PL249690B1 - Hydroksyapatytowa warstwa biobójczo-osteoindukcyjna i sposób wytwarzania takiej warstwy - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest hydroksyapatytowa warstwa biobójczo-osteoindukcyjna naniesiona na podłoże nośne implantu medycznego, składająca się z nanokrystalitów syntetycznego hydroksyapatytu o stosunku molowym wapni do fosforu większym niż 1,55 i mniejszym niż 1,67, charakteryzująca się tym, że jest porowata i powierzchnia właściwa materiału warstwy jest nie mniejsza niż 155 m²/g, syntetyczny hydroksyapatyt tworzący warstwę ma postać ziaren o średnim rozmiarze mierzonym przy pomocy transmisyjnej mkoroskopii elektronowej lub przy pomocy rentgenowskiej dyfrakcji proszkowej XRD nie większym niż 25 nm i nie mniejszym niż 7 nm, poddanych działaniu kawitacji ultradźwiękowej i zawierających od 4 do 6% wagowo wody strukturalnej, zaś grubość warstwy wynosi od 350 nm do 1000 nm. Zgłoszenie obejmuje także sposób wytwarzania hydroksyapatytowej warstwy biobójczo-osteoindukcyjnej.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cienka warstwa hydroksyapatytu pokrywająca powierzchnię implantu medycznego nasycona środkiem biobójczym i sposób wytwarzania takiej warstwy a także implant medyczny z taką warstwą.

Implanty medyczne, zwłaszcza ortopedyczne i dentystyczne są przedmiotem stałych badań i poszukiwań, mających na celu ich ulepszenie. Jednym z nierozwiązanych ciągle problemów są infekcje miejscowe związane z zakażeniem bakteryjnym powierzchni implantu poprzez bakterie takie jak Staphylococcus, Enterobacteriacea i Pseudomonas. Bakterie i patogeny potrafią tworzyć na powierzchni implantu biofilm, co powoduje infekcje, stany zapalne a nawet odrzucenie implantu. Przykładowo bakterie Gram-dodatnie Staphylococcus aureus są zdolne do wytwarzania na implancie biofilmu w ciągu od 18 do 24 godzin od zakażenia nimi. Infekcje miejscowe stanowią ponad 10% przypadków klinicznych powikłań przy wprowadzeniu do organizmu implantu medycznego. Za krytyczne dla powstania biofilmu na powierzchni implantu uznaje się pierwsze parę godzin od jego wszczepienia, maksymalnie pierwsze 24 godziny. W wielu przypadkach, po wszczepieniu implantu wskazane jest zapobiegawcze podawanie antybiotyku przez długi czas. Na rynku są dostępne implanty wydzielające lek długotrwałe, np. gąbki z gentamycyną uwalniającą się przez kilka dni. Rozwiązania te uzyskiwane są poprzez wprowadzenie dużych ilości antybiotyku do implantów, na przykład postaci polimerowych gąbki, warstw ceramicznych, powłok polimerowych albo powłok z nanocząstek tlenku srebra i cynku. W literaturze opisano wiele rozwiązań długotrwałego oddziaływania przeciwbakteryjnego implantu, trwającego od kilku dni do kilku tygodni. Istnieje jednak silna potrzeba zapewnienia implantowi cech antybakteryjnych w czasie pierwszych 24 godzin, co ma uchronić przed infekcjami miejscowymi. Fosforan wapnia, zwłaszcza hydroksyapatyt (HAp) jest stosowany od wielu lat jako materiał do powlekania implantów, gdyż tworzy na nich warstwę o wysokiej biokompatybilności, stymulującą organizm do regeneracji, głównie do odbudowy tkanki k ostnej. Jednakże znane są przypadki, gdy warstwa osteoindukcyjnego i osteointegrującego hydroksyapatytu służy także jako nośnik leków.

W artykule autorstwa Townsenda i wsp. p.t. „Antimicrobial peptide coatings for hydroxyapatite: electrostatic and covalent attachment of antimicrobial peptides to surfaces” [Journal of the Royal Society, Interface, 2017, 14(126), 20160657] opisano implant z podwójną warstwą, o właściwościach osteoindukcyjnych i antybakteryjnych i działającą przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym przez ponad 12 miesięcy. Rolą peptydów antydrobnoustrojowych przyczepionych do HAp jest zahamowanie wzrostu bakterii i tworzenia się biofilmu. W artykule autorstwa Yang i wsp. p.t. „Vancomycin-chitosan composite deposited on post porous hydroxyapatite coated Ti6Al4V implant for drug controlled release”. [Materials Science and Engineering: 2013, C, Vol. 33 (4): 2203-2212] ujawniono elektrochemiczne osadzanie warstwy hydroksyapatytu na tytanowym implancie, a następnie elektrolityczne osadzanie kompozytu wankomycyna-chitozan, w celu zapewnienia temu implantowi efektów antybakteryjnych. Warstwa pokryta hydroksyapatytem ma strukturę porowatą o grubości 7,7 μm, a warstwa antybiotyku ma postać dodatkowej gęstej warstwy o grubości około 3 μm i zawiera go od 150 do 550 μ g/cm². Profile uwalniania wankomycyny wykazały jej gwałtowne uwalnianie w pierwszych godzinach (55%), następnie stałe uwalnianie (20%) przez 5 dni oraz końcowe uwalnianie (25%), trwające ponad 30 dni. Powlekany środkiem bakteriobójczym implant zapewnia działanie przeciwbakteryjne i przeciwzapalne kości, wykazane w badaniach na modelach zwierzęcych.

Publikacja patentowa WO2018/042430A1 i powiązany z nią artykuł autorstwa Geuli i wsp. p.t. „Synthesis, coating, and drug-release of hydroxyapatite nanoparticles loaded with antibiotics” [Journal of Materials Chemistry B, 2017, 5(38), 7819-7830] ujawnia jednoetapową metodę elektroforetycznego osadzania nanocząstek hydroksyapatytu obciążonych lekami na implantach tytanowych. Lek dodawany jest w czasie syntezy hydroksyapatytu, czym sterowana jest morfologia proszku. Średnia wielkość cząstki hydroksyapatytu, przykładowo z lekiem typu ciprofloksacyna (Cip), mierzona metodą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wynosi 40 ± 12 nm. We wspomnianych publikacjach wykazano, że warstwa powlekana zawierała nanocząstki i siarczan gentamycyny (Gs) lub ciprofloksacyną (Cip), w ilości 12,5% i 12,8% wagowych, określonych metodą spektrofotometryczną. Zaprezentowane wyniki badań wykazały przedłużone uwalnianie antybiotyków, trwające do 25 dni dla Gs (25%) i do 10 dni dla Cip.

Dodatkowo 70% Cip uwolniło się w pierwszych 24 godzinach. Testy antybakteryjne in vitro powłok Cip- i Gs -HAp wykazały skuteczne hamowanie rozwoju bakterii Pseudomonas aeruginosa. Zastosowano mikrometryczną powłokę z HAp o grubości od 9,3 do 24,9 μm i chropowatości powierzchni od 0,39 do 2,31 nm (w zależności od zastosowanego antybiotyku).

W publikacji patentowej CN107261202 opisano osadzanie warstwy hydroksyapatytu technikę depozycji (angt: deposition technique) trwającą od 1 do 48 godz., na powierzchni modyfikowanego podłoża tytanowego o strukturze nanorurek. Uzyskano warstwę HAp o grubości od 20 do 1000 nm, którą następnie nasączano roztworem antybiotyku (wankomycyną i/lub gentamycyną). Zawartość leku wynosiła od 0,1 do 0,5 mg/cm² powierzchni podłoża implantu. Wykazano skuteczność antybakteryjną warstwy wobec bakterii Staphylococcus aureus.

W publikacji patentowej CA2432284C ujawniono warstwę powłoki z fosforanu wapnia lub hydroksyapatytu, zawierającą środek leczniczy w postaci antybiotyku. Powłoka hydroksyapatytu powstała w wyniku powlekania od trzech do pięciu razy metalowego implantu poprzez wytrącanie HAp z roztworu wodnego. Grubość powłoki wyniosła około 1 nm dla trzykrotnego powlekania i 20 nm dla powlekania pięciokrotnego. Antybiotyk uwalniał się w ciągu 24 godzin dzięki naturze interakcji pomiędzy antybiotykami a hydroksyapatytem, która polega na fizycznej adsorpcji. Należy zwrócić uwagę, że mikronowe warstwy HAp mają tendencję do pękania.

W publikacji patentowej US9682170B2 ujawniono powlekanie nanocząstkami hydroksyapatytu (50 do 300 nm) oraz innymi nanocząstkami implantów dentystycznych i ortopedycznych o właściwościach antybakteryjnych i osteointegracyjnych.

Do powlekania stosuje się metodę natrysku elektrostatycznego, połączoną z procesem spiekania, którego efektem ubocznym jest rozrost ziarna i utrata wody strukturalnej i powierzchniowej HAp. Finalna grubość wytwarzanych powłok wynosiła od 60 do 200 nm. Mikrostruktura powierzchni ma charakter „wyspowy” , a chropowatość - około 250 nm, z porami o rozmiarach od nano do mikro, w które można wprowadzać leki antybakteryjne lub nanocząstki innych tlenków (np. srebra, cynku). Proces ładowania leku może być uzyskany przez zanurzanie, zatapianie albo osadzanie parowe.

Publikacja patentowa US6730324B2 ujawnia powłoki z HAp i mikrosferami jako nośnikami leków. W procesie zol-żel przez kilkukrotne powlekanie otrzymywana jest porowata warstwa o grubości od 10 do 1000 nm. Stosowano lek ametopteryna (5% wagowych), który może być wprowadzany różnymi sposobami, np. w pory warstwy lub w postaci mikrosfer (10-1000 nm). Pierwsze uwalnianie leku następuje po około 8 godzinach i trwa aż do 60 godzin. Także w publikacji patentowej US006143948A ujawniono powlekanie implantu grubą warstwą o porowatej strukturze i chropowatości powierzchni, techniką osadzania plazmowego. Grubość takiej powłoki wynosi od 1 do 50 nm.

W medycynie znany jest także polieteroeteroketon (PEEK), będący alternatywnym do metali materiałem na implanty medyczne. Charakteryzuje się on wysoką, jak na tworzywo sztuczne, wytrzymałością mechaniczną, wysoką odpornością chemiczną, jest obojętny biologicznie, daje się łatwo obrabiać oraz ma moduł sprężystości o wartości zbliżonej do modułu sprężystości tkanki kostnej. Podobnie jak implanty metalowe, implanty z PEEK także pokrywa się warstwą HAp w celu uzyskania powinowactwa kostnego implantu z tworzywa sztucznego.

W publikacji patentowej US20090276053A1 ujawniono nanoszenie hydroksyapatytu za pomocą natryskiwania plazmowego (ang. plasma spray process) na powierzchnię implantu z PEEK. Otrzymana warstwa hydroksyapatytu ma grubość od 45 do 100 nm i na tyle silnie przywiera do powierzchni PEEK, że zapewnia narastanie lub/i przerost tkanką kostną.

W artykule autorstwa Johanssona i wsp. p.t. „Nanosized Hydroxyapatite Coating on PEEK Implants Enhances Early Bone Formation: A Histological and Three-Dimensional Investigation in Rabbit Bone” [Materials, 2015, 8, 3815-3830] oraz w artykule autorsta Meirelles L i wsp.p.t. „Nano hydroxyapatite structures influence early bone formation” [J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2008; 87:299-307] opisano warstwy HAp zwiększające osteointegrację implantów z PEEK o grubości od 20 do 40 nm. Do wytworzenia warstwy użyto zawiesiny drobin HAp o wielkości 10 nm, w której zanurzono implant, a w następnym etapie pokryty hydroksyapatytem implant poddawano obróbce cieplnej w temperaturze 550°C przez 5 min w atmosferze azotu.

W publikacji patentowej nr RO132032B1 ujawniono ultradźwiękowe wytwarzanie na implancie warstwy antybakteryjnej z nanocząstek srebra i cynku, przy czym nie był to implant z PEEK.

W publikacji Nr WO2016/178174A1 ujawniono kawitacyjne pokrywania implantów kostnych w wyniku zanurzenia podłoża implantu z tworzywa sztucznego w wodnej zawiesinie cząstek hydroksyapatytu, przy czym publikacja ta nie zawiera żadnych wskazówek dotycząc możliwości nasączania takich implantów substancjami leczniczymi.

Dokument PL226891B1 dotyczy sposobu wytwarzania implantu kostnego przez nanoszenie syntetycznego hydroksyapatytu na strukturę nośną implantu z zawiesiny zawierającej ziarna hydroksyapatytu, przy czym w zawiesinie wywołuje się zjawisko kawitacji, korzystnie ultradźwiękowej. Rozwiązanie to prowadzi do uzyskania bioaktywnej warstwy sprzyjającej osteointegracji i regeneracji tkanki kostnej. Dokument ten nie ujawnia jednak warstwy hydroksyapatytowej zawierającej środek biobójczy ani parametrów dotyczących jego adsorpcji i uwalniania. Nie opisuje także wielocyklowego nanoszenia warstwy z malejącą amplitudą drgań sonotrody.

Dokument US6596338B2 dotyczy implantu medycznego pokrytego warstwą fosforanu wapnia, zwłaszcza hydroksyapatytu, która może pełnić funkcję nośnika substancji terapeutycznej, takiej jak antybiotyk. Po wytworzeniu, wysuszeniu i zapakowaniu warstwy, bezpośrednio przed implantacją zwilża się ją wodnym roztworem zawierającym substancję terapeutyczną. Dokument ten nie określa jednak ilości środka terapeutycznego w warstwie ani tempa i stopnia jego uwalniania. Ponadto ujawniona w nim warstwa ma charakter mikrokrystaliczny, podczas gdy w niniejszym zgłoszeniu zastosowano warstwę z nanokryształów hydroksyapatytu o grubości poniżej 1 μm.

Celem wynalazku było uzyskanie cienkiej, czyli o grubości poniżej 1 μm, warstwy hydroksyapatytu na zewnętrznej powierzchni implantu mającej zdolność adsorbowania substancji biobójczych w ilości co najmniej 0,8 mg/cm² powierzchni implantu, a następnie uwolnienia co najmniej 85% zaadsorbowanej ilości tej substancji w miejscu wszczepienia implantu w czasie nie dłuższym niż 24 godziny od momentu wszczepienia.

Cel taki spełnia hydroksyapatytowa warstwa biobójczo-osteoindukcyjna według wynalazku, naniesiona na podłoże nośne implantu medycznego, zawierająca środek biobójczy i składająca się z nanokrystalitów syntetycznego hydroksyapatytu o stosunku molowym wapnia do fosforu większym niż 1,55 i mniejszym niż 1,67. Warstwa ta charakteryzuje się tym, że jest porowata a powierzchnia właściwa jej materiału jest nie mniejsza niż 155 m²/g. Syntetyczny hydroksyapatyt tworzący warstwę ma postać ziaren o średnim rozmiarze, mierzonym przy pomocy transmisyjnej mikroskopii elektronowej lub przy pomocy rentgenowskiej dyfrakcji proszkowej XRD, nie większym niż 25 nm i nie mniejszym niż 7 nm. Hydrosyapatyt ten poddany jest działaniu kawitacji ultradźwiękowej i zawiera od 4 do 6% wagowo wody strukturalnej. Grubość warstwy wynosi od 350 nm do 1000 nm. Środek biobójczy jest antybiotykiem beta-laktamowym aktywnym wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych i wypełnia pory warstwy hydroksyapatytowej w ilości nie mniejszej niż 0,8 mg na jeden cm² powierzchni podłoża nośnego implantu.

W kolejnym wariancie warstwy według wynalazku środkiem biobójczym jest cefalosporyny II generacji.

W innym wariancie warstwy według wynalazku materiałem jej struktury nośnej jest polieteroeteroketon.

Warstwa według wynalazku może być wykonana według dowolnego z wariantów sposobu według wynalazku.

Sposób wytwarzania hydroksyapatytowej warstwy biobójczo-osteoindukcyjnej, polega na nanoszeniu syntetycznego hydroksyapatytu na podłoże nośne w wyniku zanurzenia i unieruchomienia tego podłoża w zawiesinie. Zawiesinę stanowi ciekła faza rozpraszająca, korzystnie woda, oraz faza rozpraszana w postaci ziaren o średnim rozmiarze nie większym niż 30 nm z syntetycznego hydroksyapatytu o stosunku molowym wapnia do fosforu większym niż 1,55 i mniejszym niż 1,67, a następnie wywołaniu zjawiska kawitacji w części zawiesiny kontaktującej się z podłożem nośnym, udział wagowy fazy rozpraszanej w zawiesinie wynosi od 0,01% do 2%. Stan kawitacji wywołuje się przy pomocy sonotrody zanurzanej w zawiesinie w pobliżu struktury nośnej i mającej powierzchnię czołową wprawianą w drgania o częstotliwości z zakresu od 18 kHz do 40 kHz, przy czym przy w trakcie wytwarzani a stanu kawitacji odległość powierzchni podłoża nośnego wynosi nie więcej niż 200% średnicy jej powierzchni czołowej.

Proces nanoszenia ziaren hydroksyapatytu zawiera co najmniej trzy następujące po sobie cykle, z których każdy składa się z przygotowania świeżej zawiesiny hydroksyapatytu, kawitacyjnego oddziaływania tą zawiesiną na strukturę nośną w niej zanurzoną oraz suszenia, przy czym w każdym kolejnym cyklu amplituda drgań powierzchni czołowej sonotrody jest mniejsza niż amplituda jej drgań w cyklu bezpośrednio poprzedzającym, przy czym okres trwania kawitacji w każdym kolejnym cyklu jest nie dłuższym niż okres tej kawitacji w cyklu bezpośrednio go poprzedzającym.

W pierwszym cyklu stosuje się amplitudę drgań powierzchni czołowej sonotrody wynoszącą 75% amplitudy odniesienia, w drugim cyklu amplituda drgań wynosi 65% wspomnianej amplitudy odniesienia, a w trzecim, czwartym i piątym cyklu stosuje się amplitudę drgań wynosząca 55% amplitudy odniesienia, przy czym warstwę naniesioną na strukturę nośną implantu nasyca się roztworem wodnym antybiotyku a następnie suszy.

W jednym z wariantów sposobu według wynalazku okres trwania stanu kawitacji w każdym cyklu nie przekracza 6 minut.

W kolejnym wariancie sposobu według wynalazku stosuje się sonotrodę o regulowanej amplitudzie drgań.

W jednym z wariantów sposobu według wynalazku temperatura zawiesiny nie przekracza 40°C.

W innym wariancie sposoby według wynalazku jako antybiotyk stosuje się sól cefuroksymu.

W jeszcze innym wariancie sposobu według wynalazku sól cefuroksymu stosuje się w postaci roztworu o stężeniu 45 mg/ml o kwaśnym odczynie, wynoszącym pH 5.

Implant z warstwą według wynalazku, mimo grubości powłoki HAp poniżej 1 μm może zaadsorbować nawet ponad 1 mg substancji biobójczej na 1 cm², czyli ponad dwukrotnie więcej niż mogą tego dokonać znane implanty o znacznie grubszym pokryciu hydroksyapatytem. Materiał podłoża implantu daje się łatwo kształtować, a dzięki małej grubości warstwy HAp nie odpada ona podczas manipulacji implantem podczas jego wszczepiania, np. w wyniku przycinania i/lub zginania. Do wytworzenia warstwy hydroksyapatytu nie są potrzebne żadne toksyczne odczynniki, niezbędne w znanych technologiach, wymagających specjalnych aktywatorów, stabilizatorów itp. Uzyskana powłoka według wynalazku daje możliwość szybkiego (w ciągu kilku godzin) dostarczenia w okolice wszczepienia implantu dużej ilości antybiotyku, przy czym pozostający po tym okresie w powłoce antybiotyk, w ilości od 4 do 15% pierwotnej jego ilości (od 40 do 140 μm na 1 cm² powierzchni podłoża) zapewnia nawet w dłuższym czasie zachowania jego stężenia wyższego niż minimalne stężenie hamujące (ang. Minimum inhibitory concentration - MIC), co jest zjawiskiem nie spotykanym w znanych rozwiązaniach. Powłoka według wynalazku może być stosowana doładowania implantu różnymi lekami rozpuszczalnymi w wodzie, bez żadnych ograniczeń, np. takich jak wrażliwość na temperaturę. Mimo tak wysokiej zawartości substancji leczniczej w powłoce nie wpływa ona negatywnie na właściwości osteoindukcyjne i o steointegracyjne pokrycia hydroksyapatytem.

Wynalazek zostanie bardziej szczegółowo przedstawiony w poniższych przykładach realizacji. W przykładach tych użyto dwóch hydroksyapatytowych nanoproszków o nazwie handlowej GoHAP 1 i GoHAP 3, mających następujące właściwości:

- proszek GoHAP 1: cząstki tego nanoproszku mają ziarna o rozmiarze 8 ± 1 nm, powierzchnię właściwą wynoszącą 250 ± 25 m²/g i gęstość 2,87 ± 0,02 g/cm³,

- proszek GoHAP 3: cząstki tego nanoproszku mają ziarna o rozmiarze 15 ± 1 nm, powierzchnię właściwą 140 ± 14 m²/g i gęstość 2,94 ± 0,02 g/cm³ oraz zawierają od 4 do 6% wagowo wody strukturalnej.

Średnią wielkość ziarna w obu tych nanoproszkach wyznaczono metodą elektronowej mikroskopii transmisyjnej (TEM) lub pośrednio z gęstości i powierzchni właściwej, (ang: specific surface area - SSA) gdzie średnią wielkość ziarna obliczano na podstawie SSA i gęstości, przy założeniu, że wszystkie cząstki HAP mają kształt kulisty i są identyczne. Gęstość nanoproszków wyznaczono za pomocą piknometru helowego (AccuPyc I11340, Micromeritics), w temperaturze 24 ± 2°C, zgodnie z normą ISO 12154:2014, zaś ich powierzchnię właściwą wyznaczono metodą analizy izotermy BET za pomocą urządzenia Gemini 2360 firmy Micromeritics zgodnie z normą ISO 9277:2010. Przed wykonaniem pomiarów gęstości i SSA proszki suszono w temperaturze 150°C przez 2 godziny w stałym przepływie helu w stacji desorpcyjnej FlowPrep 060 firmy Micromeritics.

Jako strukturę nośną implantów stosowano kwadratowe płytki z polieteroeteroketon u (PEEK) o rozmiarach 1 x 1 cm i grubości 2 mm. Przed rozpoczęciem procesu pokrywania hydroksyapatytem powierzchnię każdej takiej płytki przepłukano etanolem w łaźni wodnej przez 15 minut przy użyciu płuczki ultradźwiękowej. Źródłem hydroksyapatytu była wodna zawiesina jednego z opisanych wyżej nanoproszków, przy czym udział fazy rozpraszanej w całości przygotowanej zawiesiny wynosił

0,1% wagowych. Podłoże implantu było pokrywane cząstkami hydrosyapatytu zgodnie z technologią ujawnioną w publikacji WO2016/178174A1, to jest poprzez zanurzenie i nieruchomienie podłoża w przygotowanej zawiesinie i poddanie go działaniu fali ultradźwiękowej o częstotliwości 20 kHz oraz intensywności mocy 12 W/cm², czyli w warunkach zapewniających wystąpienie kawitacji ultradźwiękowej. Do wytworzenia tej kawitacji zastosowano tytanową sonotrodę ultradźwiękową o średnicy czoła 13 mm, zasilaną z generatora typu VCX750 (Sonics, Newtown, CT, USA) pracującego z mocą 750 W. Optymalna odległość między pokrywaną strukturą nośną a drgającym czołem sonotrody wynosi 100% średnicy czoła sonotrody i nie powinna przekraczać 200% tej średnicy. W opisywanych niżej przykładach optymalną odległością będzie więc 15 mm, zaś akceptowalną - nie więcej niż 26 mm. Generator zasilający sonotrodę umożliwia regulację amplitudy drgań czoła sonotrody, co umożliwia zmianę siły wytworzonej kawitacji w celu kontrolowania procesu pokrywania hydroksyapatytem struktury nośnej. Temperaturę zawiesiny utrzymywano w zakresie od 28 do 30°C, poprzez system chłodzący zamocowany na ściana ch zbiornika, w którym prowadzono pokrywanie.

Przykład 1

Implant z płytkową strukturą nośna z PEEK pokrytą pięcioma warstwami nanoproszku GoHAP 3 Na wstępie przygotowano wodną zawiesinę cząstek nanoproszku GoHAP 3 o stosunku wapnia do fosforu wynoszącym 1,61, wyznaczonym metodą optycznej spektrometrii emisyjnej ICP-OES. W tym przykładzie hydroksyapatyt nanoszono na wspomnianą strukturę nośną w pięciu cyklach, z których każdy składa się z przygotowania świeżej zawiesiny hydroksyapatytu, kawitacyjnego oddziaływania tą zawiesiną na strukturę nośną w niej zanurzoną oraz suszenia. W pierwszym cyklu pokrywanie kawitacyjnie trwało sześć minut przy amplitudzie drgań czoła sonotrody ustawione na 75% wartości maksymalnej. W drugim cyklu zmniejszono amplitudę drgań czoła sonotrody do 65% wartości maksymalnej i generowano ultradźwięki przez pięć minut. W każdym z trzech kolejnych cykli oddziaływania kawitacyjne trwało także po pięć minut, ale amplituda drgań czoła sonotrody była ograniczona do 55% wartości maksymalnej.

Po zakończeniu procesu pokrywania gotowy implant wyjęto, przemyto wodą dejonizowaną i wysuszono w temperaturze pokojowej.

Do nasycenia lekiem naniesionej warstwy hydroksyapatytowej zastosowano metodę nakraplania. Przygotowano roztwór soli cefuroksymu o stężeniu 45 mg/ml o kwaśnym odczynie wynoszącym pH 5. Lek nanoszono przy użyciu pipety o wielkości kropli odpowiadającej 50 gl. Po nakropleniu powierzchnię implantu suszono w temperaturze pokojowej, a następnie implant płukano przez 5 sekund w łaźni z wodą dejonizowaną mieszaną przy pomocy mieszadła magnetycznego z prędkością 300 obr./min, i ponownie suszono w temperaturze pokojowej. Procedurę nakraplania lekiem powtórzono trzykrotnie.

Otrzymano w tym przykładzie bioaktywną warstwę hydroksyapatytu na powierzchni struktury nośnej z PEEK, charakteryzującą się:

- grubością 760 ± 50 nm,

- pokryciem ponad 90% powierzchni struktury nośnej,

- porowatością o średniej wielkość porów 104 ± 34 nm,

- kątem zwilżania 54 ± 6°

- ilością zaadsorbowanego leku wynoszącą 1 mg na każdy cm² powierzchni struktury nośnej implantu

- ilością leku uwalniającego się z tej warstwy w ciągu pierwszych 24 godzin na poziomie co najmniej 85% ilości zaadsorbowanej.

Grubość warstwy hydroksyapatytu i jej porowatość wyznaczono przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) firmy Ultra Plus (Zeiss, Jena, Niemcy). Próbki przełamano w ciekłym azocie i zbadano ich przełom. Otrzymane zdjęcia SEM poddano analizie w specjalistycznym oprogramowaniu - Gwyddion.

Rozkład wielkości porów w powłokach analizowano w programie obliczeniowym Excel z wykorzystaniem zdjęć SEM.

Kąt zwilżenia określony za pomocą goniometru Goniometr OCA 20 (DataPhysics Instruments GmbH, Filderstadt, Niemcy). Pomiar wykonano dla wody dejonizowanej, do analizy użyto specjalistycznego oprogramowania.

Ilość zaadsorbowanego leku określano poprzez ekstrahowanie go do medium i analizę spektrofotometryczną. W tym celu implant z biobójczą warstwą o wielkości 1 cm² umieszczenie w szklanej butelce zawierającej wodę dejonizowaną w ilości 3 ml. Całość poddano sonikacji przez 15 min (sonikator z łaźnią wodną Elma, Niemcy) w celu wypłukania leku, w ten sposób otrzymano roztwór do badań, który następnie poddano analizie. W sumie pobrano 6 ml roztworu z każdego implantu, który po filtrowaniu przy użyciu filtra strzykawkowego (0,45μm) poddano analizie UV-Vis. Ilościową analizę wykonano przy długości fali 275 nm na spektrofotometrze UV-Vis Evolution™ 60 (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, USA) z wykorzystaniem krzywej wzorcowej przygotowanej dla Cef. Każdy pomiar, polegający na określeniu ilości Cef powtórzono pięciokrotnie.

Badanie kinetyki uwalniania

Implant z warstwą biobójczą umieszczano w szklanej butelce i dodawano 3 ml buforu PBS, następnie umieszczano w cyrkulatorze zanurzeniowym z mieszadłem wielopozycyjnym w temperaturze 37°C i 150 rpm (IKA Poland, Warszawa). W punktach czasowych od 2 h do 150 h pobierano roztwory PBS, a implant z biobójczą warstwą umieszczano w nowym roztworze PBS. Zebrane roztwory PBS z różnych punktów czasowych przechowywano w fiolkach w temperaturze 4°C. Roztwory PBS podano analizie UV-Vis Evolution™ 60 przy długości fali 275 nm. Stężenie Cef w każdym punkcie czasowym określano na podstawie wcześniej przygotowanej krzywej kalibracyjnej. Dla każdej próbki wykonano trzy pomiary. Na tej podstawie określono, że 86% leku zostało uwolnione w ciągu pierwszych 24 godzin.

Przykład 2

Implant z płytkową strukturą nośna z PEEK pokrytą pięcioma warstwami nanoproszku GoHAP 1 Do pokrywania płytkowej struktury nośnej implantu zastosowano nanoproszek GoHAP 1 o stosunku wapnia do fosforu wynoszącym 1,65. Wykonano pięć cykli pokrywania ultradźwiękowego analogicznych jak w przykładzie pierwszym, uzyskując warstwę hydroksyapatytu o grubości 478 ± 20 nm, po czym tak samo jak w poprzednim przykładzie nakroploną lekiem biobójczym. Bioaktywna warstwa zaadsorbowała lek w ilości 1,095 ± 0,130 mg/cm² powierzchni struktury nośnej. Kąt zwilżania otrzymanej powłoki wynosił 64 ± 4°.

Badanie bakteriobójczości

Uzyskany w tym przykładzie implant został poddany badaniom bakteriobójczym in vitro metodą hamowania sferycznego. Ocenę przeprowadzono wobec S. aureus ATCC 25923. W eksperymencie 100 μl hodowli overnight (~108 cfu/mL) przeprowadzono w pożywce do hodowli bakterii typu Tryptone Soy Broth (TSB; Biokar Diagnostics, Beauvais, Francja), a następnie przeniesiono do pożywki Tryptone Soy Agar (TSA; Biokar Diagnostics). Implant z biobójczą warstwą zawierający Cef umieszczano na przygotowanych płytkach agarowych i inkubowano w temperaturze 37°C. Płytka z samym S. aureus ATCC 25923 oraz płytka z S. aureus ATCC 25923 i implant z warstwą z GoHAP bez antybiotyku były inkubowane jako kontrolne. Strefy zahamowania wzrostu mie rzono co 24 godziny przez 11 dni.

Badania wykonywano w trzech powtórzeniach. Wykazano, że średnica strefy zahamowania wzrostu po 24 h wynosiła 45,0 mm ± 2,0 mm. Zaobserwowano, że strefy te były takie same po 5 dniach inkubacji i 11 dniach inkubacji. Co świadczy o skuteczności warstwy biobójczej nawet do 11 dni. Przeprowadzono też testy rozcieńczeń bulionowych z wykorzystaniem opisanej wcześni hodowli w pożywce TSB. Żywotność bakterii określono mierząc gęstość optyczną (OD) przy długości fali 600 nm za pomocą aparatu Nanodrop ND-100UV/Vis (NanoDrop Technologies, USA). W tym celu 10 μl overnight hodowli S. aureus ATCC 25923 w TSB przenoszono do 3 ml TSB i inkubowano w 37°C przez 10 godzin. Badania gęstości optycznej bakterii wykonano w punktach czasowych co 14 godzin przez 7 dni. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Jako próbki kontrolne stosowano TSB z samym S. aureus ATCC 25923 lub S. aureus ATCC 25923 i implant z warstwą GoHAP bez Cef. Po każdym punkcie czasowym implanty i próbki kontrolne umi eszczano w nowym roztworze 3 ml TSB z 10 μl S. Aureus ATCC 25923. Test bulionowy wykazał skuteczność implantu z warstwą biobójczą z cefuroksymem przeciwko gronkowcowi złocistemu (Staphylococcus aureus), przez 168 godzin.

Przykład 3

Implant z płytkową strukturą nośna z PEEK pokrytą dwiema warstwami nanoproszku GoHAP 1

Do wytworzenia zawiesiny hydroksyapatytu zastosowano proszek GoHAP 1, tak sam jak w przykładzie drugim. Zastosowano dwa cykle pokrywania, przy czym w pierwszym cyklu przez sześć minut generowano ultradźwięki przy użyciu sonotrody, której amplitudę drgań jej czoła ograniczono do 75% wartości maksymalnej zaś w drugim cyklu generowanie ultradźwięków trwało pięć minut, a amplituda drgań czoła sonotrody była ustawiona na 65% wartości maksymalnej. W konsekwencji uzyskano implant pokryty warstwą hydroksyapatytu o grubości 368 ± 17 nm i o kącie zwilżania 69° ± 5°.

Przykład 4

Implant z płytkową strukturą nośna z PEEK pokrytą trzema warstwami nanoproszku GoHAP 3

Zastosowano nanoproszek taki sam jak w przykładzie pierwszym. Na opisanej wyżej płytkowej strukturze nośnej naniesiono hydroksyapatyt w trzech cyklach. W pierwszym cyklu oddziaływanie ultradźwiękowe na strukturę nośną implantu trwało sześć minut za pomocą sonotrody, w której amplitudę drgań czoła ustawiono na 75% wartości maksymalnej. W drugim cyklu amplitudę drgań czoła sonotrody zmniejszono do 65% wartości maksymalnej i generowano ultradźwięki przez pięć minut, zaś w trzecim cyklu amplitudę drgań czoła sonotrody ograniczony do 55% wartości maksymalnej i generowano ultradźwięki także przez 5 minut. W konsekwencji uzyskano warstwę hydroksyapatytu o grubości 368 ± 32 nm i o kącie zwilżania 55° ± 6°.

Claims (9)

1. Hydroksyapatytowa warstwa biobójczo-osteoindukcyjna naniesiona na podłoże nośne implantu medycznego, zawierająca środek biobójczy i składająca się z nanokrystalit ów syntetycznego hydroksyapatytu o stosunku molowym wapnia do fosforu większym niż 1,55 i mniejszym niż 1,67, która jest porowata i powierzchnia właściwa materiału wars twy jest nie mniejsza niż 155 m ²/g, syntetyczny hydroksyapatyt tworzący warstwę ma postać ziaren o średnim rozmiarze mierzonym przy pomocy transmisyjnej mikroskopii elektronowej lub przy pomocy rentgenowskiej dyfrakcji proszkowej XRD nie większym niż 25 nm i nie mniejszym niż 7 nm, poddanych działaniu kawitacji ultradźwiękowej i zawierających od 4 do 6% wagowo wody strukturalnej, zaś grubość warstwy wynosi od 350 nm do 1000 nm znamienna tym, że środek biobójczy jest antybiotykiem beta-laktamowym aktywnym wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych i wypełnia pory warstwy hydroksyapatytowej w ilości nie mniejszej niż 0,8 mg na jeden cm² powierzchni podłoża nośnego implantu.

2. Warstwa według zastrz. 1, znamienna tym, że środkiem biobójczym jest cefalosporyna II generacji.

3. Warstwa według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że materiałem jej struktury nośnej jest polieteroeteroketon.

4. Sposób wytwarzania hydroksyapatytowej warstwy biobójczo-osteoindukcyjnej, polegający na nanoszeniu syntetycznego hydroksyapatytu na po dłoże nośne w wyniku zanurzenia i unieruchomienia tego podłoża w zawiesinie, którą tworzą ciekła faza rozpraszająca, korzystnie woda, oraz faza rozpraszana w postaci ziaren o średnim rozmiarze nie większym niż 30 nm z syntetycznego hydroksyapatytu o stosunku molowym wapnia do fosforu większym niż 1,55 i mniejszym niż 1,67, a następnie wywołaniu zjawiska kawitacji w części zawiesiny kontaktującej się z podłożem nośnym, udział wagowy fazy rozpraszanej w zawiesinie wynosi od 0,01% do 2%, stan kawitacji wywołuje się przy pomocy sonotrody zanurzanej w zawiesinie w pobliżu struktury nośnej i mającej powierzchnię czołową wprawianą w drgania o częstotliwości z zakresu od 18 kHz do 40 kHz, przy czym przy w trakcie wytwarzania stanu kawitacji odległość powierzchni czołowej sonotrody od powierzchni podłoża nośnego wynosi nie więcej niż 200% średnicy jej powierzchni czołowej, znamienny tym, że proces nanoszenia ziaren hydroksyapatytu zawiera co najmniej trzy następujące po sobie cykle, z których każdy składa się z przygotowania świeżej zawiesiny hydroksyapatytu, kawitacyjnego oddziaływania tą zawiesiną na strukturę nośną w niej zanurzoną oraz suszenia, przy czym w każdym kolejnym cyklu amplituda drgań powierzchni czołowej sonotrody jest mniejsza niż amplituda jej drgań w cyklu bezpośrednio poprzedzającym, przy czym okres trwania kawitacji w każdym kolejnym cyklu jest nie dłuższym niż okres tej kawitacji w cyklu bezpośrednio go poprzedzającym, przy czym w pierwszym cyklu stosuje się amplitudę drgań powierzchni czołowej sonotrody wynoszącą 75% amplitudy odniesienia, w drugim cyklu amplituda drgań wynosi 65% wspomnianej amplitudy odniesienia, a w trzecim, czwartym i piątym cyklu stosuje się amplitudę drgań wynoszącą 55% amplitudy odniesienia, przy czym warstwę naniesioną na strukturę nośną implantu nasyca się roztworem wodnym antybiotyku a następnie suszy.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że okres trwania stanu kawitacji w każdym cyklu nie przekracza 6 minut.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sonotrodę o regulowanej amplitudzie drgań.

7. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że temperatura zawiesiny nie przekracza 40°C.

8. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako antybiotyk stosuje się sól cefuroksymu.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że sól cefuroksymu stosuje się w postaci roztworu o stężeniu 45 mg/ml o kwaśnym odczynie, wynoszącym pH 5.