PL248922B1

PL248922B1 - Sposób wytwarzania biożelu, biożel oraz zastosowanie biożelu

Info

Publication number: PL248922B1
Application number: PL447439A
Authority: PL
Inventors: Jan Dziura-Bartkiewicz; Grzegorz Bartkiewicz
Original assignee: Jan Dziura Bartkiewicz Grzegorz Bartkiewicz Petroster Spolka Jawna
Priority date: 2023-12-31
Filing date: 2023-12-31
Publication date: 2026-02-09
Also published as: PL447439A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania biożelu z wykorzystaniem szczepów mikroorganizmów środowiskowych wyizolowanych z próbek gruntów zanieczyszczonych węglowodorami, który charakteryzuje się tym, że w pierwszym etapie wytwarza się podłoże płynne do namnażania mikroorganizmów poprzez podgrzanie w mieszalniku do temperatury od 20°C do 30°C wody zdemineralizowanej w ilości 100 l, a kolejno w trakcie równomiernego mieszania wprowadza się dodatki w ilościach rozliczonych w stosunku do ich całkowitej masy, przy czym jako pierwszy wprowadza się hydrolizat kazeiny w ilości od 8% do 14% m/m i mieszanie kontynuuje się nie krócej niż 15 min, do zupełnego rozpuszczenia hydrolizatu, a następnie ciągle mieszając dodaje się od 0,08% do 0,085% m/m chlorku sodu, 0,15% m/m siarczanu żelaza (II), 1,35% m/m siarczanu magnezu, 0,085% m/m siarczanu manganu (II), od 8,5% do 10% m/m diwodorofosforanu potasu, kolejno dodaje się glukozę w ilości od 19,72% do 20% m/m i ciągle mieszając kompozycję stabilizuje nie krócej niż 1 godz. +/- 5 min, a następnie dawkuje się cytrynian sodu w ilości od 56,4% do 60% m/m i wszystkie komponenty miesza się do pełnej homogenizacji mieszaniny, nie krócej niż 1 godz., po czym w tak otrzymanym podłożu utrzymanym w temperaturze 25°C, poddaje się procesowi namnażania konsorcjum mikroorganizmów PW złożone ze szczepów Pseudomonas, Enterococcus, Enterobacter lub konsorcjum mikroorganizmów PM złożone ze szczepów Pseudomonas, Citrobacter, Legionella, Rhodococcus, Rahnella, przy czym namnażanie trwa do uzyskania do gęstości biomasy wynoszącej 109[jtk/ml] otrzymując w ten sposób bazę ciekłą, którą kolejno miesza się z bazą żelową w postaci żelu żelatynowego o stężeniu 3% lub żelu agarowego o stężeniu 3% lub żelu agarowego o stężeniu 5% w ten sposób, że bazę żelową o temperaturze 40°C wlewa się do mieszalnika zawierającego bazę ciekłą o temperaturze od 20°C do 25°C, równomiernie i wolno mieszając do czasu pełnego wymieszania baz, jednak nie dłużej niż 15 min, po czym tak otrzymany biożel podlega konfekcjonowaniu w temperaturze pokojowej od 18°C do 24°C, natomiast proporcje bazy ciekłej do bazy żelowej wynoszą 2:1. Przedmiotem zgłoszenia jest także otrzymany powyższym sposobem biożel i jego zastosowanie.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biożelu, szczególnie do remediacji wody i gruntu z zanieczyszczeń węglowodorowych oraz biożel, szczególnie do remediacji wody i gruntu z zanieczyszczeń węglowodorowych, a także zastosowanie biożelu, szczególnie z wykorzystaniem poletek do remediacji.

Wiadomym jest, że najlepsze efekty oczyszczania gleb i wody uzyskuje się z zastosowaniem preparatów mikrobiologicznych. Na przykład ze zgłoszenia rosyjskiego wynalazku nr RU2013155969 (A) znany jest biopreparat do bioremediacji gleb zanieczyszczonych olejami, przeznaczony dla warunków klimatycznych dalekiej północy. Biopreparat zawiera stały nośnik substratu oraz konsorcjum mikroorganizmów utleniających węglowodory, unieruchomionych na jego powierzchni, zawierający szczepy Bacillus vallismoris RNCIM B-11017, Exguobacterium mexicanum RNCIM B-11011, Serratia plymuthica VKM B-2819D, Rhodococcus sp. VKM AC-2626D.

Z innego zgłoszenia wynalazku rosyjskiego nr RU2016150217 (A) znany jest preparat do biodegradacji metanolu z gleby, gruntu, morza, wody słodkiej i słonej. Preparat jest wytworzony z udziałem bakterii Bacillus megaterium VKPM B-607, Methylobacterium sp. VKPM B-5603, Acinetobacter calcoaceticus VKPM B-3780 na naturalnym sorbencie jonitowym. Sposób otrzymywania preparatu polega na osobnej hodowli szczepów bakteryjnych Bacillus megaterium VKPM B-607, Methylobacterium sp. VKPM B-5603 i Acinetobacter calcoaceticus VKPM B-3780 do zawartości komórek 10-10 mcl/ml. Kolejno miesza się płyny hodowlane szczepów do uzyskania zawartości bakterii 10 mcl/ml, a następnie natryskuje w postaci aerozolu na sorbent zawierający glaukonit. Odwodnienie kapilarno-chemiczne mieszaniny przeprowadza się poprzez doprowadzenie powietrza ogrzanego do temperatury 40°C. Gdy zawartość wilgoci w końcowym produkcie biologicznym wynosi 4%, proces zostaje zatrzymany.

Rosyjski patent nrRU2149008 (C1) dotyczy sposobu przygotowania biopreparatu, zgodnie z którym przemysłowy szczep Bacillus subtilis hoduje się w pożywce dostarczającej zarodników. Biomasę oddziela się od pożywki, mieszając ją ze środkiem stabilizującym na bazie pożywki cukrowo-żelatynowej z glukanianem wapnia w ilości 0,1-5,0% wag. lub z acetyloftalylocelulozą. Biomasę i środek stabilizujący przyjmuje się w stosunku (1:1)-(1:1,5). Otrzymaną mieszaninę suszy się i umieszcza w kapsułkach żelatynowych. Odżywka dla podłoża zawiera następujące składniki w g/l: diwodorofosforan potasu, 0,2-0,4; siarczan amonu, 1,0-3,0; cytrynian sodu, 1,0-3,0; siarczan miedzi, 0,001-0,01; cynk siarczan, 0,002-0,005; siarczan żelaza, 0,0001-0,001; chlorek wapnia, 0,09-0,2; magnez siarczan, 0,1-0,5; siarczan manganu, 0,01-0,1; pepton, 2,0-8,0; maltoza, 1,0-5,0; woda dla równowagi.

W zgłoszeniu chińskiego wynalazku nr CN101177677 (A) ujawniono sposób wytwarzania drobnoustrojowych unieruchomionych cząstek i charakteryzuje się tym, że ciecz zaszczepiająca pożywki hodowlane przez 12 do 14 godzin mieszana jest z cieczą żelową według wagi 5-20%, w temperaturze 25-40°C. Unieruchomione cząstki wytwarza się za pomocą granulatora o średnicy 1-4,00 mm, z szybkością spadania 20 do 30 kropli/min, a cząstki są sieciowane chemicznie przez 10 do 18 godzin, a następnie statycznie wzmacniane środkiem utrwalającym przez 23 do 58 godzin. Stosunek masowy cieczy żelowej wynosi: alginian sodu (Na Alg) 2 do 3%, węgiel aktywny (150 mesh), gleba torfowa i/lub popiół lotny 0,3 do 0,6%, a równowagą jest woda. Bakteryjną pożywką hodowlaną jest: Pożywka podstawowa: ekstrakt wołowy 0,3%, pepton 1,0%, 0,5% NaCI, 1,5-2,0% agar, pH 7,0-7,2; Podłoże nasienne: glukoza 1,25%, NH4NO 30,1%, MgSO4 7H2O 0,02%, KCI 0,02%, pH 7,0-7,2; Pożywka proliferacyjna: glukoza 4,0%, ekstrakt drożdżowy 0,3%, KH2PO4 0,05%, MgSO4 7H2O 0,025%, (NH) 2HPO4 0,2%, pH 7,0-7,2.

Japońskie zgłoszenie wynalazku nr JP2009017861 (A) dotyczy sposobu wytwarzania żelowych perełek polimerowych z mikroorganizmami, przy czym mikroorganizmy i rozpuszczalny w wodzie polimer do tworzenia żelu są zawieszone w fazie olejowej (olej rzepakowy) stanowiąc pierwszą emulsję, zaś druga emulsja jest to roztwór zawierający wielowartościowe kationy, rozproszony w fazie olejowej. Kropelki zdyspergowanej fazy zderzają się ze sobą, tworząc kulki żelowe z zawartymi w nich mikroorganizmami.

Zgłoszenie amerykańskiego wynalazku nr US2004101944 (A1) ujawnia kultury mikrobiologiczne do wywoływania procesów mikrobiologicznych w zbiornikach wodnych, glebach, osadach, będące bakteriami chemolitoautotroficznymi unieruchomionymi w matrycy mającej postać kapsułek, żeli lub kulek żelowych. Materiał matrycy jest wybrany z szerokiej gamy polimerów naturalnych i syntetycznych.

W kolejnym zgłoszeniu rosyjskiego wynalazku nr RU2565549 (A) opisano biopreparat zawierający stały nośnik substratu i konsorcjum mikroorganizmów utleniających węglowodory unieruchomione na jego powierzchni, zawierające szczepy Bacillus vallismoris RNCIM B-11017, Exguobacterium mexicanum RNCIM B-11011, Serratia plymuthica VKM B-2819D, Rhodococcus sp. VKM AC-2626D i mineralne podłoże odżywcze dla bakterii w postaci naturalnego zeolitu.

Zgłoszenie japońskiego wynalazku JPS61247385 (A) dotyczy umożliwienia hodowania komórki drobnoustrojowej w żelatynowym nośniku, takim jak alginian, agar, kolagen, żelatyna, poliakryloamid lub prepolimer.

Rosyjski wynalazek nr RU2678528 (A) ujawnia preparat do biodegradacji metanolu, w tym związek bakterii Bacillus megaterium VKPM B-607, Methylobacterium sp. VKPM B-5603, Acinetobacter calcoaceticus VKPM B-3780 na naturalnym wymieniaczu jonowym. Sposób otrzymywania obejmuje oddzielną hodowlę szczepów bakteryjnych Bacillus megaterium VKPM B-607, Methylobacterium sp. VKPM B-5603 i Acinetobacter calcoaceticus VKPM B- 3780 do zawartości komórek 10-10 mcl/ml. Płyny hodowlane szczepów są mieszane do zawartości bakterii 10 ml/ml, a następnie rozpylane w postaci aerozolu na sorbent zawierający glaukonit.

Ze zgłoszenia chińskiego wynalazku nr CN108018229 (A) poznano drobnoustrojowy sześciowartościowy czynnik bakteryjny usuwający chrom, gdzie środek osadzający i mikrobiologiczna zawiesina bakteryjna są równomiernie mieszane zgodnie z proporcją 1:1, a otrzymana gęsta zmieszana ciecz jest upuszczana do roztworu CaCI2 i jest rozpraszana w kulki.

Sposób wytwarzania biologicznych granulek z żużlem węglowym stosowanych do oczyszczania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w glebie zanieczyszczonej ropą naftową, przedstawia zgłoszenie chińskiego wynalazku nr CN104651343 (A). Sposób charakteryzuje się tym, że obejmuje następujące etapy: wybór wysokowydajnych bakterii degradujących węglowodory i zaszczepianie wzbogaconej płynnej pożywki hodowlanej do wysokiej wydajności bakterii degradujących w celu uzyskania mętnego roztworu bakterii degradujących; następnie przygotowuje się roztwór żelu, przyjmując wstępnie przetworzony żużel węglowy jako nośnik i zmodyfikowany PVA jako żel.

Kolejne zgłoszenie chińskiego wynalazku nr CN 103275963 (A) ujawnia sposób wytwarzania mikroorganizmów w postaci mikrosfery do oczyszczania dna rzeki. Sposób wytwarzania obejmuje etapy: wytwarzania żelu PVA (alkohol poliwinylowy), obejmujące etap przygotowania roztworu PVA o stężeniu 8-10%, dodanie środków osadzających do roztworu PVA, np. alginianu sodu o stężeniu 0,5-2%, węglanu wapnia o stężeniu 0,2-0,5%, dwutlenku krzemu o stężeniu 2,0-4,0% i proszku attapulgitu o wielkości 300-500 mesh lub 300-500 mesh, proszku węgla aktywnego o stężeniu 0,5-1,0% i dodanie aktywowanych mikroorganizmów limonowych o stężeniu 10-15%. Tworzenie mikrokulek obejmuje etapy dodawania kroplami żelu PVA do roztworu kwasu borowego nasyconego chlorkiem wapnia; mieszanie; otrzymywanie cząstek sferycznych aktywowanych mikroorganizmami immobilizowanymi o wielkości cząstek 3-5 mm, przeprowadzając sieciowanie przez 24-36 godzin w 4-8°C oraz wyjmowanie i przemywanie roztworem soli.

Zgłoszenie polskiego wynalazku nr P.372636 dotyczy sposobu otrzymywania biopreparatu do degradacji węglowodorów oleju napędowego, który polega na tym, że ze środowiska skażonego węglowodorami ropy naftowej wyizolowuje się szczepy trzech gatunków bakterii Gordonia alkanivorans S7, Micrococcus luteus A.32.1 i Pseudomonas circulans Bp, które namnaża się w formie mieszaniny w hodowli wstrząsanej w warunkach tlenowych, przy pH 6,5, w temperaturze 28°C, w czasie 72 godzin, w sterylnej pożywce zawierającej przyswajalne źródło węgla, azotu i fosforu, substancje wzrostowe oraz dodatek oleju napędowego. Otrzymany biopreparat stabilizuje się siarczkiem sodu lub ewentualnie odwirowuje i suszy w strumieniu sterylnego powietrza.

W innym zgłoszeniu polskiego wynalazku P.380007 - ujawniono sposób bioremediacji gruntu, polegający na tym, że do gruntu wprowadza się drożdże z gatunku Yarrowia lipolytica w postaci unieruchomionej. Drożdże wprowadza się, bezpośrednio na tereny skażone lub wokół nich, metodą in situ w postaci szczepionki na nośniku organicznym, którym jest alginian sodu albo agar albo żelatyna albo kolagen albo pióra ptaków. Szczepionka, w postaci płynnej albo suchej, może być wprowadzana w postaci granulek albo biofilmu albo biożelu, a drożdże stanowią od 5 do 50% masy szczepionki, przy czym może ona stanowić od 10 do 100% materiału wprowadzanego do gruntu. Szczepionkę wprowadza się na głębokość od 0,1 do 2 m w otwory o średnicy od 0,1 do 1,0 m albo w rowki o szerokości od 0,1 do 1,0 m, przy czym ich rozmieszczenie może być liniowe albo poprzecznie nakładające się albo koncentryczne, albo okalające dany teren albo usytuowane na jego najniżej położonym miejscu, zgodnie z kierunkiem spływu wód gruntowych, a w przypadku ochrony akwenów, w pobliżu linii brzegowej poza zasięgiem fali. Wynalazek może znaleźć zastosowanie na terenach skażonych, w szczególności związkami ropopochodnymi, odpadami z przemysłu tłuszczowego, olejami roślinnymi i mineralnymi.

W kolejnym zgłoszeniu polskiego wynalazku nr P.403930 opisano sposób bioremediacji gleby zanieczyszczonej olejem napędowym, polegający na wprowadzeniu do oczyszczanej gleby namnożonego inokulum bakterii z rodzaju Achromobacter, wspomagany olejem roślinnym, korzystnie rzepakowym i charakteryzujący się tym, że w procesie bioremediacji stosuje się inokulum szczepu bakterii Achromobacter xylosoxidans G21 wyizolowanego z gruntu skażonego olejem napędowym, które wprowadza się do zanieczyszczonej gleby i prowadzi jego hodowlę, przy czym natleniony olej roślinny, wprowadza się do oczyszczanego środowiska w okresie między 1-14 dniem bioremediacji i po wprowadzeniu oleju kontynuuje się proces bioremediacji w warunkach tlenowych.

Stan techniki wskazuje, ze najczęściej stosowaną formą biopreparatu jest forma ciekła i zawiesina, istotnie rzadziej stosowany jest proszek, granulki lub kulki żelowe. Z dotychczasowych doświadczeń wynika, że największym problemem stosowania preparatów ciekłych i zawiesin zawierających mikroorganizmy, jest czas aplikacji po ich wytworzeniu, tj. preparaty takie mogą być aplikowane w optymalnym czasie kilku godzin po wytworzeniu, z czasem obumarcia mikroorganizmów liczonym w godzinach. Czas ten nie pozwala na traktowanie preparatu jako produktu rynkowego. Dodatkowo prowadzenie procesów remediacji przy użyciu takich preparatów posiada poważne ograniczenia, choćby dlatego, że produkcja preparatów mikrobiologicznych wymaga zaawansowanego zaplecza technicznego i doświadczonych fachowców, stąd produkowane są w stacjonarnych laboratoriach producenta, a później transportowane są na miejsce aplikacji. Przeżywalność mikroorganizmów w czasie pomiędzy wytworzeniem a aplikacją jest kluczową kwestią ograniczającą możliwości stosowania biopreparatów mikrobiologicznych w takich formach. Preparaty ciekłe zadaje się do ziemi lub wody i w jednym momencie zaszczepia się pełną populację mikroorganizmów. Mikroorganizmy w jednym czasie trafiają do środowiska, co powoduje jego największą skuteczność na początku oraz sukcesywny spadek skuteczności wraz z obumieraniem mikroorganizmów w środowisku. W przypadku środowiska silnie zanieczyszczonego, wprowadzenie do niego mikroorganizmów w sposób gwałtowny, może spowodować znaczące zmniejszenie liczebności drobnoustrojów, a nawet całkowite obumarcie masy biologicznej preparatu.

Powszechnie wiadomym jest także, że procesy remediacji z wykorzystaniem dotychczas stosowanych preparatów, gównie preparatów ciekłych, wykonywane są na wydzielonych obszarach (poletkach) remediacyjnych. Tradycyjne poletka lub płyty remediacyjne podlegają na wstępie możliwie wysokim nawodnieniu lub wręcz przepłukiwaniu. Zanieczyszczona ziemia układana jest na pryzmach i polewana jest lub zraszana preparatami ciekłymi, powodując jej możliwie wysokie nasączenie. Wysokie nasączenie pryzm jest związane z powstawaniem odcieków, które zbierane są przez system czerpany i poddawane filtrowaniu. Ważnym aspektem jest też to, że konwencjonalne płyty remediacyjne wiążą się z koniecznością wytworzenia całej, stacjonarnej infrastruktury, rozbudowanej o systemy filtrowania i zadawania. Wiąże się to nie tylko z procedurami formalnymi i długim czasem uzyskiwania pozwoleń, ale także wysokimi kosztami stworzenia takiej instalacji.

Aby ograniczyć ww. niedogodności, Twórcy wynalazku sformułowali problem wynalazczy polegający na wytworzeniu preparatu mikrobiologicznego umożliwiającego skuteczną bioremediację gruntu i wody z zanieczyszczeń węglowodorowych w formie pozwalającej na jego przechowywanie, transportowanie i dozowanie.

Celem wynalazku jest sposób wytwarzania biożelu do remediacji gruntu i wody z zanieczyszczeń węglowodorowych; biożel do remediacji wody i gruntu z zanieczyszczeń węglowodorowych oraz zastosowanie biożelu szczególnie poprzez poletka remediacyjne, przy czym biożel zawiera konsorcjum szczepów aktywnych bakterii, immobilizowanych i biologicznie stabilizowanych w środowisku substancji żelującej.

Sposób wytwarzania biożelu z wykorzystaniem szczepów mikroorganizmów środowiskowych wyizolowanych z próbek gruntów zanieczyszczonych węglowodorami charakteryzuje się tym, że w pierwszym etapie wytwarza się podłoże płynne do namnażania mikroorganizmów poprzez podgrzanie w mieszalniku do temperatury od 20 do 30°C wody zdemineralizowanej w ilości 100 l, kolejno w trakcie równomiernego mieszania wprowadza się dodatki w ilościach rozliczonych w stosunku do ich całkowitej masy, przy czym jako pierwszy wprowadza się hydrolizat kazeiny w ilości od 8% do 14% m/m i mieszanie kontynuuje się nie krócej niż 15 min. do zupełnego rozpuszczenia hydrolizatu, a następnie ciągle mieszając dodaje się od 0,08% do 0,085% m/m chlorku sodu, 0,15% m/m siarczanu żelaza (II), 1,35% m/m siarczanu magnezu, 0,085% m/m siarczanu manganu (II), od 8,5% do 10% m/m diwodorofosforanu potasu, kolejno dodaje się glukozę w ilości od 19,72% do 20% m/m i ciągle mieszając kompozycję stabilizuje nie krócej niż 1 godz. +/- 5 min., a następnie dawkuje się cytrynian sodu w ilości od 56,4% do 60% m/m i wszystkie komponenty miesza się do pełnej homogenizacji mieszaniny, nie krócej niż godz., po czym w tak otrzymanym podłożu utrzymanym w temperaturze 25°C, poddaje się procesowi namnażania konsorcjum mikroorganizmów PW złożone ze szczepów: Pseudomonas, Enterococcus, Enterobacter lub konsorcjum mikroorganizmów PM złożone ze szczepów: Pseudomonas, Citrobacter, Legionella, Rhodococcus, Rahnella, przy czym namnażanie trwa do uzyskania gęstości biomasy wynoszącej 10⁹ [jtk/ml] otrzymując w ten sposób bazę ciekłą, którą kolejno miesza się z bazą żelową w postaci żelu żelatynowego o stężeniu 3% lub żelu agarowego o stężeniu 3% lub żelu agarowego o stężeniu 5% w ten sposób, że bazę żelową o temperaturze 40°C wlewa się do mieszalnika zawierającego bazą ciekłą o temperaturze od 20 do 25°C, równomiernie i wolno mieszając do czasu pełnego wymieszania baz, jednak nie dłużej niż 15 min, po czym tak otrzymany biożel podlega konfekcjonowaniu w temperaturze pokojowej od 18 do 24°C, natomiast proporcje bazy ciekłej do bazy żelowej wynoszą 2:1.

Biożel wytworzony powyżej wskazanym sposobem, stosuje się do remediacji zanieczyszczonych gruntów in-situ poprzez jego wprowadzenie doglebowo przez wykonane aplikatory pionowe i/lub poziome, w sposób grawitacyjny lub mechaniczny lub poprzez wtłaczanie ciśnieniowe oraz do czyszczenia zbiorników lub separatorów przemysłowych poprzez jego nałożenie na ściany zbiornika wałkiem, pędzlem lub natryskowo.

Ze względu na zaplanowaną bioaktywność biożelu według wynalazku, koniecznością stało się wyselekcjonowanie szczepów mikroorganizmów środowiskowych zdolnych do degradacji węglowodorów i do bytowania w środowisku żelowym jako środowisku nisko uwodnionym. Pobrano kilkaset próbek gruntów zanieczyszczonych węglowodorami naftowymi z różnych środowisk. Każdą z prób przebadano pod kątem zawartości zanieczyszczeń. Z prób wykazujących ponadnormatywne zawartości zanieczyszczeń węglowodorowych wyselekcjonowano mikroorganizmy naturalnie występujące w ziemi. W ten sposób uzyskano przekrój różnego typu mikroorganizmów z różnych środowisk i ziem o różnych właściwościach. W celu określenia preferowanych warunków bytowych mikroorganizmów degradujących węglowodory, wykonano roztwory wodne. W wyniku ekstrakcji wodnej uzyskano próby do określenia warunków bytowych mikroorganizmów.

Tabela 1 zawiera próby ujawniające liczebność mikroorganizmów w pobranych próbkach gleby.

Dla każdej z prób ujawnionych w Tabeli 1 wykonano badanie poziomu pH, po czasie 72 h po wykonaniu ekstrakcji. Wartość pH wiąże się z oddziaływaniem pożywki preparatu na środowisko gruntowe.

Wyniki badań poziomu pH przedstawia Tabela 2.

Spośród badanych szczepów bakteryjnych, ujawnionych w Tabeli 2 wykonywano sekwencjonowanie szczepów wykazujących szczególne właściwości degradacji węglowodorów. Każda z prób została poddana badaniom poziomu redukcji węglowodorów znanymi metodami. Spośród prób zawierających mikroorganizmy powodujące najwyższe redukcje węglowodorów w badanych próbach wytypowano i skatalogowano szczepy najlepsze do degradacji zanieczyszczeń ropopochodnych różnego typu. Wykonano posiewy każdej z próbek i na podstawie cech morfologicznych (kształt, barwa, wzrost, wygląd kolonii, itp.), wybrano ponad 100 szczepów bakterii o potencjalnych właściwościach biodegradacyjnych.

Po ich oczyszczeniu, do analizy napięcia powierzchniowego wybrano kilkadziesiąt szczepów.

W Tabeli 3 przedstawiono wartości napięcia powierzchniowego wybranych szczepów.

Na podstawie cech morfologicznych i wartości napięcia powierzchniowego wybrano szczepy, których wartość napięcia powierzchniowego była niższa aniżeli napięcie powierzchniowe wody oraz podłoża hodowlanego. Z wyznaczonych szczepów wyizolowano DNA. Próbki oczyszczonego DNA poddano sekwencjonowaniu i identyfikacji.

Zidentyfikowano mikroorganizmy z grup:

- Acidovorax

- Acinetobacter

- Alcaligenes

- Bacillus

- Brevundimonas

- Candidia

- Castellaniella

- Chromobacterium

- Citrobacter

- Comamonas

- Delftia

- Enterococcus

- Enterobacter

- Flavobacterium

- Lactobacillus

- Legionella

- Micrococcus

- Ottowia

- Proteus

- Providencia

- Pseudomonas

- Pseudoxanthomonas

- Ralstonia

- Radiobacter

- Rahnella

- Rodococcus

- Serratia

- Shinella

- Sphingobacterium

- Stenotrophomonas

- Ochrobactrum

- Vagococcus

Wszystkie zidentyfikowane szczepy zostały zdeponowane na micro-bankach Instytutu Ekologii Terenów Uprzemysłowionych i wchodzą w skład kolekcji mikroorganizmów. Wszystkie z nich można zastosować (w formie konsorcjum lub pojedynczo) w różnych procesach bioremediacji środowisk zanieczyszczonych węglowodorami ropopochodnymi, przy czym spośród wyizolowanych szczepów, wyselekcjonowano mikroorganizmy (konsorcja) w uwzględnieniem zarówno ich właściwości degradacji ksenobiotyków, ale także podatności na przeżywanie w środowisku żelowym oraz potencjalne produkowanie biosurfaktantów.

Pierwsze konsorcjum składa się ze szczepów: Pseudomonas, Enterococcus, Enterobacter (oznaczono PW). Liczne badania potwierdziły, że najlepsze efekty bioremediacyjne uzyskuje się z jego zastosowaniem do biodegradacji olejów i benzyn.

Drugie konsorcjum składa się ze szczepów: Pseudomonas, Citrobacter, Legionella, Rhodococcus, Rahnella (oznaczono PM). W tym przypadku liczne badania potwierdziły, że doskonałe efekty bioremediacyjne uzyskuje się z jego zastosowaniem do biodegradacji różnego typu węglowodorów.

Jak wyżej ujawniono, wytypowane konsorcja to konsorcja bakterii glebowych, wyizolowanych wcześniej z próbek gruntu, zawierające saprofityczne, niepatogenne drobnoustroje. Wiele przeprowadzonych uprzednio badań wykazało, że taka złożona, wielogatunkowa biocenoza, ma wysoką zdolność adaptacyjną do różnych środowisk i potrafi kolonizować siedliska zróżnicowanych warunkach bytowania.

Wytworzenie biożelu z udziałem wytypowanych konsorcjów polega na immobilizacji mikroorganizmów(konsorcjum mikroorganizmów PW lub PM) w substancjach żelujących.

W sposobie według wynalazku jako substancje żelujące wykorzystano żelatynę oraz agar. Konsorcjum, przed dokonaniem inokulacji namnaża się w podłożu płynnym do gęstości biomasy wynoszącej ok. 109 [jtk/ml].

Wzorcowe udziały komponentów zostały określone na ilość 100 I wody zdemineralizowanej, do której są dodawane i wynoszą łącznie od 2500 g do 3550 g, korzystnie 3020 g.

Poniżej wskazuje się ilości poszczególnych komponentów w % masowych, rozliczonych w stosunku do całej masy użytych dodatków:

- od 8% do 14% m/m, korzystnie 11,6% m/m hydrolizatu kazeiny;

- od 56,4% do 60% m/m, korzystnie 58% m/m cytrynianu sodu;

- od 19,72% do 20% m/m, korzystnie 19,85% m/m glukozy;

- od 0,08% do 0,085% m/m, korzystnie 0,082% m/m chlorku sodu;

- 0,15% m/m siarczanu żelaza (II);

- 1,35% m/m siarczanu magnezu;

- 0,085% m/m siarczanu manganu (II);

- od 8,5% do 10% m/m, korzystnie 8,95% m/m diwodorofosforanu potasu.

W sposobie według wynalazku 100 I wody zdemineralizowanej podgrzewa się do temperatury min. 20°C i nie więcej niż 30°C, po czym sekwencyjnie wsypuje się poszczególne komponenty przeliczone w ilości masowych na 100% masy wszystkich dodatków, zapewniając równomierne, stałe i wolne mieszanie z prędkością mieszadła nie większą niż 18 obrotów/min oraz temperaturę w zakresie od 20 do 30°C. Jako pierwszy, do wody zdemineralizowanej dodaje się hydrolizat kazeiny w ilości od 8% do 14% m/m, korzystnie 11,6% m/m i całość miesza się do jego zupełnego rozpuszczenia, przy czym mieszanie kontynuuje się nie krócej niż 15 min. Kolejno do mieszalnika dodaje się od 0,08% do 0,085% m/m korzystnie 0,082% m/m chlorku sodu; 0,15% m/m siarczanu żelaza (II); 1,35% m/m siarczanu magnezu; 0,085% m/m siarczanu manganu (II); od 8,5% do 10% m/m, korzystnie 8,95 % m/m diwodorofosforanu potasu, przy czym należy zachować równomierne dawkowanie zapewniające lepsze rozmieszanie komponentów. Kolejność dodawania komponentów jest dowolna. Jako następny komponent dodaje się glukozę w ilości od 19,72% do 20% m/m, korzystnie 19,85 m/m. Kompozycję stabilizuje się zachowując równomierne mieszanie przez nie krócej niż 1 godz. +/- 5 min, po czym stale mieszając równomiernie dawkuje się cytrynian sodu w ilości od 56,4% do 60% m/m, korzystnie 58% m/m. Wszystkie komponenty miesza się do pełnej homogenizacji mieszaniny, nie krócej niż 1 godz. Podłoże płynne jako przejrzysta ciecz, bez wtrąceń i widocznych zamąceń jest gotowe do zaaplikowania mikroorganizmów. Do czasu wykonania procesu inokulacji mieszaninę należy utrzymywać w temperaturze 25°C, ciągle mieszając.

Oczywiście zachowując wskazane proporcje udziałów wszystkich komponentów podłoża ciekłego w odniesieniu do 100 I wody zmineralizowanej, można wytwarzać odpowiednio większe lub mniejsze jego ilości w odniesieniu do określonej ilości wody zmineralizowanej.

Do przygotowanego podłoża płynnego implementowane są mikroorganizmy znanymi sposobami. Namnażanie mikroorganizmów do ilości wymaganej do produkcji biożelu odbywa się sekwencyjne, stosując kilkuetapowe namnażanie mikroorganizmów poprzez pasażowanie. Do każdego etapu pasażowania wykorzystuje się przygotowane uprzednio podłoże ciekłe, do którego wlewa się roztwór wodny z mikroorganizmami. Namnażanie następuje do gęstości mikroorganizmów do 10⁹ [jtk/ml], po czym w każdym kroku wykonuje się pasażowanie w proporcjach nie większych jak 1:10 (przykładowo z 1 l pasażuje się na 10 l, z 10 l na 100 l itd.). Proces w podłożu płynnym prowadzi się do uzyskania gęstości biomasy wynoszącej ok. 10⁹ [jtk/ml]. Finalnie uzyskuje się bazę ciekłą w ilości wymaganej do wytworzenia założonej ilości biożelu. Bazę ciekłą utrzymuje się w temperaturze 20-25°C.

Po każdej sekwencji pasażowania, w celu potwierdzenia bezpieczeństwa bioprepreparatu, wykonuje się analizę w celu wykluczenia drobnoustrojów patogennych, np. Ercherichia coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa oraz Enterococcus fecalis.

Kolejno przygotowuje się podłoże żelowe. Przyjęto możliwość wytwarzania podłoża żelowego na bazie żelatyny oraz Agar-Agar, które w zależności od dostępności mogą być używane zamiennie względem siebie oraz w zależności od potrzeb podłoża przeznaczonego do remediacji. Żelatyna to najczęściej stosowana substancja żelująca. Agar to substancja pochodzenia roślinnego, pozyskiwana z glonów- krasnorostów, posiadająca właściwości żelujące. Jest też neutralnym podkładem do pożywek, na których hoduje się bakterie. Posiada wysoką porowatość, co pozwala na zamknięcie dużej liczby mikroorganizmów w stosunkowo małej objętości. Wykazuje się silną hydrofilowością, a także odpornością na czynniki fizyczne i mechaniczne. Tworzy stabilne nośniki, których dodatkowym atutem jest brak kurczenia oraz pęcznienia.

W trakcie licznych badań i prób okazało się, że najlepsze efekty bioremediacyjne (najlepszą przeżywalność mikroorganizmów) uzyskuje się, wykorzystując do wytworzenia biożelu żel żelatynowy o stężeniu 3%. W przypadku żelu wytworzonego na bazie Agar-Agar, najlepsze efekty uzyskano przy stężeniu żelu 3% i 5%. W trakcie prowadzenia badań testowano również wyższe stężenia substancji żelujących (zarówno żelatyna, jak i Agar Agar), jednakże wszystkie modele badawcze odrzucono ze względu na zbyt niską przeżywalność mikroorganizmów w żelu.

Wytworzenie biożelu polega na połączeniu bazy ciekłej (podłoża płynnego z zaimplementowanymi mikroorganizmami) oraz bazy żelowej w proporcjach 2 (baza ciekła) :1 (baza żelowa). W mieszalniku wodę zdemineralizowaną podgrzewa się do temperatury 60°C, po czym dodaje się substancję żelową (agar lub żelatyna). Bazę żelową wykonuje się w zależności od założonego stężenia (3% żel żelatynowy lub 3% żel na bazie Agar-Agar lub 5% żel na bazie Agar-Agar). Po dodaniu substancji żelującej całość miesza się wolno i równomiernie, do czasu jej pełnego rozpuszczenia, po czym ogrzewanie wyłącza się i następuje proces stopniowego schłodzenia bazy żelującej do temperatury 40°C,a ko lejno wlewa się ją do mieszalnika zawierającego bazę ciekłą o temperaturze od 20 do 25°C, równomiernie i wolno mieszając do czasu pełnego wymieszania baz, jednak nie dłużej niż 15 min, po czym biożel od razu podlega konfekcjonowaniu w pojemnikach. Konfekcjonowanie jest wykonywane w temperaturze pokojowej od 18 do 24°C. Po 24 godzinach biożel przyjmuje formę gotową do użycia.

Biożel wytworzony sposobem według wynalazku nadaje się do przechowywania, przy czym najlepszą temperaturą przechowywania jest 25°C.

Biożel wg wynalazku składa się z bazy ciekłej oraz bazy żelowej w proporcjach 2:1, przy czym baza ciekła to podłoże płynne z zaimplementowanymi konsorcjami mikroorganizmów o gęstości biomasy wynoszącej ok. 109 [jtk/ml], a baza żelowa to 3% żel żelatynowy lub 3% żel agarowy lub 5% żel agarowy, zaś podłoże płynne to mieszanina dodatków rozpuszczonych w wodzie zdemineralizowanej, rozliczona w odniesieniu do 100 I wody i zawierająca następujące komponenty rozliczone na w stosunku do całkowitej ich ilości: od 8% do 14%,m/m,korzystnie11,6% m/m hydrolizatu kazeiny; od 56,4% do 60% m/m, korzystnie 58% m/m cytrynianu sodu; od 19,72% do 20% m/m, korzystnie 19,85% m/m glukozy; od 0,08% do 0,085% m/m, korzystnie 0,082% m/m chlorku sodu; 0,15% m/m siarczanu żelaza (II); 1,35% m/m siarczanu magnezu; 0,085% m/m siarczanu manganu (II); od 8,5% do 10% m/m, korzystnie 8,95% m/m diwodorofosforanu potasu. Konsorcja mikroorganizmów to konsorcjum ”PW” - złożone ze szczepów: Pseudomonas, Enterococcus, Enterobacter oraz „PM” - złożone ze szczepów: Pseudomonas, Citrobacter, Legionella, Rhodococcus, Rahnella. Biożel o powyżej wskazanym składzie stosuje się do remediacji skażonych gruntów oraz do czyszczenia zbiorników lub separatorów przemysłowych.

Przeprowadzono testy przeżywalności mikroorganizmów w żelu dla żeli żelatynowych o stężeniu 3% oraz 5% oraz żeli na bazie Agar-Agar o stężeniu 3% oraz 5%. Wyniki przedstawione w tabelach od 4 do 7 to wyniki uśrednione dla konsorcjów „PW” i „PM”.

Tabela 4 - wyniki dla żelu żelatynowego o stężeniu 3%

Tabela 5 - wyniki dla żelu żelatynowego o stężeniu 5%

Tabela 6 - wyniki dla żelu na bazie Agar-Agar o stężeniu 3%

Tabela 7 - wyniki dla żelu na bazie Agar-Agar o stężeniu 5%

Wyniki potwierdzają, że biożel według wynalazku gwarantuje zachowanie żywej formy mikroorganizmów, zachowując ich pełną żywotność w czasie pozwalającym na swobodny transport bez znaczących ograniczeń w zakresie warunków przewozu i czasu. W badaniach wykazano, że żywotność mikroorganizmów na praktycznie niezmienionym poziomie, uzyskiwana była w okresie nawet 3 miesięcy.

Warunki temperatur pokojowych są wystarczające do zapewniania długiego czasu przydatności mikroorganizmów do remediacji. Dodatkowo wszelkie odstępstwa od warunków optymalnych nie będą powodowały tak szybkich zmian właściwości bioremediacyjnych jak w przypadku preparatów ciekłych, ponieważ biożel działa jako bufor środowiskowy dla mikroorganizmów. Forma żelowa gwarantuje „zamknięte środowisko” mikrobiologiczne, przez co mikroorganizmy nie mając bezpośredniego styku z otoczeniem są mniej podatne na wszelkie jego zmiany.

Dodatkowe cechy biożelu wynikające z jego formuły, to możliwość tworzenia warstwy separującej od otoczenia zanieczyszczeń. W przypadku zanieczyszczeń powodujących emisję, np. odparowywanie, można nałożyć warstwę biożelu, która oddzieli zanieczyszczenie mechanicznie od środowiska, tworząc aktywną barierę. Bariera taka ograniczy lub wręcz zniweluje oddziaływanie zanieczyszczenia na środowisko, działając jednocześnie bezpośrednio na zanieczyszczenie, neutralizując lub degradując je. Tworzy rodzaj aktywnego kompresu zamykającego proces degradacji zanieczyszczeń w zamkniętej, odseparowanej przestrzeni pomiędzy podłożem a kompresem z biożelu.

Przykład - test biożelu wg wynalazku

Celem testu jest wykazanie czasu rozpadu biożeli w środowisku żelowym, okresów wzrostu temperatury i pH, jako kluczowych wskaźników działania mikroorganizmów.

pH - łączony jest z oddziaływaniem biożeli, a dokładniej jego komponentów na glebę, którego to rozkład podłoża powoduje chwilowy wzrost pH w czasie rozkładu podłoża.

Temperatura - jest wskaźnikiem wskazującym przebieg procesu rozkładu ksenobiotyków w wyniku pracy mikroorganizmów. Mikroorganizmy w naturalnych procesach metabolicznych rozbijają wiązania węglowe, wykorzystując węgiel do pozyskania energii potrzebnej im do bytowania. W wyniku ich działalności wytwarzana jest i emitowana do otoczenia energia w postaci energii cieplnej. Monitorowanie wzrostu wartości temperatury wykorzystane może być jako wskaźnik pomiarowy czasu i intensywności zachodzącego w ziemi procesu degradacji węglowodorów.

Do testu użyto biożelu z udziałem obydwu konsorcjów (odpowiednio bazy ciekłej dla konsorcjum PW i kolejno dla konsorcjum PM z mikroorganizmami namnożonymi do gęstości 10⁹ [jtk/ml), wytworzonego zgodnie ze sposobem według wynalazku oraz z uwzględnieniem jego warunków procesowych, gdzie podłoże płynne było złożone z: 100 I wody zdemineralizowanej, 380 g hydrolizatu kazeiny; 1750 g cytrynianu sodu; 610 g glukozy; 2,6 g chlorku sodu; 5 g siarczanu żelaza (II); 40 g siarczanu magnezu; 2 g siarczanu manganu (II); 270 g diwodorofosforanu potasu, natomiast bazę żelową stanowiły odpowiednio żel żelatynowy o stężeniu 3% i żel na bazie Agar-agar o stężeniu 3%. Wytworzono biożel zgodnie z warunkami procesowymi sposobu według wynalazku poprzez zmieszanie bazy ciekłej j.w. z 51 kg bazy żelowej.

Wytworzone biożele były porównywane do testu referencyjnego, który stanowi baza ciekła o gęstości mikroorganizmów 10⁹ [jtk/ml].

Celem bezpośrednim testu było sprawdzenie czasu uwalniania mikroorganizmów, czasu ich działania oraz dynamiki procesów. W trakcie testu były również zbierane inne dane, przez co w sposób pośredni celem było również wskazanie różnicy w działaniu żelu względem preparatu ciekłego w ujęciu efektywności redukcji węglowodorów oraz pomiaru emisji związanej z pracą biożelu.

Przygotowano ziemię do testów. Zanieczyszczoną ziemię w odmierzonych ilościach formowano w pryzmy (tzw. poletko remediacyjne), przy czym przed kontaktem ziemi z rodzimym gruntem zastosowane zostało podłoże ze szczelnej geomembrany, która zapewniała odseparowanie wszelkich procesów prowadzonych na poletku od rodzimego gruntu. Przygotowywano sekwencje testowe, składające się każda z 10 prób, tj. z 8 prób badawczych (wytworzony biożel odpowiednio 4 z PW i 4 z PM oraz 2 prób referencyjnych (baza ciekła odpowiednio: 1 z PW oraz 1 z PM). Nad każdą próbą badawczą (poletkiem remediacyjnym) umieszczano czujniki węglowodorów, gromadzących dane dotyczące emisji związanej z prowadzonym procesem. Każda próba rozpoczynała się od pomiaru pH oraz temperatury, jako parametry rozpoczynające każdą sekwencję testową. Każda próba była opisywana, oznaczana zgodnie z dawką oraz rodzajem biożelu jaki był zadawany. Po zadaniu biożelu umieszczano w próbach badawczych urządzenia bateryjne pomiaru pH oraz temperatury i pozostawiano do dalszych obserwacji. Obserwacje pH i temperatury prowadzono codziennie w celu weryfikacji czy proces zachodzi poprawnie. Celem testów było wykazanie degradacji węglowodorów w zależności od rodzaju biożelu, ziemi i dawek, stąd pomiary pH i temperatury stanowiły bieżący monitoring. Na podstawie wyników prowadzonych badań sporządzono wykresy.

Wykres 1 - zmiany pH biożel z konsorcjum PW i 3% żel żelatynowy vs. baza ciekła z PW

Wykres 2 - zmiany pH biożel z konsorcjum PW i 3% żel Agar vs. baza ciekła z PW

Wykres 3 - zmiany pH biożel z konsorcjum PM i 3% żel żelatynowy vs. baza ciekła z PM

Wykres 4 - zmiany pH biożel z konsorcjum PM i 3% żel Agar vs. baza ciekła z PM

Wykres 5 - zmiany temperatury biożel z konsorcjum PW i 3% żel żelatynowy vs. baza ciekła z PW Wykres 6 - zmiany temperatury biożel z konsorcjum PW i 3% żel Agar vs. baza ciekła z PW Wykres 7 - zmiany temperatury biożel z konsorcjum PM i 3% żel żelatynowy vs. baza ciekła z PM Wykres 8 - zmiany temperatury biożel z konsorcjum PM i 3% żel Agar vs. baza ciekła z PM Przeprowadzone testy charakteryzują sposób działania biożelu, jego przedłużony czas działania względem preparatu ciekłego oraz potwierdzają bezpośrednią relację procesów degradacji węglowodorów z uwalnianiem mikroorganizmów z podłoża żelowego do środowiska.

Kolejno wykonano weryfikację aktywności biodegradacyjnej preparatów bakteryjnych stabilizowanych w żelach. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach dla dwóch wariantów biożeli prób dla wariantu PW + żel agar-agar 3%; wariantu PW + żel żelatynowy 3% oraz dla wariantu PM + żel agar-agar 3%; wariantu PM + żel żelatynowy 3%. Ziemię przed rozpoczęciem testów przebadano w celu oznaczenia początkowych stężeń badanych substancji. Doświadczenie przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Badania biodegradacyjne prowadzone były w dwóch 60-dniowych cyklach. Przed przystąpieniem do chromatografii gazowej, próbki dokładnie przemieszano w celu ujednolicenia próby. Przykładowe zestawienie wyników chromatografii gazowej przedstawiono w tabelach. Stosowano odniesienie wyników badań do suchej masy ziemi. Suchą masę próbek glebowych wyznaczano wg normy PN-75/C-04573/10.

Tabela 8 - aktywność biodegradacyjna - wariant PW + żel 3% agar-agar

Tabela 9 - aktywność biodegradacyjna - wariant PW + żel 3% żelatyna

Tabela 10 - aktywność biodegradacyjna - wariant PM + żel 3% agar-agar

Tabela 11 - aktywność biodegradacyjna - wariant PM + żel 3% żelatyna

Biożel według wynalazku gwarantuje zachowanie żywej formy mikroorganizmów, wykazujących pełną żywotność w czasie pozwalającym na swobodny transport bez znaczących ograniczeń w zakresie warunków przewozu i czasu. W badaniach wykazano, że żywotność na praktycznie niezmienionym poziomie uzyskiwana była w okresie 3 miesięcy, a na poziomie gwarantującym wysoką jakość preparatu, przewyższającą wszelkie preparaty ciekłe. Forma żelowa gwarantuje „zamknięte środowisko” mikrobiologiczne, przez co mikroorganizmy nie mając bezpośredniego styku z otoczeniem są mniej podatne na wszelkie jego zmiany. Ze względu na ochronę mikroorganizmów przed nagłymi zmianami środowiska, również podczas aplikacji mikroorganizmy nie są podatne na szok związany z nagłą zmianą środowiska.

Badania prowadzone w trakcie prób potwierdziły, że biożel zadany do remediowanego środowiska wykazuje 100% efektywności populacyjnej zawartych w nim mikroorganizmów, bez strat liczebności od wytworzenia po samą aplikację. Mikroorganizmy przez cały cykl są utrzymywane w formie żywej, przez co nie występują też straty związane z ich „wybudzaniem”, jak w przypadku wszelkich form suchych.

Jak widać na wykresach, unikalną cechą biożelu według wynalazku jest stopniowe i sukcesywne oddawanie mikroorganizmów do środowiska po aplikacji. Mikroorganizmy po zadaniu nadal znajdują się w środowisku żelowym, które podlega degradacji. Tym sposobem mikroorganizmy uwalniane są do środowiska przez określony czas, w sposób systematyczny i miarowy, powodując niejako ciągłą aplikację dogruntową (lub na inne podłoże) przez cały czas rozpadu podłoża żelowego, który może trwać od 3 dni do nawet kilku tygodni po aplikacji. Preparat w formie biożelu niweluje więc ryzyko szoku mikroorganizmów po aplikacji, nie powoduje ryzyka spadków liczebności mikroorganizmów, powoduje działanie preparatu na wysokim poziomie przez długi czas, wykorzystując cały dostępny potencjał w sposób kompletny. Czas działania preparatu pozwala na rzadsze aplikacje, co umożliwia mniejszy nakład pracy i znaczące obniżenie kosztów. Biożel powoduje też mniejszą emisję, zarówno w rozumieniu emisji zapachów, ale także odcieków.

Na szczególną uwagę zasługuje fakt zastosowania poletka remediacyjnego wykonanego jako pryzma zanieczyszczonej ziemi z podłożem ze szczelnej geomembrany, które nie jest instalacją (wykonywaną często z konieczności przy stosowaniu płynów remediacyjnych), nie podlega skomplikowanym procedurom budowlanym, a jego postawienie jest tanie i szybkie. Na poletku, przyjmowana ziemia może podlegać bioremediacji od razu, przez co nie będzie występowało jej magazynowanie i nie będą konieczne jej zabezpieczanie na czas magazynowania. Testy i badania ujawniły więc, że możliwa jest lokalizacja poletek w pobliżu ziemi podlegającej remediacji, emisja związana z jej transportem jest minimalizowana.

Przez zastosowanie w testach poletka remediacyjnego nie występowały emisje związane np. z parowaniem, zaś emisja zapachów powstających w procesie bioremediacji była niewielka. Poletko nie generowało żadnych odpadów procesowych, które musiałyby być przekazywane do dalszej utylizacji. Zastosowanie poletka remediacyjnego z biożelem według wynalazku, to sposób na skuteczne, proste i relatywnie tanie pole remediacyjne, co dotychczas było niemożliwe bez generowania odcieków i konieczności uzyskania pozwolenia na budowę i związanych z tym procedur, zniwelowało ryzyka kosztowe związane z uzyskiwaniem pozwolenia na przetwarzanie odpadów, ograniczyło emisję do minimum i zapewniło możliwość szybkiego i bezpiecznego procesu remediacji w możliwie bliskiej odległości od miejsca gdzie występuje taka potrzeba.

Biożel według wynalazku może być wykorzystany do różnych zastosowań

Zastosowanie 1 - remediacja zanieczyszczonych gruntów i wód metodą in-situ, ze szczególnym uwzględnieniem opisanego wyżej poletka remediacyjnego. Zastosowanie to jest intencyjnym zastosowaniem wynalazku. Biożel może być wprowadzany doglebowo przez wykonane aplikatory pionowe lub/i poziome, w sposób grawitacyjny lub mechaniczny, w tym również wtłaczany ciśnieniowo. Biożel wprowadzony do aplikatorów nie powoduje nagłego i jednoczesnego rozejścia mikroorganizmów oraz cieczy po gruncie, a uwalnia mikroorganizmy (i inne substancje) sukcesywnie przez dany okres czasu. Aplikacja biożelu nie powoduje wprowadzenia do gruntu dużej ilości cieczy, nie zaburza więc poziomu wód gruntowych, nie powoduje wymywania gruntu. Biożel uwalniania mikroorganizmy w sposób celowy miejscowy, nie będąc podatnym na rozprzestrzenianie się w bardziej dowolny sposób jak ciecz. Uwalniane mikroorganizmy ze środowiska żelowego mają znacząco wyższą przeżywalność i skuteczność, a okres działania preparatu jest znacznie dłuższy, niż w przypadku preparatów ciekłych.

Zastosowanie 2 - czyszczenie zbiorników przemysłowych: Biożel może mieć zastosowanie w dziedzinie przemysłu, gdzie może być stosowany do czyszczenia zbiorników. Jeden z przykładów takiego zastosowania, to czyszczenie zbiorników stacji paliw. Z paliw wytrącają się różnego typu osady, które pozostają na ściankach wewnętrznych zbiorników. Dodatkowo w zbiornikach ze względu na zmiany temperatur wydzielają się skropliny, stąd zbiornik nie jest nigdy opróżniany do zera, a na dnie znajdują się skropliny i inne cięższe frakcje wydzielone z paliw. W trakcie rewizji i czyszczenia, zbiornik zostaje opróżniony, ale na ściankach pozostają w nim osady, a na dnie zanieczyszczone skropliny, resztki paliwa i osady denne. Biożel jako środek neutralizujący węglowodory, pozwala na zneutralizowanie substancji ropopochodnych bezpośrednio w zbiorniku. Ze względu na swoją formę, może on zostać nałożony na ściany zbiornika - wałkiem, pędzlem lub zostać nałożony natryskowo, bez konieczności wchodzenia do zbiornika osób. Ten ostatni sposób może zupełnie ograniczyć czynności generujące największe ryzyko zapłonu, warunki szkodliwe do pracy ludzi, a także najwyższą emisję par do atmosfery.

Zastosowanie 3 - czyszczenie zbiorników przemysłowych: Kolejnym zastosowaniem o ogromnym potencjale rynkowym jest czyszczenie separatorów. Separatory substancji ropopochodnych występują wszędzie tam, gdzie występuje ruch samochodowy. Instalowane są na osiedlach mieszkaniowych z parkingami, na parkingach, placach manewrowych, stacjach benzynowych, warsztatach mechanicznych, stanowiskach rozładunku paliw na obiektach przemysłowych, przy autostradach oraz wszędzie tam, gdzie istnieje ryzyko przedostania się substancji ropopochodnych do środowiska. Biożel może służyć do czyszczenia separatorów podobnie jak w przypadku zastosowania w zbiornikach stacji paliw, przy czym ilość stosowanych separatorów, zarówno w przemyśle, ale także w aplikacjach codziennego użytku, jest znacząco większa. Biożel może być stosowany natryskowo na ścianki oraz/lub do neutralizacji osadów w odstojnikach separatorów.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania biożelu z wykorzystaniem szczepów mikroorganizmów środowiskowych wyizolowanych z próbek gruntów zanieczyszczonych węglowodorami, znamienny tym, że w pierwszym etapie wytwarza się podłoże płynne do namnażania mikroorganizmów poprzez podgrzanie w mieszalniku do temperatury od 20 do 30°C wody zdemineralizowanej w ilości 100 I, a kolejno w trakcie równomiernego mieszania wprowadza się dodatki w ilościach rozliczonych w stosunku do ich całkowitej masy, przy czym jako pierwszy wprowadza się hydrolizat kazeiny w ilości od 8% do 14% m/m i miesz anie kontynuuje się nie krócej niż 15 min. do zupełnego rozpuszczenia hydrolizatu, a następnie ciągle mieszając dodaje się od 0,08% do 0,085% m/m chlorku sodu, 0,15% m/m siarczanu żelaza (II), 1,35% m/m siarczanu magnezu, 0,085% m/m siarczanu manganu (II), od 8,5% do 10% m/m diwodorofosforanu potasu, kolejno dodaje się glukozę w ilości od 19,72% do 20% m/m i ciągle mieszając kompozycję stabilizuje nie krócej niż 1 godz. +/- 5 min, a następnie dawkuje się cytrynian sodu w ilości od 56,4% do 60% m/m i wszystkie komponenty miesza się do pełnej homogenizacji mieszaniny, nie krócej niż 1 godz., po czym w tak otrzymanym podłożu utrzymanym w temperaturze 25°C, poddaje się procesowi namnażania konsorcjum mikroorganizmów PW złożone ze szczepów: Pseudomonas, Enterococcus, Enterobacter lub konsorcjum mikroorganizmów PM złożone ze szczepów: Pseudomonas, Citrobacter, Legionella, Rhodococcus, Rahnella, przy czym namnażanie trwa do uzyskania gęstości biomasy wynoszącej 109 [jtk/ml] otrzymując w ten sposób bazę ciekłą, którą kolejno miesza się z bazą żelową w postaci żelu żelatynowego o stężeniu 3% lub żelu agarowego o stężeniu 3% lub żelu agarowego o stężeniu 5% w ten sposób, że bazę żelową o temperaturze 40°C wlewa się do mieszalnika zawierającego bazą ciekłą o temperaturze od 20 do 25°C, równomiernie i wolno mieszając do czasu pełnego wymieszania baz, jednak nie dłużej niż 15 min, po czym tak otrzymany biożel podlega konfekcjonowaniu w temperaturze pokojowej od 18 do 24°C, natomiast proporcje bazy ciekłej do bazy żelowej wynoszą 2:1.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarzanie podłoża płynnego odbywa się z prędkością mieszadła nie większą niż 18 obrotów/min, w temperaturze w zakresie od 20 do 30°C.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że dodaje się 11,6% m/m hydrolizatu kazeiny.
4. Sposób według zastrzeżenia 1 albo 2 albo 3,znamienny tym, że dodaje się 0,082% m/m chlorku sodu.
5. Sposób według któregokolwiek z powyższych zastrzeżeń od 1 do 4 znamienny tym, że dodaje się, 8,95% m/m diwodorofosforanu potasu.
6. Sposób według któregokolwiek z powyższych zastrzeżeń od 1 do 5, znamienny tym, że dodaje się 19,85 m/m glukozy.
7. Sposób według któregokolwiek z powyższych zastrzeżeń od 1 do 6, znamienny tym, że dodaje się 58% m/m cytrynianu sodu.
8. Biożel zawierający konsorcja mikroorganizmów, znamienny tym, że składa się z bazy ciekłej oraz bazy żelowej w proporcjach 2:1, przy czym baza ciekła to podłoże płynne z zaimplementowanymi konsorcjami mikroorganizmów PW lub PM o gęstości biomasy wynoszącej 10⁹ [jtk/ml], a baza żelowa to 3% żel żelatynowy lub 3% żel agarowy lub 5% żel agarowy, zaś podłoże płynne to mieszanina dodatków rozpuszczonych w wodzie zdemineralizowanej, rozliczona w odniesieniu do 100 I wody i zawierająca komponenty rozliczone w stosunku do ich całej masy w postaci: hydrolizatu kazeiny w ilości od 8% do 14% m/m, korzystnie 11,6% m/m; cytrynianu sodu w ilości od 56,4% do 60% m/m, korzystnie 58% m/m; glukozy w ilości od 19,72% do 20% m/m, korzystnie 19,85% m/m; chlorku sodu w ilości od 0,08% do 0,085% m/m, korzystnie 0,082% m/m; siarczanu żelaza (II) w ilości 0,15% m/m; siarczanu magnezu w ilości 1,35% m/m; siarczanu manganu (II) w ilości 0,085% m/m oraz diwodorofosforanu potasu w ilości od 8,5% do 10% m/m, korzystnie 8,95% m/m, zaś w skład konsorcjum PW wchodzą szczepy: Pseudomonas, Enterococcus, Enterobacter, a w skład konsorcjum PM wchodzą szczepy: Pseudomonas, Citrobacter, Legionella, Rhodococcus, Rahnella.
9. Zastosowanie biożelu określonego w zastrz. 8, do remediacji zanieczyszczonych gruntów in-situ poprzez jego wprowadzenie doglebowo przez wykonane aplikatory pionowe i/lub poziome, w sposób grawitacyjny lub mechaniczny, lub wtłaczanie ciśnieniowe.
10. Zastosowanie biożelu określonego w zastrz. 8, do czyszczenia zbiorników lub separatorów przemysłowych poprzez jego nałożenie na ściany zbiornika wałkiem, pędzlem lub natryskowo.