PL249509B1

PL249509B1 - Sposób uzyskania ekstraktów pochodzenia glonowego o wysokim stężeniu antyoksydantów oraz zastosowanie ekstraktów z zielenicy Klebsormidium dissectum w produktach żywnościowych, farmaceutycznych i kosmetycznych

Info

Publication number: PL249509B1
Application number: PL445985A
Authority: PL
Inventors: Michał Adamski
Original assignee: Instytut Botaniki Im. Władysława Szafera Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2023-09-01
Filing date: 2023-09-01
Publication date: 2026-05-04
Also published as: PL445985A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób uzyskania ekstraktów pochodzenia glonowego o wysokim stężeniu antyoksydantów charakteryzujący się tym, że kultywowane w pożywce płynnej komórki glonów Klebsormidium dissectum (zielenicy) oddziela się od pożywki poprzez filtrację próżniową, a następnie filtry umieszcza się w zamrażarce i przetrzymuje w temperaturze -20°C w czasie nie krótszym niż 1 h, po czym wyjmuje z zamrażarki i poddaje działaniu temperatury z zakresu od 19°C do 22°C w czasie nie krótszym niż 1 h i proces ten powtarza jeszcze dwukrotnie do uzyskania zniszczenia błon komórkowych i naruszenia ścian komórkowych glonów, a następnie uzyskany materiał liofilizuje się, po czym łączy z rozpuszczalnikiem w proporcji 1:3 w/w, sonifikuje ultradźwiękami i wytrząsa do całkowitego odbarwienia pozostałości filtrów; uzyskane roztwory wiruje się różnicowo 10 000 x g do oddzielenia frakcji supernatantu od frakcji pelletu, a otrzymany supernatant filtruje się i do momentu wykorzystania przetrzymuje w zamrażarce w temperaturze -20°C. Przedmiotem zgłoszenia jest także zastosowanie ekstraktów z zielenicy w produktach żywnościowych, farmaceutycznych i kosmetycznych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskania ekstraktów pochodzenia glonowego o wysokim stężeniu antyoksydantów oraz zastosowanie ekstraktów z zielenicy Klebsormidium dissectum w produktach żywnościowych, farmaceutycznych i kosmetycznych.

Antyoksydanty, czyli przeciwutleniacze, to związki chemiczne, których głównym zadaniem jest neutralizacja wolnych rodników tlenowych, które w nadmiernym stężeniu w komórkach organizmów żywych powodują wystąpienie tzw. stresu oksydacyjnego (oxidativ stress OS). Wykazano, że w organizmie człowieka OS prowadzi między innymi do przyspieszenia procesów starzenia, rozwoju chorób takich jak: choroby neurodegeneracyjne, cukrzyca, miażdżyca oraz zwiększenia prawdopodobieństwa nowotworzenia, czyli karcynogenezy.

Niektóre związki wykazujące przeciwutleniające właściwości zwane antyoksydantami endogennymi mogą być syntetyzowane wewnątrz organizmu człowieka, natomiast antyoksydanty egzogenne mogą być dostarczane jedynie z pożywieniem. Antyoksydantami endogennymi są między innymi glutation oraz melanina, a egzogennymi - polifenole, których przykładem są flawonoidy, karotenoidy takie jak likopen, luteina czy astaksantyna, a także witaminy takie jak na przykład kwas askorbinowy. Źródłem antyoksydantów egzogennych są przede wszystkim produkty pochodzenia roślinnego, ale także mięso, ryby czy nabiał. Dieta zawierająca odpowiednią ilość antyoksydantów jest kluczowa w zachowaniu prawidłowej odporności, odpowiedniego funkcjonowania poszczególnych narządów i całych układów, a także spowolnieniu procesów starzenia organizmu.

Ze zgłoszenia EP2026759 (A2) znane jest zastosowanie ekstraktów zawierających antyoksydanty pozyskane z sinic do wytwarzania produktów farmaceutycznych i kosmetycznych.

W zgłoszeniu WO2017142906 (A1) ujawniono sposób poprawy odporności i kondycji organizmów ludzkich i zwierzęcych w wyniku podania kompozycji zawierającej biomasę z glonów z rodzaju Klebsormidium.

Patent US11065287 (B2) dotyczy rozwiązania z zakresu stymulacji odporności i odpowiedzi immunologicznej bydła na różnego rodzaju patogeny poprzez działanie preparatami uzyskanymi z biomasy zawierającej glony z rodzaju Klebsormidium. Preparaty te mogą mieć formę iniekcji podskórnej, domięśniowej lub dosutkowej, a także roztworu do nebulizacji.

Istota rozwiązania według pierwszego wynalazku polega na tym, komórki glonów Klebsormidium dissectum, kultywowane w pożywce płynnej, którą jest modyfikowana pożywka BBM, w temperaturze 20 ± 1°C w fitotronie z ustawionym fotoperiodem 12 h dzień/12 h noc i natężeniem promieniowania fotosyntetycznie aktywnego wynoszącym 50 μmol m^-2-s^-1, oddziela się od pożywki poprzez filtrację próżniową, a następnie filtraty umieszcza się w zamrażarce i przetrzymuje w temperaturze -20°C w czasie nie krótszym niż 1 h, po czym wyjmuje z zamrażarki i poddaje działaniu temperatury z zakresu od 19 do 22°C w czasie nie krótszym niż 1 h i proces ten powtarza jeszcze dwukrotnie do uzyskania zniszczenia błon komórkowych i naruszenia ścian komórkowych glonów, a następnie uzyskany materiał liofilizuje się, po czym łączy z rozpuszczalnikiem - wodą lub metanolem - w proporcji 1:3 w/w, sonifikuje ultradźwiękami i wytrząsa do całkowitego odbarwienia pozostałości filtrów; uzyskane roztwory wiruje się różnicowo 10 000 x g do oddzielenia frakcji supernatantu od frakcji pelletu, a otrzymany supernatant filtruje się i do momentu wykorzystania przetrzymuje w zamrażarce w temperaturze -20°C.

Korzystnie modyfikacja pożywki BBM polega na dodaniu 1 mL roztworu wyjściowego witaminy B12 do 1 L pożywki BBM.

Korzystnie filtrację próżniową prowadzi się z wykorzystaniem lejka Buchnera i filtrów GF/C.

W korzystnym wykonaniu do sonifikacji materiału używa się ultradźwięków o częstotliwości od 20 do 40 kHz.

Korzystnie supernatant filtruje się za pomocą filtra strzykawkowego o porowatości wynoszącej 0,45 mikrometrów.

Ekstrakt z zielenicy Klebsormidium dissectum zawierający antyoksydanty otrzymany opisanym powyżej sposobem do zastosowania w produktach żywnościowych.

Korzystnie ekstrakt z zielenicy zawiera antyoksydanty w stężeniu nie mniejszym niż 4 mg/g suchej masy przy ekstrakcji wodą oraz w stężeniu nie mniejszym niż 3 mg/g suchej masy przy ekstrakcji metanolem.

Ekstrakt z zielenicy Klebsormidium dissectum zawierający antyoksydanty otrzymany opisanym powyżej sposobem do zastosowania w produktach farmaceutycznych do utrzymania prawidłowej homeostazy organizmu i stymulacji odporności.

PL 249509 Β1

Ekstrakt z zielenicy Klebsormidium dissectum zawierający antyoksydanty otrzymany opisanym powyżej sposobem do zastosowania w produktach kosmetycznych do spowalniania procesów starzenia skóry.

Glony to organizmy kosmopolityczne, które jako jedne z pierwszych form życia pojawiają się na nowych stanowiskach, nawet tych, na których wcześniej nie istniała żadna biocenoza. Ich wymagania życiowe są relatywnie niewielkie - do przeżycia potrzebują jedynie wody, prostych składników nieorganicznych oraz światła. Jako fotoautotrofy same w procesie fotosyntezy uzyskują związki organiczne, które następnie metabolizują do form, na które w ich komórkach występuje zapotrzebowanie. W warunkach laboratoryjnych, kultywacja glonów jest dużo prostsza w porównaniu do np. upraw mszaków, roślin naczyniowych czy porostów. Kultywacje glonów zajmują mniej miejsca, mogą być prowadzone bez specjalistycznych podłoży, z reguły są także bardziej odporne na zmiany czynników abiotycznych, takich jak natężenie promieniowania fotosyntetyczne aktywnego czy temperatura. Cykle życiowe glonów najczęściej nie są długie, po kilku tygodniach z inokulum można uzyskiwać duże ilości materiału biologicznego. Wykazano wielokrotnie, że glony zdolne są do syntezy wielu cennych w kontekście suplementacji organizmu człowieka substancji, między innymi pełnowartościowych białek, lipidów o potencjale aplikacyjnym czy witamin. Przykładem glonu wpisującego się w powyższą charakterystykę jest zielenica Klebsormidium dissectum. Gatunek ten, w krótkim czasie może zwielokrotnić swoją biomasę, nie wymaga specjalistycznych warunków kultywacji, a stosowane do jego rozwoju pożywki są ekonomicznie korzystne. Co najważniejsze, udowodniono, że glony z rodzaju Klebsormidium cechują się wysoką wartością w kontekście produkcji cennych metabolitów.

W niniejszym rozwiązaniu stosuje się Klebsormidium dissectum jako producenta związków wykazujących wysoki potencjał antyoksydacyjny. Potencjał ten jest porównywalny do najcenniejszych z tego punktu widzenia roślin uprawnych.

Rozwiązanie według wynalazku zostało zilustrowane przykładami wykonania, przedstawionymi poniżej oraz rysunkiem, na którym Fig. 1 przedstawia krzywe kalibracyjne dedykowane kwasowi galusowemu w metodzie Folina-Ciocalteu, Fig. 2 - krzywe kalibracyjne dedykowane kwasowi galusowemu w metodzie FRAP, Fig. 3 - kinetykę reakcji usuwania rodnika DPPH przez związki zawarte w wodnych i metanolowych ekstraktach z komórek Klebsormidium dissectum, Fig. 4 - kinetykę reakcji usuwania rodnika DPPH przez związki zawarte w rozcieńczonym ekstrakcie wodnym z komórek Klebsormidium dissectum, Fig. 5 - kinetykę reakcji usuwania rodnika DPPH przez związki zawarte w rozcieńczonym ekstrakcie metanolowym z komórek Klebsormidium dissectum.

Przykład I

Przedmiotem rozwiązania jest sposób ekstrakcji związków wykazujących właściwości przeciwutleniające z komórek glonów Klebsormidium dissectum. Płynne kultywacje glonów prowadzi się z wykorzystaniem pożywki BBM wzbogaconej witaminą B12. Skład pożywki przedstawiono w tabeli poniżej.

1.	NaNos	10 mL	10,0g/400mL	2,94 mM
2.	CaCI₂+H₂O	10 mL	l,0g/400 mL	0,17 mM
3.	MgSO₄+7H₂O	10 mL	3,0g/400 mL	0,30 mM
4.	K2HPO4	10 mL	3,0g/400 mL	0,43 mM
5.	KH2PO4	10 mL	7,0g/400 mL	1,29 mM
6.	NaCl	10 mL	l,0g/400 mL	0,43 mM
7.	EDTA Stock	1 kropla (0,05 mL)
8.	Iron stock	1 kropla (0,05 mL)
9.	Boroń Stock	1 kropla (0,05 mL)
10.	Bold Tracę Stock	1 kropla (0,05 mL)

Do 1 L pożywki BBM dodaje się 1 mL roztworu wyjściowego witaminy B12 przygotowanego w następujący sposób:

- ustala się pH buforu HEPES na poziomie 7,8,

- do buforu HEPES dodaje się witaminę B12, tak aby jej końcowe stężenie wynosiło 13,5 μg/100 mL i czeka, aż się całkowicie rozpuści,

- roztwór przepuszcza się przez filtr o wielkości porów wynoszącej 0,45 μm, a następnie przechowuje bez dostępu światła w temperaturze 6-10°C.

Kultywacje znajdują się w temperaturze 20 ± 1°C w fitotronie z ustawionym fotoperiodem 12 h dzień/12 h noc i natężeniem promieniowania fotosyntetycznie aktywnego wynoszącym 50 μmol m^-2-s^-1. Po miesięcznym wzroście komórki glonów oddziela się od pożywki za pomocą filtracji próżniowej z wykorzystaniem lejka Buchnera i przy użyciu filtrów GF/C. W kolejnym kroku filtry z materiałem komórkowym układa się na szalkach Petriego, a następnie umieszcza w zamrażarce w temperaturze -20°C na 1 h. Po tym czasie szalki z filtrami umieszcza się w temperaturze pokojowej 21 °C na 1 h. Procedurę zamrażania/rozmrażania powtarza się trzykrotnie, a jej celem jest zniszczenie błon komórkowych oraz naruszenie ścian komórkowych glonów. Uzyskany materiał umieszcza się w klasycznym liofilizatorze celem przeprowadzenia liofilizacji, a następnie poddaje działaniu odpowiedniego rozpuszczalnika wody lub metanolu (100%) w proporcjach 1:3 w/w. Roztwory sonifikuje się ultradźwiękami z częstotliwością 30 kHz i umieszcza na wytrząsarce laboratoryjnej, aż do całkowitego odbarwienia pozostałości filtrów. Następnie roztwory wirowane są różnicowo 10 000 x g przez około 5 min, aż frakcja supernatantu zostaje odizolowana od frakcji pelletu. Uzyskany supernatant filtruje się za pomocą filtra strzykawkowego o porowatości 0,45 mikrometrów. Końcowe roztwory do momentu wykorzystania przetrzymywane są w zamrażarce w temperaturze -20°C. Roztwory przetrzymywane w takiej temperaturze nie tracą właściwości antyoksydacyjnych przez okres trzech miesięcy. Ekstrakty uzyskane niniejszym sposobem mogą znaleźć aplikacyjne zastosowanie jako składniki suplementów diety, wyrobów farmaceutycznych czy kosmetyków.

Przykład II

Zdolności antyoksydacyjne związków zawartych w ekstraktach zweryfikowano za pomocą trzech metod spektrofotometrycznych: Folina-Ciocalteu, FRAP oraz metody z wykorzystaniem syntetycznego rodnika DPPH.

Metoda Folina-Ciocalteu polega na oznaczaniu ogólnej zawartości polifenoli - jednej z głównych składowych roślinnych systemów antyoksydacyjnych. Przyjmuje się, że ilość związków fenolowych jest wprost proporcjonalna do potencjału antyoksydacyjnego próbki. W skład odczynnika F-C wchodzą: wolframian(VI) sodu (Na2WO4), molibdenian(VI) sodu (Na2MoO4), siarczan(VI) litu (U2SO4), woda bromowa oraz stężone kwasy - solny i ortofosforowy. Nadrzędną reakcją jest redukcja przez związki fenolowe molibdenu(VI) do molibdenu(V). Powstający związek do tej pory nie jest zdefiniowany, lecz uważa się, że powstaje heteropolifosfomolibdenianowolframian (PMoWnO4o). W wyniku reakcji następuje zmiana barwy roztworu z żółtej na niebieską. Powstający związek wykazuje maksimum absorbcji przy długości fali 765 nm. Do prawidłowego przeprowadzenia reakcji konieczne jest środowisko alkaliczne o pH 10. W takich warunkach powstaje anion fenolanowy, który jest czynnikiem redukującym. Redukcja molibdenu(VI) zachodzi pod wpływem wszystkich związków fenolowych, niezależnie od ich struktury chemicznej. Metoda FRAP polega na ewaluacji zdolności antyoksydanta do redukowania jonów Fe³⁺ do jonów Fe²⁺, które następnie kompleksowane są przez 2,4,6-tris(2-pirydylo)-1,3,5-triazyn (TPTZ). Powyższej reakcji towarzyszy zmiana barwy roztworu z bezbarwnej na niebieską. Powstały związek kompleksowy Fe²⁺-TPTZ wykazuje maksimum absorbcji przy długości fali 595 nm. W celu określenia potencjału przeciwutleniającego wymagane jest porównanie zmian absorbancji ΔΑ próbki z wartością ΔΑ roztworu wzorcowego Fe(II) zgodnie ze wzorem:

ΔΑ595 nm próbki / ΔΑ595 nm wzorca x wartość FRAP wzorca

Wartość ΔΑ próbki jest wprost proporcjonalna do stężenia antyoksydantów. Uznano, że jednostce FRAP odpowiada zdolność redukcji 1 mola żelaza(III) do żelaza(II).

Metoda z wykorzystaniem syntetycznego rodnika DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl) polega na delokalizacji elektronu dotyczącej całości cząsteczki, a nie jedynie poszczególnych jej grup funkcyjnych. Dzięki temu DPPH nie tworzy dimerów, co występuje powszechnie wśród innych syntetycznych rodników Zredukowany DPPH przybiera charakterystyczną purpurową barwę i wykazuje maksimum absorbcji przy długości fali 517 nm. Według opisanego mechanizmu najprawdopodobniej przebiegają również reakcje w systemach antyoksydacyjnych organizmów żywych. Rolę DPPH pełnią naturalne wolne rodniki, cząsteczkami dostarczającymi wodór są przeciwutleniacze. Wybrane metody są powszechnie używane do oceny potencjału przeciwutleniającego licznych materiałów badawczych m.in. próbek pochodzenia komórkowego oraz tkankowego, a także produktów przeznaczonych do celów spożywczych. Zastosowanie ich do analizy ekstraktów pochodzących z komórek Klebsormidium dissectum umożliwiło kompleksową i wiarygodną ocenę zdolności antyoksydacyjnych związków produkowanych przez ten gatunek.

Przykład III

Zdolności antyoksydacyjne związków wyekstrahowanych z komórek Klebsormidium dissectum zostały odniesione do związków wzorcowych. Wyrażone w ekwiwalencie kwasu galusowego przedstawione na rysunku Fig. 1 całkowite stężenie związków polifenolowych oznaczonych metodą Folina-Ciocalteu wynosiło 3,6 ± 0,7 mg/g suchej masy oraz 2,7 ± 0,6 mg/g suchej masy, odpowiednio dla ekstraktu wodnego oraz metanolowego. Oznaczona zawartość polifenoli jest porównywalna do oszacowanej w ekstraktach wodnych, cenionej jako składnik diety, kapusty białej.

Wysoką aktywność badanych ekstraktów odnotowano także w kontekście redukcji jonów Fe³⁺. Stężenie zawartych w ekstraktach związków redukujących żelazo oznaczone metodą FRAP w ekwiwalencie kwasu galusowego przedstawione na rysunku Fig. 2 wynosiło 0,72 ± 0,06 mg/g suchej masy oraz 0,71 ± 0,06 mg/g suchej masy, odpowiednio dla ekstraktu wodnego i metanolowego. Wartości te są nieco niższe w porównaniu do oznaczanych dla kapusty białej, w której komórkach stężenie analogicznych substancji wynosiło ok. 1 mg/g suchej masy. Badane ekstrakty wykazywały także wysoką efektywność w usuwaniu rodnika DPPH - jego stężenie zmniejszyło się w czasie 30 min o 40% i 26%, odpowiednio dla ekstraktu wodnego i metanolowego co przedstawiono na rysunku Fig. 3.

Nawet trzykrotnie rozcieńczony ekstrakt wodny wciąż zachowywał zdolności usuwania wolnego rodnika, natomiast dla ekstraktu metanolowego nie zaobserwowano podobnej zależności. Kinetyka reakcji usuwania rodnika DPPH przez związki zawarte w rozcieńczonych wodnych i metanolowych ekstraktach z komórek Klebsormidium dissectum przedstawiona została na rysunku Fig. 4 i Fig. 5.

Uzyskane wyniki jednoznacznie wykazały wysoką aktywność antyoksydacyjną związków zawartych w Klebsormidium dissectum. Co więcej, oznaczone różnymi metodami stężenia całkowitej puli przeciwutleniaczy zaświadczyły o ich potencjalnie dużej różnorodności. Związki wyekstrahowane z Klebsormidium dissectum cechują się także dużą efektywnością w usuwaniu wolnych rodników. Porównując niniejsze dane z tymi dostępnymi np. dla roślin cenionych jako komponenty diety, należy stwierdzić, że Klebsormidium dissectum pod względem własności antyoksydacyjnych nie odbiega od nich znacząco. Ekstrakty uzyskane niniejszą metodą mogą znaleźć aplikacyjne zastosowanie jako składniki suplementów diety, wyrobów farmaceutycznych czy kosmetyków.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób uzyskania ekstraktów pochodzenia glonowego o wysokim stężeniu antyoksydantów, znamienny tym, że komórki glonów Klebsormidium dissectum, kultywowane w pożywce płynnej, którą jest modyfikowana pożywka BBM, w temperaturze 20 ± 1°C w fitotronie z ustawionym fotoperiodem 12 h dzień/12 h noc i natężeniem promieniowania fotosyntetycznie aktywnego wynoszącym 50 μmol m^-2-s^-1, oddziela się od pożywki poprzez filtrację próżniową, a następnie filtraty umieszcza się w zamrażarce i przetrzymuje w temperaturze -20°C w czasie nie krótszym niż 1 h, po czym wyjmuje z zamrażarki i poddaje działaniu temperatury z zakresu od 19 do 22°C w czasie nie krótszym niż 1 h i proces ten powtarza jeszcze dwukrotnie do uzyskania zniszczenia błon komórkowych i naruszenia ścian komórkowych glonów, a następnie uzyskany materiał liofilizuje się, po czym łączy z rozpuszczalnikiem - wodą lub metanolem w proporcji 1:3 w/w, sonifikuje ultradźwiękami i wytrząsa do całkowitego odbarwienia pozostałości filtrów; uzyskane roztwory wiruje się różnicowo 10 000 x g do oddzielenia frakcji supernatantu od frakcji pelletu, a otrzymany supernatant filtruje się i do momentu wykorzystania przetrzymuje w zamrażarce w temperaturze -20°C.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikacja pożywki BBM polega na dodaniu 1 mL roztworu wyjściowego witaminy B12 do 1 L pożywki BBM.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że filtrację próżniową prowadzi się z wykorzystaniem lejka Buchnera i filtrów GF/C.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do sonifikacji materiału używa się ultradźwięków o częstotliwości od 20 do 40 kHz.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że supernatant filtruje się za pomocą filtra strzykawkowego o porowatości wynoszącej 0,45 mikrometrów.
6. Ekstrakt z zielenicy Klebsormidium dissectum zawierający antyoksydanty otrzymany sposobem według zastrz. od 1 do 5 do zastosowania w produktach żywnościowych.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że ekstrakt z zielenicy zawiera antyoksydanty w stężeniu nie mniejszym niż 4 mg/g suchej masy przy ekstrakcji wodą oraz w stężeniu nie mniejszym niż 3 mg/g suchej masy przy ekstrakcji metanolem.
8. Ekstrakt z zielenicy Klebsormidium dissectum zawierający antyoksydanty otrzymany sposobem według zastrz. od 1 do 5 do zastosowania w produktach farmaceutycznych do utrzymania prawidłowej homeostazy organizmu i stymulacji odporności.
9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że ekstrakt z zielenicy zawiera antyoksydanty w stężeniu nie mniejszym niż 4 mg/g suchej masy przy ekstrakcji wodą oraz w stężeniu nie mniejszym niż 3 mg/g suchej masy przy ekstrakcji metanolem.
10. Ekstrakt z zielenicy Klebsormidium dissectum zawierający antyoksydanty otrzymany sposobem według zastrz. od 1 o 5 do zastosowania w produktach kosmetycznych do spowalniania procesów starzenia skóry.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że ekstrakt z zielenicy zawiera antyoksydanty w stężeniu nie mniejszym niż 4 mg/g suchej masy przy ekstrakcji wodą oraz w stężeniu nie mniejszym niż 3 mg/g suchej masy przy ekstrakcji metanolem.