PL249021B1 - Sposób otrzymywania ekstraktu z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.), i zastosowanie ekstraktu w kosmetykach przeciwstarzeniowych - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie rozwiązuje problem otrzymywania ekstraktu w postaci suchej lub micelarnej z 7 dniowych kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) z zastosowaniem etanolu o stężeniu 60° - 80° lub etanolu 60° - 80° i Polyoxyethylene (23) lauryl ether, w ilości od 0,003 cz. do 0,005 cz. na 1 część wag. etanolu. Zgodnie z wynalazkiem, ekstrakt z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) w postaci suchej lub micelarnej otrzymuje się z wykorzystaniem 7 dniowych kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.), które poddaje się maceracji w mieszaninie wodno-etanolowej z zastosowaniem etanolu o stężeniu 60° - 80° lub etanolu 60° - 80° i Polyoxyethylene (23) lauryl ether, w ilości od 0,003 cz. do 0,005 cz. na 1 część wag. ekstrahenta dla ekstraktu micelarnego, stale mieszając w temperaturze pokojowej, korzystnie dwukrotnej maceracji, a następnie poddaje się działaniu ultradźwięków w 30°C do 50°C, korzystnie 40°C, oddziela rozpuszczalnik od frakcji stałej, filtruje i zagęszcza ekstrakt pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym zatężony ekstrakt suszy się przez liofilizację. Korzystnie do układu rozpuszczalników dodaje się środek powierzchniowo czynny w postaci Polyoxyethylene (23) lauryl ether, w ilości od 0,003 cz. do 0,005 cz., korzystnie 0,004 cz. na 1 część wag. ekstrahenta. Zgłoszenie obejmuje też zastosowanie ekstraktu z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) otrzymywanego według wynalazku jako środka o właściwościach przeciwstarzeniowych, poprzez hamowanie aktywności kolagenazy i elastazy w skórze, w kosmetyce.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest ekstrakt z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) do zastosowania jako środek przeciwstarzeniowy oraz do zastosowań w tworzeniu kompozycji kosmetycznych o działaniu przeciwstarzeniowym i sposób jego otrzymywania.

Fasola zwyczajna (Phaseolus vulgaris L.) jest rośliną szeroko rozpowszechnioną na całym świecie. Jest to roślina zielna uprawiana ze względu na jadalne ziarna. Do wielu znanych odmian należących do tego gatunku należą: fasola czarna, fasola pinto, fasola różowa, fasola czerwona lub czerwona, fasola biała i fasola żółta. Ponadto w krajach z dużym niedożywieniem oprócz ziaren fasoli, za pokarm wykorzystuje się także świeże zielone liście [Oyelude, E.O., Gli, N.P., Amafo, J. Proximate, mineral and anti-nutrient composition of Phaseolus vulgaris leaf. Journal of Scientific Innovations for Development. 2012, 1, 12-21.]. Zawartość składników czynnych w zielonych liściach fasoli przebadał Oyelude i wsp. [Oyelude, E.O., Gli, N.P., Amafo, J. Proximate, mineral and anti-nutrient composition of Phaseolus vulgaris leaf. Journal of Scientific Innovations for Development. 2012, 1, 12-21.]. W największej ilości w zielonych wysuszonych liściach występowały sterole (51,69 mg/100 g), garbniki (3,54 mg/100 g), fenole (1,94 mg/100 g), saponiny (0,94 mg/100 g), flawonoidy (0,79 mg/100 g) i fityniany (0,77 mg/100 g). Wskazane składniki, będące metabolitami wtórnymi, często wykorzystywane są jako składniki czynne formulacji kosmetycznych [Nimse, S.B., Pal, D. Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms. RSC Adv. 2015, 5, 27986-28006]. Związki fenolowe można podzielić na różne grupy, takie jak kwasy fenolowe np.: kwas elagowy, flawonoidy, stilbeny i lignany, na podstawie obecności wielu grup fenolowych, które są związane z mniej lub bardziej złożonymi strukturami [Massimo, D.A., Carmela, F., Roberta, D.B., et al. Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann-Ist Super Sanita. 2007, 43, 348-361]. Związki z grupy polifenoli wykazują silne działanie przeciwutleniające, ale wykazano, że posiadają także inne korzystne efekty, takie jak działanie przeciwzapalne, przeciwstarzeniowe, antyseptyczne, przeciwgrzybicze, przeciwbakteryjne i przeciwwirusowe [Ganesan, K., Xu, B. Polyphenol-rich dry common beans (Phaseolus vulgaris L.) and their health benefits. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2331]. Fenolokwasy, w tym kwas elagowy, wykazują także aktywność hamującą tyrozynazę, przez co zapobiega nadmiernemu tworzeniu się melaniny i przebarwieniom skóry [Ozer, B., Kivc, M.B. Antityrosinase activity of some plant extracts and formulations containing ellagic acid, Pharm. Biol. 2007, 45, 519-524].

Jednym z istotnych czynników zewnętrznych, który ma wpływ na starzenie się skóry jest promieniowanie UV. Określenie „fotostarzenie” opisuje wiele destrukcyjnych zmian w wyglądzie, funkcji i strukturze skóry, spowodowanych przez nadmierną i długotrwałą ekspozycję na promieniowanie ultrafioletowe oraz sztuczne promieniowanie UV, np. w solarium. Promieniowanie słoneczne przyczynia się do powstawania tzw. wolnych rodników odpowiedzialnych za starzenie się komórek skóry. Szczególnie niebezpieczne są reakcje aktywnych formy tlenu (RFT) z białkami, błonami lipidowo-białkowymi i kwasami nukleinowymi. Palenie papierosów również przyczynia się do generowania wolnych rodników i szybszego starzenia się skóry [Wang, A.S., Dreesen, O. Biomarkers of cellular senescence and skin aging. Frontiers in Genetics. 2018, 23, 247]. Skutkiem działania wolnych rodników jest uszkodzenie komórek i destrukcja jej składników, dlatego też stres oksydacyjny uważany jest za jeden z głównych mechanizmów powodujących starzenie się skóry. Lokalnie stosowane antyoksydanty pozwalają zniwelować szkodliwe działanie wolnych rodników tlenowych [Kornsteiner, M., Wagner, H., Elmadfa, I. Tocopherols and total phenolics in 10 different nut types, Food Chem. 2006, 98, 381-387]. Ponadto, kwas elagowy wykazuje aktywność hamującą tyrozynazę, przez co zapobiega nadmiernemu tworzeniu się melaniny i przebarwieniom skóry [Ozer, B., Kivc, M.B. Antityrosinase activity of some plant extracts and formulations containing ellagic acid, Pharm. Biol. 2007, 45, 519-524].

We współczesnej kosmetologii największym uznaniem cieszą się preparaty o działaniu odmładzającym, których składniki aktywne pozyskiwane są z roślin. Najczęściej są to ekstrakty wodne, wodnoetanolowe lub glicerolowe pozyskane z różnych części roślin. Zawarte w nich związki aktywne, głównie kwasy fenolowe i flawonoidy, hamują aktywność wielu enzymów np.: kolagenazy, elastazy, hialuronidazy, tyrozynazy, cyklooksygenazy opóźniając tym samym procesy starzenia [Thring, T.S.S., Hili, P., Naughton, D.P. Anti-collagenase, anti-elastase and anti-oxidant activities of extracts from 21 plants, BMC Complementary and Alternative Medicine. 2009, 9, 27-37]. Ustalono, że za działanie przeciwzmarszczkowe większości ekstraktów roślinnych odpowiedzialne są głównie polifenole, m.in. kwas elagowy, który chroni kolagen przed rozpadem poprzez blokowanie MMP (metaloproteinazy) w fibroblastach skóry wystawionej na działanie promieni UVB. Przeciwzmarszczkowe działanie kwasu elagowego zostało potwierdzone w badaniach in vivo u bezwłosych myszy napromieniowywanych przez 8 tyg. promieniami UVB [Kim, et al. Anti-wrinkle activity of Platycarya strobilacea extract and its application as a cosmeceutical ingredient. J. Cosmet. Sci. 2010, 61,211-213].

W związku z dobroczynnym działaniem ekstraktów pozyskiwanych z kiełkujących roślin [Schmid, D.; Sacher, R.; Belser, E.; Zulli, F. Vegetable sprouts: a potent source for cosmetic actives. Household and Personal Care Today. 2011, 1, 50-52] poszukuje się ekstraktów z tych części roślin. Kiełki są to młode, kilkudniowe pędy, które rozwijają się z nasion. W kiełkujących nasionach mobilizowane są rezerwy energetyczne, zawarte w zarodku. Tłuszcze są przekształcane w wolne kwasy tłuszczowe, skrobia w maltozę, a białka w wolne aminokwasy. Syntetyzowane są także witaminy, enzymy i metabolity wtórne (m.in. polifenole, antocyjany, fitosterole), które mają za zadanie chronić młody pęd przed niekorzystnymi warunkami środowiska [Chavan, J.K., Kadam, S.S., Beuchat, L.R. Nutritional improvement of cereals by sprouting. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 1989, 28, 401-437]. Wiele z tych składników wywiera korzystny wpływ na zdrowie ludzkie, stąd też kiełki roślinne np. słonecznika, rzeżuchy, rzodkiewki, fasoli, lucerny zalecane są przez dietetyków jako cenne źródło substancji prozdrowotnych. Wykorzystanie ekstraktów z kiełków w przemyśle kosmetycznym jest na razie dość ograniczone. Naukowcy z Uniwersytetu Johns Hopkins, jako pierwsi przebadali ekstrakty z kiełków brokuła (Brassica olerace). Wykazano, że zawartość izotiocyjanianiu - sulforafanu w 3. dniowych kiełkach jest nawet do 50. razy wyższe niż w dojrzałym warzywie [Fahey, J.W., Zhang, Y. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1997, 94, 10367-10372]. Związek ten wykazuje aktywność przeciwrodnikową poprzez wpływ aktywujący na czynnik transkrypcyjny NF-E2 związany z czynnikiem 2 (Nrf2), który odgrywa istotną rolę w obronie komórkowej przed wysoce reaktywnymi formami tlenu [Nioi, P., McMahon, M., Itoh, K., Yamamoto, M., Hayes, J.D. Identification of a novel Nrf2-regulated antioxidant response element (ARE) in the mouse NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 gene: reassessment of the ARE consensus sequence. Biochem J. 2003, 374, 337-348.]. Dzięki tym właściwościom ekstrakt z kiełków brokuła może być zastosowany w kosmetykach przeciwstarzeniowych, chroniących skórę przed szkodliwym promieniowaniem UV oraz zanieczyszczeniem środowiska. Surowcem kosmetycznym może być także ekstrakt z 4-5. dniowych kiełków rzeżuchy ogrodowej (Lipidium sativum). Ekstrakt ten jest bogaty w sulforafan oraz wiele składników odżywczych, między innymi witaminy A, C i E, minerały takie jak selen i cynk oraz fitoskładniki, takie jak flawonoidy i karotenoidy. W kosmetykach, składniki te mogą działać przeciwzmarszczkowo na kilka sposobów: sulforafan, witamina A, C, E i karotenoidy wykazują silną aktywność oksydacyjną. Witamina A i karotenoidy pomagają dodatkowo zwiększyć produkcję kolagenu, który poprawia elastyczność skóry i zapobiega zmarszczkom. Cynk i selen mogą pomóc w zapobieganiu utracie elastyczności skóry poprzez poprawę jej struktury i stanu nawilżenia [Schmid, D., Schurch, C., Hanggi, S., Zulli, F. Extract of cress sprouts for a broad skin protection to prevent wrinkle formation. Mibelle Biochemistry. Sep. 2007]. Glukozynolan sinalbiny jest głównym składnikiem ekstraktu z 7. dniowych kiełków gorczycy białej (Sinapis alba). Wykorzystany został w preparatach kosmetycznych przeznaczonych do zwiększania objętości ust. Po nałożeniu preparatu kosmetycznego na skórę warg dochodzi do rozszerzenia naczyń włosowatych i zwiększenia objętości krążącej krwi, dzięki czemu dochodzi do wzrostu objętości i lepszego dotlenienia tkanki [Albin, K.C., Carstens, M.I., et al. Chem Senses. 2008, 33, 3-15; Schmid, D.; Sacher, R.; Belser, E.; Zulli, F. Vegetable sprouts: a potent source for cosmetic actives. Household and Personal Care Today. 2011, 1, 50-52.]. Ekstrakt z 10. dniowych kiełków słonecznika (Helianthus annuus L.) dzięki zawartości witamin z grupy B (B1, B3, B6), zwiększa metabolizm energetyczny co przyczynia się do wzrostu energii komórkowej gromadzonej w postaci ATP (adenozynotrifosforanie), dzięki czemu wydłuża się żywotność komórek. Ponadto witaminy B w ekstrakcie z kiełków słonecznika mogą pomóc w redukcji wysuszania i uszkodzeń skóry, zapobiegając powstawaniu zmarszczek [Schmid, D.; Sacher, R.; Belser, E.; Zulli, F. Vegetable sprouts: a potent source for cosmetic actives. Household and Personal Care Today. 2011, 1, 50-52].

Stosunkowo niewiele jest doniesień, gdzie przedmiotem wynalazku byłyby ekstrakty otrzymane z kiełków różnych roślin do zastosowania kosmetycznego w produktach przeciwzmarszczkowych np.: KR20160058613A; 2014., KR20200059446A; 2018., KR100687468B1 2005, US8808761B2; 2005, CN103622889B; 2013, WO2017131175A1; 2017., WO2012171106A1; 2012., CN102349865A; 2011., WO2011059292A2; 2009., US20120328721; 2009., KR KR102219594B1; 2019., WO2009107984A2; 2009., KR20160058613A; 2014. W opisanych wynalazkach autorzy wykorzystują np.: fermentowany ekstrakt z kiełków żeńszenia do zastosowania w kompozycjach kosmetycznych o działaniu przeciwzmarszczkowym KR20200059446A; 2018. Fermentowane kiełki roślinne jarmużu (Brassia oleracea L.), brokułów (Brassica cretica Lam.), lucerny (Medicago sativa L.), i gryki zwyczajnej (Fagopyrum esculentum Moench) były także przedmiotem wynalazku KR100687468B1; 2005. Kompozycje kosmetyczne zawierające te wspomniane fermentowane ekstrakty kiełków roślin były tworzone z przeznaczeniem do nawilżania skóry. Patent US8808761B2; 2005 wymienia różę alpejską, której kiełki zostały użyte do pozyskiwania ekstraktu do zastosowań kosmetycznych, który ze względu na dużą zawartość witaminy C oraz witamin z grupy B, ma działanie przeciwutleniające, pomaga w regeneracji uszkodzonej skóry i zwiększa jej elastyczność. Sproszkowane kiełki rzodkiewki (Raphanus raphanistrum subsp. sativus (L.) Domin) posłużyły do otrzymania maseczki do twarzy według wynalazku CN103622889B; 2013, której celem było spowolnienie procesów starzenia się skóry, wybielanie, nawilżanie, spłycenie zmarszczek, a także ochrona przed promieniami UV. Autorzy zastrzegają sobie, że wspomniane sproszkowane kiełki rzodkiewki mogą być stosowane jako surowiec lub dodatek do wszelkiego rodzaju kosmetyków. Autorzy Patentu CN102349865A; 2011, użyli ekstraktu z kiełków z zielonego groszku (Vigna radiata) w kompozycji kosmetycznej celem poprawy nawilżenia skóry, zwiększenia elastyczności a także łagodzenia podrażnień. Patent KR20130057534A, 2011 zawiera opis pozyskania mieszaniny ekstraktów, składającej się z ekstraktu z jagód acai i ekstraktów pozyskanych z kiełków roślinnych takich jak kiełków słonecznika, kiełków Brassica ampestris, brokuła, kapusty, borówki, Sequoiadendron giganteum oraz ekstraktu z pąków brzoskwini. Wykazano, że kompozycja ta poprzez działanie antyoksydacyjne i przeciwzapalne może być stosowana w kosmetykach o działaniu przeciwstarzeniowym. Celem poprawy wyglądu skóry stosowane są także następujące ekstrakty: ekstrakt z kiełków arbuza (Citrullus Schrad.) WO2017131175A1; 2017, ekstrakt z kiełków arganii (Argania spinosa Skeels) WO2012171106A1; 2012, ekstrakt z kiełków aloesu zwyczajnego (Aloe vera (L.) Burm.f.) US20120328721; 2009, ekstrakt z kiełków sekwoi, kiełków borówki czarnej, kiełków brzoskwini, kiełków kapusty koreańskiej, kiełków brokułów, kiełków słonecznika i kiełków jarmużu KR20160058613A; 2014. W patencie US8815308B2, 2014, opisano ekstrakt z kiełków lucerny, o działaniu przeciwzapalnym, przeciwutleniającym i przeciwstarzeniowym. Ekstrakt ten może być stosowany w produktach do pielęgnacji skóry, a jego stosowanie może pomóc w utrzymaniu skóry w dobrej kondycji. Patent KR20070111636A, 2006 zawiera opis pozyskania ekstraktu z kiełków (Phaseolus radiatus) nazywanej obecnie (Vigna radiata L.), zwaną także potocznie fasolą mung [Dianzhi Hou, i inni: Mung Bean (Vigna radiata L.): Bioactive polyphenols, polysaccharides, peptides, and health benefits. Nutrients. 2019, 11, 1238.], fasolą sago, fasolą złotą lub dorodnikiem zielonym. Ekstrakt ten według wynalazku może być stosowany w celu promowania biosyntezy kolagenu, nawilżenia skóry i zmniejszenia parowania wody ze skóry dzięki czemu zapobiega powstawaniu zmarszczek i nawilża skórę. Ekstrakt według wynalazku otrzymuje się przez ekstrakcje 36 h kiełków o długości 0,2-0,4 mm za pomocą C1-C4 bezwodnego lub uwodnionego niższego alkoholu, acetonu, octanu etylu, octanu butylu, chloroformu lub glikolu 1,3-butylenowego. W znanym stanie techniki nie stwierdzono jednak ekstraktu z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) o właściwościach przeciwstarzeniowych wykorzystywanych do kosmetyków do stosowania na skórę.

Celem obecnego wynalazku jest zapewnienie suchego ekstraktu z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.), lub micelarnego ekstraktu z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) do zastosowania w kosmetykach o działaniu przeciwstarzeniowym oraz sposób jego otrzymywania. Wynalazek rozwiązuje problem otrzymywania ekstraktu w postaci suchej lub micelarnej z 7 dniowych kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) z zastosowaniem etanolu o stężeniu 60°-80° lub etanolu 60°-80° i Polioksyetylenowany (23) eter laurowy, w ilości od 0,003 cz. do 0,005 cz. na 1 część wag. etanolu. Ekstrakty te będą wykazywać, istotne dla działania przeciwstarzeniowego, co zostało potwierdzone badaniami.

Wynalazek dotyczy otrzymywania ekstraktu z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) w postaci suchej lub micelarnej o właściwościach przeciwzapalnych.

Zgodnie z obecnym wynalazkiem, ekstrakt z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) w postaci suchej lub micelarnej otrzymuje się z wykorzystaniem 7. dniowych kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vilgaris L.), które poddaje się maceracji w mieszaninie wodno - etanolowej z zastosowaniem etanolu o stężeniu 60°-80° lub etanolu 60°-80° i Polioksyetylenowany (23) eter laurowy, w ilości od 0,003 cz. do 0,005 cz. na 1 część wag. ekstrahenta dla ekstraktu micelarnego, stale mieszając w temperaturze pokojowej, korzystnie dwukrotnej maceracji, a następnie poddaje się działaniu ultradźwięków w 30°C do 50°C, korzystnie 40°C, oddziela rozpuszczalnik od frakcji stałej, filtruje i zagęszcza ekstrakt pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym zatężony ekstrakt suszy się przez liofilizację. Korzystnie do ekstrakcji do układu rozpuszczalników dodaje się środek powierzchniowo czynny w postaci Polioksyetylenowany (23) eter laurowy, w ilości od 0,003 cz. do 0,005 cz., korzystnie 0,004 cz. na 1 część wag.

ekstrahenta. Korzystnie, w sposobie według wynalazku, macerację w prowadzi się w 22-25°C. Korzystnie, w sposobie według wynalazku, macerację w prowadzi się przez 1-3 godziny. Korzystnie, w sposobie według wynalazku, liofilizowany ekstrakt z (d) przechowuje się w temperaturze poniżej 10°C. Korzystnie, w sposobie według wynalazku, stosuje się w na 1 część wagową suchego ekstraktu 2 części wagowych propanediolu i 2 części wagowe wody. Wynalazek obejmuje też zastosowanie ekstraktu z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) otrzymywanego według wynalazku jako środka o właściwościach przeciwstarzeniowych, poprzez hamowanie aktywności kolagenazy i elastazy w skórze, w kosmetyce. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie ekstraktu z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) otrzymanego sposobem według wynalazku do otrzymywania preparatów kosmetycznych, o działaniu przeciwstarzeniowym.

Korzystnie ekstrakt suchy i ekstrakt micelarny stosuje się w ilości 0,3%-0,5%, korzystnie 0,4% wagowych ekstraktu w przeliczeniu na 100% wag. preparatu.

Nieoczekiwanie okazało się, że ekstrakt suchy lub micelarny z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) wykazuje działanie przeciwstarzeniowe na skórę dzięki silnym właściwościom hamującym elastazę i kolagenazę, co prawdopodobnie wynika z dużej zawartości flawonoidów i kwasów fenolowych, które mają udowodnione działanie hamujące te enzymy [Ersoy, E., Ozkan, E.E., Boga, M., Yilmaz, M.A., Mat, A. (2019). Anti-aging potential and anti-tyrosinase activity of three Hypericum species with focus on phytochemical composition by LC-MS/MS. Ind. Crop. Prod. 2019, 141, 111735; Wittenauer, J., Mackle, S., Sussmann, D., Schweiggert-Weisz, U., Carle, R. (2015). Inhibitory effects of polyphenols from grape pomace extract on collagenase and elastase activity. Fitoterapia 2015, 101, 179- 187].

Sposób z użyciem ekstrahenta w postaci etanolu o stężeniu 60°-80° z zastosowaniem ultradźwięków pozwala na uzyskanie ekstraktu z kiełków z fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) o dużej wydajności.

Dodatek środka powierzchniowo czynnego w postaci Polioksyetylenowany (23) eter laurowy w ilości 0,3%-0,5% do ekstrakcji zwiększa wydajność czynnych składników w ekstrakcie.

Przedmiot wynalazku uwidoczniony jest w przykładach wykonania, w odniesieniu do załączonego rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia chromatogram z analizy ilościowej zidentyfikowanych związków 1-14 przedstawionych w Tabeli 3, sporządzony na podstawie krzywych kalibracyjnych uzyskanych dla odpowiednich wzorców, gdzie oś x to czas w minutach, zaś oś y to względna abundancja.

Wynalazek opisano w przykładach, które nie ograniczają zakresu wynalazku.

Przykład 1

Do otrzymania ekstraktu suchego (numer 1) wykorzystano 25 g 7. dniowych kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.), o rozdrobnieniu nie większym niż frakcja 5 mm i 100 g etanolu 70°. Siedmiodniowe kiełki zostały zadane 50 g etanolu 70° i umieszczone na wytrząsarce z zastosowaniem obrotów 200 obr/min. Czas trwania maceracji wynosił 2 h. Po tym czasie ekstrakt umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na czas 20 minut z zastosowaniem temperatury 40°C. Ekstrakt zlano znad surowca roślinnego, który ponownie zadano taką samą ilością rozpuszczalnika. Przeprowadzono takie same procedury. Otrzymany ekstrakt zagęszczono w wyparce próżniowej, a następnie poddano liofilizacji. Gotowy liofilizat przechowywano w temperaturze 2-8°C.

Przykład 2

Do otrzymania ekstraktu suchego (numer 2) wykorzystano 25 g 5. dniowych kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.), o rozdrobnieniu nie większym niż frakcja 5 mm, i 100 g etanolu 60°. Siedmiodniowe kiełki zostały zadane 50 g etanolu 60° i umieszczone na wytrząsarce z zastosowaniem obrotów 200 obr/min. Czas trwania maceracji wynosił 2 h. Po tym czasie ekstrakt umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na czas 20 min z zastosowaniem temperatury 40°C. Ekstrakt zlano znad surowca roślinnego, który ponownie zadano taką samą ilością rozpuszczalnika. Przeprowadzono takie same procedury. Otrzymany ekstrakt zagęszczono w wyparce próżniowej, a następnie poddano liofilizacji. Gotowy liofilizat przechowywano w temperaturze 2-8°C.

Przykład 3

Do otrzymania ekstraktu suchego (numer 3) wykorzystano 25 g 7. dniowych kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.), o rozdrobnieniu nie większym niż frakcja 5 mm i 100 g etanolu 80°. Siedmiodniowe kiełki zostały zadane 50 g roztworu etanolu 80° i umieszczone na wytrząsarce z zasto

PL 249021 Β1 sowaniem obrotów 200 obr/min. Czas trwania maceracji wynosił 2 h. Po tym czasie ekstrakt umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na czas 30 minut z zastosowaniem temperatury 40°C. Ekstrakt zlano znad surowca roślinnego, który ponownie zadano taką samą ilością rozpuszczalnika. Przeprowadzono takie same procedury. Otrzymany ekstrakt zagęszczono w wyparce próżniowej, a następnie poddano liofilizacji. Gotowy liofilizat przechowywano w temperaturze 2-8°C.

Przykład 4

Do otrzymania ekstraktu suchego (numer 4) wykorzystano 25 g 7. dniowych kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.), o rozdrobnieniu nie większym niż frakcja 5 mm i 200 g etanolu 70°. Siedmiodniowe kiełki zostały zadane 100 g roztworu etanolu 70° i umieszczone na wytrząsarce z zastosowaniem obrotów 200 obr/min. Czas trwania maceracji wynosił 3 h. Po tym czasie ekstrakt umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na czas 30 min z zastosowaniem temperatury 40°C. Ekstrakt zlano znad surowca roślinnego, który ponownie zadano taką samą ilością rozpuszczalnika. Przeprowadzono takie same procedury. Otrzymany ekstrakt zagęszczono w wyparce próżniowej, a następnie poddano liofilizacji. Gotowy liofilizat przechowywano w temperaturze 2-8°C.

Przykład 5

Do otrzymania ekstraktu micelarnego (numer 5) wykorzystano 25 g 7. dniowych kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.), o rozdrobnieniu nie większym niż frakcja 5 mm, 99,6 g etanolu 70° oraz 0,4 g Brij 35 (Polioksyetylenowany (23) eter laurowy. Siedmiodniowe kiełki zostały zadane 50 g roztworu etanolu z dodatkiem środka powierzchniowo czynnego i umieszczone na wytrząsarce z zastosowaniem obrotów 200 obr/min. Czas trwania maceracji wynosił 2 h. Po tym czasie ekstrakt umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na czas 20 minut z zastosowaniem temperatury 40°C. Ekstrakt zlano znad surowca roślinnego, który ponownie zadano taką samą ilością rozpuszczalnika. Przeprowadzono takie same procedury. Otrzymany ekstrakt zagęszczono w wyparce próżniowej, a następnie poddano liofilizacji. Gotowy liofilizat przechowywano w temperaturze 2-8°C.

Badając wydajność ekstrakcji z użyciem mieszaniny etanolu 70° lub mieszaniny etanolu 70° i 0,004 części (w/w) Polioksyetylenowany (23) eter laurowy, dwukrotnej maceracji surowca z mieszaniem w temperaturze pokojowej, a następnie zastosowaniem ultradźwięków w podwyższonej temperaturze, nieoczekiwanie stwierdzono, że przy zastosowaniu optymalnego ekstrahenta, uzyskuje się ekstrakt o trzykrotnie wyższej całkowitej zawartości polifenoli odpowiedzialnych za aktywność biologiczną surowca. W przeprowadzonym spektrofotometrycznym oznaczeniu całkowitej zawartości polifenoli, które wykonano z użyciem zmodyfikowanej metody opracowanej przez Singletona i Rossiego [Singleton, V.L., Rossi, J.A. Jr. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic - phosphotungstic acid reagents. Amer. J. Enol. Viticult. 1965, 16, 144-158.], stwierdzono, że w ekstrakcie micelarnym z kiełków fasoli znajduje się 192,85 mg/g ekstraktu polifenoli w przeliczeniu na kwas galusowy, zaś w suchym ekstrakcie jedynie 66,55 mg/g ekstraktu.

Ekstrakt zawierał:

Nr	Zawartość [pg/g suchego ekstraktu]
piku	Nazwa związku
1	kwas galusowy	24,9 - 25,8
2	kwas chlorogenowy	466,8 - 468,2
3	kwas p-hydroksybenzoesowy	4692,6 - 4693.9
4	alderinian kwasu p-kumarowego	58667,2 - 58669,3
5	alderinian kwasu o-kumarowego	2191,2-2192,8
6	kwas protokatechowy	108,5-110,3
7	alderinian kwasu ferułowego	10265,9 - 10267,3
8	kwas kawowy	11852,0- 11860,2
9	kwas p-kumarowy	1600,1 - 1608,7
10	kwas o-kumarowy	1439,8 - 1443,2

PL 249021 Β1

Nr		Zawartość [pg/g
	Nazwa związku
piku		suchego ekstraktu]
11	kwas ferulowy	11206,4 - 11210,1
12	kwas wanilinowy	36,8 - 39,5
13	kwercetyny-3-O-ksylozyloglukozyd	1203,9- 1206,7
14	rutyna	10636,4 - 10639,0
15	kwercetyny-3-O-(6-O-malonylo) glukozyd	1150,8- 1152,5
16	kemferolu-3-O-glukozyloheksoza	2637,6 - 2642,1
17	kemferolu-3-O-(6”-O-malonylo) glukozyd	1345,8- 1348,9
18	hiperozyd	3596,5 - 3599,0
19	izokwercytryna	290,1-292,5
20	kwcrcytryna	2035,2 - 2038,0
21	aldcrinian kwasu synapowego	377,5-380,1
22	mirycetyny-3-O-glukozyd	216,5-218,8
23	prunina	139,0- 141,9
24	astragalina	3503,2 - 3505,5
25	mirycetyna	54,1 - 55,2
26	kwas synapowy	1441,6- 1442,9
27	kwercetyna	683,0-684,3
28	(+)-katechina	41530,1 -41531,5
29	kemferol	2808,3 -2811,0
30	naryngenina	1213,1 - 1215,9
31	daidzeina	1164,8- 1166,0
32	glicyteina	1132,9- 1133,7

Testy potwierdzające działanie ekstraktu według wynalazku.

Ekstrakt według wynalazku wykazuje wiele korzystnych cech, istotnych dla działania przeciwstarzeniowego. Udowodniono dla niego następujące właściwości:

1. Hamowanie aktywności kolagenazy izolowanej z Clostridium heamolyticum:

Do badania użyto enzymatycznej metody oznaczania kolagenazy (EC 3.4.24.3) z użyciem FALGPA (N-(3-[2-furylo]akryloilo)-Leu-Gly-Pro-Ala), jako substratu dla kolagenazy, która została rozpuszczona w 50 mM buforze Tricine (pH 7,5) w stężeniu początkowym 0,8 U/ml. FALGPA został rozpuszczony w buforze Tricine do 2 mM. Z liofilizowanego ekstraktu z Przykładu 1 przygotowano różne stężenia przez rozpuszczenie w glicerynie i inkubowano z enzymem przez 15 minut przed dodaniem substratu w celu rozpoczęcia reakcji. Ostateczna mieszanina reakcyjna (150 μΙ) zawierała bufor Tricine, 0,8 mM FALGPA, 0,1 U kolagenazy i ekstrakt w odpowiednim stężeniu. Z ekstraktu micelarnego z Przykładu 5 również wykonano rozcieńczenia i postępowano jak w przypadku ekstraktu suchego. Jako wzorzec zastosowano galusan epigallokatechiny (EGCG; Supelco) w stężeniu 100 μg/ml. Absorbancję przy długości fali λ=345 nm mierzono natychmiast po dodaniu substratu, a następnie w sposób ciągły przez 20 minut. Rezultaty zaprezentowano w poniższej Tabeli 1 dla ekstraktu suchego oraz w Tabeli 2 dla ekstraktu micelarnego.

PL 249021 Β1

Tabela 1

Stężenie liofilizatu z Przykładu 5 w gg/ml gliceryny	Hamowanie kolagenazy (%)
5	3,50
10	7,69
25	23,15
50	39,27
100	53,35
EGCG	83,29

Tabela 2

Stężenie ekstraktu z Przykładu 5 w gg/ml gliceryny	Hamowanie kolagenazy (%)
5	8,40
10	14,22
25	31,72
50	69,69
100	61,27
EGCG	83,29

Najsilniejsze hamowanie wykazał ekstrakt micelarny z Przykładu 5 w stężeniu 50 |Lig/ml i była to aktywność zbliżona do działania EGCG użytego jako wzorca. Wyniki świadczą o bardzo wysokiej zdolności hamującej aktywność kolagenazyz Clostridium heamolyticum przez ekstrakt według wynalazku.

2. Hamowanie aktywności elastazy.

Do badania użyto metody z użyciem wieprzowej elastazy trzustkowej (PE - E.C.3.4.21.36; Sigma-Aldrich), którą rozpuszczono w wodzie destylowanej w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 3,33 mg/ml. Substrat N-Sukcynylo-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAAPVN; Sigma-Aldrich) rozpuszczono w buforze Tris-HCI o stężeniu 1,6 mM (pH 8,0). Ekstrakt z Przykładu 1 i Przykładu 5 rozpuszczony w glicerynie (stężenia 5-100 pg/ml) inkubowano z enzymem przez 15 minut przed dodaniem substratu w celu rozpoczęcia reakcji. Końcowa mieszanina reakcyjna w dołku na 96 dołkowej płytce (całkowita objętość 200 μΙ) zawierała bufor, 0,8 mM AAAPVN, 1 pg/ml elastazy i 25 μΙ ekstraktu w odpowiednim stężeniu. Jako wzorzec zastosowano galusan epigallokatechiny (EGCG; Supelco) w stężeniu 100 pg/ml. Kontrole negatywne przeprowadzono przy użyciu wody. Wartości absorbancji mierzono natychmiast po dodaniu substratu, a następnie po 20 minutach przy długości fali λ=410 nm.

Rezultaty zaprezentowano w poniższej Tabeli 3 oraz w Tabeli 4:

Tabela 3

Stężenie liofilizatu z Przykładu 1 w μ&/ιη1 gliceryny	Hamowanie elastazy (%)
5	4,75
10	6,79
25	19,26
50	45,67
100	68,92
EGCG	90,35

PL 249021 Β1

Tabela 4

Stężenie ekstraktu z Przykładu 5 w gg/ml gliceryny	Hamowanie elastazy (%)
5	10,62
10	18,10
25	42,71
50	67,18
100	86,29
EGCG	90,35

Najsilniejsze hamowanie wykazał ekstrakt micelarny z Przykładu 5 w stężeniu 100 μ0/πΊΐ i była to aktywność zbliżona do działania EGCG użytego jako wzorca. Wyniki świadczą o bardzo wysokiej zdolności hamującej aktywność elastazy przez ekstrakt według wynalazku.

3. Właściwości antyoksydacyjne (przeciwutleniające)

a) Ocenę właściwości przeciwutleniających przeprowadzono oznaczając zdolność zliofilizowanego ekstraktu z Przykładu 1 oraz ekstraktu micelarnego z Przykładu 5 do neutralizacji fioletowego rodnika 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (DPPH·, Sigma-Aldrich). Do oznaczeń sporządzono etanolowy roztwór DPPH· o stężeniu 0,07 mg/ml, a także glicerynowy roztwór podstawowy ekstraktu o stężeniu 1 mg/ml. Na 96 dołkowe płytki nanoszono po 20 μΙ ekstraktu w różnym stężeniu oraz po 180 μΙ roztworu DPPH·. Następnie przeprowadzono 30 minutową inkubację w 28°C, po czym zmierzono absorbancję przy długości fali λ=517 nm. Natomiast w próbie ślepej zamiast ekstraktu naniesiono do dołka 20 μΙ gliceryny w przypadku ekstraktu suchego i w przypadku ekstraktu micelarnego. Aktywność wychwytywania rodnika DPPH· wyrażono jako procentowe hamowanie i obliczono przy użyciu następującego równania:

% Współczynnik inhibicji = [(Ao-Ai)/Ao]*1OO%, gdzie: Ao oznacza absorbancję kontroli (roztwór DPPH· i rozpuszczalnik zamiast próbki); Ai to absorbancja próbki.

Wyniki pojemności antyoksydacyjnej wyrażono jako równoważnik Troloksu ^g Troloksu na 1 g ekstraktu) w oparciu o wartości EC50.

Rezultaty zaprezentowano w poniższej Tabeli 5 oraz w Tabeli 6:

Tabela 5

Stężenie liofilizatu z Przykładu 1 według wynalazku w pg/ml gliceryny	Aktywność antyoksydacyjna [gg Troloksu/g]
5	4,23
10	7,94
25	51,55
50	138,20
100	153,05

Tabela 6

Stężenie ekstraktu z Przykładu 5 według wynalazku w tig/ml gliceryny	Aktywność antyoksydacyjna [gg Troloksu/g]
5	28,54
10	35,80
25	118,25
50	172,46
100	246,24

PL 249021 Β1

Otrzymane wyniki świadczą o bardzo dobrej aktywności anty oksydacyjnej ekstraktu micelarnego z Przykładu 5 według wynalazku, szczególnie w stężeniu 100 i 50 μg/ml.

b) ABTS

Kolejną metodą użytą do oceny właściwości przeciwutleniających zliofilizowanego ekstraktu z Przykładu 1 oraz ekstraktu micelarnego z Przykładu 5 była metoda odbarwiania ABTS'⁺ (kwas 2,2- azynobis-(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy) przeprowadzona w 96. dołkowych mikropłytkach. Absorbancję mierzono po 6. minutowej inkubacji przy 734 nm. Aktywność wychwytywania rodników ABTS wyrażono jako procentowe hamowanie i obliczono przy użyciu następującego równania: % Współczynnik inhibicji =[(Ao-Ai)/Ao]*1OO%, gdzie: Ao oznacza absorbancję kontroli (roztwór ABTS'⁺ i rozpuszczalnik zamiast próbki); Ai to absorbancja próbki.

Wyniki aktywności przeciwutleniającej wyrażono jako równoważnik Troloksu ^g Troloksu na 1 g ekstraktu), przedstawiono w Tabeli 7 oraz w Tabeli 8:

Tabela 7

Stężenie liofilizatu z Przykładu 1 według wynalazku w pg/inl gliceryny	Aktywność anty oksydacyjna [pg Troloksu/g ekstraktu]
5	2,67
10	12,48
25	27,67
50	42,27
100	48,90

Tabela 8

Stężenie ekstraktu z Przykładu 5 według wynalazku w μί/ηιΐ gliceryny	Aktywność anty oksydacyjna |jig Troloksu/g ekstraktu]
5	9,57
10	15,47
25	29,75
50	61,56
100	74,38

Otrzymane wyniki świadczą o bardzo dobrej aktywności antyoksydacyjnej ekstraktu micelarnego z Przykładu 5 według wynalazku, szczególnie w stężeniu 100 i 50 μg/ml.

2. Analiza zawartości głównych substancji czynnych

Analizę jakościową i ilościową głównych substancji czynnych zawartych w ekstrakcie z Przykładu 1 wykonano z zastosowaniem chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas LC/MS (Thermo Scientifc; Q-EXATCTIVE i ULTIMATE 3000, San Jose, CA) wyposażonego w źródło elektrorozpraszania ESI. Do rozdziału chromatograficznego, który przeprowadzono stosując elucję gradientową, zastosowano kolumnę Gemini 08 (4,6 x 100 mm, 3 μητ) (Phenomenex, USA). Faza ruchoma A zawierała 25 mM kwasu mrówkowego w wodzie; fazą ruchomą B był 25 mM kwas mrówkowy w acetonitrylu. Program gradientu rozpoczął się przy 5% B wzrastającym do 95% przez 60 minut, następnie następowała elucja izokratyczna (95% B) przez 10 minut. Całkowity czas przepływu wynosił 70 minut przy szybkości przepływu fazy ruchomej 0,4 ml/min. Temperatura kolumny wynosiła 25°C. W trakcie każdego przepływu w sposób ciągły zbierano widma MS w zakresie 100-700 m/z.

Analizę ilościową zidentyfikowanych związków sporządzono na podstawie krzywych kalibracyjnych uzyskanych dla odpowiednich wzorców. Rezultaty badań zaprezentowano na chromatogramie (Fig. 1) i w Tabeli 9:

PL 249021 Β1

Tabela 9

Nr piku	Nazwa związku	Zawartość [pg/g suchego ekstraktu według wynalazku]
1	kwas galusowy	25,3 ± 1,3
2	kwas chlorogenowy	467,8 ± 20,9
3	kwas p-hydroksybenzoesowy	4693,5 ±214,0
4	alderinian kwasu p-kumarowego	58668,2 ± 3056,6
5	alderinian kwasu o-kumarowego	21923,4 ± 1091,8
6	kwas protokatcchowy	109,9 ±5,2
7	alderinian kwasu ferulowego	10266,9 ±541,1
8	kwas kawowy	11857,2 ± 550,2
9	kwas p-kumarowy	1605,7 ± 85,3
10	kwas o-kumarowy	1442,0 ±65,9
11	kwas ferulowy	11208,7 ± 558,2
12	kwas wanilinowy	37,2 ± 1,9
13	kwercetyny-3-O-ksylozyloglukozyd	1204,2 ±60,5
14	rutyna	10637,5 ± 529,7
15	kwercetyny-3-O-(6’'-O-malonylo) glukozyd	1151,7 ±52,6
16	kemferolu-3 -O-glukozyl oheksoza	2640,1 ± 133,6
17	kemferolu-3-0-(6”-0-malonylo) glukozyd	1347,8 ±59,8
18	hiperozyd	3597,3 ± 173,4
19	izokwercytryna	290,3 ± 14,7
20	kwercytryna	2037,9 ± 106,2
21	alderinian kwasu synapowego	378,3 ± 17,1
22	mirycetyn y-3 - 0 -glukozyd	217,7 ± 10,1
23	prunina	140,2 ±7,1
24	astragalina	3504,7 ± 174,5
25	mirycetyna	54,7 ± 2,8
26	kwas synapowy	1442,0 ± 74,6
27	kwercetyna	683,9 ±32,0
28	(+)-katechina	41530,9 ±2126,4
29	kemferol	2809,9 ± 128,4
30	naryngenina	1215,0 ±55,3
31	daidzeina	1165,6 ±59,3
32	glicyteina	1133,2 ±54,1

Claims (5)

1. Sposób otrzymywania ekstraktu z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.), znamienny tym, że 5-10 dniowe kiełki fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) o rozdrobnieniu nie większym niż frakcja 5 mm poddaje się ekstrakcji w układzie wodno - etanolowym składającym się z etanolu 60°-80°, korzystnie 70°, w układzie 1 część wagowa kiełków i 3-8 części etanolu, korzystnie 3,5-5,5 części wagowych układu, w temperaturze do 22°C, przez okres od 1 do 3 godzin, korzystnie 2 godziny, stale mieszając, po czym otrzymany ekstrakt poddaje się działaniu ultradźwięków przez okres 15-30 minut, w 30°C do 50°C, korzystnie 40°C, następnie rozpuszczalnik oddziela się od frakcji stałej, filtruje, zebrany ekstrakt zagęszcza się pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym oddzieloną i zatężoną frakcję płynną suszy się przez liofilizację.

2. Sposób wg zastrz. 2, znamienny tym, że prowadzi się dwukrotną macerację z zastosowaniem tych samych warunków.

3. Sposób wg zastrz. 2, znamienny tym, że do przeprowadzenia ekstrakcji do układu rozpuszczalników dodaje się środek powierzchniowo czynny Polioksyetylenowany (23) eter laurowy w ilości od 0,003 cz. do 0,005 cz., korzystnie 0,004 cz. na 1 część wag. ekstrahenta.

4. Ekstrakt z kiełków fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) otrzymany sposobem opisanym w zastrz. 1 do zastosowania jako środek przeciwstarzeniowy.

5. Ekstrakt z kiełków z fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris L.) otrzymany sposobem opisanym w zastrz. 1 do zastosowania do wytwarzania preparatów kosmetycznych o działaniu przeciwstarzeniowym.