PL248795B1 - Preparat o działaniu wirusobójczym i biobójczym, jego zastosowanie zwłaszcza przeciw SARS-CoV-2, sposób wytwarzania preparatu i warstwy ochronnej o własnościach bójczych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest preparat o działaniu wirusobójczym i biobójczym zawierający koloid niefunkcjonalizowanego tlenku grafenu i wolnych od zanieczyszczeń powierzchniowych nanoczastek srebra w proporcji wagowej 5:25. Wynalazek dotyczy również zastosowania tego preparatu przeciwko wirusom i mikroorganizmom, zwłaszcza wirusowi SARS-CoV-2, sposobu przygotowania preparatu i sposobu wytwarzania stabilnej i trwałej warstwy ochronnej, wykazującej właściwości bójcze wobec bakterii i wirusów, a zwłaszcza wirusa SARS-CoV-2 poprzez nanoszenie preparatu koloidalnego na materiały i powierzchnie, zwłaszcza maseczki i odzież ochronną w jednostkach medycznych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wirusobójczy i biobójczy preparat koloidalny, zastosowanie tego preparatu przeciwko wirusom i mikroorganizmom, zwłaszcza wirusowi SARS-CoV-2, sposób przygotowania preparatu i sposób wytwarzania stabilnej i trwałej warstwy ochronnej, wykazującej właściwości bójcze wobec bakterii i wirusów, a zwłaszcza wirusa SARS-CoV-2 na materiałach i powierzchniach, zwłaszcza maseczkach i odzieży ochronnej w jednostkach medycznych.

Ze stanu techniki znane są różne rozwiązania w zakresie antymikrobiologicznego działania tlenku grafenu połączonego z nanocząstkami srebra. W badaniach Jaworskiego i wsp. „Graphene Oxide-Based Nanocomposites Decorated with Silver Nanoparticles as an Antibacterial Agent Nanoscale Research Letters.” (2018) 13:116 https://doi.org/10.1186/s11671-018-2533-2 mieszaninę tlenku grafenu oraz nanocząstek srebra, produkowanych metodą chemiczną, poprzez działanie ultradźwiękami nanoszono na folię poliuretanową. Tak uzyskana folia posiadała właściwości antybakteryjne.

W badaniach Liu i wsp. „Facile synthesis of monodispersed silver nanoparticles on graphene oxide sheets with enhanced antibacterial activity. J. Chem.” (2011) 35, 1418-1423 kompozyt GO-nanoAg wykazywał właściwości antybakteryjne wobec Escherichia coli na poziomie 99%.

Inne badania (Khorrami i wsp. „Method for Fabrication of Ag-GO Nanocomposite with Controlled Anti-Cancer and Anti-bacterial Behavior; A Comparative Study”. Scientific Reports (2019) 9:9167 oraz Shao i wsp. “Preparation, Characterization, and Antibacterial Activity of Silver Nanoparticle-Decorated Graphene Oxide Nanocomposite.” ACS Appl. Mater. Interfaces (2015) 7, 6966-6973) wykazały aktywność antybakteryjną nanokompozytu GO i nanocząstek Ag przeciwko Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus.

Nieliczne źródła dokumentują antywirusowe właściwości kompozytu, mieszaniny czy substancji złożonej z tlenku grafenu i przyłączonych do niego (dekorowanych) nanocząstek srebra.

Badano aktywność przeciwwirusową tlenku grafenu z dołączonymi nanocząstkami Ag wobec wirusów otoczkowych i bezotoczkowych ale jedynie przeciwko koronawirusowi kotów (FCoV) a nie ludzi (Chen i wsp. “Antiviral Activity of Graphene-Silver Nanocomposites against Non-Enveloped and Enveloped Viruses.” Int. J. Environ. Res. Public Health (2016) 13, 13, 430).

Podobnie w innych badaniach udokumentowano antywirusowe działanie nanokompozytu G OAg wobec wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRRSV) (Du i wsp. „Antiviral Activity of Graphene Oxide-Silver Nanocomposites by Preventing Viral Entry and Activation of Antiviral Innate Immune Response. ACS Applied Bio Materials (2018) 1 (5)).

W kolejnych badaniach (Crane i wsp. „Graphene oxide/silver nanoparticle ink formulations rapidly inhibit influenza A virus and OC43 coronavirus infection in vitro. (2021) https://doi.org/10.1101/2021.02.25.432893) udokumentowano aktywność antywirusową kompozytu GO-Ag wobec dwu otoczkowych ludzkich wirusów RNA, wirusa grypy A i koronawirusa OC43.

Dotychczas stosowane metody przygotowania nanowarstwy tlenku grafenu, dekorowanego nanocząstkami srebra można podzielić na chemiczne i fizyczne. Znane metody chemiczne wykorzystują reakcje chemiczne pomiędzy nanocząstkami i tlenkiem grafenu, a najczęściej funkcjonalizację nanocząstek srebra lub tlenku grafenu, celem związania tych struktur i stworzenia koloidu GO-Ag (Crane i wsp., 2021). Funkcjonalizację GO wykonuje się poprzez przyłączanie grup tiolowych, które łączą nanocząstki Ag. Wadą tych metod jest silne związanie GO i Ag, co utrudnia wydzielanie nanocząstek Ag i ich jonów do mikrośrodowiska i zmniejsza skuteczność bójczą preparatu GO-Ag.

W innych rozwiązaniach stosuje się jeszcze dodatkowe materiały i związki chemiczne, które tworzą kompozyt wraz z GO i Ag. Do niektórych należą kompozyt GO-nanoAg na folii propylenowej (Jaworski i wsp. 2018). Tlenek grafenu i nanocząstki srebra nanoszono na folię lub inne struktury i badano właściwości antybakteryjne tak uzyskanych kompozytów.

Znane ze stanu techniki rozwiązania tlenku grafenu dekorowanego cząstkami srebra polegają na opracowaniu preparatu (kompozytu) tlenku grafenu dekorowanego nanocząstkami srebra do zastosowania jako płynu dezynfekcyjnego o działaniu antymikrobiologicznym.

W zakresie sposobów nanoszenia nanowarstwy najbardziej popularnym rozwiązaniem osadzania tlenku grafenu na powierzchni jest chemiczne osadzanie z fazy gazowej (CVD) (Lavin-Lopez i wsp. “Role of inert gas in the CVD-graphene synthesis over polycrystalline nickel foils”. Mater. Chem Phys. (2019) 222, 173-180). Jednak metoda ta wymaga zaawansowanego sprzętu aparaturowego.

W innych znanych rozwiązaniach tlenek grafenu osadzano na oczyszczanej plazmą szalce Petriego, a następnie poddawano suszeniu próżniowemu. W tej procedurze tlenek grafenu rozpylano pod ciśnieniem, a następnie poddawano suszeniu próżniowemu w temperaturze 150°C. (Nasiłowska i wsp. „Graphene Oxide Aerosol Deposition and its Influence on Cancer Cells. Preliminary Results.” Materials (2020) 13, 4464).

Ze stanu techniki znane są również metody napylania czy natryskiwania. Metodą nakładania cienkich warstw, opracowaną przez Kim i wsp. „Self-Healing Reduced Graphene Oxide Films by Supersonic Kinetic Spraying.” Adv. Funct. Mater. (2014) 24, 4986-4995. jest metoda naddźwiękowego rozpylania kinetycznego. Zaletą tej metody jest możliwość osadzania grafenu (rGO) na dowolnym podłożu i na znaczą skalę. Generalnie metody napylania na zimno dzieli się na wysokociśnieniowe i niskociśnieniowe, gdzie gaz nośny ma prędkość od 300-1200 m/s. Technologia ta dzieli się na dwa rodzaje: wysoko- i niskociśnieniową, różniące się budową dyszy do natryskiwania. Jednak, w obu tych metodach stosuje się specjalne dysze, gaz nośny (np. hel lub jego mieszaniny), wysoką temperaturę. Co więcej metody te dedykowane są nanoszeniu proszków metali i ich tlenków (Moridi i wsp. “Cold spray coating: review of material systems and future perspectives.” Surface Engineering (2014) 30, 5, 369-395).

Celem wynalazku jest dostarczenie wysoce efektywnego środka bójczego wobec bakterii i wirusów, zwłaszcza przeciwko koronawirusowi SARS-CoV-2, do pokrywania materiałów, powierzchni i sprzętów użytku medycznego i codziennego. Utworzona na powierzchni danego materiału warstwa będzie ultra cienka, trwała i nie będzie zmieniać istotnie cech materiału.

Przedmiotem wynalazku jest preparat o działaniu wirusobójczym i biobójczym zawierający tlenek grafenu i nanocząstki srebra, który zawiera koloid niefunkcjonalizowanego tlenku grafenu i wolnych od zanieczyszczeń powierzchniowych nanocząstek srebra w proporcji wagowej 1:5, przy czym nanocząstki srebra stanowią monokrystaliczne nanocząstki srebra wytworzone metodą fizyczną EDM.

Korzystnie, stężenie koloidu tlenek grafenu - nanocząstki srebra wynosi 25 ppm do 50 ppm srebra i 5 do 10 ppm tlenku grafenu.

Korzystnie, preparat zawiera tlenek grafenu o średnicy płatka od 5 do 30 μm, grubości pojedynczej warstwy płatków 0,8-1,2 nm, o zawartości węgla 40-50%, tlenu 39-49%, wodoru 1-4%, siarki < 2%, azotu < 1%, manganu < 0,006%.

Korzystnie, tlenek grafenu zawieszony w wodzie o stężeniu 1 mg/ml zachowuje stabilność przez minimum 6 miesięcy, a potencjał Zeta wynosi < 25 mV.

Korzystnie, stężenie tlenku grafenu wynosi 5 ml/L i srebra 25 ml/L.

Korzystnie, tlenek grafenu zawiera na swojej powierzchni grupy -OH, COOH, =O oraz -H.

Korzystnie, preparat zawiera koloidalny roztwór nanocząsteczek srebra, w którym srebro zawieszone jest w wodzie o przewodności elektrycznej < 1,020 μS.

Korzystnie, nanocząstki srebra są wolne od zanieczyszczeń powierzchniowych, o wielkości od 1 do 100 nm, rozkładzie wielkości 50% nanocząstek < 30 nm, potencjale Zeta < 30 mV, o morfologii zaokrąglonej, bez ostrych krawędzi.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie preparatu o działaniu wirusobójczym i biobójczym jak określono powyżej do dezynfekcji i zabezpieczania powierzchni przeciwko mikroorganizmom i wirusom.

Korzystnie, wirusem jest koronawirus, zwłaszcza SARS-CoV-2.

Korzystnie, powierzchnię stanowią maseczki, materiały, odzież ochronna, sprzęty i akcesoria medyczne, materiały, sprzęty użytku domowego oraz skóra ludzka.

Korzystnie, preparat natryskiwany jest na powierzchnie na zimno lub metodą jednorazowej sonikacji.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ochronnej warstwy o własnościach bójczych, charakteryzujący się tym, że powyżej określony preparat natryskiwany jest na powierzchnie na zimno lub metodą jednorazowej sonikacji.

Korzystnie, preparat rozpyla się co najmniej dwukrotnie na suchą powierzchnię wybranego materiału z odległości ok. 0,5 m poprzez równomierne natryskiwanie na zimno całej powierzchni aż do uzyskania efektu maksymalnego nasączenia materiału lub maksymalnego pokrycia warstwą preparatu, po wyschnięciu naniesionej pierwszej warstwy przeprowadza się kolejne natryskiwanie warstwy drugiej.

Korzystnie, po wyschnięciu naniesionej drugiej warstwy przeprowadza się natryskiwanie trzeciej warstwy.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania preparatu jak określono powyżej charakteryzujący się tym, że mieszaninę nanocząstek srebra i tlenku grafenu poddaje się sonikacji w celu związania nanocząstek srebra do płatków tlenku grafenu w procesie wymuszonej samoorganizacji i utworzenia stabilnego koloidu, przy czym stosunek wagowy tlenku grafenu do nanocząstek srebra wynosi 1:5, przy czym nanocząstki srebra wytworzone są metodą fizyczną EDM.

Korzystnie, sonikację mieszaniny srebra i tlenku grafenu prowadzi się w ultrapłuczce małej mocy przez 30 minut, w temperaturze pokojowej.

Rozwiązanie według wynalazku polega na przygotowaniu preparatu wirusobójczego i biobójczego, będącego mieszaniną niefunkcjonalizowanego tlenku grafenu i wolnych od zanieczyszczeń powierzchniowych nanocząstek srebra (GO-nanoAg) w proporcji wagowej 5 : 25. W rozwiązaniu według wynalazku nie stosuje się folii i innych materiałów, a czynnikiem stanowiącym podłoże dla nanocząstek srebra są płatki tlenku grafenu. Rozwinięta powierzchnia płatków grafenu stanowi rodzaj nanowarstwy, która z uwagi na liczne grupy funkcyjne, znajdujące się na jej powierzchni (-OH, =O, -COOH) ma powinowactwo do większości materiałów i łatwo ulega adhezji poprzez siły Van der Vaalsa do powierzchni materiału, na który została naniesiona.

W rozwiązaniu według wynalazku mieszaninę nanocząstek srebra i tlenku grafenu poddaje się sonikacji w celu związania nano-srebra do płatków tlenku grafenu w procesie wymuszonej samoorganizacji i utworzenia stabilnego koloidu nanoAg-GO o koncentracji 25 ppm do 50 ppm Ag i 5 ppm do 10 ppm GO. W rozwiązaniu według wynalazku preparat nanoAg-GO poprzez natryskiwanie na zimno na wybrane powierzchnie, a w tym materiały, odzież w tym ochronną i inne przedmioty użytku medycznego i codziennego tworzy silnie przylegającą, stabilną i trwałą nanowarstwę ochronną przeciwko bakteriom i wirusom, a zwłaszcza przeciwko koronawirusowi SARS-CoV-2.

Cechy nanocząstek srebra

W rozwiązaniu według wynalazku stosuje się tylko nanocząstki srebra produkowane metodą fizyczną EDM (micro-electrical discharge machining). Metoda ta gwarantuje najwyższą czystość koloidu i czystość powierzchniową nanocząstek srebra. W innych rozwiązaniach wykorzystuje się nanocząstki srebra uzyskane metodami chemicznymi, zazwyczaj poprzez redukcję soli srebra. W dostępnej literaturze znana jest metoda fizyczna łączenia tlenku grafenu z nanocząstkami srebra (Chen i wsp., „Nanocomposites against Non-Enveloped and Enveloped Viruses”. Int. J. Environ. Res. Public Health (2016) 13, 13, 430), jednak proces ten odbywa się w inny sposób, a pozostałe różnice dotyczą charakterystyki nanocząstek srebra. W porównaniu do innych znanych rozwiązań otrzymywania kompozytu koloidalnego złożonego z tlenku grafenu i nanocząstek srebra w rozwiązaniu według wynalazku zastosowano nanocząstki srebra wytwarzane tylko metodą fizyczną. Metoda polegała na powstawaniu nanocząstek srebra z elektrody zanurzonej w ultraczystej wodzie pod wpływem odpowiedniego natężenia i napięcia prądu elektrycznego, do którego podłączano elektrody. Zaletą tego rozwiązania jest doskonała czystość koloidu z uwagi na brak stosowania reagentów chemicznych, które muszą być stosowane w metodzie chemicznej, i których nie można wyeliminować w stu procentach. W rozwiązaniu według wynalazku używamy koloidalnego roztworu nanocząstek srebra w ultraczystej wodzie (miliQ-water) o przewodności elektrycznej < 1,020 μS. Dzięki temu nie wprowadzamy do preparatu żadnych dodatkowych związków i pierwiastków, które mogłyby być szkodliwe dla organizmu, czy mogłyby zaburzać lub zmniejszać skuteczność preparatu. Wiadomo, że nawet zastosowanie procesu oczyszczania nanocząstek srebra ze śladów reagentów chemicznych nigdy nie daje skuteczności stuprocentowej. Koloidy nanocząstek srebra były sprawdzane pod względem podstawowych parametrów fizyko-chemicznych, a także stabilności koloidu, czystości, wielkości nanocząstek srebra, rozkładu wielkości nanocząstek, morfologii nanocząstek i potencjału Zeta koloidu.

Cechy tlenku grafenu

W rozwiązaniu według wynalazku stosujemy tlenek grafenu (możliwie czysty) otrzymany metodą Hammersa, poprzez utlenianie grafitu. Jednak różnica pomiędzy rozwiązaniem według wynalazku a innymi znanymi ze stanu techniki polega na tym, że w kolejnych etapach postępowania tlenek grafenu nie jest poddawany żadnym procesom chemicznym (w tym funkcjonalizacji) i żaden związek chemiczny nie jest dodawany w procesie tworzenia nanokoloidu GO-Ag. Zastosowany w wynalazku wodny roztwór tlenku grafenu był sprawdzany pod względem podstawowych parametrów fizyko-chemicznych, a także stabilności koloidu, czystości, wielkości nanocząstek płatków, rozkładu wielkości płatków, morfologii płatków, potencjału Zeta koloidu i dobierany był pod względem optymalizacji czystości, wielkości płatków i stabilności koloidu. Najbardziej optymalnym produktem jest tlenek grafenu zdyspergowany w wodzie o koncentracji 4 mg/L zakupiony przykładowo w Advance Graphene Products, Antoniego Wysockiego 4, 66-002 Nowy Kisielin.

W rozwiązaniu według wynalazku, dzięki unikalnym właściwościom i doborowi składników oraz doskonałej jakości i czystości chemicznej nanocząstek srebra oraz dużej czystości tlenku grafenu możemy zastosować metodę fizyczną, kierowanej, wymuszonej samoorganizacji, w celu związania GO i nanoAg i uzyskaniu preparatu GO-Ag. Wolne grupy funkcyjne na tlenku grafenu oraz wolne grupy funkcyjne na nanocząstkach srebra, które nie zostały zablokowane w procesie ich produkcji czy też funkcjonalizacji chemicznej reagują ze sobą i tworzą stabilne, jednak stosunkowo nietrwałe (nie kowalencyjne) wiązania. Wiązania takie umożliwiają wolne migrowanie jonów srebra w mikrośrodowisku co zwiększa skuteczność bójczą preparatu.

Preparat według wynalazku służy do wytworzenia nanowarstwy GO-nanoAg na powierzchni, tak by na dłuższy czas była ona zabezpieczona przed mikroorganizmami i wirusami, a zwłaszcza SARS-CoV-2. Rozwiązanie według wynalazku, a mianowicie bardzo duża czystość preparatu GO-nanoAg uzyskana poprzez zastosowanie metod fizycznych podczas tworzenia tego koloidu oraz przez wykorzystanie nanocząstek srebra wyprodukowanych metodą fizyczną pozwoliły na uzyskanie wyjątkowych cech koloidu. Cechy te to duża ilość, nie związanych grup funkcyjnych -OH, =O i COOH, które pozwalają na silną adhezję preparatu do podłoża.

Rozwiązanie według wynalazku charakteryzuje szereg wskazanych poniżej cech.

Preparat zawiera tlenek grafenu, wyprodukowany metodą zmodyfikowaną Hummers’a, o typowej średnicy płatka od 5 do 30 μm, grubości pojedynczej warstwy płatków 0,8 -1,2 nm, o zawartości węgla 40-50%, tlenu 39-49%, wodoru 1-4%, siarki < 2%, azotu <1%, manganu < 0,006%. Tlenek grafenu, zawieszony w wodzie o stężeniu 1 mg/ml zachowuje stabilność przez minimum 6 miesięcy, potencjał Zeta roztworu wynosi < 25 mV. Tlenek grafenu nie jest funkcjonalizowany zawiera na swej powierzchni, przede wszystkim, grupy -OH, COOH, =O oraz -H. Preparat zawiera monokrystaliczne nanocząstki Ag (0), wytworzone metodą fizyczną poprzez rozdrobnienie metalu Ag (0) o wysokiej czystości metodą elektryczną w dejonizowanej, ultraczystej wodzie. Nanocząstki srebra są wolne od zanieczyszczeń powierzchniowych, mają wielkość od 1 do 100 nm, rozkład wielkości 50% nanocząstek < 30 nm, potencjał Zeta < 30 mV, morfologię zaokrągloną, bez ostrych krawędzi. Koloid GO-nanoAg (GO dekorowane nanocząstkami Ag) jest wytwarzany poprzez wymuszoną samoorganizację koloidalnego roztworu wodnego GO i Ag (0) mieszanych w proporcji wagowej 5 : 25. W kompozycie koncentracja GO występuje na poziomie od 5 ml/L do 10 ml/L i Ag (0) na poziomie od 25 ml/L do 50 ml/L.

Przygotowanie roztworu polega na sonikacji w ultra płuczce małej mocy przez 30 minut, w temperaturze pokojowej. Natryskiwanie polega na dwu lub trzykrotnym rozpylaniu koloidu na powierzchni wybranego materiału. Natryskiwanie stosuje się na suchą powierzchnię z odległości ok. 0,5 m poprzez równomierne natryskiwanie całej powierzchni aż do uzyskania efektu maksymalnego nasączenia materiału lub maksymalnego pokrycia warstwą płynu (w przypadku materiału hydrofobowego), kolejne natryskiwanie przeprowadza się po wyschnięciu naniesionej warstwy pierwszej, ewentualne trzecie natryskiwanie również stosuje się po wyschnięciu warstwy natryskiwania drugiego. Natryskiwany materiał może być zawieszony wertykalnie lub położony na powierzchni nieprzemakalnej (np. folii polietylenowej). Utworzona na powierzchni danego materiału warstwa jest ultracienka, trwała, nie zmienia istotnie cech materiału, nie powoduje powstawania plam, może nieznacznie (o ton) przyciemniać materiał biały. Utworzona warstwa jest stabilna i odporna na działanie czynników fizyko-chemicznych, w tym zachowuje trwałość podczas dwu-, trzykrotnego mycia, dwukrotnego delikatnego prania, prasowania zgodnie z wymaganiami materiału. Utworzona warstwa nie jest odporna na działanie czynników mechanicznych jak tarcie, skrobanie i inne zabiegi polegające na zdzieraniu powierzchni. Proponowany sposób nanoszenia preparatu jest metodą prostą, możliwą do zastosowania w każdych warunkach, w tym szpitalnych i domowych. Metoda ta nie wymaga zaawansowanego sprzętu. Metoda ta jest możliwa do zastosowania dzięki dużej czystości chemicznej preparatu oraz odpowiedniej recepturze preparatu (koncentracja tlenku grafenu i nanosrebra). W metodzie wykorzystuje się zjawisko samoorganizacji płatków tlenku grafenu na powierzchni natryskiwanego materiału, dzięki temu, że jego niska koncentracja pozwala na korzystne rozwinięcie płatków tlenku grafenu i ich adhezję do natryskiwanej powierzchni. Swobodne suszenie również pozwala na samoorganizację natryskiwanego środka wobec traktowanej powierzchni. Zaletą tej metody jest to, że odpowiednio dobrane cechy preparatu (procentowy udział komponentów), dostępność grup funkcyjnych na tlenku grafenu oraz zastosowanie metody samoorganizacji (self-assembling) pozwalają na łatwe i szybkie tworzenie nanowarstwy na powierzchni większości materiałów. Zaletą proponowanego rozwiązania jest również trwałość warstwy i jej antywirusowa i antybakteryjna aktywność w ciągu długiego okresu czasu (nawet do miesiąca) i możliwość jej usunięcia, zmycia utworzonej warstwy w wyniku kilku zabiegów mycia bądź tarcia.

Preparat może mieć zastosowanie do pokrywania różnego rodzaju podłoży, najlepiej hydrofilnych lecz również hydrofobowych. Nie może mieć zastosowania do podłoży silnie hydrofobowych jak tłuszcz. Preparat może mieć zastosowanie do pokrywania podłoży biologicznych skóra człowieka (ręce, nogi), podłoży abiotycznych, na przykład materiałów tekstylnych, odzieży, obuwia, a tym maseczek medycznych i ubrania szpitalnego. Środek może służyć do pokrywania ścian, podłóg, mebli w pomieszczeniach użytku publicznego i jednostkach medycznych. Z uwagi na biozgodność preparatu, potwierdzoną badaniami na keratynocytach oraz modelu sztucznej skóry, zgodnie z normą UE może on mieć kontakt ze skórą ludzką.

Opis figur

Fig. 1. Wybrane materiały (bawełna, jedwab, polipropylen) pokryte nanowarstwą tlenku gra- fenu, dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg) poprzez natryskiwanie górny rząd lub sonikację (dolny rząd).

Fig. 2. Maseczka eksperymentalna z wyeksponowanymi materiałami (po lewej kontrola, po prawej GO-nanoAg) w kształcie półkola, umieszczonymi w strefie wydechu. Po zdjęciu maseczki były transportowane do laboratorium.

Fig. 3. Schematyczny opis analizy RT-PCR w kierunku genu specyficznego dla wirusa SARS-

-CoV-2 oraz genu specyficznego dla beta-wirusa, w stosunku do genu beta-aktyny.

Fig. 4a Maseczki wykonane z jedwabiu pokrytego nanowarstwą kompozytu GO-nanoAg poprzez natryskiwanie.

Fig. 4b Przykładowy zapis wyników z RT-PCR pochodzący z analizy maseczek podawanych 4 pacjentom.

Fig. 5. Test żywotności bakterii Pseudomonas aeuginosa oraz Staphylococcus aureus pod wpływem zastosowania kompozytu tlenku grafenu dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg), tlenku grafenu i nanocząstek srebra.

Fig. 6. Test właściwości antybakteryjnych wobec bakterii Pseudomonas aeuginosa oraz Sta- phylococcus aureus powierzchni pokrytej kompozytem tlenku grafenu dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg), tlenku grafenu i nanocząstek srebra, na rysunkach przedstawiono płytki pokryte koloniami bakterii na powierzchni pokrytej (od lewej: kontrola, GO, nanoAg, GO-nanoAg).

Fig. 7. Test właściwości antybakteryjnych wobec bakterii Pseudomonas aeuginosa oraz Sta- phylococcus aureus powierzchni bawełny pokrytej kompozytem tlenku grafenu dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg), tlenku grafenu i nanocząstek srebra, na rysunkach przedstawiono płytki pokryte koloniami bakterii na powierzchni pokrytej (od lewej: GO-nanoAg, nanoAg, GO, kontrola).

Fig. 8 A, B Wyniki testu toksyczności MTT oraz koncentracji Interleukiny 1 w medium hodowlanym sztucznej skóry poddawanej działaniu kompozytu GO-nanoAg, tlenku grafenu i nanocząstek srebra w różnych koncentracjach w porównaniu do grupy kontrolnej oraz grupy negatywnej (SDS).

Fig. 9. Wyniki koncentracji markerów stanu zapalnego, oznaczonych w medium hodowlanym sztucznej skóry poddawanej działaniu kompozytu GO-nanoAg, tlenku grafenu i nanocząstek srebra w różnych koncentracjach w porównaniu do grupy kontrolnej (PBS) oraz grupy pozytywnej (antybiotyk).

Fig. 10. Liczba kolonii żywych bakterii Staphylococcus aureus oznaczona w medium oraz insercie sztucznej skóry ludzkiej, zakażanej wymienioną bakterią, a następnie traktowaną kompozytem GO-nanoAg, tlenkiem grafenu i nanocząstkami srebra po 3 i 6 godzinach.

Przykład 1

Otrzymywanie i natryskiwanie koloidu GO-nanoAg

Koloidalny wodny roztwór nanocząstek srebra (nanoAg), zakupiony np. w firmie NanoTech Polska sp. z o.o. jako preparat Axonite (lub w firmie NanoKoloid sp. z o.o.) o koncentracji 100 ppm rozcieńczono dwukrotnie otrzymując roztwór koloidalny nanoAg o koncentracji 50 ppm. Koloidalny roztwór płatków tlenku grafenu o koncentracji 4000 ppm, zakupiony np. w Advance Graphene Products, sp. z o.o. rozcieńczono 400 krotnie otrzymując roztwór tlenku grafenu o koncentracji 100 ppm. Dodawano roztwór nanoAg (o koncentracji 50 ppm) do roztworu GO (o koncentracji 10 ppm) w stosunku 1:1 i uzyskano roztwór mieszaniny GO i nanoAg (GO-nanoAg) o koncentracji GO 5 ppm i nanoAg 25 ppm. Uzyskany roztwór GO-nanoAg umieszczono w szklanej butelce i wstawiono do ultrapłuczki małej mocy (Ultron U-503 1,6 L o mocy generatora ultradźwięków 150 W i częstotliwości drgań ultradźwiękowych 21,5 kHz), w temperaturze pokojowej na 2 x 15 min i poddawano sonikacji. Uzyskany koloid GO-nanoAg przelano do natryskiwacza wykonanego z PE, np. zakupionego w IKEA of Sweden AB i rozpoczęto proces natryskiwania. Materiał (bawełna) powieszono i równomiernie natryskiwano go z odległości ok 0,5 m aż do całkowitego nasączenia materiału, następnie materiał był samoistnie suszony w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu czynność natryskiwania powtórzono. Po wyschnięciu czynność natryskiwania powtórzono po raz trzeci. Po wyschnięciu materiał był gotowy do stosowania jako antymikrobiologiczny. Blat stołu równomiernie natryskiwano z odległości ok 0,5 m aż do całkowitego zwilżenia, następnie powierzchnia uległa samoistnemu suszeniu w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu czynność natryskiwania powtórzono. Po wyschnięciu powierzchnia blatu była gotowa do stosowania jako antymikrobiologiczna.

Przykład 2

Celem doświadczenia było stwierdzenie właściwości wirusobójczych preparatu (koloidu) tlenku grafenu, dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg) oraz porównanie różnych metod nanoszenia kompozytu GO-nanoAg na różne materiały, które były eksponowane na maseczkach, zakładanych pacjentom ze stwierdzonym w badaniach RT-PCR Covid-19.

Materiał i metody

Przygotowano 6 rodzajów materiałów: bawełna, jedwab, polipropylen 1 (fizelina), polipropylen 2 (o małej gęstości), sztuczny jedwab (celuloza), polietylen (przyłbice) (Fig. 1). Materiały te były pokryte nanowarstwą kompozytu GO-nanoAg wg sposobu przygotowania opisanego w Przykładzie 1. Zastosowano dwa rodzaje nanoszenia: metodę natryskiwania oraz metodę sonikacji. W metodzie natryskiwania materiał umieszczano na foli, zapobiegając zasysaniu kompozytu przez podłoże, a następnie natryskiwano materiał w sposób równomierny komercyjnym spryskiwaczem, stosując kompozyt w ilości 5 ml/m² materiału. Po odparowaniu wody w sposób swobodny, w temperaturze pokojowej dokonano drugiego natryskiwania postępując w taki sam sposób i po kolejnym wyschnięciu powtórzono natryskiwanie po raz trzeci. Po wyschnięciu materiał cięto na półkola i umieszczano na masce stanowiącej podporę zawsze umieszczając po lewej stronie materiał kontrolny (nie natryskiwany) a po prawej stronie materiał z nanowarstwą GO-nanoAg (Fig. 2). W metodzie z zastosowaniem sonikacji postępowano w sposób podobny, jednak zamiast natryskiwania zastosowano metodę jednorazowej sonikacji. Tak, więc materiał umieszczano w płuczce ultradźwiękowej małej mocy o charakterystyce: ULTRON U-503 1,6L o mocy generatora ultradźwięków 150 W i częstotliwości drgań ultradźwiękowych 21,5 na 30 minut (2 x 15 min), w temperaturze pokojowej. Potem materiały suszono i umieszczano na masce podporowej. W przypadku przyłbicy postępowano podobnie z tym, że dzielono ją na dwa pola lewe i prawe. Maseczki i przyłbice zakładano pacjentom ze stwierdzonym COVID-19, przebywającym w szpitalu. Maseczki zakładano w standardowy sposób na czas 1 godziny, następnie pakowano z uwzględnieniem środków bezpieczeństwa i przekazywano do laboratorium. Część maseczek zakładano a część pokrywano śliną pacjenta.

Próbki maseczek badano metodą RT-PCR w laboratorium akredytowanym w kierunku genu specyficznego dla wirusa SARS-CoV-2 oraz genu specyficznego dla beta-wirusa ludzkiego, w stosunku do ludzkiego genu beta-aktyny (Fig. 3). Analizę przeprowadzono metodą akredytowaną.

Wyniki

Badanie prowadzono przez okres 1 miesiąca uzyskując wyniki w poszczególnych transzach (Fig. 4b). Po uzyskaniu całości wyników i ich podsumowaniu stwierdzono, że wszystkie materiały z naniesioną warstwą kompozytu GO-nanoAg niezależnie od materiału wykazały cechy antywirusowe ponieważ nie zidentyfikowano obecności RNA wirusa w badaniach RT-PCR. Sposób nanoszenia kompozytu GO-nanoAg (natryskiwanie vs. sonikacja) nie wpływał na aktywność bójczą wobec wirusa SARS-CoV-2, a także innych wirusów z grupy beta wirusów, a zatem metoda prostego i własnoręcznego natryskiwania jest wystarczająca do stworzenia antywirusowej nanowarstwy GO-nanoAg. Rodzaj materiału wykazywał różnice w zakresie cech antywirusowych, wynikających z cech fizyko-chemicznych materiału. Przyłbice, a także jedwab wykazywały pewne cechy powierzchni antywirusowej. Jednak tylko materiały z naniesionym kompozytem GO-nanoAg zabezpieczały całkowicie materiał przez obecnością wirusa. Materiały eksponowane na maseczce podporowej nie miały cech drażniących, alergizujących czy innych wskazujących na ich działanie szkodliwe lub powodujące dyskomfort pacjenta.

Podsumowując, można stwierdzić, że prosta aplikacja kompozytu GO-nanoAg, wykonana trzykrotnie w sposób amatorski przy użyciu standardowego natryskiwacza zabezpiecza materiał przed wirusem.

Przykład 3

Celem doświadczenia było stwierdzenie właściwości przeciwwirusowych (przeciwko ludzkim koronawirusom beta oraz koronawirusowi SARS-CoV-2) maseczek, pokrytych warstwą środka - tlenku grafenu, dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg) w badaniach RT-PCR Covid-19. Materiały: jedwab, bawełnę i fizelinę, używaną do produkcji maseczek medycznych natryskiwano kompozytem GO-nanoAg zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1. Uzyskany materiał wykorzystano do uszycia maseczek. Ponadto kupiono komercyjnie dostępne maseczki z jedwabiu, bawełny i fizeliny (maseczki medyczne) i nanoszono warstwę GO-nanoAg zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1 (Fig. 4a). Połowa maseczek nie została potraktowana kompozytem i stanowiła grupę kontrolną. Następnie maseczki udostępnione zostały pacjentom ze stwierdzonym COVID-19 testem RT-PCR. Po 3 godzinach maseczki były zbierane i wysyłane do laboratorium. W Laboratorium pobierano materiał z zastosowaniem wymazu z okolic oddechowych maseczki i przeprowadzono testy RT-PCR na obecność wirusa SARS-CoV-2 oraz obecność innych ludzkich beta-koronawirusów metoda opisaną w przykładzie 1. W teście nie obserwowano działania drażniącego, alergizującego czy toksycznego maseczek pokrywanych SARS-CoV-2. W badaniach nie stwierdzono obecności materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 ani też innych ludzkich beta-wirusów na materiale, pobranym z maseczek pokrytych nanowarstwą GO-nanoAg, w przeciwieństwie do maseczek nie pokrywanych badanym preparatem. Zastosowana metoda przez natryskiwanie materiału maseczki preparatem GO-nanoAg skutecznie zabezpiecza materiał, nadając mu właściwości przeciwwirusowe.

Przykład 4

Celem badania było stwierdzenie właściwości biobójczych wobec bakterii normatywnych Pseudomonas aeuginosa oraz Staphylococcus aureus kompozytu tlenku grafenu dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg), w porównaniu do tlenku grafenu i w porównaniu do srebra wobec grupy kontrolnej (brak dodatku) w badaniu żywotności metodą zawiesinową.

Zastosowano GO (5 ppm), nanocząstki Ag (25 ppm) oraz kompozyt GO-nanoAg (5 ppm GO + 25 ppm Ag), który przygotowano jak w przykładzie 1. Podczas badania żywotności testowanych bakterii Pseudomonas aeuginosa oraz Staphylococcus aureus wykorzystano standardowy test redukcji soli tetrazolowej (XTT). Stwierdzono, że GO (5 ppm) nie wykazuje właściwości antybakteryjnych, nanocząstki Ag (25ml/L) wykazują silne właściwości antybakteryjne, natomiast największą skuteczność bójczą wobec bakterii normatywnych Pseudomonas aeuginosa oraz Staphylococcus aureus wykazano dla kompozytu GO-nanoAg (Fig. 5).

Badania jednoznacznie wykazały skuteczność antybakteryjną preparatu GO-nanoAg.

Przykład 4

Celem badania było określenie właściwości biobójczych wobec bakterii normatywnych Pseudomonas aeuginosa oraz Staphylococcus aureus kompozytu tlenku grafenu dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg), który został naniesiony na powierzchnię metodą natryskową.

Preparat przetestowano na powierzchni stałej, twardej (blat laboratoryjny) o średnicy 9 cm, na której rozprowadzono zawiesinę bakterii P. aeruginosa oraz S. aureus (5*106 komórek/ml). Po 3 godzinach od czasu naniesienia bakterii badana powierzchnia została pokryta preparatem GO-nanoAg (o koncentracji i z zastosowaniem metody natryskiwania na zimno jak w przykładzie 1 ). Po god zinie inkubacji oceniono ilość bakterii z wykorzystaniem płytek odciskowych, pobranych z zakażanego blatu. Wyniki przedstawione na poniższych zdjęciach obrazują ilość wytworzonych kolonii oraz potwierdzają redukcję żywotności bakterii po zastosowaniu preparatu (Fig. 6). Powierzchnia pokryta kompozytem GO-nanoAg wykazuje silne właściwości antybakteryjne.

Przykład 5

Celem badania było określenie właściwości biobójczych wobec bakterii normatywnych Pseudomonas aeuginosa oraz Staphylococcus aureus kompozytu tlenku grafenu dekorowanego nanocząstkami Ag (GO-nanoAg), który został naniesiony metodą natryskiwania na powierzchnię materiałów stosowanych do produkcji odzieży (bawełna, jedwab, fizelina) w tym maseczek chirurgicznych.

Kompozyt tlenku grafenu dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg), przygotowany jak w przykładzie 1 został naniesiony metodą natryskiwania na zimno jak w przykładzie 2. Następnie badania wykonano według normy PL-ENG ISO 20645 (Płaskie wyroby włókiennicze). Aktywność antybakteryjną powierzchni materiałów pokrytych GO-nanoAg określono metodą dyfuzji na płytce z agarem. Zgodnie z procedurą normy próbki materiału, pokryte preparatem GO-nanoAg umieszczono na podłożu stałym z wysianymi bakteriami i inkubowano 24 h. Następnie oceniono efekt antybakteryjne. Nie stwierdzono kolonii bakterii na powierzchni bawełny, jedwabiu i fizeliny pokrytych kompozytem GO-nanoAg (Fig. 7).

Przykład 6

Celem badania było określenie biozgodności preparatu tlenku grafenu dekorowanego nanocząstkami srebra (GO-nanoAg), który został naniesiony na powierzchnię sztucznej skóry. Preparat przygotowano jak w przykładzie 1. W badaniu zastosowano model skóry EpiDerm firmy Mattek - 3D tissue model (Normal human epidermal keratinocytes (NHEK). Przeprowadzono test biozgodności metodą „Skin Irritation Test - norma OECD/OCDE TG No. 439. Ponadto oznaczono parametry stanu zapalnego -II-1 (Fig. 8), poziom aktywności innych cytokin stanu zapalnego (Fig. 9), morfologię, żywotność i inne parametry. W badaniu nie stwierdzono negatywnego wpływu preparatu GO-nanoAg, GO i Ag na stan sztucznej ludzkiej skóry, poziom cytokin stanu zapalnego, obraz morfologiczny skóry i testy toksyczności nie różniły się od grupy kontrolnej. Na podstawie badania, wykonanego zgodnie z normą UE do oceny toksyczności preparatów biobójczych, można uznać kompozyt GO-nanoAg (o koncentracji odpowiednio dla GO i nanoAg: 5 ppm; 25 ppm) oraz utworzoną przez niego nanowarstwę za całkowicie biozgodną.

Przykład 7

Celem badania było stwierdzenie czy kompozyt naniesiony na ludzką sztuczną skórę EpiDerm firmy Mattek - 3D tissue model (Normal human epidermal keratinocytes (NHEK) wpłynie ochronnie na zakażenie bakterią Staphylococcus aureus. Kompozyt przygotowano jak w przykładzie 1.

W badaniu ludzką sztuczną skórę hodowano zgodnie z zaleceniami producenta EpiDerm firmy Mattek. Do hodowli wprowadzono żywe bakterie Staphylococcus aureus, a po inkubacji z bakteriami traktowano sztuczną skórę kompozytem GO-nanoAg oraz GO i nanoAg. Następnie oznaczano liczbę kolonii bakterii metodą powierzchniową w 10-krotnym szeregu rozcieńczeń. Badanie przeprowadzono zarówno w medium jak też w insercie sztucznej skóry po 3 oraz 6 godzinach traktowania skóry, zakażonej bakteriami, kompozytem GO-nanoAg oraz GO i nanoAg (Fig. 10). Stwierdzono, że kompozyt GO-nanoAg, a także nanocząstki Ag skutecznie chronią skórę ludzką (model 3D) przed zakażenie bakterią Staphylococcus aureus.

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Preparat o działaniu wirusobójczym i biobójczym zawierający tlenek grafenu i nanocząstki srebra, znamienny tym, że zawiera koloid niefunkcjonalizowanego tlenku grafenu i wolnych od zanieczyszczeń powierzchniowych nanocząstek srebra w proporcji wagowej 1:5, przy czym nanocząstki srebra stanowią monokrystaliczne nanocząstki srebra wytworzone metodą fizyczną EDM.
2. 2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie koloidu tlenek grafenu - nanocząstki srebra wynosi 25 ppm do 50 ppm srebra i 5 do 10 ppm tlenku grafenu.
3. 3. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera tlenek grafenu o średnicy płatka od 5 do 30 μm, grubości pojedynczej warstwy płatków 0,8-1,2 nm, o zawartości węgla 40-50%, tlenu 39-49%, wodoru 1-4%, siarki < 2%, azotu <1%, manganu < 0,006%.
4. 4. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że tlenek grafenu zawieszony w wodzie o stężeniu 1 mg/ml zachowuje stabilność przez minimum 6 miesięcy, a potencjał Zeta wynosi < 25 mV.
5. 5. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie tlenku grafenu wynosi 5 ml/L srebra 25 ml/L.
6. 6. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że tlenek grafenu zawiera na swojej powierzchni grupy -OH, COOH, =O oraz -H.
7. 7. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera koloidalny roztwór nanocząsteczek srebra, w którym srebro zawieszone jest w wodzie o przewodności elektrycznej < 1,020 μS.
8. 8. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że nanocząstki srebra są wolne od zanieczyszczeń powierzchniowych, o wielkości od 1 do 100 nm, rozkładzie wielkości 50% nanocząstek < 30 nm, potencjale Zeta < 30 mV, o morfologii zaokrąglonej, bez ostrych krawędzi.
9. 9. Zastosowanie preparatu o działaniu wirusobójczym i biobójczym jak określono w którymkolwiek z zastrz. 1-8 do dezynfekcji i zabezpieczania powierzchni przeciwko mikroorganizmom i wirusom.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym że wirusem jest koronawirus, zwłaszcza SARS-CoV-2.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że powierzchnię stanowią maseczki, materiały, odzież ochronna, sprzęty i akcesoria medyczne, materiały, sprzęty użytku domowego oraz skóra ludzka.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że preparat natryskiwany jest na powierzchnie na zimno lub metodą jednorazowej sonikacji.
13. 13. Sposób wytwarzania ochronnej warstwy o własnościach bójczych, znamienny tym, że preparat według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-8 natryskiwany jest na powierzchnie na zimno lub metodą jednorazowej sonikacji.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że preparat rozpyla się co najmniej dwukrotnie na suchą powierzchnię wybranego materiału z odległości ok. 0,5 m poprzez równomierne natryskiwanie na zimno całej powierzchni aż do uzyskania efektu maksymalnego nasączenia materiału lub maksymalnego pokrycia warstwą preparatu, po wyschnięciu naniesionej pierwszej warstwy przeprowadza się kolejne natryskiwanie warstwy drugiej.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że po wyschnięciu naniesionej drugiej warstwy przeprowadza się natryskiwanie trzeciej warstwy.
16. 16. Sposób otrzymywania preparatu jak określono w którymkolwiek z zastrz. 1-8, znamienny tym, że mieszaninę nanocząstek srebra i tlenku grafenu poddaje się sonikacji w celu związania nanocząstek srebra do płatków tlenku grafenu w procesie wymuszonej samoorganizacji i utworzenia stabilnego koloidu, przy czym stosunek wagowy tlenku grafenu do nanocząstek srebra wynosi 1:5, przy czym nanocząstki srebra wytworzone są metodą fizyczną EDM.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że sonikację mieszaniny srebra i tlenku grafenu prowadzi się w ultrapłuczce małej mocy przez 30 minut, w temperaturze pokojowej.