PL249414B1 - Sposób wytwarzania fibryny bogatopłytkowej - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy probówki do wytwarzania fibryny bogatopłytkowej (PRF) zawierającej czynniki wspomagające krzepnięcie krwi, znajdującej zastosowanie w medycynie regeneracyjnej i estetycznej oraz w chirurgii stomatologicznej, która zawiera mieszaninę izolowanego lub rekombinowanego ludzkiego czynnika von Willebranda (VWF) oraz izolowanego lub rekombinowanego ludzkiego czynnika VIII krzepnięcia (FVIII) użytych w proporcji 1 : 1-2. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania fibryny bogatopłytkowej (PRF).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania fibryny bogatopłytkowej, znajdujący zastosowanie w medycynie regeneracyjnej i estetycznej oraz w chirurgii stomatologicznej.

Obecnie w stomatologii rośnie zainteresowanie produktami wspomagającymi gojenie się ran. W ciągu ostatnich kilku lat, stosowanie preparatów płytkowych, samodzielnie lub w połączeniu z innymi biomateriałami okazały się wartościową komponentą regeneracji tkanek twardych i miękkich. W praktyce płytki krwi nie tylko odgrywają kluczową rolę w hemostazie, ale są również niezbędne w procesie gojenia, ponieważ są źródłem czynników wzrostu. Ponadto w ostatniej dekadzie wykazano, że stosowanie autologicznych składników krwi w chirurgii jamy ustnej i ortopedii pozwalają na lepszą i przyspieszoną epitelializację i szybszą waskularyzację tkanki łącznej w miejscach gojenia się ran i zmniejszenia natężenia bólu przebijającego po zabiegu. Opisywano również zdolność kilku kluczowych czynników wzrostu występujących we krwi, w tym PDGF, transformującego czynnika wzrostu beta 1 (TGF-e1) i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w wyższych stężeniach niż w krwi pełnej, sprzyjając w ten sposób modulacji naprawy tkanek i gojenia się ran. Niedawno zaproponowano fibrynę bogatopłytkową (PRF) jako koncentrat płytek krwi uzyskany z pełnej krwi, bez stosowania antykoagulantów, ale ze zmienionym protokołem wirowania. PRF obejmuje tworzenie skrzepu fibryny po odwirowaniu i może być stosowany jako środek regeneracyjny o określonych stężeniach płytek krwi i leukocytów gospodarza, a także autologicznych czynników wzrostu. Fibryna bogatopłytkowa (PRF) została zaproponowana jako autologiczna błona z zaletami akumulacji płytek krwi i leukocytów u gospodarza i akumulacją płytkowych czynników wzrostu. Jednak ograniczenia obejmują właściwości szybszej resorpcji (około 2 tygodnie). Pomimo precyzyjnych algorytmów postępowania obecnie stosowane metody nie są w stanie zagwarantować otrzymania PRF w odpowiedniej ilości i o odpowiedniej jakości w każdym analizowanym przypadku klinicznym. Konwencjonalna technika otrzymywania fibryny bogatopłytkowej została po raz pierwszy opracowana Choukrouna i wsp. z myślą o zastosowaniu w periodontologii, chirurgii stomatologicznej i okołoimplantacyjnej. Sam sposób przygotowania polega na pobraniu krwi żylnej od pacjenta bezpośrednio lub w trakcie zabiegu do probówek bez żadnego antykoagulantu, które niezwłocznie wiruje się z prędkością 2700 obr./min przez 12 minut przy użyciu wirówki stało kątowej lub zmiennokątowej (horyzontalnej). W wyniku wirowania dochodzi do powstania w środkowej części probówki skrzepu fibrynowego. Powyżej znajduje się osocze ubogopłytkowe (PPP - platelet poor plasma), natomiast na dnie probówki znajdują się krwinki czerwone. Istotnym parametrem tej procedury jest czas pobierania krwi i rozpoczęcia jej wirowania. Szybkie rozpoczęcie wirowania po pobraniu krwi jest warunkiem uzyskania klinicznie użytego skrzepu PRF. Jeśli pobieranie krwi i rozpoczęcie wirowanie trwa zbyt długo fibryna będzie polimeryzować samoistnie w probówce w sposób rozproszony, a skrzep krwi będzie miał małą objętość i nieodpowiednią konsystencję. We wszystkich znanych przypadkach klinicznych zastosowania PRF, uwagę zwraca przyśpieszony czas gojenia tkanek z powodu występującej neowaskularyzacji, przyspieszonego zamykania rany z szybszą przebudową tkanek po zabiegu. Fibryna bogatopłytkowa jest koncentratem płytkowym i jednocześnie preparatem immunologicznym gromadzącym na pojedynczej błonie fibrynowej wszystkie składniki krwi sprzyjające gojeniu i wzmagające odporność. Mimo że cytokiny płytkowe i leukocytarne mają znaczny wpływ na cechy biologiczne tego biomateriału, to utrzymująca je matryca fibrynowa z pewnością jest głównym elementem odpowiedzialnym za obserwowane terapeutyczne możliwości PRF.

Wykorzystanie koncentratów płytkowych otrzymywanych z krwi własnej pacjenta (fibryny bogatopłytkowej) w celu usprawnienia i przyspieszenia gojenia tkanek twardych i miękkich oraz ograniczenia bólu pozabiegowego zostało opisane w piśmiennictwie [Platelet-rich plasma and regenerative dentistry. Xu J, Gou L, Zhang P, Li H, Qiu S. Aust Dent J. 2020 Jun;65(2): 131-142. doi:10.1111/adj.12754. Epub 2020 Mar 24.], [An Update on the Protocols and Biologic Actions of Platelet Rich Fibrin in Dentistry. Shah R, M G T, Thomas R, Mehta DS. Eur J Prosthodont Restor Dent. 2017 Jun;25(2):64-72. doi:10.1922/EJPRD_01690Shah09.]. Opracowane zostały różne metody i schematy otrzymywania polegające na zmianie czasu i szybkości wirowania w różnego rodzaju wirówkach (kątowych i horyzontalnych). Różne materiały z jakiego probówki są wykonane jak plastik, szkło czy tytan okazały się mieć wpływ na efektywność otrzymywania PRF jak również modyfikacje temperaturowe przed i po pobraniu krwi. Z dodatkowych substancji stosowane są antykoagulanty kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) oraz cytrynian sodu (CPD), oraz trombina i chlorek wapnia (CaCl2), które są czynnikami stymulującymi krzepnięcie krwi.

Czynnik VIII oraz czynnik von Willebranda jako dodatek w procedurze otrzymywania PRF nie został dotychczas opisany w literaturze. Czynnik von Willebranda (vWF) jest glikoproteiną osocza krwi zbudowaną z multimetrów utworzonych z podjednostek o ciężarze ok. 250 kDa, kodowanych przez gen położony na chromosomie 12. Wielkocząsteczkowe multimetry vWF wspomagają adhezję płytek krwi w miejscu uszkodzenia naczynia krwionośnego poprzez łączenie się z kolagenem i płytkami krwi. vWF łączy się z czynnikiem VIII i stabilizuje go. Czynnik VIII (czynnik antyhemofilowy A, czynnik płytkowy I stanowi element tzw. wewnątrzpochodnego układu - kaskady krzepnięcia). Powstaje w komórkach śródbłonka i wątroby jako nieaktywny proenzym. Jego aktywacja zachodzi pod wpływem trombiny i czynnika Xa. Bierze udział w stabilizowaniu usieciowanej fibryny. Czynnik VIII w krążeniu występuje w kompleksie z czynnikiem von Willebranda. Po podaniu rekombinowanego czynnika VIII następuje zwiększenie aktywności prokoagulacyjnej czynnika VIII w osoczu. Czynnik von Willebranda oraz VIII uzyskiwany jest z puli osocza wielu dawców po uprzednim przebadaniu w kierunku nosicielstwa HBsAg, obecności przeciwciał anty-HCV i przeciwciał anty-HIV. W trakcie przygotowywania koncentratu czynnika VIII stosowane są różne metody (np. inaktywacja cieplna, metody chemiczne) mające na celu inaktywację wirusów i zmniejszenie ryzyka przeniesienia chorób zakaźnych. W ostatnim czasie dostępne są również postacie rekombinowane czynnika VIII.

Stosowany tu termin „krzepnięcie” w odniesieniu do krzepnięcia krwi jest rozumiany w następujący sposób. Aktywacja płytek krwi, a następnie degranulacja i agregacja odgrywają kluczową rolę w krzepnięciu krwi. Koagulacja może być aktywowana przez wewnętrzną lub „kontaktową ścieżkę aktywacji”, która jest inicjowana, gdy czynnik krzepnięcia krwi XII wchodzi w kontakt z ujemnie naładowanymi powierzchniami w reakcji obejmującej kininogen o dużej masie cząsteczkowej i kalikreinę osoczową. FXII można aktywować za pomocą tak zwanych „kontaktowym systemie aktywacji”, - ang. CAS - Contact Activation System. Kaskada krzepnięcia obejmuje szereg, czyli kaskadę reakcji, w których aktywowany jest zymogen, np. przez enzymy wspierane przez kofaktory, aby stać się aktywnym enzymem, który następnie katalizuje następną reakcję w kaskadzie reakcji, ostatecznie prowadząc do powstania skrzepu fibryny, który wzmacnia agregat płytek krwi. Zymogeny są również znane jako czynniki krzepnięcia lub czynniki krzepnięcia.

W wyniku aktywacji krzepnięcia tworzy się skrzep krwi, który jest tu określany jako koagulat. Jest szczególnie rozumiany jako skoagulowana faza krwi, tj. miękka, spójna, galaretowata masa będąca wynikiem konwersji fibrynogenu do fibryny, składająca się głównie z włókien fibrynowych połączonych w celu utworzenia fibrynowego żelu lub skrzepu. Uzyskany koagulat, jak tu opisano, w szczególności zawiera płytki krwi i inne składniki skoagulowanego osocza: erytrocytów, membrany fibrynowej i PPP. W wyniku procesu powstaje trójwarstwowa struktura. Na dnie pozostają krwinki czerwone, zewnętrzna warstwa to ubogokomórkowe serum (PPP - platelet poor plasma). Między tymi warstwami znajduje się PRF, skrzep fibrynowy, z którego powstaje membrana fibrynowa. Klinicznie membrana taka jest bardzo sprężysta, elastyczna i wytrzymała, daje się formować. Koagulat pochodzący z PRP jest szczególnie rozumiany jako fibryna bogato płytkowa (PRF), które mogą w szczególności obejmować zagregowaną fibrynę i krwinki, takie jak płytki krwi, białe krwinki i/lub czerwone krwinki. Należy tutaj rozumieć, że koagulat PRF składa się z dwóch frakcji, frakcji płynnej i frakcji stałej, które można fizycznie oddzielić w celu wyodrębnienia fazy ciekłej i usunięcia masy stałej. Wykrzepianie jest specyficznie aktywowane w odpowiednim pojemniku, takim jak probówka lub inny pojemnik aktywujący skrzep, np. probówka.

Termin „osocze bogatopłytkowe” lub PRP jest tu rozumiany jako objętość osocza, która ma stężenie płytek krwi powyżej linii podstawowej. Prawidłowa liczba płytek krwi w zakresie od 150 000 / mililitr do 350 000 / mililitr. Stężenie płytek krwi jest specyficznie zwiększane przez wirowanie i/lub w inny sposób frakcjonowanie lub oddzielanie frakcji krwinek czerwonych, np. odwirowanie pełnej krwi najpierw przez delikatne wirowanie, takie jak np. 8 min przy 460 g, a następnie stosuje się kożuszek leukocytarny lub dalej granuluje przez twarde wirowanie przy wyższych wartościach g. PRP zazwyczaj obejmuje zwiększone stężenie płytek krwi, które jest około 1,5-20-krotnie większe w porównaniu z krwią żylną. Takie wirowanie i/lub frakcjonowanie oddzieli czerwone krwinki od krwi i dodatkowo oddzieli frakcję bogatopłytkową (PRP), w tym płytki krwi, z krwinkami białymi lub bez nich, razem z kilkoma krwinkami czerwonymi, z osocza ubogiego w płytki. PRP można dalej zagęszczać przez ultrafiltrację, w której zawartość białka w osoczu bogatopłytkowym jest stężona od około 5% do około 20%. PRP można aktywować sposobem opisanym w niniejszym dokumencie, w szczególności przez krzepnięcie, który specyficznie aktywuje płytki krwi zawarte w PRP z dodatkiem egzogennych koagulantów. Niniejszy wynalazek w szczególności zapewnia aktywację PRP, np. tak, że większość płytek krwi jest aktywowana. Zatem co najmniej 50% płytek krwi w PRP jest aktywowanych poprzez aktywację koagulacji. Stosowany tu termin „podawanie” obejmuje drogi wprowadzania lub podawania aktywowanego preparatu, takiego jak frakcja surowicy według wynalazku, pacjentowi potrzebującemu takiego podania według wskazań, pacjenta z niezaburzonym układem krzepnięcia ale również pacjenta z wrodzonym bądź nabytym ilościowym lub jakościowym niedoborem czynnika krzepnięcia VII lub VIII. Preferowanymi drogami podawania PRF/PRP są miejscowe, w tym miejscowe lub na błonę śluzową, lub aplikacja na miejsce rany lub miejsce interwencji (chirurgicznej), miejsce przerwania ciągłości tkanki np. ścięgna, więzadła, mięśnia, skóry, błony śluzowej ale nie tylko. Na przykład za pomocą płynu, sprayu, hydrożelu, kremu lub maści, lub inną dogodną drogą, w tym podawanie ogólnoustrojowe, na przykład zastrzyki, takie jak wstrzyknięcia podskórne lub dostawowe, przez wstrzyknięcie do warstw skóry.

Z polskiego opisu patentowego nr PL168353 B1 znany jest sposób wytwarzania zatężonego, standaryzowanego ludzkiego czynnika von Willebranda o wysokiej czystości, wzbogaconego w multimery o wysokiej, masie cząsteczkowej, który charakteryzuje się tym, że krioprecypitowaną frakcję osocza poddaje się trzem kolejnym etapom chromatografii, przy czym w pierwszych dwóch etapach stosuje się chromatografię jonowymienną na żywicy z polimeru winylowego o dużych porach z przyłączonymi grupami DEAE, a w trzecim etapie stosuje się chromatografię powinowactwa na żelu żelatyna-sefaroza.

W polskim opisie patentowym nr PL164754 B1 ujawniono natomiast sposób wytwarzania koncentratu kompleksu czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda o wysokiej aktywności swoistej przez strącanie zanieczyszczonych białek środkami chemicznymi i chromatografię anionowymienną, charakteryzujący się tym, że pełną plazmę oczyszcza się wstępnie przez podwójne traktowanie chlorkiem baru i wodorotlenkiem glinowym, następnie odsala się przez ultrafiltrację roztworu wobec buforu podstawowego stosowanego w chromatografii opartego na cytrynianie sodowym i chlorku wapniowym z dodatkiem heparyny albo przez chromatografię na kolumnie Sephadex G 50 eluowanej buforem podstawowym używanym w chromatografii z dodatkiem heparyny, a następnie supernatant plazmy z etapu wstępnego oczyszczania nanosi się na kolumnę chromatograficzną wypełnioną żelem żywicy anionowymiennej opartym na polimerze winylowym, do którego wprowadzono grupy funkcyjne dietyloaminoetylowe, trimetyloaminoetylowe lub dimetyloaminoetylowe i kompleks czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda desorbuje się z kolumny przez zwiększenie siły jonowej buforu do 0,27 M chlorku sodowego i ewentualnie oczyszcza się i zatęża białka zawarte w wycieku z kolumny chromatograficznej.

Z europejskiego opisu patentowego nr EP2310043 B1 znana jest kompozycja składająca się z czynnika von Willebranda (vWF) lub FVIII/vWF do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu przypadku krwawienia związanego z trombopatią wywołaną substancjami hamującymi trombocyty, w którym substancją hamującą trombocyty jest inhibitor receptora ADP lub kombinacja inhibitora cyklooksygenazy i inhibitora ADP.

Sposób otrzymywania koncentratu czynnika von Willebranda lub kompleksu czynnik VIII/czynnik von Willebranda pochodzenia ludzkiego lub rekombinowanego ujawniono w patencie europejskim nr EP2078730 B1, który polega na a) otrzymywaniu roztworu czynnika von Willebranda lub kompleksu czynnika VIII/czynnika von Willebranda, zawierającego VWF w stężeniu do 12 j.m. VWF:RCo/ml i proporcję czynnika von Willebranda/czynnika VIII wynoszącą 0,4 lub więcej, b) nanofiltracji roztworu otrzymanego w punkcie a) przez filtr o wielkości porów 20 nanometrów przy ciśnieniu maksymalnym mniejszym lub równym 0,5 bar, w obecności jonów wapnia i w pH większym niż 5,5.

Celem wynalazku było opracowanie nowego rozwiązania w postaci metody wytwarzania fibryny bogatobiałkowej (PRF).

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania fibryny bogatobiałkowej (PRF) charakteryzujący się tym, że

- w pierwszym etapie do probówki dodaje się mieszaninę izolowanego lub rekombinowanego ludzkiego czynnika von Willebranda (VWF) oraz izolowanego ludzkiego lub rekombinowanego czynnika VIII krzepnięcia (FVIII) użytych w proporcji 1:1-2 w postaci zawiesiny w roztworze buforującym lub w postaci proszku,

- w drugim etapie, probówkę poddaje się modyfikacji temperaturowej w zakresie temperatur od +25°C do +45°C, do tak przygotowanej probówki pobiera się krew, przy czym ilość pobranej krwi do ilościowej zawartości mieszaniny izolowanego lub rekombinowanego ludzkiego czynnika von Willebranda (VWF) oraz izolowanego ludzkiego lub rekombinowanego czynnika VIII krzepnięcia (FVIII) wynosi 7-9 ml : 0,1-2,0 ml w postaci zawiesiny i 0,05-0,2 g w postaci proszku.

- w trzecim etapie probówkę zawierającą krew i mieszaninę izolowanego lub rekombinowanego ludzkiego czynnika von Willebranda (VWF) oraz izolowanego ludzkiego lub rekombinowanego czynnika VIII krzepnięcia (FVIII) poddaje się działaniu urządzenia do rozdzielania krwi na frakcje przy użyciu siły odśrodkowej, przy ilości obrotów od 1000 do 4000 rpm oraz w czasie od 1 minuty do 20 minut,

- w czwartym etapie po odwirowaniu otrzymuje się skrzep fibrynowy zawierający fibrynę bogatopłytkową (PRF).

Korzystnie stosuje się probówkę szklaną, plastikową lub tytanową.

Korzystnie, w czwartym etapie jako urządzenie do rozdzielania krwi na frakcje przy użyciu siły odśrodkowej stosuje się wirówkę stałokątową, zmiennokątową (horyzontalną) lub separator komórkowy.

Korzystnie otrzymany skrzep fibrynowy zawierający fibrynę bogatopłytkową (PRF) poddaje się modyfikacji temperaturowej w zakresie temperatury -70°C-0°C.

Otrzymany skrzep zawierający fibrynę bogatopłytkową (PRF) charakteryzuje się większą objętością, zwiększoną wytrzymałością mechaniczną, dłuższym okresem trwania, zmianą stężenia czynników wzrostu oraz czasu ich uwalniania, zawartością i rozkładem komórek krwi w skrzepie fibrynowym.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach realizacji jednocześnie nie ograniczając jego zakresu.

Przykład 1

Do sterylnej szklanej probówki próżniowej zostaje dodana za pomocą strzykawki i igły mieszanina zawierająca izolowany ludzki czynnik von Willebranda oraz izolowany ludzki czynnik VIII użytych w proporcji 1:1 w postaci zawiesiny w roztworze soli buforujących: chlorek sodu, cytrynian sodu, chlorek wapnia, Polisorbat 80 w wodzie do wstrzykiwań w oznaczonej wcześniej ilości 0,5 ml, a następnie równomiernie rozprowadzona. W kolejnym etapie do tak przygotowanej probówki zostaje pobrana krew w ilości 8 ml przy użyciu zestawu igły motylkowej. Probówkę przed pobraniem krwi poddaje się działaniu temperatury +35°C. Następnie probówkę umieszcza się w wirówce stałokątowej z nastawionymi odpowiednimi parametrami wirowania 2700 rpm przez 12 min. Po odwirowaniu otrzymany skrzep fibrynowy zostaje wyciągnięty z probówki odcięty od pozostałego skrzepu zawierającego RBC i zostaje poddany dalszym modyfikacjom jak chłodzenie w temp. -10°C lub zostać bezpośrednio zastosowany w operowanym miejscu.

Przykład 2

Do sterylnej tytanowej probówki próżniowej zostaje dodana za pomocą strzykawki i igły mieszanina zawierająca rekombinowany ludzki czynnik von Willebranda oraz rekombinowany ludzki czynnik VIII użytych w proporcji 1:2 w postaci zawiesiny w roztworze soli buforujących: chlorek sodu, cytrynian sodu, chlorek wapnia, Polisorbat 80 w wodzie do wstrzykiwań w oznaczonej wcześniej ilości 0,1 ml a następnie równomiernie rozprowadzona. W kolejnym etapie do tak przygotowanej probówki zostaje pobrana krew w ilości 7 ml przy użyciu zestawu igły motylkowej. Następnie probówkę umieszcza się w wirówce zmiennokątowej z nastawionymi odpowiednimi parametrami wirowania 2700 rpm przez 5 min. Po odwirowaniu otrzymany skrzep fibrynowy zostaje wyciągnięty z probówki odcięty od pozostałego skrzepu zawierającego RBC i jest przygotowany do bezpośredniego zastosowania w operowanym miejscu.

Przykład 3

Do sterylnej plastikowej probówki próżniowej zostaje dodana mieszanina zawierająca izolowany ludzki czynnik von Willebranda oraz rekombinowany ludzki czynnik VIII użytych w proporcji 1:1,5 w postaci proszku w oznaczonej wcześniej ilości 0,1 g a następnie równomiernie rozprowadzona. W kolejnym etapie do tak przygotowanej probówki zostaje pobrana krew w ilości 8 ml przy użyciu zestawu igły motylkowej. Następnie probówkę umieszcza się w wirówce zmiennokątowej z nastawionymi odpowiednimi parametrami wirowania 1500 rpm przez 5 min. Po odwirowaniu otrzymany skrzep fibrynowy zostaje wyciągnięty z probówki odcięty od pozostałego skrzepu zawierającego RBC i może zostać poddany dalszym modyfikacjom lub zostać bezpośrednio zastosowany w operowanym miejscu.

Przykład 4

Do sterylnej szklanej probówki próżniowej zostaje dodana za pomocą strzykawki i igły mieszanina zawierająca rekombinowany ludzki czynnik von Willebranda oraz izolowany ludzki czynnik VIII użytych w proporcji 1:1 w postaci proszku w oznaczonej wcześniej ilości 0,05 g a następnie równomiernie rozprowadzona. W kolejnym etapie do tak przygotowanej probówki zostaje pobrana krew w ilości 7 ml przy użyciu zestawu igły motylkowej. Następnie probówkę umieszcza się w wirówce zmiennokątowej z nastawionymi odpowiednimi parametrami wirowania 1000 rpm przez 10 min. Po odwirowaniu otrzymany skrzep fibrynowy zostaje wyciągnięty z probówki odcięty od pozostałego skrzepu zawierającego RBC i może zostać poddany dalszym modyfikacjom lub zostać bezpośrednio zastosowany w operowanym miejscu.

Przykład 5

Do sterylnej szklanej probówki próżniowej zostaje dodana za pomocą strzykawki i igły mieszanina zawierająca izolowany ludzki czynnik von Willebranda oraz izolowany ludzki czynnik VIII użytych w proporcji 1:1 w postaci zawiesiny w roztworze soli buforujących: chlorek sodu, cytrynian sodu, chlorek wapnia, Polisorbat 80 w wodzie do wstrzykiwań w oznaczonej wcześniej ilości 2 ml, a następnie równomiernie rozprowadzona. W kolejnym etapie do tak przygotowanej probówki zostaje pobrana krew w ilości 9 ml przy użyciu zestawu igły motylkowej. Probówkę przed pobraniem krwi poddaje się działaniu temperatury +45°C. Następnie probówkę umieszcza się w separatorze zmiennokątowym z nastawionymi odpowiednimi parametrami wirowania 1300 rpm przez 8 min. Po odwirowaniu otrzymany skrzep fibrynowy zostaje wyciągnięty z probówki odcięty od pozostałego skrzepu zawierającego RBC i zostaje poddany dalszym modyfikacjom jak chłodzenie w temp. -70°C lub zostać bezpośrednio zastosowany w operowanym miejscu.

Przykład 6

Do sterylnej tytanowej probówki próżniowej zostaje dodana za pomocą strzykawki i igły mieszanina zawierająca rekombinowany ludzki czynnik von Willebranda oraz izolowany ludzki czynnik VIII użytych w proporcji 1:2 w postaci proszku w oznaczonej wcześniej ilości 0,2 g a następnie równomiernie rozprowadzona. W kolejnym etapie do tak przygotowanej probówki zostaje pobrana krew w ilości 8 ml przy użyciu zestawu igły motylkowej. Następnie probówkę umieszcza się w wirówce zmiennokątowej z nastawionymi odpowiednimi parametrami wirowania 4000 rpm przez 20 min. Po odwirowaniu otrzymany skrzep fibrynowy zostaje wyciągnięty z probówki odcięty od pozostałego skrzepu zawierającego RBC i może zostać poddany dalszym modyfikacjom lub zostać bezpośrednio zastosowany w operowanym miejscu.

Claims (4)

1. Sposób otrzymywania fibryny bogatopłytkowej (PRF), znamienny tym, że

- w pierwszym etapie do probówki dodaje się mieszaninę do wytwarzania fibryny bogatopłytkowej (PRF) zawierającą izolowany lub rekombinowany ludzki czynnik von Willebranda (VWF) oraz izolowany ludzki lub rekombinowany czynnika VIII krzepnięcia (FVIII) użytych w proporcji 1:1-2 w postaci zawiesiny w roztworze buforującym lub w postaci proszku,

- w drugim etapie probówkę poddaje się modyfikacji temperaturowej w zakresie temperatury +25°C - +45°C, do tak przygotowanej probówki wprowadza się pobraną krew, przy czym ilość pobranej krwi do ilościowej zawartości mieszaniny izolowanego lub rekombinowanego ludzkiego czynnika von Willebranda (VWF) oraz izolowanego ludzkiego lub rekombinowanego czynnika VIII krzepnięcia (FVIII) wynosi 7-9 ml : 0,1-2,0 ml w postaci zawiesiny i 0,05-0,2 g w postaci proszku.

- w trzecim etapie probówkę zawierającą krew i mieszaninę izolowanego lub rekombinowanego ludzkiego czynnika von Willebranda (VWF) oraz izolowanego ludzkiego lub rekombinowanego czynnika VIII krzepnięcia (FVIII) poddaje się działaniu urządzenia do rozdzielania krwi na frakcje przy użyciu siły odśrodkowej, przy ilości obrotów od 1000 do 4000 rpm oraz w czasie od 1 minuty do 20 minut.

- w czwartym etapie po odwirowaniu otrzymuje się skrzep fibrynowy zawierający fibrynę bogatopłytkową (PRF).

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się probówkę szklaną, plastikową lub tytanową.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w czwartym etapie jako urządzenie do rozdzielania krwi na frakcje przy użyciu siły odśrodkowej stosuje się wirówkę stałokątową, zmiennokątową (horyzontalną) lub separator komórkowy.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymany skrzep fibrynowy zawierający fibrynę bogatopłytkową (PRF) poddaje się modyfikacji temperaturowej w zakresie temperatury - 70°C- 0°C.