przez zdrowe komórki. Dwie grupy, takie jak Cks włókien pośrednich (ang. cytokeratin intermediate filaments) i rodzina glikoprotein - mucyny (MUC), mogą wytwarzać kilka klasycznych biomarkerów raka piersi. Na przykład test CA 15-3 jest obecnie używany do monitorowania leczenia, podczas gdy CK zostały zaproponowane jako markery wczesnego stadium BC, ale ich skuteczność jest maskowana ze względu na słabą czułość. Stosunek stężenia antygenu błony nabłonkowej CA 15-3 w surowicy do CK1 (ang. cytokeratin 1) jest rozważany jako możliwy marker diagnostyczny, zwłaszcza w diagnostyce początkowego stadium raka piersi. Badanie stosunku CA 15-3 do CK1 ma na celu wykrycie dysregulacji w ekspresji tych markerów, która może wskazywać na obecność raka piersi. W zdrowych komórkach nabłonkowych, poziom ekspresji CK1 jest stabilny, podczas gdy poziom CA 15-3 jest niski. Jednak w przypadku rozwoju raka piersi, dochodzi do zmian w ekspresji tych markerów. Zdolność diagnostyczna tej nowej kombinacji została oceniona lepiej niż CA 15-3.
Wiele badań wskazuje na istotną rolę enzymów, takich jak proteazy, w rozwoju raka piersi oraz ich udział w progresji i przerzutach. Mogą one być traktowane jako potencjalne biomarkery prognostyczne i predykcyjne odzwierciedlające odpowiedź na leczenie, stopień zaawansowania klinicznego, podtyp molekularny lub potencjalny całkowity czas przeżycia. Ponadto istnieje znaczny potencjał wykorzystania enzymów jako biomarkerów diagnostycznych i przesiewowych, opublikowano wiele badań opisujących zmienione ich poziomy w tkankach, moczu i surowicy, metaloproteinazy macierzy, metaloproteinazy cysteinowe, Twist, aktywator plazminogenu typu urokinazy, metaloproteinazy ADAM, hialuroniany, enzymy glikolityczne, katepsyny, proteazy serynowe, kalikreiny, kaspazy, tkankowe inhibitory metaloproteinaz, karboksypeptydazy, a także regulujące te enzymy miRNA można zaliczyć do najbardziej obiecujących.
Wiadomo, że proces inicjacji, wzrostu i przerzutowania komórek nowotworu złośliwego przebiega przy udziale wielu czynników, w tym wielu enzymów, w szczególności enzymów hydrolitycznych, zwłaszcza proteolitycznych. Takie enzymy katalizują rozpad enzymatyczny (hydrolityczny lub proteolityczny) białek i peptydów na mniejsze ich fragmenty. Proces ten umożliwia komórkom nowotworowym rozrost przez kolonizację nowych tkanek, wzmożenie procesu tworzenia naczyń krwionośnych (angiogenezy), co umożliwia efektywne dostarczanie substancji odżywczych do guza nowotworowego. Ponadto, enzymy te powstają także w wyniku obumierania komórek zdrowych na skutek procesu rozrostu
PL 248105 Β1 guza. Wszystkie te procesy tworzą charakterystyczny i swoisty profil aktywności enzymatycznej (proteolitycznej) komórek nowotworowych, charakterystyczny dla guza nowotworowego.
Znane są w dziedzinie chromogeniczne cząsteczki peptydowe, które ulegają rozpadowi enzymatycznemu na mniejsze fragmenty z powstaniem zmiany lub wzrostu zabarwienia badanego roztworu. Ten efekt chromogeniczny jest następstwem uwalniania chromoforu (np. 4-anilidu lub kwasu 2-amino-benzoesowego) z chromogenicznej cząsteczki peptydowej.
Tego typu chromogeniczne cząsteczki peptydowe i ich zastosowania znane są, przykładowo, z publikacji autorstwa Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W., „The preparation and properties of two new chromogenie substrates of trypsin”, Arch Biochem Biophys., listopad 1961; 95:271-8 oraz Hojo K, Maeda M, Iguchi S, Smith T, Okamoto H, Kawasaki K. Amino acids and peptides. XXXV. „Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method”, Chem Pharm Buli (Tokyo), listopad 2000; 48(11): 1740-4.
Jak dotąd nie opisano jednak zastosowania tej klasy związków w diagnostyce raka piersi.
W stanie techniki znane są także sposoby otrzymywania peptydów chromogenicznych polegające na przyłączaniu poszczególnych elementów składowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Taki proces przyłączania składa się z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) są przyłączane, pozostałości odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla każdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od żywicy poprzez reakcję w warunkach kwasowych. Kolejno roztwór oddzielany jest od żywicy w procesie sączenia, a następnie z otrzymanego roztworu peptyd wytrącany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym.
W stanie techniki nie są znane jednakże ani chromogeniczne związki peptydowe odpowiednie do swoistego i wczesnego diagnozowania raka piersi, ani sposoby ich otrzymywania.
Pomimo opisanych powyżej możliwości diagnostycznych w dziedzinie wciąż istnieje zatem pilne zapotrzebowanie na „marker nowotworowy” raka piersi, który pozwalałby na wczesne, czułe i swoiste rozpoznanie raka piersi w sposób nieinwazyjny i wiarygodny oraz na sposoby diagnostyczne i sposoby leczenia wykorzystujące taki marker diagnostyczny.
Celem wynalazku jest zatem dostarczenie nowego, swoistego markera diagnostycznego raka piersi oraz sposobów diagnostycznych wykorzystujących taki marker do bezinwazyjnego, szybkiego, czułego, swoistego, wczesnego wykrywania raka piersi, który byłby odpowiedni także do badań przesiewowych, a także sposobów leczenia wykorzystujących taki marker. Cele te zrealizowano dzięki wynalazkom zdefiniowanym w załączonych zastrzeżeniach patentowych, przy czym korzystne ich warianty zostały zdefiniowane w zastrzeżeniach zależnych.
Krótki opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest związek o wzorze 1 :
Xl1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym związek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Gln-Gln-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
Taki wiązek według wynalazku ulega korzystnie rozpadowi hydrolitycznemu, korzystniej proteolitycznemu.
Korzystnie w związku według wynalazku para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)ZpNA,1 ABZZANB-NH2, ABZZDNP, ABZZEDDNP, EDANSZDABCYL, TAMZDANSYL, ABZZTyr(3-NO2), korzystniej parę C1 i C2 stanowi (ABZ)ZpNA lub ABZZANB-NH2.
Korzystnie związek według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-pNA (wzór 3).
Korzystniej związek według wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika pochodzącej z komórek raka piersi, obejmujący:
PL 248105 Β1
a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem o wzorze 1:
Xl14Jeu2-Gln3-Gln4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Gln-Gln-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2), i
b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku aktywność enzymatyczną stanowi korzystnie aktywność hydrolityczna, korzystniej aktywność proteolityczna.
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku jako wspomniany związek korzystnie stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-pNA (wzór 3).
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku jako wspomniany płyn ustrojowy stosuje się korzystnie mocz, korzystniej mocz ludzki. Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro diagnozowania raka piersi, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka piersi u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka piersi, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka piersi, i przy czym do pomiaru wspomnianej aktywności enzymatycznej stosuje się związek o wzorze 1:
XI 1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Gln-Gln-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka piersi według wynalazku wykrywanie aktywności enzymatycznej przeprowadza się korzystnie sposobem wykrywania aktywności enzymatycznej jak określono powyżej.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka piersi według wynalazku wspomnianą próbkę płynu ustrojowego korzystnie inkubuje się ze wspomnianym związkiem w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub pH zasadowym, korzystniej fizjologicznym, w zakresie proporcji 1 :2 do 1 :10 korzystnie 1 :5 próbki do buforu pomiarowego.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka piersi według wynalazku wspomniany związek korzystnie stosuje się w stężeniu 0,1-10 mg/ml, w szczególności 0,25-7,5 mg/ml.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka piersi według wynalazku jako wspomniany związek korzystnie stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-pNA.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka piersi według wynalazku jako wspomnianą próbkę korzystnie stosuję się próbkę moczu, korzystniej moczu ludzkiego.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka piersi według wynalazku pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej korzystnie obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystniej 380-430 nm, w szczególności 410 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystniej 36-38°C.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zestaw zawierający dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej i bufor pomiarowy.
W takim zestawie według wynalazku związek korzystnie stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-pNA. Przedmiotem wynalazku jest także dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi.
Przedmiotem wynalazku jest również dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania do diagnozowania raka piersi.
Korzystnie w takim zastosowaniu diagnozowanie raka piersi obejmuje wykrywanie pierwotnego raka piersi, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka piersi i/lub wykrywanie wznowy raka piersi.
Korzystnie związek w takich zastosowaniach według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA. Przedmiotem wynalazku jest ponadto dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka piersi. Korzystnie taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA.
Zgodnie z wynalazkiem opisano tu ponadto sposób leczenia raka piersi, w którym a) wykrywa się obecność aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi dowolnym sposobem jak określono powyżej w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego, i b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi się występowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej, podejmuje się leczenie raka piersi u osobnika.
W takim sposobie leczenia według wynalazku po zakończeniu leczenia zgodnie z punktem b), można przeprowadzać monitorowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi w określonych odstępach czasu.
W takim sposobie leczenia jako próbkę można stosować próbkę moczu, na przykład moczu ludzkiego.
W takim sposobie leczenia jako wspomniany związek można stosować związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA.
Szczegółowy opis wynalazku
Należy rozumieć, że niniejszy wynalazek jest zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach. Niniejszy opis ilustruje różne, nieograniczające, wykonania wynalazku i przykłady jego realizacji. Niniejszy wynalazek nie ogranicza się do jakiejkolwiek konkretnej metodologii, protokołu czy odczynników stosowanych do jego realizacji, o ile nie wskazano inaczej. Zastosowane pojęcia oraz określenia naukowe i techniczne mają znaczenia powszechnie znane i stosowane przez specjalistów w dziedzinie niniejszego wynalazku. Dla wyjaśnienia jednak następujące określenia i skróty zastosowane w opisie i zastrzeżeniach patentowych, należy rozumieć następująco:
Związek chromogeniczny lub inaczej cząsteczka chromogeniczna oznacza związek posiadający właściwości chromogeniczne. Właściwości chromogeniczne oznaczają zdolność związku do tworzenia produktu barwnego.
Związek fluorescencyjny lub inaczej cząsteczka fluorogeniczna oznacza związek posiadający właściwości fluorogeniczne. Właściwości fluorogeniczne oznaczają zdolność związku do tworzenia produktu emitującego fluorescencję.
NMP to N-metylopirolidon; DMF to dimetyloformamid; DCM to chlorek metylenu, inaczej dichlorometan; pNA to 4-nitroanilina, inaczej para-nitroanilina; ABZ to kwas 2-aminobeznoesowy, ANB-NH2 to amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego; Boc to grupa tert-butyloksykarbonylowa; Fmoc to grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa; zaś TFA to kwas trifluorooctowy.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie rak piersi należy rozumieć jako rak (nowotwór złośliwy) pierwotny piersi rozwijający się z tkanek znajdujących się w piersi. Rak piersi powstaje z komórek nabłonka przewodów lub zrazików gruczołu sutkowego. Można wyróżnić dwie postaci tej choroby: przedinwazyjną lub inwazyjną. Klasyfikuje się je histopatologicznie w zależności od obszaru zajętego przez nowotwór. Rak przedinwazyjny dzieli się na przewodowy i zrazikowy, natomiast postać inwazyjna dzieli się na raka przewodowego, zrazikowego, rdzeniastego, śluzotwórczego oraz cewkowego. Najczęstszym typem raka piersi jest rak przewodowy inwazyjny, który wywodzi się z komórek nabłonka przewodów sutkowych. Stanowi on około 70-80% przypadków raka piersi. Rak zrazikowy inwazyjny jest drugim pod względem częstości występowania typem raka piersi, ale jest znacznie mniej powszechny niż rak przewodowy inwazyjny. Stosowane tu pojęcie rak piersi obejmuje zatem wszelkie nowotwory złośliwe piersi rozwijające się z tkanek znajdujących się w piersi.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie diagnozowanie raka piersi należy rozumieć jako rozpoznanie tej choroby, w szczególności na jej wczesnym etapie, na którym inne metody diagnostyczne są zbyt mało czułe i/lub swoiste. W stosowanym tu znaczeniu diagnozowanie raka piersi obejmuje także wykrywanie choroby resztkowej po chirurgicznym wycięciu raka piersi oraz wykrywanie wznowy raka piersi po wcześniej zakończonym leczeniu raka piersi.
PL 248105 Β1
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie leczenie raka piersi należy rozumieć jako leczenie na wczesnym etapie rozwoju choroby, pozwalające na istotne wydłużenie czasu przeżycia oraz poprawę jakości życia chorych.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie monitorowanie należy rozumieć jako diagnostykę choroby resztkowej (ang. Minimal Residual Disease (MRD)) - obecności małej liczby przetrwałych w organizmie (w trakcie leczenia lub w remisji) komórek nowotworowych, w ilościach niewykrywanych standardowo stosowanymi metodami diagnostycznymi.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie osobnik należy rozumieć jako człowieka lub ssaka, u którego podejrzewa się występowanie raka piersi, ewentualnie jako człowieka lub ssaka należącego do grupy zwiększonego ryzyka wystąpienia raka piersi, albo człowieka lub ssaka po resekcji raka piersi, lub po zakończonym leczeniu raka piersi. Osobnikiem jest korzystnie człowiek.
Związki według wynalazku mają właściwości chromogeniczne dzięki obecności chromofora oraz fluorogeniczne, tj. zawierają cząsteczki donora i akceptora fluorescencji. Dzięki swojej budowie, opracowanej w taki sposób, że obserwowany jest wzrost barwy w przedziale długości fali 380-440 nm swoiście w wyniku kontaktu badanej próbki płynu ustrojowego od osobnika badanego z rakiem piersi, a jednocześnie nie jest obserwowany taki efekt w reakcji z próbką płynu ustrojowego osobnika zdrowego lub z diagnozą innego typu nowotworu, związki te pozwalają na wykrywanie aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi, a w szczególności diagnozowanie raka piersi w sposób swoisty i czuły, również na wczesnym etapie rozwoju tego raka. Osobnikiem badanym jest korzystnie człowiek. Płynem ustrojowym jest korzystnie mocz, korzystniej ludzki.
W pierwszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest nowy związek chemiczny o wzorze 1:
Xl1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierający cząsteczkę C1 lub X1 składa się z takiej cząsteczki C1, a X2 stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierający cząsteczkę C2 lub X1 składa się z takiej cząsteczki C2, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji. Cyfry w indeksie górnym oznaczają kolejne pozycje reszt w związku według wynalazku oraz kolejność ich dołączania podczas syntezy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem można w tym kontekście wymiennie stosować także zapis wzoru 1 bez podawania numeracji reszt. Rdzeń wszystkich związków według wynalazku stanowi tetrapeptyd o wskazanej sekwencji 4 aminokwasów, tj. Leu-GIn-GIn-Thr (zapis w formacie trój literowych skrótów aminokwasów równoważny z zapisem LQQT w formacie jednoliterowych skrótów aminokwasów), którą to sekwencję przedstawiono także w Wykazie sekwencji jako sekwencję nr 1.
Związek według wynalazku ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Gln-Gln-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2. Taki mierzalny sygnał optyczny jest mierzony sposobem pomiaru zmiany absorpcji/fluorescencji po rozpadzie enzymatycznym związku. Korzystnie cząsteczki C1 i C2 są rozdzielone od siebie nie więcej niż 10 resztami aminokwasowymi, co zapewnia wydajne wygaszanie donora fluorescencji przez akceptor fluorescencji. Dla znawcy oczywistym jest, że kluczowym czynnikiem jest odległość pomiędzy donorem i akceptorem fluorescencji. Zatem, w przypadkach, gdy sekwencja aminokwasowa oddzielająca cząsteczkę C1 i C2 jest zwinięta w skręconą lub skondensowaną strukturę drugorzędową, skutkującą zbliżeniem cząsteczek C1 i C2 w stosunku do struktury pierwszorzędowej, odległość między cząsteczkami C1 i C2 może być większa niż 10 reszt aminokwasowych.
Taki związek, dzięki swoim właściwościom chromogenicznym oraz posiadaniu miejsca reaktywnego w pozycji 5 pozwalającego na rozpad enzymatyczny (korzystnie proteolityczny) na mniejsze fragmenty, jest szczególnie odpowiedni do stosowania go jako marker diagnostyczny, w szczególności swoisty marker diagnostyczny raka piersi, w szczególności do zastosowania we wczesnym wykrywaniu raka piersi.
W korzystnych wykonaniach związek według wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystniej proteolitycznemu.
W korzystnych wykonaniach para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), przy czym korzystniej parę cząsteczek C1 i C2 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
W korzystnych wykonaniach związek według wynalazku stanowi:
PL 248105 Β1 związek o wzorze 2:
ABZ1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-ANB6-NH2 (wzór 2), lub związek o wzorze 3:
ABZ1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-pNA6 (wzór 3), w których ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego, zaś pNA oznacza 4-nitroanilinę.
Taki związek ulega korzystniej rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2 w przypadku związku o wzorze 2, zaś w przypadku związku o wzorze 3 z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-OH oraz fragmentu 2: pNA. Fragmenty 2 stanowią zatem chromofory w postaci wolnej.
Separacja przestrzenna cząsteczek C1 i C2 będąca następstwem rozpadu enzymatycznego związku według wynalazku powoduje powstanie mierzalnego sygnału optycznego, ponieważ fluorescencja emitowana z donora fluorescencji nie jest już wygaszana przez akceptor fluorescencji. Taki mierzalny sygnał optyczny można wykrywać korzystnie przy długości fali 300-500 nm, korzystniej 380-430 nm.
Związki według wynalazku można otrzymywać znanymi sposobami. Przykładowo można je otrzymać z zastosowaniem sposobu otrzymywania peptydów chromogenicznych polegającego na prowadzeniu procesu na nośniku w postaci żywicy, posiadającej grupę Fmoc, którą usuwa się w trakcie prowadzenia reakcji. Przykładowo może to być żywica amidowa, np. TentaGel S RAM lub RinkAmide, ale można także zastosować dowolną inną żywicę dostępną na rynku. Używana żywica do prowadzenia tego procesu powinna zostać odpowiednio przygotowana. Przygotowanie tej żywicy polega na zwiększeniu jej objętości poprzez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi. Korzystnie stosuje się żywicę o osadzeniu 0,23 mmol/g. Z żywicy tej należy usunąć grupę ochronną Fmoc poprzez przemywanie 20% roztworem rozpuszczalnika.
Następnie, znane procesy otrzymywania peptydów chromogenicznych obejmują przyłączanie poszczególnych elementów składowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Ten proces przyłączania składa się z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) są przyłączane, pozostałości odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla każdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od żywicy poprzez reakcję w warunkach kwasowych. Następnie roztwór oddzielany jest od żywicy w procesie sączenia, a następnie z otrzymanego roztworu peptyd wytrącany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym. Uzyskany w ten sposób osad peptydu jest wirowany. Przykładowy, szczegółowy ale nieograniczający, sposób syntezy związków według wynalazku opisano poniżej i w Przykładzie 1 poniżej.
Sposób syntezy związków według wynalazku polega na tym, że proces prowadzi się na nośniku w postaci żywicy, korzystnie posiadającej grupę Fmoc, przy czym nośnik przed rozpoczęciem procesu przygotowuje się poprzez zwiększenie jego objętości przez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi, korzystnie dimetyloformamidem, chlorkiem metylenu lub N-metylopirolidonem, i usunięcie grupy ochronnej Fmoc, korzystnie poprzez przemywanie 10-30% roztworem piperydyny, w rozpuszczalnikach, takich jak dimetyloformamid, chlorek metylenu lub N-metylopirolidon. Następnie przeprowadza się sposób w kolejnych etapach:
a) osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego ANB (lub innego chromoforu odpowiedniego do zastosowania zgodnie z wynalazkiem jak zdefiniowano w zastrzeżeniach) na żywicy poprzedza się przemyciem nośnika 3-6% roztworem A/-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF, po czym przygotowuje się roztwór ANB w DMF, do którego dodaje się kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3 :3 :2 :6, tak przygotowaną mieszaninę dodaje się do żywicy i miesza się do uzyskania jednorodności, po czym żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i przemywa rozpuszczalnikami, takimi jak DMF, DCM i izopropanolem, a następnie kontynuuje się przyłączanie ANB do żywicy poprzez zastosowanie heksafluorofosforanu O-iy-azabenzotriazol-l-iloj-^^A/^Af-tetrametylouroniowego (HATU), a potem heksafluorofosforanu O-(benzotriazol-1-ilo)-A/,A/,A/’,A/’-tetrametylouroniowego (HBTU) w ilościach nadmiarowych, a po zakończeniu przemywa się nośnik kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i łagodnie suszy się;
b) przyłączanie reszty aminokwasowej do ANB prowadzi się poprzez reakcję z pochodną aminokwasową Fmoc-Thr(tBu)-OH, przy czym co najmniej pięciokrotny nadmiar molowy pochodnej aminokwasowej w stosunku do żywicy rozpuszcza się w bezwodnej pirydynie i kontaktuje się z żywicą z osadzonym ANB, po czym całość chłodzi się do temperatury nie niższej niż -20°C, a następnie dodaje się POCI3 w stosunku 1 : 1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej i całość miesza się, po czym proces mieszania prowadzi się w temperaturze pokojowej, a następnie w podwyższonej temperaturze, zaś po zakończeniu reakcji żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa się DMF oraz MeOH i łagodnie suszy się, po czym uzyskany związek przejściowy poddaje się procesowi acylowania przyłączając kolejno fragment Leu-Gln-Gln;
c) acylowanie uzyskanego związku przejściowego prowadzi się przy zastosowaniu pochodnej aminokwasowej, korzystnie Fmoc-Gln(Trt) OH, i kolejno Fmoc-Gln(Trt)-OH, następnie Fmoc-Leu-OH i w końcowym etapie syntezy Boc-Abz-OH, przy czym acylowanie prowadzi się etapowo od reszty 6 do 1 z wykorzystaniem diizopropylokarbodiimidu jako środka sprzęgającego, który stosuje się w nadmiarze, a po zakończeniu każdego etapu żywicę przemywa się DMF, i korzystnie podaje testowi chloroanilowemu (test na obecność wolnych grup aminowych), w którym monitoruje się przyłączenia pochodnej aminokwasowej; d) usunięcie grupy ochronnej Fmoc prowadzi się poprzez przemywanie roztworem 10-30% piperydyny w DMF i kolejnymi przemywaniami każdym z rozpuszczalników: DMF, izopropanolem i chlorkiem metylenu;
e) odszczepianie peptydu od żywicy przeprowadza się stosując mieszaninę TFA : fenol : woda : TIPS przy zachowaniu stosunków odpowiednio 88 : 5 : 5 : 2 v/v/v/v, przy czym mieszaninę miesza się przez okres co najmniej jednej godziny, korzystnie trzy godziny, a uzyskany osad odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym przemywa się eterem dietylowym i uzyskany peptyd odwirowuje się;
f) przygotowanie gotowego produktu przeprowadza się poprzez rozpuszczenie peptydu w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddaje liofilizacji.
W drugim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej, korzystnie proteolitycznej, obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka piersi, obejmujący a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem według wynalazku i b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek obecnych w związku według wynalazku C1 i C2. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem badanym jest w takim przypadku człowiek. W innym korzystnym wykonaniu tego aspektu płynem ustrojowym jest mocz, w szczególności ludzki.
W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA.
W trzecim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro diagnozowania raka piersi, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka piersi u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka piersi, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka piersi, i przy czym do pomiaru w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej jak określono powyżej stosuje się dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej. Takie wykrywanie aktywności enzymatycznej korzystnie przeprowadza się z zastosowaniem sposobów wykrywania aktywności enzymatycznej jak omówiono powyżej. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem jest człowiek. W korzystnym wykonaniu tego aspektu płynem ustrojowym jest mocz, w szczególności ludzki. W korzystnym wykonaniu tego aspektu aktywność enzymatyczną swoistą dla raka piersi stanowi aktywność proteolityczna. W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje się dowolny związek według wynalazku, korzystniej związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA. Ponadto, w korzystnym wykonaniu tego aspektu pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej w sposobach według wynalazku obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, zwłaszcza 410 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40°C, korzystnie 36-38°C. Dzięki, czemu otrzymuje się maksymalnie intensywny mierzalny sygnał optyczny wynikający ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji.
Ponadto, w korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów według wynalazku prowadzi się pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej z zastosowaniem związku według wynalazku w zakresie stężeń 0,1-10 mg/ml, korzystniej w stężeniu 1 mg/ml. W korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów według wynalazku badaną próbkę inkubuje się ze związkiem według wynalazku w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub zasadowym, korzystnie fizjologicznym, z próbką płynu ustrojowego, korzystnie ludzkiego moczu, w zakresie proporcji 1 : 2 do 1 : 10, korzystnie 1 : 5 próbki (np. moczu) do buforu pomiarowego. Próbka korzystnie pochodzi od osoby skierowanej do diagnozy raka piersi. Korzystnie mierzy się intensywność absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, zwłaszcza 410 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40°C, korzystnie 36-38°C. W powyższych warunkach otrzymujemy maksymalnie intensywny mierzalny sygnał optyczny wynikający ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji.
W czwartym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zestaw zawierający dowolny związek według wynalazku i bufor pomiarowy. Bufory pomiarowe znane są w dziedzinie, przy czym odpowiedni do zastosowania w zestawie według wynalazku bufor to na przykład, ale nieograniczająco, bufor Tris-HCl. W korzystnym wykonaniu w takim zestawie według wynalazku wspomniany związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA.
W piątym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi. W szóstym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania do diagnozowania raka piersi. Korzystnie diagnozowanie raka piersi obejmuje zgodnie z wynalazkiem wykrywanie pierwotnego raka piersi, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka piersi i/lub wykrywanie wznowy raka piersi po zakończonym wcześniej leczeniu raka piersi.
W siódmym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka piersi. W korzystnych wykonaniach tego aspektu takim związkiem jest związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA.
Opisano tu również sposób leczenia raka piersi, w którym
a) wykrywa się obecność aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi dowolnym sposobem według wynalazku jak określono powyżej w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego, i b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi się występowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej, podejmuje się leczenie raka piersi u osobnika.
W jednym wariancie takiego sposobu leczenia po zakończeniu leczenia zgodnie z punktem b), można przeprowadzać monitorowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi a w określonych odstępach czasu jak wiadomo w dziedzinie, np. co tydzień, co kilka tygodni, co miesiąc, co kilka miesięcy, co rok lub w dowolnych innych odstępach uznanych przez specjalistę za stosowne, celem wykrywania choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka piersi lub pojawienia się wznowy. Ponadto, w innym wariancie takiego sposobu leczenia jako próbkę do badania można stosować próbkę moczu, korzystnie moczu ludzkiego. W korzystnym wykonaniu takiego sposobu leczenia jako wspomniany związek stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA (wzór 3).
Zalety niniejszego wynalazku polegają na dostarczeniu nowego związku chemicznego o właściwościach sprawiających, że nadaje się on do zastosowania do czułego i swoistego wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi, do zastosowania jako biomarker diagnostyczny do wykrywania raka piersi, do zastosowania do szybkiego, bezinwazyjnego diagnozowania raka piersi, pozwalającego przy tym na wykrywanie raka piersi na wczesnym etapie jego rozwoju. Kolejną zaletą jest to, że sposoby diagnostyczne według wynalazku mogą być z powodzeniem stosowane w badaniach przesiewowych. Daje to możliwość wykonania pełnej diagnostyki na wczesnym etapie rozwoju nowotworu i w konsekwencji skuteczniejszego leczenia. Wczesne rozpoznanie daje możliwość leczenia operacyjnego, które znacząco wydłuża przeżycie pacjenta. Jest to także istotne w przypadku monitorowania skuteczności przeprowadzonego leczenia chirurgicznego i/lub chemioterapeutycznego raka piersi, dzięki możliwości wykrywania choroby resztkowej lub ewentualnej wznowy.
Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany na poniższych figurach i w poniższych przykładach, które jednak nie mają na celu ograniczenia w żaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach patentowych.
Krótki opis figur
Fig. 1 przedstawia wyniki analizy chromatograficznej rozpadu substratu, tj. ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2, w próbce moczu od osobnika z rakiem piersi.
Fig. 2 przedstawia stopień hydrolizy substratu - ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 - w próbkach moczu pochodzących od osobników ze zdiagnozowanym rakiem piersi (próbki 1-20) i moczu pochodzących od osób zdrowych (21-40). Cyfry arabskie oznaczają numer wybranej próbki moczu.
Fig. 3 przedstawia selektywność hydrolizy przykładowego substratu - ABZ1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-ANB6-NH2 (tj. związku o wzorze 2) w próbkach moczu ze zdiagnozowanym rakiem piersi (próbka 1) i moczu pochodzącym od osób z diagnozą innej choroby nowotworowej (próbki 2-9). Cyfry arabskie oznaczają numery poszczególnych rodzajów nowotworów. Badane próbki dla każdego rodzaju nowotworu pochodziły od 20 różnych pacjentów dla każdego z badanych nowotworów. Wyniki oznaczają średnie wartości dla poszczególnych rodzajów nowotworów. Wyniki te wykazują selektywność rozpadu substratu wobec moczu pacjentów z rakiem piersi względem próbek moczu od pacjentów chorych na inne nowotwory.
Fig. 4 przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu, tj. ABZ1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-NH2, od środowiska pH. Wartości wskazane na osi X oznaczają pH środowiska.
Przykłady
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, niestanowiące jednak jego ograniczenia. O ile nie wskazano inaczej, w poniższych przykładach stosowano znane i/lub komercyjnie dostępne urządzenia, metody, warunki reakcji, odczynniki i zestawy, takie jakie powszechnie stosuje się w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek i jakie są zalecane przez wytwórców odpowiednich odczynników i zestawów.
Przykład 1: Synteza związku według wynalazku
W przykładzie tym przedstawiono syntezę reprezentatywnego związku według niniejszego wynalazku, mianowicie związku: ABZ1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-ANB6-NH2. Pozostałe peptydy według wynalazku można zsyntetyzować w analogiczny sposób. Cyfry w indeksie górnym oznaczają kolejne pozycje reszt w związku według wynalazku oraz kolejność ich dołączania podczas syntezy. Związki według wynalazku można zamiennie przedstawiać analogicznym wzorem bez podawania pozycji reszt, co nie zmienia kolejności reszt w związkach według wynalazku, gdyż pozostaje ona bez zmian.
1. Otrzymanie peptydu chromogenicznego
a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu chromogenicznego który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej - na nośniku stałym - z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu, czyli z użyciem osłon.
Związek o sekwencji ABZ1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-ANB6-NH2, gdzie ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, a ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zaś ANB to kwas 5-amino-2-benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych.
Boc-ABZ, Fmoc-Leu, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Thr(tBu).
Syntezę związku według wynalazku, który może być stosowany jako marker diagnostyczny do wykrywania raka piersi, prowadzono na nośniku stałym umożliwiającym przekształcenie kwasu 5-amino-2-beznoesowego w amid ANB-NH2, mianowicie żywicy amidowej TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) o osadzeniu 0,23 mmol/g. Można jednakże zastosować dowolną inną żywicę amidową, np. Rink Amide (Niemcy).
Syntezę związku prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez większość etapów reaktorami była strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.
Wszystkie otrzymywane końcowe związki zawierały w swojej sekwencji w pozycji 1, czyli na N-końcu, kwas 2-aminobenzoesowy (ABZ), zaś w pozycji 6, czyli na C-końcu, cząsteczkę kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB). ABZ pełni tu rolę donora fluorescencji, natomiast ANB - kwas 5-amino-2-benzoesowy pełni rolę wygaszacza fluorescencji i jednocześnie chromoforu. Peptydy w swojej sekwencji zawierały co najmniej i korzystnie jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztą aminokwasową Thr-ANB-NH2, tj. w pozycji 5 związku. Syntezę polegającą na przyłączaniu pochodnych aminokwasowych prowadzi się od reszty 6 do 1, czyli od końca C do N.
b) Osadzenie ANB na żywicy TentaGel S RAM:
Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie przygotowano żywicę, w tym dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1 x 10 minut; IsOH 1 x 10 minut; DCM 1 x 10 minut.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut; 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
c) Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu, za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki - do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej ANB (kwasu 5-ami no-2-nitrobenozesowego).
d) Osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na nośniku stałym:
Pierwszym etapem syntezy peptydu było osadzenie ANB na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem chromoforu przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF, DCM i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc-:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
e) Przemywanie:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
f) Test chloranilowy:
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF. Procedurę usuwania osłony Fmoc- oraz cykl przemywań przeprowadzono w naczynku Merrifielda. W osobnej kolbie rozpuszczono ANB w DMF i dodawano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3 : 3 : 2 : 6 v/v/v/v. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania ANB do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-N,N,N’,N’tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan-O-(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.
g) Przyłączenie C-końcowej reszty aminokwasowej (Fmoc-Thr(tBu)-OH) do ANB:
Odpowiednią pochodną aminokwasową (9-krotny nadmiar molowy w stosunku do osadzenia żywicy) rozpuszczono w pirydynie i przeniesiono do kolby zawierającej żywicę z osadzonym ANB. Całość chłodzono do uzyskania temperatury -15°C (łaźnia lodowa: 1 cz. wagowa NH4CI, 1 cz. wagowa NaNOs, 1 cz. wagowa lodu). Po osiągnięciu żądanej temperatury dodano POCI3 (w stosunku 1 : 1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej) i całość mieszano na mieszadle magnetycznym: 20 minut w -15°C, 30 minut w temperaturze pokojowej oraz 6 godzin w 40°C (łaźnia olejowa). Po zakończeniu reakcji żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF oraz MeOH i zostawiono do wysuszenia.
W kolejnym etapie przyłączono resztę w pozycji P2 (Fmoc-Gln(Trt)).
Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączaniach stosowano diizopropylokarbodiimid jako środek sprzęgający. Procedurę powtarzano dwukrotnie.
Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej do wolnych grup aminowych żywicy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to o przyłączeniu ANB do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu.
h) Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Żywicę wraz z przyłączonym fragmentem ANB-Thr(tBu) - znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej reszty Gln.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut; 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Gln(Trt)-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej:
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty seryny skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian. Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - Fmoc-Leu i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywnie, ziarna żywicy były bezbarwne.
2. Usuwanie peptydu z nośnika
Po zakończeniu syntezy amid peptydu ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 3 godzin zawartość kolby odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszczano w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji. W analogiczny sposób można przeprowadzić otrzymywanie pozostałych związków według niniejszego wynalazku.
Potwierdzenie tożsamości/charakterystykę nowego związku według wynalazku przeprowadzono z zastosowaniem analizy HPLC. Warunki tej analizy HPLC były następujące: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8, 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm.
Przeprowadzona analiza potwierdziła otrzymanie związku według wynalazku.
Przykład 2: Badanie właściwości związku według wynalazku jako markera nowotworowego
Badanie aktywności nowych związków według wynalazku wykonano na grupie 20 chorych z diagnozą raka piersi z wykorzystaniem reprezentatywnego związku według wynalazku. Mechanizm działania związków według wynalazku, w tym reprezentatywnego związku o wzorze 2, polega na swoistym rozpadzie enzymatycznym, dokładniej hydrolizie enzymatycznej, w takim miejscu, które prowadzi do uwolnienia wolnych cząsteczek chromoforów, odpowiednio, ANB-NH2 (amidu kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego) w przypadku związku o wzorze 2 lub pNA (para-nitroaniliny) w przypadku związku o wzorze 3, które wykazują absorbancję przy długości fali 320-480 nm, zwłaszcza 380-430 nm, w szczególności 410 nm. Pozostałe związki według wynalazku cechują się analogicznym mechanizmem działania. W tym celu reprezentatywny związek według wynalazku, ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 rozpuszczono w dimetylosuflotlenku (w stężeniu 0,5 mg/ml), a następnie 20 μl takiego roztworu zmieszano z 100 μl buforu (100 mM Tris-HCl, pH 8,3) i 80 μl moczu osoby chorej na raka piersi. Pomiar wykonano w płytce 96 dołkowej przeznaczonej do pomiaru absorbancji, a każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach w temperaturze 37°C. Czas trwania pomiaru wynosił 60 minut. W czasie pomiaru monitorowano długość fali charakterystyczną dla uwalniającego się chromoforu (ANB-NH2) przy długości fali 410 nm (zakres 380-430 nm).
PL 248105 Β1
Jak pokazano na Fig. 1 analiza RP HPLC losowo wybranego systemu zawierającego mocz pochodzący od osoby z diagnozą raka piersi wskazuje na to, że związek według wynalazku rozpada się na fragment peptydowy ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-OH i grupę chromoforową związku (ANB-NH2).
W wyniku pomiaru wzrost zabarwienia roztworu w czasie zaobserwowano we wszystkich próbkach moczu pochodzących od osób z diagnozą raka piersi. Obserwowana wielkość wzrostu absorbancji w czasie jest różna dla każdej z badanych próbek. Odmienny efekt uzyskano dla 20 próbek osób zdrowych, gdyż w żadnej z 20 badanych próbek moczu nie zaobserwowano wzrostu absorbancji w zakresie diagnostycznym.
Przeprowadzane badania wskazują, że wszystkie próbki 1-20 od osób chorych na raka piersi uległy rozpadowi, lecz w przypadku próbek 4 i 19 rozpad substratu, tj. ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2, zachodził mniej wydajnie niż w przypadku próbek 6 czy 9 (Tabela 1, Fig. 2). Taki rezultat może być spowodowany różnicą w aktywności, jak i ilości enzymów odpowiedzialnych za rozpad enzymatyczny (proteolizę). Ponadto wyniki przedstawione w poniższej Tabeli 1 wskazują, że inkubacja roztworu substratu - związku według wynalazku - z próbkami moczu pochodzącymi od osób zdrowych (bez zdiagnozowanego nowotworu, oznaczone cyframi arabskimi kolejno od 21 do 40) nie prowadzi do wzrostu absorbancji, a zatem nie zachodzi hydroliza badanego związku. Rezultat wskazuje na brak obecności enzymów proteolitycznych swoistych/charakterystycznych dla raka piersi.
Tabela 1
Wyniki analizy absorbancji
1 0,0326 0,0157 0,0145
2 0,1367 0,0776 0,0494
3 0,0152 0,0154 0,0067
4 0,3421 0,1597 0,2042
5 0,0521 0,0515 0,0206
6 0,0121 0,013 0,0241
7 0,076 0,0516 0,0687
8 0,1124 0,0345 0,0361
9 0,0782 0,071 0,0232
10 0,0459 0,015 0,0299
11 0,053 0,0253 0,0219
12 0,172 0,1037 0,0137
13 0,0862 0,0621 0,0398
14 0,0702 0,038 0,0805
15 0,0177 0,0083 0,0392
16 0,1181 0,032 0,1333
17 0,168 0,0695 0,0858
18 0,1133 0,0635 0,0696
19 0,3503 0,2363 0,2837
20 0,1951 0,0915 0,0826
PL 248105 Β1
21 0 0 0
22 0 0 0
23 0 0 0
24 0 0 0
25 0 0 0
26 0 0 0
27 0 0 0
28 0 0 0
29 0 0 0
30 0 0 0
31 0 0 0
32 0 0 0
33 0 0 0
34 0 0 0
35 0 0 0
36 0 0 0
37 0 0 0
38 0 0 0
39 0 0 0
40 0 0 0
Ponadto, przeprowadzano badania selektywności rozpadu substratu, tj. związku według wynalazku, w zależności od badanego typu raka. Wyniki przeprowadzonych badań przedstawiono na Fig. 3 i wskazują one, że badany przykładowy substrat, tj. ABZ1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-ANB6-NH2, inkubowany z próbkami pochodzącymi od pacjentów z diagnozą poszczególnych nowotworów: pierś, żołądek, płuco, jelito, prostata, trzon macicy, trzustka, jajnik, wątroba nie rozpada się i nie powoduje wzrostu absorbancji we wskazanym zakresie. Badane próbki każdorazowo stanowiły mieszaninę 20 próbek otrzymanych dla każdego z badanych nowotworów. Wskazuje to na selektywność rozpadu związków według wynalazku, która sprawia, że nadają się one do swoistego wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej wobec raka piersi oraz swoistego diagnozowania raka piersi.
W tabeli 2 poniżej przedstawiono wyniki pomiarów uzyskane dla trzech powtórzeń każdej z próbek.
Tabela 2
Wyniki analizy selektywności rozpadu
pierś 0,3503 0,2363 0,2837
żołądek 0 0 0
płuco 0 0 0
jelito 0 0 0
PL 248105 Β1
prostata 0 0 0
trzon macicy 0 0 0
trzustka 0 0 0
jajnik 0 0 0
wątroba 0 0 0
Ponadto przeprowadzono pomiary zależności aktywności proteolitycznej reprezentatywnego związku według wynalazku od odczynu środowiska reakcji. W wyniku tego eksperymentu stwierdzono, że w badanym materiale występuje co najmniej jeden enzym wykazujący maksimum aktywności w pH zasadowym (Fig. 4).
Przeprowadzone analizy potwierdziły przydatność związków według wynalazku w czułym i swoistym wykrywaniu aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi, a tym samym ich przydatności także do swoistego diagnozowania raka piersi, jak również jako markera diagnostycznego raka piersi. Mechanizm działania związków według wynalazku polega na ich swoistym rozpadzie enzymatycznym w takiej pozycji, która prowadzi do uwolnienia wolnych cząsteczek chromoforów, co powoduje powstanie mierzalnego sygnału optycznego, który można wykorzystywać do celów diagnostycznych, w szczególności w diagnozowaniu raka piersi zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
PL 248105 Β1
WYKAZ SEKWENCJI W FORMACIE WIPO STANDARD ST.25 <110> URTESTE S.A.
<120> Nowy7 marker diagnostyczny raka piersi <130> 17P51926PL00 <160> 1 <170>BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211>4 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400> 1
Leu Gin Gin Thr

Claims (24)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Związek o wzorze 1:
    Xl'-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-X2ć (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym związek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Gln-Gln-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
  2. 2. Związek według zastrzeżenia 1, który to związek ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystnie proteolitycznemu.
  3. 3. Związek według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym to związku para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), ‘(ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), korzystnie parę C1 i C2 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
  4. 4. Związek według jednego z zastrzeżeń 1 do 3, który to związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-pNA (wzór 3).
  5. 5. Związek według zastrzeżenia 4, który to związek ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2.
  6. 6. Sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika pochodzącej z komórek raka piersi, obejmujący:
    a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem o wzorze 1:
    ΧΙ^Εβι^-ΟΙιΡ-ΟΙιΑΤΙιΑΧΖ6 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Gln-GIn-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2), i
    b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
  7. 7. Sposób in vitro według zastrzeżenia 6, w którym aktywność enzymatyczną stanowi aktywność hydrolityczna, korzystnie aktywność proteolityczna.
  8. 8. Sposób in vitro według zastrzeżenia 6 albo 7, w którym jako wspomniany związek stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-GIn-GIn-Thr-pNA (wzór 3).
  9. 9. Sposób według jednego z zastrz. 6 do 8, w którym jako wspomniany płyn ustrojowy stosuje się mocz, korzystnie mocz ludzki.
  10. 10. Sposób in vitro diagnozowania raka piersi, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka piersi u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka piersi, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka piersi, przy czym do pomiaru wspomnianej aktywności enzymatycznej stosuje się związek o wzorze 1:
    Xl1-Leu2-Gln3-Gln4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Gln-Gln-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, w którym wykrywanie aktywności enzymatycznej przeprowadza się sposobem jak określono w jednym z zastrz. 6 do 9.
  12. 12. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 11, w którym wspomnianą próbkę płynu ustrojowego inkubuje się ze wspomnianym związkiem w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub pH zasadowym, korzystnie fizjologicznym, w zakresie proporcji 1 : 2 do 1 : 10 korzystnie 1 : 5 próbki do buforu pomiarowego.
  13. 13. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 12, w którym wspomniany związek stosuje się w stężeniu 0,1-10 mg/ml, w szczególności 0,25-7,5 mg/ml.
  14. 14. Sposób według zastrz. 10 do 13, w którym jako wspomniany związek stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA (wzór 3).
  15. 15. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 14, w którym jako wspomnianą próbkę stosuję się próbkę moczu, korzystnie moczu ludzkiego.
  16. 16. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 15, w którym pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, w szczególności 410 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystnie 36-38°C.
  17. 17. Zestaw zawierający związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 i bufor pomiarowy.
  18. 18. Zestaw według zastrz. 17, w którym związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA (wzór 3).
  19. 19. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka piersi.
  20. 20. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania do diagnozowania raka piersi.
  21. 21. Związek do zastosowania według zastrzeżenia 20, w którym diagnozowanie raka piersi obejmuje wykrywanie pierwotnego raka piersi, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka piersi i/lub wykrywanie wznowy raka piersi.
  22. 22. Związek do zastosowania według jednego z zastrz. 20 do 21, w którym związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA (wzór 3).
  23. 23. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka piersi.
  24. 24. Związek do zastosowania według zastrz. 23, który to związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Gln-Gln-Thr-pNA (wzór 3).
PL445390A 2023-06-29 2023-06-29 Związek, marker diagnostyczny raka piersi, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka piersi, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku PL248105B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL445390A PL248105B1 (pl) 2023-06-29 2023-06-29 Związek, marker diagnostyczny raka piersi, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka piersi, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku
PCT/PL2024/050044 WO2025005815A1 (en) 2023-06-29 2024-06-28 Compound, diagnostic marker for breast cancer, method for detecting enzymatic activity, method for the diagnosis of breast cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of breast cancer

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL445390A PL248105B1 (pl) 2023-06-29 2023-06-29 Związek, marker diagnostyczny raka piersi, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka piersi, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL445390A1 PL445390A1 (pl) 2024-12-30
PL248105B1 true PL248105B1 (pl) 2025-10-20

Family

ID=92503840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL445390A PL248105B1 (pl) 2023-06-29 2023-06-29 Związek, marker diagnostyczny raka piersi, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka piersi, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL248105B1 (pl)
WO (1) WO2025005815A1 (pl)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005071387A1 (en) * 2004-01-09 2005-08-04 Children's Medical Center Coporation Methods for diagnosis and pronosis of cancers of epithelial origin
CN106568954A (zh) * 2016-10-26 2017-04-19 北京师范大学 乳腺癌的尿液蛋白标志物及其在诊断和预后中的用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005071387A1 (en) * 2004-01-09 2005-08-04 Children's Medical Center Coporation Methods for diagnosis and pronosis of cancers of epithelial origin
CN106568954A (zh) * 2016-10-26 2017-04-19 北京师范大学 乳腺癌的尿液蛋白标志物及其在诊断和预后中的用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
I. BELCZACKA ET AL.: "Sci Rep; 2018; 8: 5227", URINARY CE-MS PEPTIDE MARKER PATTERN FOR DETECTION OF SOLID TUMORS. *
M. POREBA ET AL.: "Chem Sci. 2018; 9(8): 2113-2129", SELECTIVE IMAGING OF CATHEPSIN L IN BREAST CANCER BY FLUORESCENT ACTIVITY-BASED PROBES. *
R. ROY ET AL.: "Clin Biochem. 2011; 44(17-18): 1434-1439", POTENTIAL OF FLUORESCENT METALLOPROTEINASE SUBSTRATES FOR CANCER DETECTION. *

Also Published As

Publication number Publication date
PL445390A1 (pl) 2024-12-30
WO2025005815A1 (en) 2025-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240353410A1 (en) Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer
PL248105B1 (pl) Związek, marker diagnostyczny raka piersi, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka piersi, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku
PL246444B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka jajnika, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka jajnika, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku
PL245425B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka trzonu macicy, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka trzonu macicy, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego
HK40116114A (zh) 化合物-子宫体癌诊断标志物、检测酶活性的方法、诊断子宫体癌的方法、含该化合物的试剂盒、该化合物的用途和治疗子宫体癌的方法
PL247268B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka dróg żółciowych, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka dróg żółciowych, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku
PL244819B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka płuca, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka płuca, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego
JP2025513350A (ja) 化合物 － 腎臓がん用診断マーカー、酵素活性の検出法、腎臓がんの診断法、本化合物を含むキット、本化合物の使用、及び腎臓がんの治療法
HK40111059A (zh) 化合物——肠癌诊断标志物、酶活性检测方法、肠癌诊断方法、包含该化合物的试剂盒、化合物的用途和治疗肠癌的方法
HK40121437A (zh) 化合物-卵巢癌诊断标记物、检测酶活性的方法、诊断卵巢癌的方法、包含所述化合物的试剂盒、所述化合物的用途和治疗卵巢癌的方法
HK40129291A (zh) 化合物-用於胆道癌的诊断标志物、用於检测酶活性的方法、用於诊断胆道癌的方法、包括该化合物的试剂盒、该化合物的用途和用於治疗胆道癌的方法
JP2026506172A (ja) 化合物、胃がんの診断マーカー、酵素活性の検出法、胃がんの診断法、本化合物を含むキット、本化合物の使用、及び胃がんの治療法
HK40105068A (zh) Fret酶底物及其在肝癌中的应用
KR20240163731A (ko) 화합물 - 장암 진단 마커, 효소 활성 검출 방법, 장암 진단 방법, 상기 화합물을 포함하는 키트, 상기 화합물의 용도 및 장암 치료 방법
HK40107766A (zh) Fret酶底物及其在肺癌中的应用
HK40113726A (zh) 化合物-肾癌诊断标志物、酶活性检测方法、肾癌诊断方法、包含该化合物的试剂盒、化合物的用途及肾癌治疗方法