PL249064B1 - Porowate elastomerowe aktywne biologicznie kompozyty polimerowo- ceramiczne do wypełniania ubytków kostnych i regeneracji tkanki kostnej oraz sposób ich wytwarzania - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są biokompozyty polimerowo-ceramiczne na bazie poli(sebacynianu glicerolu) (PGS) zawierające cząstki fosforanów wapnia, wytworzone w postaci elastycznych materiałów porowatych, przeznaczone do zastosowania jako materiał implantacyjny do wypełniania ubytków kostnych. Przedmiotem zgłoszenia jest także sposób wytwarzania biokompozytów w postaci elastycznych materiałów porowatych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są biokompozyty polimerowo-ceramiczne na bazie poli(sebacynianu glicerolu) (PGS) zawierające cząstki fosforanów wapnia, wytworzone w postaci elastycznych materiałów porowatych, przeznaczone do zastosowania jako materiał implantacyjny do wypełniania ubytków kostnych. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania biokompozytów w postaci elastycznych materiałów porowatych.

Znane są rozwiązania dotyczące wykorzystania PGS w inżynierii tkanki kostnej. Na przykład wniosek patentowy EP3420020A2 opisuje termoutwardzalny materiał kompozytowy. Zarówno wypełnienie jak i matryca, może być produktem reakcji kondensacji pomiędzy kwasem dikarboksylowym, a alkoholem polihydroksylowym (np. poli(sebacynian gliceryny), PGS). Polimerowa matryca jak i polimerowy napełniacz różnią się właściwościami fizykochemicznymi umożliwiającymi dowolne formowanie materiału. Zgłoszenie dopuszcza domieszkowanie dodatkowymi napełniaczami polimerowymi takimi jak PCL, PGLA, PGA czy PLA. Zgłoszenie patentowe opisuje proces prowadzenia matrycy PGS do napełniacza na drodze kriomielenia (mielenia w obniżonej temperaturze). Zgłoszenie opisuje również potencjalne zastosowanie ww. kompozytu polimerowo-polimerowego w ortopedii po zmieszaniu z hydroksyapatytem (gotowa mieszanka w postaci pasty). Z kolei z międzynarodowego opisu patentowego US10525140B2 znane są kompozyty poli(sebacynianu glicerolu), w których napełniacz i matryca wytworzone są z tego samego materiału, w celu zapewnienia jednorodnej kompozycji polimerowej oraz kompozyty trójskładnikowe z dodatkiem hydroksyapatytu lub fosforanu trójwapniowego. Przedmiotem opisanego wynalazku jest również sposób otrzymywania mączki PGS, pełniącej funkcję wypełniacza oraz sposób formowania porowatych rusztowań przy wykorzystaniu techniki wymywania soli. Inną, dotyczącą inżynierii tkanki kostnej recepturą, jest formulacja z wniosku patentowego WO2019152582A1. Jest to formuła elastomerycznego oraz osteostymulacyjnego wypełnienia kostnego. Ww. receptura zawiera mikrocząstki materiału elastomerycznego oraz wypełniacz. Co najmniej jeden z materiałów elastomerycznych zawiera termoutwardzalny poli(sebacynian glicerolu). Elastomeryczna matryca przenosi obciążenie dzięki czemu sprzyja procesowi regeneracji tkanki kostnej. Zgłoszenie opisuje również możliwość formowania matrycy z poli(sebacynianu glicerolu) oraz wytwarzania jego porowatej struktury. W opisie wniosku można znaleźć związki bazujące PGS wskazywane jako związki matrycowe np. PGSA, PGSU, PGS-kwas salicylowy jak i porofory takie jak fosforany i wodorofosforany wapnia. Jako napełniacz wymienione są m.in. tlenek magnezu, hydroksyapatyt, tlenek krzemu oraz bioszkło. Mieszanina elastomeru, napełniacza oraz poroforu jest sieciowana temperaturowo w zakresie czasu od 24-96 h a następnie odmywana rozpuszczalnikiem zależnym od wykorzystanego porogenu.

W literaturze znane są materiały kompozytowe na bazie poli(sebacynianu gliceryny) zarówno w postaci litej jak i porowatej, dedykowane do różnych zastosowań. Odnosząc się do kompozytów w formie litej, jednymi z częściej badanych są materiały na bazie PGS z dodatkiem wielościennych nanorurek węglowych. Akhilesh K. Gaharwa w swojej pracy (Akhilesh K. Gaharwar i inni w Biomaterials Science 3 (2015): 46-58, doi: 10.1039/c4bm00222a) wytworzył prepolimer PGS na drodze polikondensacji glicerolu i kwasu sebacynowego pod obniżonym ciśnieniem. Następnie do rozpuszczonego w tetrahydrofuranie prepolimeru wprowadził nanorurki węglowe w ilości 1-10% wagowych doprowadzając do postaci zawiesiny. Po odparowaniu rozpuszczalnika materiały były dosieciowane w suszarce próżniowej w temperaturze 130°C przez 40 h. Przeprowadzone badania in vitro z wykorzystaniem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych wykazały biozgodność kompozytów i wzmożony potencjał różnicowania komórek w stosunku do niedomieszkowanego PGS. Dostępne są również inne prace naukowe dotyczące kompozytów PGS z wielościennymi nanorurkami węglowymi. Yi Yan wraz ze swoim zespołem (Yi Yan i inni w Journal of Colloid and Interface Science 521 (2018): 24-32, doi: org/10.1016/j.jcis.2018.03.015) na podobnej drodze wytworzył kompozyty z dodatkiem nanorurek węglowych w ilościach 1 -3% wagowych. Po dodaniu napełniacza, zaobserwował znaczący wzrost parametrów mechanicznych materiału, jednocześnie bez utraty elastyczności. Badania biologiczne na linii komórkowej neuronów podwzgórza dorosłej myszy A59, wykazały potencjał wytworzonych materiałów do regeneracji tkanki nerwowej. W innej publikacji (Yi Yan I inni w Composites Science and Technology 142 (2017): 163-170, doi:

10.1016/j.compscitech.2017.02.007) została zasugerowana możliwość zastosowania takich kompozytów do budowy czujników piezorezystancyjnych w zastosowaniach inżynierii biomedycznej.

Istniejące badania naukowe wskazują również na potencjał materiałów krzemionkowych jako dodatków do PGS. W pracy (C. Talla Ferrer i inni w International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials 69:12 (2020): 761-772, doi: 10.1080/00914037.2019.1616197) pokazano potencjał kompozytów PGS z dodatkiem 5% wagowych dwóch rodzajów nanocząstek krzemionki z przeznaczeniem do inżynierii tkankowej w dziedzinie stomatologicznej. Wspomniane nanocząstki zostały wprowadzone do prepolimeru na drodze mechanicznego mieszania. Następnie materiał został usieciowany termicznie w docelowych formach. Równolegle wytworzono materiały porowate o takim samym składzie za pomocą metody wymywania ziaren soli. Przeprowadzone badania z wykorzystaniem mysich fibroblastów wykazały wysoką bioaktywność oraz przeżywalność komórek. Innym stosowanym do PGS dodatkiem na bazie krzemionki jest szkło krzemionkowe (Xin Zhao i inni w Journal of Materials Chemistry B 3 (2015): 3222, doi: 10.1039/c4tb01693a). Kompozyty te wykazały potencjał do regeneracji tkanki kostnej, poparty badaniami in vitro z wykorzystaniem komórek z linii osteoblastów MC3T3. Ponadto, obecność szkła krzemionkowego w układzie pozwoliła na kontrolę procesu biomineralizacji w roztworze symulowanych płynów ustrojowych. Innym przykładem jest kompozyt na bazie PGS z dodatkiem mikrometrycznego bioszkła w ilościach 0-15% wagowych dedykowany do zastosowań w inżynierii tkanek miękkich (Shu-Ling Liang i inni w Biomaterials 31 (2010): 8516-8529, doi: 10.1016/j.biomaterials.2010.07.105). Dodatek napełniacza wpłynął na wyraźną poprawę parametrów wytrzymałościowych (moduł sprężystości wzdłużnej, odkształcenie przy zerwaniu), a także na zwiększenie stabilności mechanicznej materiału w warunkach in vivo. Znane są również kompozyty PGSU (PGS wzbogacony o związek sieciujący HDI) z dodatkiem glinokrzemianów (Mohammad Monem i inni w Journal of Polymer research 29:25 (2022), doi: https://doi.org/10.1007/s10965-021-02866-7). Napełniacze z tej grupy znacząco poprawiły zwilżalność materiałów oraz wpłynęły na przebieg degradacji hydrolitycznej.

Znane są również materiały lite na bazie poli(sebacynianu gliceryny) sieciowanego chemicznie (za pomocą HDI) wzbogacone o kurkuminę i hydroksyapatyt z przeznaczeniem do medycyny regeneracyjnej tkanek twardych (Vafa Fakhri i inni w Polymer Chemistry 12 (2021): 6263, doi: 10.1039/d1py01040a). Wprowadzenie dodatków wpłynęło na wzrost modułu sprężystości materiału, polepszenie proliferacji i aktywności metabolicznej komórek z linii mysich fibroblastów L-929 oraz poprawę właściwości antybakteryjnych materiału.

W literaturze można znaleźć kilka prac skupiających się na opracowaniu porowatych materiałów na bazie PGS do zastosowań w inżynierii tkankowej układu kostnego. W pracy (Marina Trevelin Souza i inni w Materials 10(83) (2017): 1-14, doi: 10.3390/ma10010083), korzystając z metody wymywania soli, wytworzono porowate materiały o zawartości 5 oraz 10% wagowych bioaktywnych włókien szklanych, dedykowane do regeneracji tkanki chrzęstnej. Zastosowanie tego napełniacza wpłynęło na poprawę właściwości mechanicznych materiałów, bioaktywności oraz lepszą kontrolę nad kinetyką degradacji hydrolitycznej.

Z kolei do najczęściej stosowanych napełniaczy do zastosowań w inżynierii tkankowej kości można zaliczyć związki na bazie fosforanów wapnia, w tym również hydroksyapatyt. W publikacji (Yaozong Wang i inni w Scientific Reports 9 (2019): 7960, doi: 10.1038/s41598-019-44478-8) zaprezentowano porowate kompozyty PGS-u szczepionego bezwodnikiem maleinowym z dodatkiem hydroksyapatytu w ilości 40-60% wagowych. Do ich wytworzenia skorzystano z połączenia technik wymywania ziaren soli oraz liofilizacji. Dodatek napełniacza wpłynął na wzrost żywotności komórek z linii ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (hADSC), a także zwiększenie ekspresji genów osteogenicznych. Znana jest również inna praca potwierdzająca osteokonduktywne właściwości kompozytów PGS z hydroksyapatytem wytworzonego podobną techniką (Paweł Piszko i inni w International Journal of Molecular Sciences 22 (2021): 8587, doi: 10.3390/ijms22168587). Wyniki badań in vitro oraz in vivo w niej zawarte wskazują, że kompozyt PGS z 25% wagowym dodatkiem hydroksyapatytu jest materiałem o bardzo dużym potencjale do regeneracji tkanki kostnej.

Dostępne również doniesienia literaturowe prezentujące bardziej złożone układy kompozytowe, gdzie oprócz PGS-u do układu wprowadza się inne polimery w formie mieszaniny bądź kopolimeru z PGS-em. Przykładem są materiały dedykowane do wytwarzania techniką elektroprzędzenia, gdzie PGS zazwyczaj występuje w mieszaninie z polikaprolaktonem (PCL). Obecnie znanych jest kilka układów kompozytowych PGS/PCL wykonanych techniką elektroprzędzenia z różnymi dodatkami funkcjonalnymi, w tym z hydroksyapatytem - materiały przeznaczone do zastosowań w inżynierii tkanki nerwowej (Ahmad Saudi i inni w Materials Chemistry and Physics 275 (2022): 125224, doi:

doi.org/10.1016/j.matchemphys.2021.125224) oraz kostnej (Abdelrahman I. Rezk i inni w Polymers 12 (2020): 2667, doi: 10.3390/polym12112667), z węglowymi kropkami kwantowymi - do inżynierii tkankowej serca (Sara Rastegar i inni w Materials Chemistry and Physics 266 (2021): 124543, doi:

10.1016/j.matchemphys.2021.124543), a także z grafenem - do zastosowań w inżynierii tkanki nerwowej (Aref Fakhrali i inni w Applied Polymer Science 138 (2021): 51177, doi: 10.1002/app.51177). Dodatek grafenu do mieszaniny PGS/PCL znany jest również dla materiałów litych (Shirin Ghafaralahi i inni w Journal of Bioactive and Compatible Polymers 33:5 (2018): 529-542, doi: 10.1177/0883911518793912). Oprócz kompozytów na bazie mieszanin PGS/PCL podjęto próby wytworzenia kompozytów na bazie kopolimeru PGS-co-PCL z dodatkiem hydroksyapatytu z przeznaczeniem do zastosowań inż ynierii tkanek miękkich (Mostafa Rostamian w European Polymer Journal 138 (2020): 109985, doi:

10.1016/j.eurpolymj.2020.109985).

Znane są również kompozytowe mieszaniny PGS z żelatyną wraz z różnymi dodatkami. Mahshid Kharaz w swojej pracy zaprezentował możliwość wytworzenia mieszaniny PGS/żelatyna z dodatkiem nanorurek węglowych w formie maty techniką elektroprzędzenia (Mahshid Kharaziha i inni w Biomaterials 35 (2014): 7346-7354, doi: 10.1016/j.biomaterials.2014.05.014). Dodatek nanorurek węglowych spowodował znaczącą poprawę właściwości mechanicznych oraz elektrycznych (wzrost przewodności elektrycznej) materiałów, co otwiera drzwi do ich wykorzystania w inżynierii tkankowej serca czy układu nerwowego. Opisane są również w literaturze materiały lite na bazie mieszaniny PGS/żelatyna z dodatkiem glinokrzemianów i tlenku grafenu (Mohammad Hossein Aghajan w European Polymer Journal 131 (2020): 109720, doi: 10.1016/j.eurpolymj.2020.109720).

W chwili obecnej w literaturze naukowej znanych jest kilka podejść do sieciowania poli(sebacynianu gliceryny) na drodze chemicznej. Różnego typu związki chemiczne wprowadza się do wytworzonego prepolimeru, przeważnie na drodze rozpuszczalnikowej, które są reaktywne względem łańcucha polimerowego. W wyniku reakcji chemicznej czynników sieciujących z łańcuchami polimerowymi powstaje trójwymiarowa sieć nadcząsteczkowa o zdecydowanie innych właściwościach fizykochemicznych względem polimeru wyjściowego.

Najczęściej spotykanym jest zastosowanie związków sieciujących z grupy izocyjanianów. Prekursorem takiego podejścia była praca autorstwa Marii Jose Nunes Pereira i innych (Maria Jose Nunes Pereira i inni w Advanced Materials 25 (2013): 1209-12015, doi: 10.1002/adma.201203824), w której zastosowano jako czynnik sieciujący diizocyjanian heksametylenu (HDI), tworzący wiązanie uretanowe pomiędzy grupami izocyjanianowymi oraz grupami hydroksylowymi łańcucha polimerowego. Podobne podejście wykorzystał Martin Frydrych (Martin Frydrych i inni w Polymer 122 (2017): 159-168, doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.polymer.2017.06.064), stosując HDI jako chemiczny czynnik sieciujący przy produkcji rusztowań komórkowych z PGS z przeznaczeniem do inżynierii tkankowej tkanek miękkich. HDI znalazł również zastosowanie do sieciowania PGS-u przy produkcji materiałów kompozytowych z dodatkiem napełniaczy: cząstek tlenku cynku (Hooman Golbaten-Mofrad i inni w European Polymer Journal 159 (2021): 110749, doi: 10.1016/j.eurpolymj.2021.110749) oraz nanocząstek glinokrzemianowych (Mohammad Monem i inni w Journal of Polymer research 29:25 (2022), doi: 10.1007/S10965-021-02866-7).

Innym związkiem z grupy izocyjanianów stosowanym do sieciowania PGS opisanym w literaturze jest diizocyjanian difenylometanu (MDI) o podobnym mechanizmie sieciowania jak w przypadku HDI. Xinda Li (Xinda Li i inni w Biomacromolecules 16 (2015): 1525-1533, doi: 10.1021/acs.biomac.5b00018) wykazał zasadność jego stosowania, dowodząc, że jego dodatek do PGS w ilości 7,8 procent wagowych przyczynia się do poprawy parametrów mechanicznych końcowego produktu (moduł Younga, wytrzymałość na rozciąganie) w stopniu, który nie jest osiągalny na drodze standardowego sieciowania termicznego. MDI został wykorzystany także przez Runcy'ego Wilsona (Runcy Wilson i inni w ACS Omega 3 (2018): 118714-18723, doi: 10.1021/acsomega.8b02451) do sieciowania PGS oraz kopolimerów blokowych PGS z PTMO (poli(tlenek tetrametylenu)), w ilości 0-4% wagowych.

W literaturze do tej pory zostało zaprezentowanych również kilka innych podejść do sieciowania chemicznego materiałów na bazie PGS. Akhilesh K. Gaharwar (Akhilesh K. Gaharwar i inni w Biomaterials Science 3 (2015): 46-58, doi: 10.1039/c4bm00222a) zaproponował wykorzystanie nanorurek węglowych jako czynnika sieciującego. Nanorurki węglowe wprowadzone do roztworu PGS w tetrahydrofuranie po odparowaniu rozpuszczalnika i kondycjonowaniu w podwyższonej temperaturze uległy połączeniu z polimerem poprzez wytworzenie wiązań estrowych pomiędzy grupami karboksylowymi obecnymi w strukturze ścian nanorurek węglowych, a grupami hydroksylowymi obecnymi w szkielecie polimeru. Przykładem innego chemicznego czynnika sieciującego opisanego w literaturze naukowej stosowanego do PGS jest żelatyna, która zwiększa wydajność sieciowania poprzez wytworzenie dodatkowych połączeń estrowych i amidowych z prepolimerem (Sungkwon Yoon i inni w Polymer Chemistry 9 (2018): 3727-3740, doi: 10.1039/c8py00544c). Dodatek żelatyny w znaczącym stopniu wpływa na właściwości materiału końcowego, takie jak wytrzymałość mechaniczna czy zdolność do degradacji hydrolitycznej.

Niedogodnością znanych biokompozytów polimerowo-ceramicznych do zastosowania jako wypełnienie ubytków kostnych i do regeneracji kości są: brak efektywnego działania osteoindukcyjnego, brak właściwości proadhezyjnych względem komórek kości, sztywność i kruchość, brak tolerancji dopasowania kształtu do wymiarów ubytku kostnego.

Celem wynalazku było zatem opracowanie takich biokompozytów do zastosowania jako wypełnienie ubytków kostnych i do regeneracji tkanki kostnej, aby cechowały się one następującymi właściwościami: miały udowodnione właściwości osteoindukcyjne, były biozgodne na poziomie komórkowym in vitro i in vivo oraz były materiałami elastomerowymi, a przez to charakteryzowały się elastycznością i odwracalnością odkształceń, wykazywały się łatwością dopasowania do wymiarów ubytku kostnego.

Efekty te uzyskano poprzez opracowany skład kompozytów na bazie poli(sebacynianu glicerolu) sieciowanego chemicznie z zastosowaniem jednego czynnika sieciującego wybranego z trzech: ester etylowy diizocyjanianu L-lizyny lub diizocyjanian izoforonu lub izocyjanian 3-(trietoksysilylo)propylu oraz cząstek fosforanów wapnia jednego rodzaju z czterech: hydroksyapatytu w postaci nanometryczn ych cząstek „HAP_B” lub nanometrycznych cząstek hydroksyapatytowych kowalencyjnie funkcjonalizowanych L-lizyną „HAP_B-Lys” lub nanometrycznych cząstek dwufazowego fosforanu wapnia „nanoHAP1200” lub hydroksyapatytu w postaci nanometrycznych cząstek o dużym rozwinięciu powierzchni modyfikowanego kowalencyjnie L-lizyną „nanoHAP-Lys”. W cudzysłowiu podano używane dalej skróty do tych składników.

Zastosowano cząstki fosforanów wapnia kowalencyjnie funkcjonalizowane L-lizyną, HAP_B-Lys i nanoHAP-Lys, ponieważ L-lizyna promuje adhezję i proliferację osteoblastów (Yoshikawa Masataka i inni w Journal of Biomedical Science and Engineering 8 (2015): 389-398 doi:10.4236/jbise.2015.86037, Liuyun Jang i inni w Journal of Biomaterials Applications 30 (2016): 750-758 doi: 10.1177/0885328215584491) i zwiększa potencjał osteogeniczny komórek macierzystych kości (Yoshikawa Masataka i inni w Journal of Biomedical Science and Engineering 5 (2012): 587-592, doi:10.4236/jbise.2012.510072).

A. SKŁAD BIOKOMPOZYTU

Istotą wynalazku są nowe osteoindukcyjne elastomerowe kompozyty polimerowo-ceramiczne o potwierdzonej cytozgodności względem komórek normatywnych i kostnych, na bazie poli(sebacynianu glicerolu) sieciowanego chemicznie z zastosowaniem jednego czynnika sieciującego wybranego z trzech: ester etylowy diizocyjanianu L-lizyny lub diizocyjanian izoforonu lub izocyjanian 3-(trimetoksysililo)propylu oraz cząstek fosforanów wapnia jednego rodzaju wybranego z czterech: hydroksyapatytu w postaci nanometrycznych cząstek „HAP_B” lub nanometrycznych cząstek hydroksyapatytowych kowalencyjnie funkcjonalizowanych L-lizyną „HAP_B-Lys” lub nanometrycznych cząstek dwufazowego fosforanu wapnia „nanoHAP1200” lub hydroksyapatytu w postaci nanometrycznych cząstek o dużym rozwinięciu powierzchni modyfikowanego kowalencyjnie L-lizyną „nanoHAP-Lys” do zastosowania jako materiał implantacyjny do wypełnień ubytków kostnych i regeneracji tkanki kostnej. Kompozyt ma zastosowanie medyczne jako materiał o działaniu osteoindukcyjnym do wypełniania ubytków kostnych i regeneracji tkanki kostnej. Co do ilości poszczególnych składników w biokompozycie: poli(sebacynianu glicerolu) sieciowanego chemicznie z zastosowaniem jednego czynnika sieciującego wybranego z trzech: ester etylowy diizocyjanianu L-lizyny, diizocyjanian izoforonu, izocyjanian 3-(trietoksysilylo)propylu, jest od 70% wag. do 85% wag. w stosunku do całkowitej masy kompozytu dwuskładnikowego, cząstek fosforanów wapnia (jeden rodzaj wybrany z czterech: hydroksyapatytu w postaci nanometrycznych cząstek „HAP_B”, nanometrycznych cząstek hydroksyapatytowych kowalencyjnie funkcjonalizowanych L-lizyną „HAP_B-Lys”, nanometrycznych cząstek dwufazowego fosforanu wapnia „nanoHAP1200”, hydroksyapatytu w postaci nanometrycznych cząstek o dużym rozwinięciu powierzchni modyfikowanego kowalencyjnie L-lizyną „nanoHAP-Lys”, jest w ilości 15-30% wag. w stosunku do całkowitej masy kompozytu dwuskładnikowego.

Kompozyt dwuskładnikowy o właściwościach osteoindukcyjnych do wypełniania ubytków kostnych i regeneracji tkanki kostnej zawiera korzystnie jako napełniacz cząstki fosforanów wapnia niemodyfikowane powierzchniowo wybrane z dwóch w/w: hydroksyapatyt (HAP_B) lub dwufazowy fosforan wapnia (nanoHAP1200); lub cząstki fosforanów wapnia modyfikowane powierzchniowo L-lizyną czyli „HAP_B-Lys” lub nanoHAP-Lys o zawartości L-lizyny od 1 do 10% wag. w stosunku do całości ilości napełniacza.

Korzystnie zawartość cząstek fosforanów wapnia jednego rodzaju z czterech: nanometryczny hydroksyapatyt „HAP_B”, nanometryczny hydroksyapatyt kowalencyjnie funkcjonalizowany L-lizyną

PL 249064 Β1 „HAP_B-Lys”, dwufazowe cząstki fosforanów wapnia „nanoHAP1200” i hydroksyapatyt w postaci nanometrycznych cząstek o dużym rozwinięciu powierzchni modyfikowany kowalencyjnie L-lizyną „nanoHAP-Lys”, wynosi 30% wag. w stosunku do całkowitej masy dwuskładnikowego kompozytu.

Istotą według wynalazku jest również sposób wytwarzania elastomerowych biokompozytów porowatych o właściwościach osteoindukcyjnych na bazie poli(sebacynianu glicerolu) sieciowanego chemicznie z zastosowaniem jednego z trzech czynników chemicznych: diizocyjanian izoforonu, izocyjanian 3-(trietoksysilylo)propylu, ester etylowy diizocyjanianu L-lizyny, oraz cząstek fosforanów wapnia jednego rodzaju wybranego z czterech: hydroksyapatyt w postaci nanometrycznych cząstek „HAP_B”, nanometrycznych cząstek hydroksyapatytowych kowalencyjnie funkcjonalizowanych L-lizyną „HAP_B-Lys”, nanometrycznych cząstek dwufazowego fosforanu wapnia „nanoHAP1200” i hydroksyapatytu w postaci nanometrycznych cząstek o dużym rozwinięciu powierzchni modyfikowanego kowalencyjnie L-lizyną „nanoHAP-Lys”), do zastosowania do wypełnień ubytków kostnych i regeneracji tkanki kostnej.

Kompozyty elastomerowe według wynalazku w postaci sprężystych materiałów porowatych otrzymuje się dwuetapowo. Pierwszym etapem tworzenia biokompozytu według wynalazku jest otrzymywanie matrycy elastomerowej na drodze wstępnego chemicznego sieciowania poli(sebacynianu glicerolu) (otrzymanego uprzednio znanym sposobem) jednym z czynników wybranym z trzech: estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny lubdiizocyjanianem izoforonu lub izocyjanianem 3-(trietoksysilylo)propylu, w rozpuszczalniku. W drugim etapie dodaje się przygotowane wcześniej cząstki fosforanów wapnia (wytworzone uprzednio znanym sposobem) jednego rodzaju z czterech: hydroksyapatyt w postaci nanometrycznych cząstek „HAP_B”, nanometryczne cząstki hydroksyapatytowe kowalencyjnie funkcjonalizowane L-lizyną „HAP_B-Lys”, nanometryczne cząstki dwufazowego fosforanu wapnia „nanoHAP1200” i hydroksyapatyt w postaci nanometrycznych cząstek o dużym rozwinięciu powierzchni modyfikowany kowalencyjnie L-lizyną „nanoHAP-Lys” i następnie prowadzi się dalsze sieciowanie chemiczne produktu w podwyższonej temperaturze bez udziału rozpuszczalnika.

Reakcje sieciowania chemicznego prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny, diizocyjanianem izoforonu i izocyjanianem 3-(trietoksysilylo)propylu pokazano schematycznie na wzorach 1-4 i dalej opisano.

NCO

O o

H--N

I CH₂ \ j /4 —N O

—J n

Wzór 1 Reakcja chemiczna sieciowania prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny

PL 249064 Β1

Wzór 2 Reakcja chemiczna sieciowania prepolimeru polijsebacynianu glicerolu) diizocyjanianem izoforonu

OH

Q .i............IIIIIIIH·^ m Ilijilll11 j ' Q

oąH_s

0¾¾

Wzór 3 Reakcja chemiczna modyfikacji prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) pPGS izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu.

PL 249064 Β1

Wzór 4 Reakcja chemiczna sieciowania polijsebacynianu glicerolu) pPGS zmodyfikowanego izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu.

Sposób otrzymywania kompozytu elastomerowego w postaci materiału porowatego przeznaczonego do wypełniania ubytków kostnych i regeneracji tkanki kostnej polega na tym, że prowadzi się w pierwszym etapie modyfikację chemiczną prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) pPGS (uprzednio otrzymanego znanym sposobem) diizocyjanianem izoforonu lub izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny w bezwodnym dioksanie, z zastosowaniem czynnika sieciującego w ilości 2 mmole na 1 g pPGS w przypadku sieciowania diizocyjanianem izoforonu lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny oraz 4 mmol na 1 g pPGS w przypadku sieciowania izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu, w temperaturze od 25°C do 70°C w czasie od 3 do 24 godz., korzystnie w temperaturze 50°C w czasie 4 godz. Następnie w temperaturze pokojowej sporządza się mieszaninę składników kompozytu składającą się z pPGS modyfikowanego chemicznie diizocyjanianem izoforonu (pPGS-IDI) lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny (pPGS-LDI) lub izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu (pPGS-ICPTES) w ilości od 70% wag. do 85% wag. w stosunku do całkowitej masy kompozytu, uprzednio otrzymanych znanym sposobem cząstek fosforanów wapnia, w ilości od 15% wag. do 30% wag., dokładnie miesza się substraty i umieszcza je w formie wraz z poroforem. Następnie prowadzi się sieciowanie właściwe matrycy elastomerowej opisanego powyżej kompozytu w temperaturze od 50°C do 90°C, aż do zaniku pasma izocyjanianowego pochodzącego od diizocyjanianu izoforonu lub izocyjanianu 3-(trietoksysililo)propylu lub estru etylowego diizocyjanianu L-lizyny.

Otrzymywanie biokompozytu porowatego według wynalazku polega na opisanych poniżej operacjach prowadzonych w kolejności (etapy):

1. Synteza prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu), znanym sposobem, na drodze reakcji kondensacji kwasu sebacynowego i glicerolu.

2. Synteza cząstek fosforanów wapnia.

2a. synteza nanometrycznego hydroksyapatytu HAP_B znaną metodą mokrego strącenia z soli wodorofosforanu disodu i uwodnionego octanu wapnia w podwyższonej temperaturze lub dwuetapowa synteza cząstek fosforanowo-wapniowych nanoHAP1200 znaną metodą, w której na 1 etapie na drodze mokrego strącania z wodorotlenku wapnia i kwasu ortofosforowego w środowisku alkalicznym uzyskuje się hydroksyapatyt w postaci nanometrycznych cząstek o dużym rozwinięciu powierzchni (nanoHAP), a następnie na 2 etapie cząstki te poddaje się kalcynacji wg znanej metody w temperaturze 1200°C.

2b. w przypadku HAP_B-Lys lub nanoHAP-Lys: kowalencyjna funkcjonalizacja powierzchni cząstek fosforanów wapnia HAP_B lub nanoHAP otrzymanych w etapie 2a znaną metodą modyfikacji powierzchni cząstek hydroksyapatytu 3-aminopropylotrietoksysilanem APTS i w kolejnym etapie reakcji sprzęgania grup aminowych APTS z grupami karboksylowymi L-lizyny z zastosowaniem czynnika sprzęgającego chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i sulfo-N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS) zwiększającego wydajność reakcji prowadzącą do otrzymania HAP_B-Lys w przypadku funkcjonalizacji HAP_B lub nanoHAP-Lys w przypadku funkcjonalizacji nanoHAP.

3. Modyfikacja chemiczna prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) diizocyjanianem izoforonu lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny lub izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu przedstawiona na wzorach 1,2, 3 polegająca na reakcji prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) z diizocyjanianem izoforonu lub izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny prowadzonej w bezwodnym dioksanie w temperaturze od 25°C do 70°C w czasie od 3 do 24 godzin i wydzielenie produktu reakcji przez odparowanie rozpuszczalnika.

4. Przygotowanie roztworu o stężeniu od 15 do 25 %(m/v), korzystnie 20 %(m/v) poli(sebacynianu glicerolu) modyfikowanego chemicznie diizocyjanianem izoforonu lub izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny, otrzymanego w etapie 4, w bezwodnym dioksanie. Do roztworu poli(sebacynianu glicerolu) modyfikowanego chemicznie izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu dodaje się również wodę w ilości 12 mmol na 1 g poli(sebacynianu glicerolu) modyfikowanego chemicznie izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu oraz etanol w ilości 4 mmol na 1 g poli(sebacynianu glicerolu) modyfikowanego chemicznie izocyjanianem 3-(trietoksysiIiIo)propyIu oraz jedną kroplę stężonego kwasu solnego.

5. Dodanie do roztworu przygotowanego w etapie 4 jednego typu cząstek fosforanów wapnia w ilości od 15% wag. do 30% wag. w stosunku do całkowitej suchej masy kompozytu dwuskładnikowego i dokładne wymieszanie układu z wykorzystaniem laboratoryjnego mieszadła magnetycznego.

6. Odważenie do formy porofor w postaci chlorku sodu o uziarnieniu od 200 do 800 μm, korzystnie od 400 do 500 μm, w ilości od 0,6 do 1,3 g na 1 cm³ objętości formy, korzystnie 1 g na 1 cm³ objętości formy, i wprowadzenie do formy dyspersji przygotowanej w etapie 5, w ilości od 0,3 cm³ do 0,7 cm³ dyspersji na 1 cm³ objętości formy, korzystnie 0,5 cm³na 1 cm³ objętości formy.

7. Usunięcie rozpuszczalnika z formy przygotowanej według procedury opisanej w etapie 6 dla poli(sebacynianu glicerolu) modyfikowanego chemicznie izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu, diizocyjanianem izoforonu lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny realizowano poprzez pozostawienie płytki w temperaturze 25°C na 24 godziny. Próbki otrzymane z poli(sebacynianu glicerolu) modyfikowanego chemicznie diizocyjanianem izoforonu lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny następnie zamrożono w temperaturze -20°C w czasie od 5 do 24 h, korzystnie 12 h, i poddano liofilizacji.

8. Sieciowanie właściwe próbek biokompozytu prowadzone w temperaturze 50°C przez 24 godziny i następnie w temperaturze 90°C przez 96 godzin.

9. Usunięcie poroforu z wytworzonych usieciowanych próbek poprzez co najmniej czterokrotne przemycie ich wodą dejonizowaną w ilości co najmniej 1 dm³ na 1 g biokompozytu, przy jednoczesnej kontroli przewodności wody wykorzystywanej do przemywania.

10. Suszenie próbek biokompozytu w suszarce atmosferycznej w temperaturze od 25 do 60°C, korzystnie 40°C, przez co najmniej 24 h.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest w przykładach od 1 do 20, oraz na schematach reakcji sieciowania chemicznego poli(sebacynianu glicerolu) estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny, diizocyjanianem izoforonu i izocyjanianem 3-(trietoksysilylo)propylu na wzorach 1,2, 3 i 4.

Na Figurze 1 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu HAP_B w zakresie cytozgodności (a) względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19, proliferacji (b) komórek hFOB 1.9 w warunkach osteoindukcyjnych, właściwości osteoindukcyjnych produktu względem komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych: ocena produkcji ALP (c) oraz badanie stężenia osteokalcyny (d).

Na Figurze 2 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu nanoHAP w zakresie cytozgodności (a) względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19, proliferacji (b) komórek hFOB 1.9 w warunkach osteoindukcyjnych, właściwości osteoindukcyjnych produktu względem komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych: ocena produkcji ALP (c) oraz badanie stężenia osteokalcyny (d).

Na Figurze 3 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu nanoHAp1200 w zakresie cytozgodności (a) względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19, proliferacji (b) komórek hFOB 1.9 w warunkach osteoindukcyjnych, właściwości osteoindukcyjnych produktu względem komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych: ocena produkcji ALP (c) oraz badanie stężenia osteokalcyny (d).

Na Figurze 4 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-IDI/15HAP_B w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT.

Na Figurze 5 (a) zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-IDI/30HAP_B w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT; (b) reprezentacyjne zdjęcie przedstawiające analizę histologiczną produktu PGS-IDI po 7 dniach od implantacji in vivo w modelu szczurzym w badaniu miejscowej odpowiedzi tkankowej na wszczepienie.

Na Figurze 6 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-IDI/15HAP_B-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT.

Na Figurze 7(a) zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-IDI/30HAP_B-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT; (b) reprezentacyjne zdjęcie przedstawiające analizę histologiczną produktu PGS-IDI po 7 dniach od implantacji in vivo w modelu szczurzym w badaniu miejscowej odpowiedzi tkankowej na wszczepienie.

Na Figurze 8 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-ICEPTES/15HAP_B w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT.

Na Figurze 9 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-ICEPTES/30HAP_B w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT.

Na Figurze 10 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-ICEPTES/15HAP_B-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT.

Na Figurze 11 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-ICEPTES/30HAP_B-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT.

Na Figurze 12 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-LDI/30nanoHAP1200 w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT.

Na Figurze 13 zestawiono charakterystykę biologiczną produktu PGS-LDI/30nanoHAP-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT.

Dokładniejszy opis figur:

Oś Y w przypadku braku: aktywność metaboliczna komórek - % komórek kontrola - aktywność metaboliczna, lub Oś Y B) liczba komórek hFOB.

Figura 1. Charakterystyka biologiczna produktu HAP_B w zakresie cytozgodności (a) względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19, proliferacji (b) komórek hFOB 1.9 w warunkach osteoindukcyjnych, właściwości osteoindukcyjnych produktu względem komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych: ocena produkcji ALP (c) oraz badanie stężenia osteokalcyny (d). Wyniki na wykresie (a) przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT- kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu.

Figura 2. Charakterystyka biologiczna produktu nanoHAP w zakresie cytozgodności (a) względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19, proliferacji (b) komórek hFOB 1.9 w warunkach osteoindukcyjnych, właściwości osteoindukcyjnych produktu względem komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych: ocena produkcji ALP (c) oraz badanie stężenia osteokalcyny (d). Wyniki na wykresie (a) przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu.

Figura 3. Charakterystyka biologiczna produktu nanoHAP1200 w zakresie cytozgodności (a) względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19, proliferacji (b) komórek hFOB 1.9 w warunkach osteoindukcyjnych, właściwości osteoindukcyjnych produktu względem komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych: ocena produkcji ALP (c) oraz badanie stężenia osteokalcyny (d). Wyniki na wykresie (a) przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu.

Figura 4. Charakterystyka biologiczna produktu PGS-IDI/15HAP_B w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym.

Figura 5. a) Charakterystyka biologiczna produktu PGS-IDI/30HAP_B w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym, b) Reprezentacyjne zdjęcie przedstawiające analizę histologiczną produktu PGS-IDI/30HAP_B po 7 dniach od implantacji in vivo w modelu szczurzym w badaniu.

Figura 6. Charakterystyka biologiczna produktu PGS-IDI/15HAP_B-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym.

Figura 7. a) Charakterystyka biologiczna produktu PGS-IDI/30HAP_B-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym, b) Reprezentacyjne zdjęcie przedstawiające analizę histologiczną produktu PGS-IDI/30HAP_B-Lys po 7 dniach od implantacji in vivo w modelu szczurzym w badaniu miejscowej odpowiedzi tkankowej na wszczepienie.

Figura 8. Charakterystyka biologiczna produktu PGS-ICEPTES/15HAP_B w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym.

Figura 9. Charakterystyka biologiczna produktu PGS-ICEPTES/30HAP_B w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym.

Figura 10. Charakterystyka biologiczna produktu PGS-ICEPTES/15HAP_B-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym.

Figura 11. Charakterystyka biologiczna produktu PGS-ICEPTES/30HAP_B-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% Żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT- kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym.

Figura 12. Charakterystyka biologiczna produktu PGS-LDI w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% Żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie stan dardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym.

Figura 13. Charakterystyka biologiczna produktu PGS-LDI/30nanoHAP1200 w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% Żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym.

Figura 14. Charakterystyka biologiczna produktu PGS-LDI/30nanoHAP-Lys w zakresie cytozgodności względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 w teście redukcji MTT. Wyniki przedstawiono w odniesieniu do kontroli przyjętej jako 100% Żywotności. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, n > 3. KT - kontrola traktowana nadtlenkiem wodoru; KNT - kontrola nietraktowana komórek inkubowanych w pożywce bez produktu; R - komórki inkubowane z referencyjnym materiałem biozgodnym.

Przykład 1. Synteza prepolimeru pPGS

Do naczynia reakcyjnego odważona została równomolowa ilość kwasu sebacynowego (65.85 g, 0.3258 mola) oraz gliceryny (30 g, 0.3258 mola). Mieszanina reakcyjna została podgrzana do temperatury 135°C aż to roztopienia się kwasu sebacynowego przy jednoczesnym mieszaniu. Następnie temperatura została obniżona do 130°C i reakcja trwała przez 48 godzin pod ciśnieniem atmosferycznym wraz z ciągłym mieszaniem. Mieszaninę reakcyjną schłodzono i przeniesiono ilościowo do jałowego pojemnika. Produkt syntezy przechowywany w temperaturze 8°C.

Strukturę produktu potwierdzono metodą spektroskopii w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR) oraz metodą protonowego rezonansu magnetycznego ¹H NMR. Właściwości termiczne produktu scharakteryzowano metodą skaningowej kalorymetrii różnicowej (DSC) oraz określono stabilność termiczną metodą termograwimetryczną (TGA).

FT-IR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3436 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH, 2927 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2854 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1733 pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O, 1455 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2,1417 i 1210 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1165 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1097 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH, 1046 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie OH, 945 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym OH w grupie karboksylowej, 724 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2 ¹H NMR ((CD3)2CO), 400 MHz): δ

1.29 (sz.s, 8H, protony w reszcie kwasu sebacynowego w pozycjach C4, C5, C6, C7),

1.57 (sz.s, 4H, protony w reszcie kwasu sebacynowego w pozycji C3 i C8),

2.30 (m, 4H, protony w reszcie kwasu sebacynowego w pozycjach C2 i C9),

3.52 (m, 0.44H, -CH2OH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji a),

3.65 (m, 0.44H, -CH2OH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji β oraz -CH2OH w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a i β),

3.80 (m, 0.22H, -CHOH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji a),

4.07 (m, 2.28H, -CH2O- w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji aoraz protony w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a),

4.30 (m, 1.10H, CH2O- w trójpodstawionej jednostce glicerydowej oraz CH2O- w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a i β),

4.84 (m, 0.025H, CH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji β),

5.04 (m, 0.17H, CH w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a i β),

5.24 (m, 0.19H, CH w trójpodstawionej jednostce glicerydowej).

Wyjaśnienie skrótów: sz.s - szeroki sygnał, m - multiplet

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia prepolimeru pPGS wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas drugiego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60ml/min wynosi -16.6°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 382°C.

Przykład 2. Synteza pPGS-IDI

W kolbie okrągłodennej umieszczono 18.00 g pPGS z przykładu 1, i rozpuszczono w 90 ml bezwodnego 1,4-dioksanu. Następnie, małymi porcjami do roztworu dodano 7.60 ml diizocyjanianu izoforonu. Zawartość kolby ogrzewano w temperaturze 50°C pod chłodnicą zwrotną przez 4 godziny przy ciągłym mieszaniu na mieszadle magnetycznym. Po tym czasie na wyparce rotacyjnej odparowano rozpuszczalnik, uzyskując oleistą ciecz z wydajnością 75%. Strukturę otrzymanego produktu potwierdzono metodą spektroskopii 1H NMR oraz FTIR.

¹H NMR (CD3)2CO, 400 MHz):

0.99 (s), 1.01 (s) i 1.08 (s) (6H, CH3 przy pierścieniu 1,3,3-trimetylocykloheksanowym w pozycji C3),

1.05 (s) i 1.12 (s) (3H, CH3 przy pierścieniu 1,3,3-trimetylocykloheksanowym w pozycji C1),

1.34 (sz.s., 16H, protony w reszcie kwasu sebacynowego w pozycjach C4, C5, C6, C7),

1.62 (sz.s., 8H, protony w reszcie kwasu sebacynowego w pozycjach C3 i C8),

1.19-1.31 (m), 1.50 (m) i 1.53 (m) (4H, CH2 w pierścieniu 1,3,3-trimetylocykloheksanowym w pozycjach C4 i C6)

1.83 (m), 1.96 (m) (2H, CH2 w pierścieniu 1,3,3-trimetylocykloheksanowym w pozycji C2),

2.34 (m, 8H, protony w reszcie kwasu sebacynowego w pozycjach C2 i C9),

3.20 (s) i 3.47 (m) (2H, przy pierścieniu 1,3,3-trimetylocykloheksanowym w pozycji C1)

3.53 (m, 0.88H, -CH2OH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji a),

3.65 (m, 0.88H, -CH2OH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji β oraz -CH2OH w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a i β),

3.85 (m, 0.44H, -CHOH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji a),

3.89 (m) (1H, CH w pierścieniu 1,3,3-trimetylocykloheksanowym w pozycji C5),

4.07 (m, 4.56H, -CH2O- w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji a oraz protony w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a),

4.34 (m, 2.20H, CH2O- w trójpodstawionej jednostce glicerydowej oraz CH2O- w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a i β),

4.88 (m, 0.05H, CH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji β),

5.08 (m, 0.34H, CH w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a i β),

5.28 (m, 0.38H, CH w trójpodstawionej jednostce glicerydowej)

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3338 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH i - NH-, 2957 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2852 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2266 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy - NCO, 1735 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O, 1658 i 1533 - pasma odpowiadające drganiom deformacyjnym w grupie - NH-, 1454 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1417 i 1254 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1168 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1082 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH, 1048 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie OH, 775 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

Przykład 3. Synteza pPGS-ICPTES

Do kolby okrągłodennej naważono 9 g pPGS z przykładu 1, dodano 45 ml bezwodnego 1,4-dioksanu i całość mieszano do całkowitego rozpuszczenia prepolimeru. Następnie zawartość kolby przedmuchano azotem i dodano 36 mmol 3-(trietoksysililo)propyloizocyjanianu. Całość ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 50°C przez 24 godziny. Po tym czasie na wyparce rotacyjnej odparowano rozpuszczalnik. Produkt w postaci oleistej cieczy otrzymano z 90% wydajnością. Strukturę produktu potwierdzono na podstawie widma ¹H NMR i FTIR.

¹H NMR (CD3)2CO, 400 MHz):

0.67 (m, 2H, CH2 w grupie 3-trietoksysililopropylowej w pozycji C3),

1.19 (t, 9H, CH3 w grupie etoksylowej),

1,33 (sz.s., 8H, protony w reszcie kwasu sebacynowego w pozycjach C4, C5, C6, C7),

1.61 (sz.s., 4H, protony w reszcie kwasu sebacynowego w pozycjach C3 i C8),

1.72 (m, 2H, CH2 w grupie 3-trietoksysililopropylowej w pozycji C2),

2.33 (m, 4H, protony w reszcie kwasu sebacynowego w pozycjach C2 i C9),

3.36 (t, 2H, CH2 w grupie 3-trietoksysililopropylowej w pozycji C1),

3.59 (m, 0.44H, -CH2OH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji a),

3.68 (m, 0.44H, -CH2OH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji β oraz -CH2OH w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a i β), 3.81 (m, 6H, CH2 w grupie etoksylowej),

3.85 (m, 0.22H, -CHOH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji a), 4.11 (m, 2.28H, -CH2O- w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji a oraz protony w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a),

4.34 (m, 1.10H, CH2O- w trójpodstawionej jednostce glicerydowej oraz CH2O- w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a i β),

4.87 (m, 0.025H, CH w terminalnej jednostce glicerydowej podstawionej w pozycji β),

5.07 (m, 0.17H, CH w jednostce glicerydowej dwupodstawionej w pozycjach a i β),

5.28 (m, 0.19H, CH w trójpodstawionej jednostce glicerydowej)

8.01 (sz.s., 1H, NH w grupie uretanowej)

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3368 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH, 2929 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2855 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1984 pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom SiO2, 1732 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O, 1456 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1416 i 1240 pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1193 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1097 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH oraz asymetrycznym drganiom SiO2, 774 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

Przykład 4. Synteza pPGS-LDI

5.00g pPGS z przykładu 1 rozpuszczono w 50 ml bezwodnego tetrahydrofuranu. Do roztworu wkroplono 2.02 ml estru etylowego diizocyjanianu L-lizyny. Roztwór reakcyjny mieszano na mieszadle magnetycznym (250 rpm) i ogrzewano w temperaturze 50°C pod chłodnicą zwrotną w atmosferze azotu w czasie 5 h. Następnie na wyparce rotacyjnej odparowano tetrahydrofuran. Produkt w postaci oleistej cieczy uzyskano z wydajnością 100%. Strukturę produktu potwierdzono metodą spektroskopii w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR). Właściwości termiczne produktu scharakteryzowano metodą skaningowej kalorymetrii różnicowej oraz określono stabilność termiczną metodą termograwimetryczną.

FTIR-ATR: Na widmie FTIR-ATR widoczne są pasma przy 3365 cm^-1 oraz 1417 cm^-1 pochodzące od rozciągających i zginających drgań grup -OH. Pasma przy 2950 cm^-1, 2869 cm^-1 i 1456 cm^-1 charakteryzują rozciągające i zginające drgania wiązań C-H zlokalizowanych w łańcuchu głównym PGS. Pasmo o dużej intensywności przy 1723 cm^-1 związane jest z obecnością grupy karbonylowej i jest przesunięte w kierunku niższych liczb falowych w stosunku do widma PGS. Przy 2252 cm^-1 widoczne jest pasmo od drgań rozciągających nieprzereagowanych grup izocyjanianowych estru etylowego diizocyjanianu L-lizyny. Ponadto pojawia się nowe pasmo absorpcyjne przy 1531 cm^-1 tzw. II pasmo amidowe -CO- NH, potwierdzające utworzenie wiązania amidowego w reakcji grupy izocyjanianowej estru etylowego diizocyjanianu L-lizyny z grupą hydroksylową PGS. Dodatkowo obserwuje się pasmo przy 1021 cm^-1 od rozciągających drgań wiązań eterowych C-O-C pochodzące od estru etylowego diizocyjanianu L-lizyny.

TGA: Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, z uwzględnieniem ubytku masy związanym z sieciowaniem termicznym, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 338°C.

Przykład 5. Synteza nanometrycznego hydroksyapatytu HAP_B

HAP_B otrzymano metodą mokrego strącania prowadzoną w temperaturze wrzenia składników. Do kolby trójszyjnej o objętości 500 mL wlano wodę destylowaną oraz Na2HPO4 (0,32 mol/L) i umieszczono na czaszy grzewczej z mieszaniem magnetycznym. Odczyn środowiska doprowadzono do pH o wartości 11 za pomocą dodatku 25% wody amoniakalnej. Po doprowadzeniu układu do wrzenia wkraplano (CH3COO)2Ca (0,128 mol/L) z szybkością 1 kropla/sek. Po zakończeniu wkraplania, zawiesinę mieszano przez godzinę, następnie schłodzono i odstawiono na 24 h do dojrzewania osadu. Po tym czasie osad przemyto dokładnie wodą destylowaną, doprowadzono do neutralnego pH i poddano liofilizacji.

XRD: Analizą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego obrazowano strukturę HAP_B. Otrzymany materiał jest czysty fazowo, a jedyną fazą zidentyfikowaną w promieniach X jest hydroksyapatyt.

PL 249064 Β1

Wynik jest zgodny z fazami wymienionymi w bazie ICDD (nr karty katalogowej 01-080-7085), a refleksy XRD przypisano do struktury heksagonalnej (grupa przestrzenna P63/m) hydroksyapatytu o parametrach sieciowych a = 9,4172 A i c = 6,8799 A.

FTIR: Analiza spektroskopowa HAP_B wykazała obecność grup fosforanowych, o czym świadczą wyraźne pasma w zakresie 550-1016 cm'¹. Charakterystyczne dla hydroksyapatytu intensywne piki związane z asymetrycznymi drganiami rozciągającymi P-O przypisuje się wartościom 960 cm¹ i 1026 cm¹. Szerokie piki dla wartości 2900-3640 cm¹ wskazują na występowanie drgań walencyjnych grupy OH^-, te szerokie pasma absorpcyjne przypisuje się obecności H2O związanego z cząsteczkami HAp. Pasmo w zakresie długości fal od 558 cm¹ do 605 cm¹ związane było z potrójnym zdegenerowanym trybem zginania O-P-O w grupach PO4³·, które zajmują dwa miejsca w sieci krystalicznej. Pasmo obserwowane przy 885 cm¹ odpowiada obecności jonów węglanowych.

Stosunek molowy Ca/P: W oparciu o normy PN-80/C-87015 i on PN-97/R-64803 oznaczono zawartość wapnia i fosforu w proszku HAP_B. Zawartość wapnia wynosi 37,51 ± 0,65 (wt. %), a zawartość fosforu 17,26 ± 0,19 (wt. %). Stosunek molowy Ca/P proszku określono na 1,6795, co świadczy o tym, że otrzymany materiał jest hydroksyaptytem stechiometrycznym.

Badanie powierzchni właściwej i porowatości: Doświadczalne wyznaczono izotermy adsorpcji i desorpcji azotu (77 K) dla HAP_B. Badany proszek ujawnia strukturę mezoporowatą i mi kro porowatą. Profil rozkładu objętości porów wykazuje pojedyncze wąskie piki z maksimum przy 8-12 nm. Parametry fizysorpcyjne charakteryzujące otrzymany proszek ceramiczny HAP_B przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1. Parametry fizysorpcyjne N2 charakteryzujące otrzymany proszek HAP_B.

Proszek ceramiczny	Powierzchnia właściwa [m2/g]	Rozkład wielkości porów [nm]	Wielkości makroporów [cm3/g]	Wielkości mikro porów [m2/g]
HAP_B	53	4, 10, 11, 13	0,345	3,52

DLS i potencjał zeta: Określono rozmiar cząstek HAP_B za pomocą techniki DLS. Przed pomiarem DLS wodną zawiesinę HAP_B poddano działaniu ultradźwięków (T=25°C, 15 minut, 160 W). Zawiesina charakteryzuje się rozkładem bimodalnym. Poddanie roztworu HAP_B ultradźwiękom o mocy 160 W wykazało rozkład wielkości obejmujący zakres 43 nm - 531 nm. Roztwór w tym zawiera w przeważającej części cząsteczki o średnim rozmiarze wynoszącym ok. 86 nm (80%) oraz w mniejszej części cząsteczki o średnim rozmiarze 280 nm (20%).

Określono potencjał zeta równy -21.7 ± 1.33. Potencjał zeta jest ściśle związany z mechanizmem formowania się nowych warstw apatytowych podczas inkubacji w płynach typu SBF. Uzyskano wynik ujemny, a negatywny potencjał zeta został opisany na korzyść oste o integracji, zarodkowania apatytu i regeneracji kości. Uważa się, że ujemne potencjały zeta sprzyjają adsorpcji jonów Ca²⁺, które biorą udział w osadzaniu się macierzy pozakomórkowej niezbędnej do adhezji komórek.

Cytotoksyczność produktu HAP_B badano na poziomie aktywności mitochondrialnej komórek mysich fibroblastów L929 (ATTC) i ludzkich komórek osteoblastów hFOB.1.19 (ATCC) zgodnie z normami ISO 10993-5-2009 przy użyciu testu redukcji MTT po traktowaniu cząstkami HAP_B w stężeniu 1 mg/mL przez 24 godziny. Potencjał proliferacyjny komórek hFOB 1.19 hodowanych w warunkach osteoindukcyjnych (39°C; podłoże różnicujące: DMEM F-12 bez czerwieni fenolowej z 1% dodatkiem surowicy bydlęcej, zawierające genetycynę G148 oraz stymulatory: β-glicerofosforan, kwas askorbinowy, deksametazon, oraz dodatkiem badanego produktu w kolagenie buforowanym HEPES w stężeniu 62,5 mg/mL) z produktem badano po 21 dniach testem CyOuant® opartym na fluorescencyjnym oznaczeniu liczby komórek. Właściwości osteokondukcyjne badanego produktu oceniano po inkubacji z komórkami hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych (39°C; podłoże różnicujące: DMEM F-12 bez czerwieni fenolowej z 1 % dodatkiem surowicy bydlęcej, zawierające genetycynę G148 oraz stymulatory: β-glicerofosforan, kwas askorbinowy, deksametazon, oraz dodatkiem badanego produktu w kolagenie buforowanym HEPES w stężeniu 62.5 mg/mL) w czasie do 21 dni. Właściwości osteokondukcyjne były oceniane na podstawie aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP), będącej wskaźnikiem różnicowania osteogenicznego komórek, formowania kości i mineralizacji matriksu oraz badaniem stężenia, za pomocą testu ELISA, mediatorów rozpuszczalnych tj. osteokalcyny, swoistego markera odpowiedzialnego za mineralizację kości.

Charakterystyka biologiczna HAP_B wykazała następujące właściwości produktu. HAP_B w badanym stężeniu nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Figura 1a). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji z produktem w ilości 1 mg/mL wynosiła odpowiednio 118.3% ± 12.8% oraz 84.4% ± 5.7% co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro. Ponadto produkt w stężeniu 62.5 mg/mL nie wykazuje działania promującego proliferację komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych (Fig. 1b).

W ilości 62.5 mg/mL w warunkach osteoindukcyjnych produkt powodował:

- wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) do poziomu 0.05 ± 0.04 iU/mL po 21 dniach (Fig. 1c);

- wzrost produkcji osteokalcyny (OC) przez komórki hFOB 1.19 w czasie do poziomu 432.6 ± 0.4 pg/mL po 21 dniach inkubacji (Fig. 1d).

Przykład 6. Synteza cząstek nanoHAP

W kolbie kulistej o pojemności 250 mL, przygotowano 0,25 mola Ca(OH)2 dodano 200 mL wody dejonizowanej i umieszczono na mieszadle magnetycznym na 20 min w temperaturze 50°C. W kolbie kulistej o pojemności 100 mL odmierzono 0,15 mola H3PO4 i rozcieńczono go w 50 mL wody dejonizowanej. Tak przygotowany roztwór wkroplono przez 45 min do roztworu Ca(OH)2 umieszczonego na mieszadle magnetycznym pracującym z ciągłym mieszaniem z prędkością 600 obr/min. W trakcie dodawania H3PO4 utrzymywano pH=11 poprzez dodawanie wody amoniakalnej w roztworze 25%, jeśli było to konieczne. Wszystkie etapy reakcji przeprowadzono w temperaturze 50°C. Roztwór mieszano przez dalsze 2 godziny. Po syntezie roztwór odwirowano i produkt przemywano wodą dejonizowaną, aż do uzyskania obojętnego odczynu. Produkt reakcji przeniesiono do naczynia ceramicznego i wysuszono przez 24 godziny w temperaturze 90°C.

SEM/EDS: Mikrostrukturę, wielkość ziaren i analizę składu pierwiastkowego wyznaczono na podstawie obrazowania SEM z analizą EDS. W reakcji uzyskano produkt o jednorodnej strukturze i kulistej morfologii, o wielkości ziaren od 40,9 do 48,8 nm.

XRD: Skład fazowy uzyskanego produktu wyznaczono metodą dyfrakcji promieni Roentgena (XRD). Uzyskany produkt to czysty fazowo hydroksyapatyt.

FTIR: Strukturę chemiczną potwierdzono metodą spektroskopii w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR). Na widmie widoczne są charakterystyczne pasma pochodzące od drgań rozciągających grup hydroksylowych (OH) (3568 cm^-1), pasma pochodzące od asymetrycznych drgań rozciągających wiązań P-O w ugrupowaniach fosforanowych (PO4^3-) (1092 cm^-1, 1033 cm^-1, 962 cm^-1) i pasma pochodzące od drgań zginających wiązań O-P-O ugrupowań fosforanowych (PO4^3-).

(603 cm^-1, 565 cm^-1, 477 cm^-1). Widoczne jest szerokie pasmo przy 3422 cm^-1 pochodzące od wody związanej z cząstkami hydroksyapatytu i pasma pochodzące od drgań zginających H-O-H w wodzie (1634 cm^-1).

BET: Stopień rozwinięcia powierzchni uzyskanych cząstek oceniono poprzez wyznaczenie wielkości powierzchni właściwej metodą BET. Wielkość powierzchni właściwej ziaren wynosi: 80,7 m²/g.

Cytotoksyczność, proliferację oraz właściwości osteokondukcyjne produktu zbadano analogicznie jak w przykładzie 5.

nanoHAP w badanych stężeniach (1, 5, i 10 mg/mL) nie wykazuje właściwości cytotoksyczn ych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 2a). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji z produktem w ilości 1 mg/mL wynosiła odpowiednio 117.5% ± 1.2% oraz 89.5% ± 5.8%, a dla 5 mg/mL, odpowiednio 88.0% ± 1.5% oraz 86.0% ± 8.0%, dla 10 mg/mL, odpowiednio 68.6% ± 6.4% oraz 66,6% ± 6.1%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w stężeniach 1 i 5 mg/ml w testach in vitro.

Ponadto produkt w stężeniu 5 mg/mL nie wykazuje działania promującego proliferację komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych (Fig. 2b). W ilości 5 mg/mL w warunkach osteoindukcyjnych produkt powodował:

- wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) do poziomu 0.8 ± 0.01 iU/mL po 21 dniach (Fig. 2c);

- wzrost produkcji osteokalcyny (OC) przez komórki hFOB 1.19 w czasie do poziomu 346.3 ± 48.8 pg/mL po 21 dniach inkubacji (Fig. 2d).

Przykład 7. Synteza cząstek nanoHAP1200

W kolbie kulistej o pojemności 250 mL, przygotowano 0,25 mola Ca(OH)2. Dodano 200 mL wody dejonizowanej i umieszczono na mieszadle magnetycznym na 20 min w temperaturze 48°C. W kolbie kulistej o pojemności 100 mL odmierzono 0,15 mola H3PO4 i rozcieńczono go w 50 mL wody dejonizowanej. Tak przygotowany roztwór wkroplono przez 45 min do roztworu Ca(OH)2 umieszczonego na mieszadle magnetycznym pracującym z ciągłym mieszaniem z prędkością 800 obr/min. W trakcie dodawania H3PO4 utrzymywano pH=11 poprzez dodawanie wody amoniakalnej w roztworze 25%, jeśli było to konieczne. Wszystkie etapy reakcji przeprowadzono w temperaturze 48°C. Roztwór mieszano przez dalsze 3 godziny. Po syntezie roztwór odwirowano i produkt przemywano wodą dejonizowaną, aż do uzyskania obojętnego odczynu. Produkt reakcji przeniesiono do naczynia ceramicznego i wysuszono przez 24 godziny w temperaturze 90°C. Po wysuszeniu otrzymany produkt poddano procesowi kalcynacji w temp. 1200°C przez 1 godzinę, zgodnie z warunkami kalcynacji: grzanie 10°C/min do 1200°C, utrzymywanie temp. 1200°C przez 1 h, chłodzenie 10°C /min do 20°C, chłodzenie powietrzem w temperaturze pokojowej. Po kalcynacji produkt mielono w celu zupełnego rozkruszenia i uzyskania jednorodnego proszku.

SEM/EDS: Mikrostrukturę, wielkość ziaren i analizę składu pierwiastkowego wyznaczono na podstawie obrazowania SEM z analizą EDS. W reakcji uzyskano produkt o morfologii kulistej i wielkości ziaren w zakresie od 692,4 nm do 958.0 nm.

XRD: Skład fazowy uzyskanego produktu wyznaczono metodą dyfrakcji promieni Roentgena (XRD). Uzyskany produkt fazowo składał się z około 94% hydroksyapatytu i około 6% β-TCP.

FTIR: Strukturę chemiczną potwierdzono metodą spektroskopii w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR). Na widmie FTIR widoczne są charakterystyczne pasma pochodzące od drgań rozciągających grup hydroksylowych (OH^-) (silne pasmo przy 3571 cm^-1, pasma pochodzące od asymetrycznych drgań rozciągających wiązań P-O w ugrupowaniach fosforanowych (PO4^3-) (1091 cm^-1,1048 cm^-1, 961 cm^-1) i pasma pochodzące od drgań zginających wiązań O-P-O ugrupowań fosforanowych (PO4^3-) (601 cm^-1, 570 cm^-1, 438 cm^-1). Widoczne jest też szerokie pasmo przy 3434 cm⁴ pochodzące od wody związanej.

BET: Wielkość powierzchni właściwej wyznaczono metodą BET. Wielkość powierzchni właściwej ziaren wynosi: 0,33 m²/g.

Cytotoksyczność, proliferację oraz właściwości osteokondukcyjne produktu zbadano analogicznie jak w przykładzie 5.

nanoHAP1200 w badanych stężeniach (1,5, i 10 mg/mL) nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 3a). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji z produktem w ilości 1 mg/mL wynosiła odpowiednio 120.4% ± 7.4% oraz 101.9% ± 2.9%, a dla 5 mg/mL, odpowiednio 109.0% ± 3.4% oraz 93.3% ± 9.8%, dla 10 mg/mL, odpowiednio 103.5% ± 9.4% oraz 104.8% ± 6.1%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Ponadto produkt w stężeniu 62.5 mg/mL nie wykazuje działania promującego proliferację komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych (Fig. 3b). W ilości 62.5 mg/mL w warunkach osteoindukcyjnych produkt powodował:

- wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) do poziomu 1.1 ± 0.2 iU/mL po 21 dniach (Fig. 3c);

- wzrost produkcji osteokalcyny (OC) przez komórki hFOB 1.19 w czasie do poziomu 1299.0± 41.0 pg/mL po 21 dniach inkubacji (Fig. 3d).

Przykład 8. Wytwarzanie hydroksyapatytu nanometrycznego kowalencyjnie funkcjonalizowanego L-lizyną (HAP_B-Lys)

Przed modyfikacją hydroksyapatyt HAP_B otrzymany sposobem opisanym w przykładzie 5 wygrzewano w temperaturze 600°C w piecu muflowym w czasie 3 h. W pierwszym etapie modyfikacji 1,5 g hydroksyapatytu HAP_B po wyprażeniu zdyspergowano w 20 ml bezwodnego toluenu. Dyspersję sonikowano w czasie 5 min. (cykl 0,5; amplituda 50%). Następnie do dyspersji wkroplono 2,03 mg 3-amino-propylotrietoksysilanu (APTES) i przedmuchano argonem. Po wkropleniu APTS układ reakcyjny mieszano na mieszadle magnetycznym w temperaturze 130°C w czasie 24 h w atmosferze argonu. Następnie osad odsączono na lejku ze spiekiem ceramicznym i przemywano bezwodnym toluenem (3 razy po 10 ml). Osad suszono 24 h w suszarce próżniowej w temperaturze 100°C. Uzyskano 1,45 g produktu (wydajność 97%). Strukturę produktu pierwszego etapu modyfikacji potwierdzono metodą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera.

FTIR produktu reakcji HAP_B z APTS (ATR, kryształ diamentowy): Na widmie produktu reakcji HAP_B z APTS widoczne są pasma odpowiadające HAP jak i nowe pasma od aminosilanowego (APTES) czynnika modyfikującego. Pasma od HAP_B to pasma absorpcyjne przy 3571 cm^-1 i 630 cm^-1 odpowiadające odpowiednio drganiom rozciągającym i deformacyjnym wiązania O-H w grupach hydroksylowych fazy krystalicznej hydroksyapatytu. Pasmo przy 1088 cm^-1 i silne pasmo przy 1026 cm^-1 odpowiadają drganiom rozciągającym V3 wiązania P-O, przy 963 cm^-1 występuje słabo intensywne pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym vi wiązania P-O. Pasma przy 2929 cm^-1 i 2868 cm^-1 pochodzące od drgań rozciągających (odpowiednio asymetrycznych i symetrycznych) wiązania C-H w grupach -CH2- łańcucha aminopropylowego APTS. Pasmo przy 1571 cm^-1 wskazuje na obecność ugrupowań jonowych -NH3⁺(HCO3)^- utworzonych przez grupy aminowe APTES.

TGA: Ilość prekursora silanowego APTS wprowadzonego na powierzchnię cząstek hydroksyapatytu na podstawie pomiarów termograwimetrycznych, wyznaczona z różnicy całkowitego ubytku masy w temperaturze 900°C pomiędzy niemodyfikowanymi cząstkami HAP_B i produktem I etapu modyfikacji, wynosi 1,50% wag.

W drugim etapie zmodyfikowane APTS cząstki HAP_B poddaje się reakcji z L-lizyną z zastosowaniem czynnika sprzęgającego 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i czynnika zwiększającego wydajność reakcji sprzęgania N-hydroksysulfosukcynimidu (Sulfo - NHS). W tym celu rozpuszcza się w kolbie okrągłodennej 14,8 mg L-lizyny, 17,3 mg EDC, 31,5mg Sulfo- NHS w 10 ml buforu MES (pH 6). Roztwór miesza się na mieszadle magnetycznym 30 min w celu aktywowania grup karboksylowych L-lizyny. Po tym czasie zmodyfikowane APTES cząstki HAP_B (1,45 g) dysperguje się w 20ml buforu MES (pH=6), sonikuje w czasie 5 min (cykl 0,5; amplituda 50%), następnie przenosi się do roztworu L-lizyny, EDC i sulfo - NHS. Całość miesza się przy użyciu mieszadła magnetycznego przez 24 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie zawiesinę poddaje się wirowaniu w celu wydzielenia zmodyfikowanych cząstek, przemywa 3-krotnie buforem MES (pH 6) i suszy się pod próżnią w temperaturze 60°C przez 24 godziny. Otrzymano 1,27 g produktu w postaci białego proszku (wydajność 87%).

FTIR produktu reakcji z L-lizyną: (ATR, kryształ diamentowy): Obecność L-lizyny przyłączonej kowalencyjnie wiązaniem amidowym potwierdza zanik pasma przy 1571 cm^-1 od grup aminowych, oraz obecność na widmie FTIR-ATR charakterystycznego I pasma amidowego przy 1646 cm^-1 od drgań wiązań C=O i II pasma amidowego przy 1457 cm^-1 od drgań deformacyjnych wiązań N-H.

TGA: Na podstawie analizy TGA obliczono zawartości L-lizyny przyłączonej kowalencyjnie do powierzchni HAP_B w produkcie końcowym. Zawartość L-lizyny na powierzchni cząstek HAP_B, obliczona z różnicy pomiędzy całkowitym ubytkiem masy w zakresie 25°C - 900°C dla cząstek HAP_B modyfikowanych APTS i L-lizyną i dla cząstek bioszkła modyfikowanych APTS, wynosi 5,65% wag. Otrzymane cząstki hydroksyapatytu mają zatem 5,65% wag. L-lizyny przyłączonej kowalencyjnie do powierzchni za pośrednictwem APTS.

Przykład 9. Wytwarzanie cząstek nanoHAP kowalencyjnie funkcjonalizowanych L-lizyną (nanoHAP-Lys)

W pierwszym etapie modyfikacji 2,50 g hydroksyapatytu nanoHAP otrzymanego sposobem opisanym w przykładzie 6 zdyspergowano w 20 ml bezwodnego toluenu. Dyspersję sonikowano w czasie 5 min. (cykl 0,5; amplituda 50%). Następnie do dyspersji wkroplono 3,84 mg 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) i przedmuchano argonem. Po wkropleniu APTS układ reakcyjny mieszano na mieszadle magnetycznym w temperaturze 130°C w czasie 24 h w atmosferze argonu. Następnie osad odsączono na lejku ze spiekiem ceramicznym i przemywano bezwodnym toluenem (3 razy po 10 ml). Osad suszono h w suszarce próżniowej w temperaturze 100°C. Uzyskano 2,42 g produktu (wydajność 97%). Strukturę produktu pierwszego etapu modyfikacji potwierdzono metodą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera.

FTIR produktu reakcji nanoHAP z APTS (ATR, kryształ diamentowy): Na widmie produktu reakcji nanoHAP z APTS widoczne są pasma odpowiadające nanoHAP jak i nowe pasma od aminosilanowego (APTES) czynnika modyfikującego. Pasma od nanoHAP to pasma absorpcyjne przy 3567 cm^-1 i 632 cm^-1 odpowiadają odpowiednio drganiom rozciągającym i deformacyjnym wiązania O-H w grupach hydroksylowych fazy krystalicznej hydroksyapatytu. Bardzo słabe i szerokie pasmo absorpcyjne przy ok. 3252 cm^-1 i słabo intensywne pasmo absorpcyjne przy 1602 cm^-1 pochodzą od wody zaadsorbowanej na powierzchni nanoHAP. Pasmo przy 1090 cm^-1 i silne pasmo przy 1026 cm^-1 odpowiadają drganiom rozciągającym v3 wiązania P-O, pasmo przy 602 cm^-1 odpowiada drganiom rozciągającym v4 wiązania P-O, przy 963 cm^-1 występuje słabo intensywne pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym vi wiązania P-O. Widoczne są również słabo intensywne pasma przy 1384 cm^-1 i 1457 cm^-1 odpowiadające resztkowym grupom NO3^2- i CO3^2-. Pasma przy 2926 cm^-1 i 2871 cm^-1 pochodzą od drgań rozciągającym (odpowiednio asymetrycznych i symetrycznych) wiązania C-H w grupach -CH2- łańcucha aminopropylowego APTS. Pasmo przy 1573 cm^-1 wskazuje na obecność ugrupowań jonowych -NH3+(HCO3)^- utworzonych przez grupy aminowe APTES. Ponadto pasmo przy 3252 cm 1 zanika, obniża się intensywność pasma przy 1602 cm^-1, co potwierdza zajście reakcji kondensacji grup OH nanoHAP z grupami etoksylowymi APTES.

TGA: Ilość prekursora silanowego APTS wprowadzonego na powierzchnię cząstek hydroksyapatytu na podstawie pomiarów termograwimetrycznych, wyznaczona z różnicy całkowitego ubytku masy w temperaturze 900°C pomiędzy niemodyfikowanymi cząstkami nanoHAP i produktem I etapu modyfikacji, wynosi 1,45% wag.

W drugim etapie zmodyfikowane APTS cząstki nanoHAP poddaje się reakcji z L-lizyną z zastosowaniem czynnika sprzęgającego 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i czynnika zwiększającego wydajność reakcji sprzęgania N-hydroksysulfosukcynimidu (Sulfo - NHS). W tym celu rozpuszcza się w kolbie okrągłodennej 12,7 mg L-lizyny, 14,8 mg EDC, 27,0 mg Sulfo - NHS w 20 ml buforu MES (pH 6). Roztwór miesza się na mieszadle magnetycznym 30 min w celu aktywowania grup karboksylowych L-lizyny. Po tym czasie zmodyfikowane APTES cząstki nanoHAP (2,42 g) dysperguje się w 20 ml buforu MES (pH=6), sonikuje w czasie 5 min (cykl 0,5; amplituda 50%), następnie przenosi się do roztworu L-lizyny, EDC i sulfo - NHS. Całość miesza się przy użyciu mieszadła magnetycznego przez 24 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie zawiesinę poddaje się wirowaniu w celu wydzielenia zmodyfikowanych cząstek, przemywa 3-krotnie buforem MES (pH 6) i suszy się pod próżnią w temperaturze 60°C przez 24 godziny. Otrzymano 2,14 g produktu w postaci białego proszku (wydajność 88%).

FTIR produktu reakcji z L-lizyną: (ATR, kryształ diamentowy): Obecność L-lizyny przyłączonej kowalencyjnie wiązaniem amidowym potwierdza zanik pasma przy 1573 cm^-1 od grup aminowych i obecność na widmie FTIR-ATR charakterystycznego I pasma amidowego przy 1644 cm^-1 od drgań wiązań C=O.

TGA: Na podstawie analizy TGA obliczono zawartości L-lizyny przyłączonej kowalencyjnie do powierzchni nanoHAP w produkcie końcowym. Zawartość L-lizyny na powierzchni cząstek nanoHAP, obliczona z różnicy pomiędzy całkowitym ubytkiem masy w zakresie 25°C - 900°C dla cząstek nanoHAP modyfikowanych APTS i L-lizyną i dla cząstek nanoHAP modyfikowanych APTS, wynosi 1,60% wag. Otrzymane cząstki hydroksyapatytu mają zatem 1,60% wag. L-lizyny przyłączonej kowalencyjnie do powierzchni za pośrednictwem APTS.

Przykład 10. Wytwarzanie kompozytu porowatego PGS-IDI/15HAP_B

3,00 g produktu opisanego w przykładzie 2 rozpuszczono w 15 ml 1,4-dioksanu. Do roztworu dodano 0.53 g hydroksyapatytu HAP_B opisanym w przykładzie 5 (15% wag. w stosunku do polimeru) i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu. Następnie, do silikonowej płytki 36-dołkowej odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 μm i dodano po 0.75 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny, zamrożono i liofilizowano przez kolejne 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu, w tym celu pianki umieszczono w zlewce z dejonizowaną wodą - proces wypłukiwania soli odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano co godzinę trzy razy, a przy czwartym wymienieniu próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały w postaci pianek PGS-IDI/15HAP_B wysuszono w temperaturze 50°C oraz scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3367 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy-OH i - NH-, 2928 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2855 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1732 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O,1646 i 1537 - pasma odpowiadające drganiom deformacyjnym w grupie - NH-, 1461 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1417 i 1234 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1163 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1089 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH, 1030 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie -OH, 725 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-IDI/15HAP_B wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60ml/min wynosi 11,6°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 325,8°C.

Cytozgodność produktu PGS-IDI/15HAP_B badano na poziomie aktywności mitochondrialnej komórek mysich fibroblastów L929 (ATTC) i ludzkich komórek osteoblastów hFOB.1.19 (ATCC) zgodnie z normami ISO 10993-5-2009 przy użyciu testu redukcji MTT po 24 godzinnej inkubacji z biomateriałem o wielkości 1/10 dna studzienki płytki 96-dołkowej.

Charakterystyka biologiczna PGS-IDI/15HAP_B wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 4). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 104.2% ± 9.1% oraz 96.6% ± 3.7%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Przykład 11. Wytwarzanie porowatego kompozytu PGS-IDI/30HAP_B

3.00 g produktu opisanego w przykładzie 2 rozpuszczono w 15 ml 1,4-dioksanu. Do roztworu dodano 1.29 g hydroksyapatytu HAP_B opisanym w przykładzie 5 (30% wag. w stosunku do polimeru) i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu. Następnie, do silikonowej płytki 36-dołkowej odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 gm i dodano po 0.75 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny, zamrożono i liofilizowano przez kolejne 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu, w tym celu pianki umieszczono w zlewce z dejonizowaną wodą - proces wypłukiwania soli odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano co godzinę trzy razy, a przy czwartym wymienieniu próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały PGS-IDI/30HAP_B w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C.

Materiały scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3368 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH i - NH-, 2928 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2855 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1732 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O,1651 i 1538 - pasma odpowiadające drganiom deformacyjnym w grupie - NH-, 1461- pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1417 i 1235 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1164 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1089 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH, 1030 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie -OH, 724 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-IDI/30HAP_B wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi 23,1°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 313,6°C.

Biozgodność na poziomie in vivo wykonywano stosując model szczurzy w badaniu miejscowej odpowiedzi tkankowej oraz reakcji uogólnionej na wszczepienie produktu według normy PN-EN ISO 10993-6:2017 (zgoda komisji bioetycznej na przeprowadzenie doświadczeń numer ŁB 192_2021). Po implantacji badanego produktu prowadzono obserwację zachowania zwierząt, miejsca wszczepienia, a także wykonano analizę histopatologiczną implantowanego produktu.

Charakterystyka biologiczna PGS-IDI/30HAP_B wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 5a). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 94.8% ± 5.3% oraz 86.1% ± 17.4%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Po wszczepieniu materiału PGS-IDI/30HAP_B do zwierząt nie obserwowano rozwoju stanu zapalnego, a obraz histologiczny implantowanego materiału (Fig. 5b) był normalny. Pojedyncze komórki makrofagowe występujące w polu widzenia napłynęły do miejsca wszczepienia produktu w celu oczyszczenia gromadzącego się płynu pooperacyjnego. Uzyskane wyniki wskazują na biozgodność materiału PGS-IDI/30HAP_B w układzie in vivo.

Przykład 12. Wytwarzanie kompozytu porowatego PGS-IDI/15HAP_B-Lys

4.50 g produktu opisanego w przykładzie 2 rozpuszczono w 22.50 ml 1,4-dioksanu. Do roztworu dodano 0.79 g (15% wag. w stosunku do polimeru) hydroksyapatytu HAP_B kowalencyjnie funkcjonalizowanego L-lizyną, opisanego w przykładzie 8, i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu. Następnie, do silikonowej płytki 36-dołkowej odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 μm i dodano po 0.75 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny, zamrożono i liofilizowano przez kolejne 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu, w tym celu pianki umieszczono w zlewce z dejonizowaną wodą - proces wypłukiwania soli odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano co godzinę trzy razy, a przy czwartym wymienieniu próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały PGS-IDI/15HAP_B-Lys w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C oraz scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3368 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH i - NH-, 2926 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2854 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1732 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O,1651 i 1537 - pasma odpowiadające drganiom deformacyjnym w grupie - NH-, 1457 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1417 i 1235 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1163 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1088 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH, 1030 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie -OH, 724 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-IDI/15HAP_B-Lys wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi 23,4°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 295,9°C.

Cytotozgodność produktu PGS-IDI/15HAP_B-Lys zbadano analogicznie jak w przykładzie 10.

Charakterystyka biologiczna PGS-IDI/15HAP_B-Lys wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 6). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 88.3% ± 3.7% oraz 77.8% ± 3.8%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Przykład 13. Wytwarzanie kompozytu porowatego PGS-IDI/30HAP_B-Lys

4.50 g produktu opisanego w przykładzie 2 rozpuszczono w 22.50 ml 1,4-dioksanu. Do roztworu dodano 1.87 g (30% wag. w stosunku do polimeru) hydroksyapatytu HAP_B kowalencyjnie funkcjonalizowanego L-lizyną, opisanego w przykładzie 8, i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu. Następnie, do silikonowej płytki 36-dołkowej odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 μm i dodano po 0.75 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny, zamrożono i liofilizowano przez kolejne 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu, w tym celu pianki umieszczono w zlewce z dejonizowaną wodą - proces wypłukiwania soli odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano co godzinę trzy razy, a przy czwartym wymienieniu próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały PGS-IDI/30HAP_B-Lys w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C.

Materiały scharakteryzowano przy wykorzystaniu technik FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3368 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy-OH i -NH-, 2925 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2854 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1732 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O,1646 i 1563 - pasma odpowiadające drganiom deformacyjnym w grupie -NH-, 1457 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1417 i 1235 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1163 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1088 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH, 1027 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie -OH, 722 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-IDI/30HAP_B-Lys wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi 27,6°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 310,6°C.

Cytozgodność produktu PGS-IDI/30HAP_B-Lys in vitro zbadano analogicznie jak w przykładzie 10 oraz in vivo analogicznie jak w przykładzie 11.

Charakterystyka biologiczna PGS-IDI/30HAP_B-Lys wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 7a). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 103.0% ± 5.8% oraz 98.9% ± 4.6%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Po wszczepieniu materiału PGS-IDI/30HAP_B-Lys do zwierząt nie obserwowano rozwoju stanu zapalnego, a obraz histologiczny implantowanego materiału (Fig. 7b) był normalny. Nieliczne komórki makrofagowe występujące w polu widzenia napłynęły do miejsca wszczepienia produktu w celu oczyszczenia gromadzącego się płynu pooperacyjnego. Uzyskane wyniki wskazują na biozgodność materiału PGS-IDI/30HAP_B-Lys w układzie in vivo.

Przykład 14. Wytwarzanie kompozytu porowatego PGS-ICEPTES/15HAP_B

Do każdego z dołków sześciokątnej silikonowej płytki 36-dołkowej (średnica pojedynczego otworu: 15 mm, głębokość otworu: 10 mm) odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 μm. 3.00 g produktu opisanego w przykładzie 3 rozpuszczono w 15 ml 1,4-dioksanu, dodano 0.53 g hydroksyapatytu HAP_B opisanego w przykładzie 5 (15% wag. w stosunku do polimeru) i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu. Następnie do mieszaniny wprowadzono kolejno 36 mmol (0.65 g) wody dejonizowanej, 12 mmol (0.55 g) etanolu oraz 1 kroplę stężonego HCI. Całość wymieszano i przeniesiono do płytki 36-dołkowej, umieszczając w pojedynczym dołku wypełnionym poroforem w postaci NaCI 1.5 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu - w tym celu pianki umieszczono w dużej zlewce zawierającej 3 dm³ wody dejonizowanej. Proces wypłukiwania soli z usieciowanych pianek odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano trzykrotnie w odstępie godziny, a po czwartej zmianie wody próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały PGS-ICEPTES/15HAP_B w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C oraz scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3341 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH, 2930 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2856 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1980 pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom SiO2, 1733 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O, 1456 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1416 i 1240 pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1192 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1087 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH oraz asymetrycznym drganiom SiO2, 1027 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie OH oraz asymetrycznym drganiom SiO2, 774 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-ICEPTES/15HAP_B wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi -8,8°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 346,6°C.

Cytozgodność produktu PGS-ICEPTES/15HAP_B zbadano analogicznie jak w przykładzie 10.

Charakterystyka biologiczna PGS-ICEPTES/15HAP_B wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 8). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 111.9% ± 7.3% oraz 102.9% ± 4.7%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Przykład 15. Wytwarzanie kompozytu porowatego PGS-ICEPTES/30HAP_B

Do każdego z dołków sześciokątnej silikonowej płytki 36-dołkowej (średnica pojedynczego otworu: 15 mm, głębokość otworu: 10 mm) odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 gm. 3.00 g produktu opisanego w przykładzie 3 rozpuszczono w 15 ml 1,4-dioksanu, dodano 0.53 g hydroksyapatytu HAP_B opisanego w przykładzie 5 (15% wag. w stosunku do polimeru) i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu. Następnie do mieszaniny wprowadzono kolejno 36 mmol (0.65 g) wody dejonizowanej, 12 mmol (0.55 g) etanolu oraz 1 kroplę stężonego HCI. Całość wymieszano i przeniesiono do płytki 36-dołkowej, umieszczając w pojedynczym dołku wypełnionym poroforem w postaci NaCI 1.5 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu - w tym celu pianki umieszczono w dużej zlewce zawierającej 3 dm³ wody dejonizowanej. Proces wypłukiwania soli z usieciowanych pianek odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano trzykrotnie w odstępie godziny, a po czwartej zmianie wody próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały PGS-ICEPTES/30HAP_B w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C oraz scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3339 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH, 2930 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2856 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1980 pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom SiO2, 1733 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O, 1456 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1416 i 1239 pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1192 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1089 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH oraz asymetrycznym drganiom SiO2, 1027 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie OH oraz asymetrycznym drganiom SiO2, 773 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-ICEPTES/30HAP_B wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi -7,2°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 376,4°C.

Cytozgodność produktu PGS-ICEPTES/30HAP_B zbadano analogicznie jak w przykładzie 10.

Charakterystyka biologiczna PGS-ICEPTES/30HAP_B wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 9). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 98.3% ± 3.4% oraz 106.9% ± 4.5%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Przykład 16. Wytwarzanie kompozytu porowatego PGS-ICPTES/15HAP_B-Lys

Do każdego z dołków sześciokątnej silikonowej płytki 36-dołkowej (średnica pojedynczego otworu: 15 mm, głębokość otworu: 10 mm) odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 μm. 3.00 g produktu opisanego w przykładzie 3 rozpuszczono w 15 ml 1,4-dioksanu, dodano 0.53 g hydroksyapatytu HAP_B kowalencyjnie funkcjonalizowanego L-lizyną, opisanego w przykładzie 8 (15% wag. w stosunku do polimeru) i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu. Następnie do mieszaniny wprowadzono kolejno 36 mmol (0.65 g) wody dejonizowanej, 12 mmol (0.55 g) etanolu oraz 1 kroplę stężonego HCI. Całość wymieszano i przeniesiono do płytki 36-dołkowej, umieszczając w pojedynczym dołku wypełnionym poroforem w postaci NaCI 1.5 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu - w tym celu pianki umieszczono w dużej zlewce zawierającej 3 dm³ wody dejonizowanej. Proces wypłukiwania soli z usieciowanych pianek odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano trzykrotnie w odstępie godziny, a po czwartej zmianie wody próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały PGS-ICPTES/15HAP_B-Lys w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C oraz scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3359 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH, 2929 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2856 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1980 pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom SiO2, 1732 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O, 1456 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1416 i 1239 pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1089 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH oraz asymetrycznym drganiom SiO2, 1028 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie OH oraz asymetrycznym drganiom SiO2, 773 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-ICPTES/15HAP_B-Lys wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi 10,7°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 322,6°C.

Cytozgodność produktu PGS-ICEPTES/15HAP_B-Lys zbadano analogicznie jak w przykładzie 10.

Charakterystyka biologiczna PGS-ICEPTES/15HAP_B-Lys wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 10). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 80.1% ± 3.3% oraz 86.6% ± 5.1%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Przykład 17. Wytwarzanie kompozytu porowatego PGS-ICPTES/30HAP_B-Lys

Do każdego z dołków sześciokątnej silikonowej płytki 36-dołkowej (średnica pojedynczego otworu: 15 mm, głębokość otworu: 10 mm) odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 μm. 3.00 g produktu opisanego w przykładzie 3 rozpuszczono w 15 ml 1,4-dioksanu, dodano 1.29 g hydroksyapatytu HAP_B kowalencyjnie funkcjonalizowanego L-lizyną, opisanego w przykładzie 8 (30% wag. w stosunku do polimeru) i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu. Następnie do mieszaniny wprowadzono kolejno 36 mmol (0.65 g) wody dejonizowanej, 12 mmol (0.55 g) etanolu oraz 1 kroplę stężonego HCI. Całość wymieszano i przeniesiono do płytki 36-dołkowej, umieszczając w pojedyn czym dołku wypełnionym poroforem w postaci NaCI 1.5 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu - w tym celu pianki umieszczono w dużej zlewce zawierającej 3 dm³ wody dejonizowanej. Proces wypłukiwania soli z usieciowanych pianek odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano trzykrotnie w odstępie godziny, a po czwartej zmianie wody próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały PGS-ICPTES/30HAP_B-Lys w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C oraz scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3359 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH, 2929 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2855 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1733 pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O, 1456 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1417 i 1239 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1088 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH oraz asymetrycznym drganiom SiO2,1026 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie OH oraz asymetrycznym drganiom SiO2, 773 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-ICPTES/30HAP_B-Lys wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi 6,8°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 348,4°C.

Cytozgodność produktu PGS-ICEPTES/30HAP_B-Lys zbadano analogicznie jak w przykładzie 10.

Charakterystyka biologiczna PGS-ICEPTES/30HAP_B-Lys wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 11). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 91.1% ± 7.0% oraz 98.4% ± 6.3%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Przykład 18. Wytwarzanie materiału porowatego PGS-LDI

3.00 g produktu opisanego w przykładzie 4 rozpuszczono w 15 ml 1,4-dioksanu. Następnie, do silikonowej płytki 36-dołkowej odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 pm i dodano po 0.75 ml przygotowanego roztworu. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny, zamrożono i liofilizowano przez kolejne 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu, w tym celu pianki umieszczono w zlewce z dejonizowaną wodą - proces wypłukiwania soli odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano co godzinę trzy razy, a przy czwartym wymienieniu próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały PGS-LDI w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C oraz scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FT-IR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3360 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH i - NH-, 2929 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2855 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1732 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O,1659 i 1533 - pasma odpowiadające drganiom deformacyjnym w grupie - NH-, 1456 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1417 i 1236 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1163 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1095 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH, 1026 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie OH, 725 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-LDI wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi 0,7°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 304,8°C.

Cytozgodność produktu PGS-LDI zbadano analogicznie jak w przykładzie 10.

Charakterystyka biologiczna PGS-LDI wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 12). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 89.2% ± 13.0% oraz 91.1% ± 10.0%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Przykład 19. Wytwarzanie kompozytu porowatego PGS-LDI/30nanoHAP1200

3.00 g produktu opisanego w przykładzie 4 rozpuszczono w 15 ml 1,4-dioksanu. Do roztworu dodano 1.29 g cząstek Ca-P nanoHAP1200 opisanych w przykładzie 7 (30% wag. w stosunku do polimeru) i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu. Następnie, do silikonowej płytki 36-dołkowej odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 μm i dodano po 0.75 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny, zamrożono i liofilizowano przez kolejne 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu, w tym celu pianki umieszczono w zlewce z dejonizowaną wodą - proces wypłukiwania soli odbywał się na mieszadle magnetycznym. Wodę zmieniano co godzinę trzy razy, a przy czwartym wymienieniu próbki pozostawiono n a 24 godziny. Otrzymane materiały PGS- LDI/30nanoHAP1200 w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C oraz scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1]): 3365 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH i - NH-, 2929 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2855 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1732 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O,1658 i 1537 - pasma odpowiadające drganiom deformacyjnym w grupie - NH-, 1456 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1417 i 1259 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1163 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1088 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH, 1022 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie -OH, 725 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-LDI/30nanoHAP1200 wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi 14,7°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 335,7°C.

Cytozgodność produktu PGS-LDI/30nanoHAP1200 zbadano analogicznie jak w przykładzie 10.

Charakterystyka biologiczna PGS-LDI/30nanoHAP1200 wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 13). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 93.2% ± 7.8% oraz 78.2% ± 11.8%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Przykład 20. Wytwarzanie kompozytu porowatego PGS-LDI/30nanoHAP-Lys

3.00 g produktu opisanego w przykładzie 4 rozpuszczono w 15 ml 1,4-dioksanu. Do roztworu dodano 1.29 g nanometrycznych cząstek hydroksyapatytu nanoHAP kowalencyjnie funkcjonalizowanych L-lizyną nanoHAP-Lys, opisanych w przykładzie 6 (30% wag. w stosunku do polimeru) i intensywnie mieszano do uzyskania jednorodnego układu.

Następnie, do silikonowej płytki 36-dołkowej odważono po 1.50 g NaCI o uziarnieniu 400-500 μm i dodano po 0.75 ml przygotowanej mieszaniny. Tak przygotowaną płytkę pozostawiono na powietrzu przez 24 godziny, zamrożono i liofilizowano przez kolejne 24 godziny. Po tym czasie rozpoczęto proces sieciowania: w pierwszym etapie próbki wygrzewano w temperaturze 50°C przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 90°C przez kolejne 96 godzin. W kolejnym etapie usunięto chlorek sodu, w tym celu pianki umieszczono w zlewce z dejonizowaną wodą - proces wypłukiwania soli odbywał się na miesza dle magnetycznym. Wodę zmieniano co godzinę trzy razy, a przy czwartym wymienieniu próbki pozostawiono na 24 godziny. Otrzymane materiały PGS-LDI/30nanoHAP-Lys w postaci pianek wysuszono w temperaturze 50°C oraz scharakteryzowano przy wykorzystaniu techniki FTIR, DSC oraz TGA.

FTIR: (ATR, kryształ diamentowy, liczba falowa [cm^-1): 3363 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy -OH i - NH-, 2928 - pasmo odpowiadające asymetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 2855 - pasmo odpowiadające symetrycznym drganiom rozciągającym grupy CH2, 1732 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O,1651 i 1533 - pasma odpowiadające drganiom deformacyjnym w grupie - NH-, 1456 - pasmo odpowiadające drganiom nożycowym w grupie CH2, 1417 i 1257 - pasma odpowiadające drganiom rozciągającym C-O w grupie karboksylowej, 1163 - pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym w grupie -C-O, 1093 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w drugorzędowej grupie OH, 1027 - pasmo odpowiadające drganiom deformacyjnym w pierwszorzędowej grupie -OH, 725 - pasmo odpowiadające drganiom kołyszącym w grupie CH2.

DSC i TGA: Temperatura zeszklenia polimeru w układzie PGS-LDI/30nanoHAP-Lys wyznaczona z krzywej DSC zmierzonej podczas pierwszego ogrzewania próbki z szybkością 10°C/min przy przepływie azotu 60 ml/min wynosi 13,4°C. Temperatura stabilności termicznej polimeru odpowiadająca temperaturze ubytku 10% masy, wyznaczona z krzywej termograwimetrycznej zmierzonej przy szybkości ogrzewania 10°C/min w przepływie azotu 60 ml/min, wynosi 338,3°C.

Cytozgodność produktu PGS-LDI/30nanoHAP-Lys zbadano analogicznie jak w przykładzie 10.

Charakterystyka biologiczna PGS-LDI/30nanoHAP-Lys wykazała, że badany materiał nie wykazuje właściwości cytotoksycznych względem fibroblastów mysich linii L929 oraz osteoblastów ludzkich linii hFOB 1.19, co zostało poparte wynikami żywotności komórek po 24 godzinnej ekspozycji na badany produkt, w teście redukcji MTT wykonanym zgodnie ze stosowną normą ISO 10993:5 2006) (Fig. 14). Żywotność fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 po 24 godzinnej inkubacji wynosiła odpowiednio 87.7% ± 11.4% oraz 85.6% ± 13.5%, co wskazuje na brak działania szkodliwego opracowanego materiału w testach in vitro.

Claims (13)

1. Porowaty kompozyt o właściwościach osteoindukcyjnych do wypełniania ubytków kostnych i regeneracji tkanki kostnej na bazie cząstek fosforanów wapnia i poli(sebacynian glicerolu) sieciowanego chemicznie, znamienny tym, że kompozyt zawiera poli(sebacynian glicerolu) sieciowany chemicznie z zastosowaniem czynnika chemicznego takiego jak ester etylowy diizocyjanianu L-lizyny lub diizocyjanian izoforonu lub izocyjanian 3-(trietoksysilylo)propylu, oraz cząstki fosforanów wapnia jako napełniacz przy czym poli(sebacynianu glicerolu) sieciowanego chemicznie jest od 70% wag. do 85% wag. w stosunku do całkowitej masy dwuskładnikowego kompozytu natomiast cząstek fosforanów wapnia jest w ilości od 15% wag. do 30% wag. w stosunku do całkowitej masy kompozytu dwuskładnikowego.

2. Kompozyt według zastrz. 1, znamienny tym, że napełniacz to hydroksyapatyt w postaci nanometrycznych cząstek „HAP_B” lub nanometryczne cząstki hydroksyapatytowe kowalencyjnie funkcjonalizowane L-lizyną „HAP_B-Lys” lub dwufazowe cząstki Ca-P „nanoHAP1200” lub dwufazowe cząstki Ca-P kowalencyjnie funkcjonalizowane L-lizyną, „nanoHAP-Lys”.

3. Kompozyt według zastrz. 1, znamienny tym, że napełniacz to cząstki fosforanów wapnia wybrane są spośród: niemodyfikowanych powierzchniowo cząstek HAP_B lub nanoHAP1200 lub cząstki fosforanów wapnia modyfikowane kowalencyjnie L-lizyną cząstek „HAP_B-Lys” i „nanoHAP-Lys” zawierające od 1 do 10% wag. L-lizyny w stosunku do całkowitej masy napełniacza.

4. Sposób otrzymywania porowatego kompozytu o właściwościach osteoindukcyjnych do wypełniania ubytków kostnych i regeneracji tkanki kostnej na bazie cząstek fosforanów wapnia i poli(sebacynian glicerolu) sieciowanego chemicznie, znamienny tym, że prowadzi się w pierwszym etapie modyfikację chemiczną prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) pPGS uprzednio otrzymanego znanym sposobem diizocyjanianem izoforonu lub izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny w bezwodnym dioksanie, z zastosowaniem czynnika sieciującego w ilości 2 mmole na 1 g pPGS w przypadku sieciowania diizocyjanianem izoforonu lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny oraz 4 mmol na 1 g pPGS w przypadku sieciowania izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu, w temperaturze od 25°C do 70°C w czasie od 3 do 24 godz., korzystnie w temperaturze 50°C w czasie 4 godz, a następnie w temperaturze pokojowej sporządza się mieszaninę składników kompozytu składającą się z pPGS modyfikowanego chemicznie diizocyjanianem izoforonu (pPGS-IDI) lub estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny (pPGS-LDI) lub izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu (pPGS-ICPTES) w ilości od 70% wag. do 85% wag. w stosunku do całkowitej masy kompozytu, uprzednio otrzymanych znanym sposobem cząstek fosforanów wapnia, w ilości od 15% wag. do 30% wag., dokładnie miesza się substraty i prowadzi się sieciowanie właściwe matrycy elastomerowej opisanego powyżej kompozytu w temperaturze od 50°C do 90°C, aż do zaniku pasma izocyjanianowego pochodzącego od diizocyjanianu izoforonu lub izocyjanianu 3-(trietoksysililo)propylu lub estru etylowego diizocyjanianu L-lizyny.

5. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że modyfikację chemiczną prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) prowadzi się za pomocą estru etylowego diizocyjanianu L-lizyny (LDI) lub diizocyjanianu izoforonu (IDI) lub izocyjanianu 3-(trietoksysilylo)propylu (ICPTES) w bezwodnym dioksanie.

6. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że do modyfikacji chemicznej prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) stosuje się ester etylowy diizocyjanianu L-lizyny (LDI) lub diizocyjanian izoforonu (IDI) w ilości 2 mmole na 1 g pPGS.

7. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że do modyfikacji chemicznej prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) stosuje się izocyjanian 3-(trietoksysilylo)propylu (ICPTES) w ilości 4 mmole na 1 g pPGS.

8. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że modyfikację chemiczną poli(sebacynianu glicerolu) prowadzi się w temperaturze od 25°C do 70°C, w czasie od 3 do 24 godz., korzystnie w temperaturze 50°C w czasie 4 godz.

9. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że produkt reakcji modyfikacji chemicznej prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny (LDI) lub diizocyjanianem izoforonu (IDI) lub izocyjanianem 3-(trietoksysilylo)propylu (ICPTES) rozpuszcza się w bezwodnym dioksanie w celu otrzymania roztworu o stężeniu od 15% (m/v) do 25% (m/v), korzystnie 20% (m/v).

10. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że do roztworu prepolimeru poli(sebacynianu glicerolu) modyfikowanego chemicznie izocyjanianem 3-(trietoksysilylo)propylu (ICPTES) w bezwodnym dioksanie dodaje się bezpośrednio po rozpuszczeniu wodę w ilości 12 mmol na 1 g pPGS modyfikowanego chemicznie izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu oraz etanol w ilości 4 mmol na 1 g pPGS modyfikowanego chemicznie izocyjanianem 3-(trietoksysililo)propylu oraz jedną kroplę stężonego kwasu solnego.

11. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że do roztworu pPGS zmodyfikowanego chemicznie estrem etylowym diizocyjanianu L-lizyny (LDI) lub diizocyjanianem izoforonu (IDI) lub izocyjanianem 3-(trietoksysilylo)propylu (ICPTES) w bezwodnym dioksanie dodaje się cząstki fosforanów wapnia: hydroksyapatytu w postaci nanometrycznych cząstek HAP_B lub nanometryczne cząstki hydroksyapatytowe kowalencyjnie funkcjonalizowane L-lizyną HAP_B-Lys lub dwufazowe cząstki Ca-P nanoHAP1200 lub nanometryczne cząstki hydroksyapatytowe o dużym rozwinięciu powierzchni kowalencyjnie funkcjonalizowane L-lizyną nanoHAP-Lys w ilości od 15% wag. do 30% wag. w stosunku do całkowitej suchej masy dwuskładnikowego kompozytu, korzystnie w ilości 30% wag. w stosunku do całkowitej suchej masy dwuskładnikowego kompozytu.

12. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że jako porofor stosuje się chlorek sodu o uziarnieniu od 200 do 800 gm, korzystnie od 400 do 500 gm.

13. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że prowadzi się sieciowanie właściwe mieszaniny w temperaturze 50°C przez 24 godziny i następnie w temperaturze 90°C przez 96 godzin.