PL438637A1

PL438637A1 - 2-(2'-Metylofenylo)-4-O-β-D-(4''-O-metyloglukopiranozylo)-chroman i sposób wytwarzania 2-(2'-metylofenylo)-4-O-β-D-(4''-O-metyloglukopiranozylo)-chromanu

Info

Publication number: PL438637A1
Application number: PL438637A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Krawczyk-Łebek; Edyta Kostrzewa-Susłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2023-02-06
Also published as: PL246797B1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 2-(2'-metylofenylo)-4-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-chroman o wzorze 2. Zgłoszenie obejmuje także sposób wytwarzania 2-(2'-metylofenylo)-4-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-chromanu charakteryzujący się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2'-metyloflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2-(2'-metylofenylo)-4-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-chroman o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.

Description

2-(2' -Metylofenylo )-4-O-,B-D-( 4'' -O-m etyloglukopiranozylo )-chrom an i sposób wytwarzania 2-(2' -m etylofenylo )-4-0-,6-0-( 4" -O-metyloglukopiranozylo )-chrom anu Przedmiotem wynalazku jest 2-(2'-Metylofenylo )-4-O-,B-D-( 4" -O metyloglukopiranozylo )-chromano wzorze 2 przedstawionym na rysunku. Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób wytwarzania 2-(2' -metylofenylo )-4-0-,6-0-( 4" -O-metyloglukopiranozylo )-chrom anu. 2-(2' -Metylofenylo )-4-O-,B-D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo )-chrom an moze znalezc zastosowanie jako zwiazek przeciwutleniajacy przeciwdrobnoustrojowy w preparatach farmaceutycznych i kosmetycznych oraz produktach spozywczych. Naturalne flawonoidy z jedna lub kilkoma grupami metylowymi wystepuja w roslinach sporadycznie. Z azjatyckiego drzewa Syzygium nervosum (Cleistocalyx operculatus) izolowano C- i O-metylowane chalkony: (E)-4,2' ,4' -trihydroksy-6' -metoksy-3', 5' -dimetylochalkon, (E)-2' ,4' -dihydroksy-6' -metoksy-3' ,5' -dimetylochalkon, (E)-2' ,4' -di hydroksy- 6' -metoksy-3' -metylochalkon, (E)-2,2' ,4' -trihydroksy-6' -metoksy-3', 5' - dimetylochalkon. Zwiazki te wykazywaly silna inhibicje wobec enzymów pochodzacych od dwóch szczepów wirusa grypy: H1 N1 oraz H9N2. Blokowaly one dzialanie neuraminidaz, umozliwiajacych wirusom opuszczanie zakazonych komórek poprzez rozklad ich blon komórkowych (Dao T. T. , Tung B. T., Nguyen P. H., Thuong P. T., Yoo S. S., Kim E. H., Kim S. K., Oh W. K. C-methylated flavonoids form Cleistocalyx operculatus and their inhibitory effects on novel influenza A (H1 N1) neuraminidase. Journal of Natura! Products 201 O, 73, 1636-1642). Podobnie (2S)-5, 7,2' -trihydroksy-8-metyloflawanon izolowany z krzewu Pisonia aculeate wykazywal aktywnosc przeciwdrobnoustrojowa podczas badania in vitro z udzialem szczepu Mycobacterium tuberculosis PL 438637 A1 2/9H37Rv. Zwiazek ten wywolywal inhibicje wzrostu bakterii przy minimalnym stezeniu hamujacym wynoszacym 50 µg/cm 3 (Wu M. C., Peng C. F., Chen I. S., Tsai I. L. Antitubercular chromones and flavanoids from Pisonia aculeata. Journal of Natura/ Products 2011, 7 4, 976-982). Aktywnosc antybakteryjna i antygrzybiczna potwierdzono równiez dla flawonoidów wyekstrahowanych z naziemnych czesci rosliny Eysenhardtia tex ana: (2S)-4' ,5, 7-trihydroksy-8-metylo-6-prenyloflawanonu oraz (2S)-4',5,7-trihydroksy-6-metylo-8-prenyloflawanonu. Dowiedziono, ze w stezeniu O, 1 mg/cm 3 hamowaly wzrost Staphylococcus aureus. (2S)-4' ,5, 7-trihydroksy-8-metylo-6-prenyloflawanon spowalnial równiez wzrost Candida albicans (Wachter G. A., Hoffmann J. J., Furbacher T. T., Blake M. E., Timmermann B. N. Antibacterial and antifungal flavanones from Eysenhardtia texana. Phytochemistry 1999, 52, 1469-1471 ). Wiekszosc flawonoidów, poza katechinami, jest obecna w roslinach w polaczeniu z cukrami, jako ,B-glikozydy. Glikozylacja skutkuje: wzrostem rozpuszczalnosci w wodzie i stabilnosci czasteczki flawonoidu oraz przyswajalnosci przyjmowanych z pokarmem zwiazków flawonoidowych. Zasadniczo glukozydy sa jedynymi glikozydami, które moga byc absorbowane w jelicie cienkim. Natomiast flawonoidy niezaabsorbowane w jelicie cienkim oraz zaabsorbowane flawonoidy wydzielone z zólcia ulegaja degradacji wraz z rozerwaniem struktury pierscieniowej przez mikroorganizmy (Hollman, P. C. Absorption, bioavailability, and metabolism of flavonoids. Pharmaceutical Biology, 2004, 42, 7 4-83, Plaza, M.; Pozzo, T.; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2014, 62, 3321-3333). Hollman i in., wykazali, ze czasteczka glukozy przylaczona w pozycji 3 kwercetyny (3,3',4',5,7-pentahydroksyflawon) zwieksza absorpcje tego zwiazku w jelicie cienkim do 52%, w porównaniu z 24% absorpcja aglikonu kwercetyny i 17% rutynozydu kwercetyny (Hollman, P. C.; Bijsman, M. N. C. P.; van Gameren, Y; Cnossen, E. P. J.; de Vries, J. PL 438637 A1 3/9H.; Katan, M. B. The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radical Research, 1999, 31, 569-573). Znany jest szczep Beauveria bassiana KCH J1 .5 uJawniony w literaturze (Kozlowska E., Urbaniak M., Hoc N., Grzeszczuk J., Dymarska M., Stepien L., Plaskowska E., Kostrzewa-Suslow E., Janeczko T. Cascade biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveria species. Scientific Reports, 2018, 8: 13449). W ostatnich latach, w leczeniu róznych chorób i ich zapobieganiu, coraz wieksze znaczenie zyskuja zwiazki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przeksztalcen mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania zwiazków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, uzytecznych dla przemyslu farmaceutycznego, kosmetycznego i spozywczego. W dostepnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 2-(2' -metylofenylo )-4-O-,B-D-( 4" -O-m etyloglukopiranozylo )-chrom anu. Istota wynalazku jest 2-(2' -metylofenylo )-4-O-,B-D-( 4" -0- metyloglukopiranozylo)-chroman. Istota sposobu polega na tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep Beauveria bassiana KCH J1 .5. Po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2'-metyloflawanon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda. Transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, przez co najmniej 96 godzin. Nastepnie produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda oraz oczyszcza chromatograficznie. 2-(2'-Metylofenylo)-4-O-,B-D-(4"-O- metyloglukopiranozylo)-chroman znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w trzecim pasmie od linii startu. PL 438637 A1 4/9Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm 3 . Korzystnie takze jest, gdy proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformacje prowadzi sie przez 9 dni. Korzystnie równiez jest, gdy oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym z chloroformem i metanolem w stosunku objetosciowym 9: 1. Postepujac zgodnie z wynalazkiem, w wyniku dzialania ukladu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCH J1 .5, nastepuje redukcja i przylaczenie 4-metoksy-,B-D-glukozy przy C-4. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela sie z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcje rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda (octan etylu). Zasadnicza zaleta wynalazku jest otrzymanie 2-(2' -metylofenylo )-4-O ,B-D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo )-chrom anu w tern peraturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystujac mikroorganizm niebedacy patogenem ludzkim. Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umozliwia, w sposób przyjazny dla srodowiska, uzyskanie zwiazków o wiekszej biodostepnosci i aktywnosci biologicznej, niz uzyte substraty. Wynalazek jest blizej objasniony na przykladzie wykonania. Przyklad. Do kolby stozkowej o pojemnosci 2000 cm 3 , w której znajduje sie 500 cm 3 sterylnej pozywki zawierajacej 1 O g am inobaku i 30 g glukozy, wprowadza sie szczep Beauveria bassiana KCH J1 .5. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje sie 50 mg 2'-metyloflawanonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm 3 dimetylosulfotlenku. Transformacje prowadzi sie w 25 stopniach Celsjusza przy ciaglym wstrzasaniu przez 9 dni. Nastepnie mieszanine poreakcyjna ekstrahuje sie dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany PL 438637 A1 /9ekstrakt oczyszcza sie chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objetosciowym 9: 1. Produkt znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w trzecim pasmie od linii startu. Na tej drodze otrzymuje sie 5,9 mg 2-(2'-metylofenylo)-4-O-,8-0-(4" O-metyloglukopiranozylo)-chromanu (wydajnosc 6,8%). Stopien konwersji substratu wedlug HPLC 99%. Uzyskany produkt charakteryzuje sie nastepujacymi danymi spektralnymi. Opis sygnalów pochodzacych z widma 1 H NMR (601 MHz, Aceton-d5) Sygnaly pochodzace od protonów Sygnaly pochodzace od protonów szkieletu flawonoidowego jednostki cukrowej o [ppm] J [Hz] H o [ppm] J [Hz] H .47 (dd) 12,1; 1,7 2 4,63 (d) 7,8 1" 2,45 (dt) 14,8; 2,0 3ax 3,22 (m) 2" 1,96 (m) 3eq 3,57 (dd) 8,9; 3,4 3" 4,97 (m) 4 3,14(m) 4" 7,43 (dd) 7,7; 1,6 5 3,36 (dd) 9,7; 5,0 5" 6,93 (td) 7,4; 1, 1 6 3,87 (m) 6" 3,72 (dd) 14,0; 3,9 7,23 (m) 7 3,54 (s) C4"- OCH3 6,87 (m) 8 4,44 (d) 4,0 C2"-OH 7,23 (m) 3' 4,23 (d) 3,7 C3"-OH 7,23 (m) 4' 3,72 (dd) 14,0; 3,9 C6"-OH 7,23 (m) 5' 7,54 (m) 6' 2,43 (s) 2'-CH3 PL 438637 A1 6/9Zastrzezenia patentowe 1. 2-(2' -Metylofenylo )-4-O-,6-D-(4" -O-metyloglukopiranozylo )-chrom an o wzorze 2. 2. Sposób wytwarzania 2-(2' -metylofenylo )-4-O-,6-D-( 4" -O- metyloglukopiranozylo )-chromanu znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep Beauveria bassiana KCH J1 .5, nastepnie po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2' - metyloflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2-(2'-metylofenylo)-4- O-,6-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-chroman o wzorze 2 znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w trzecim pasmie od linii startu. 3. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg: 1 cm 3. 4. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. . Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 9 dni. 6. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym chloroform:metanol w stosunku objetosciowym 9:1. PL 438637 A1 7/97 6 wzór1 3' 4' ' Beauveria bassiana KCH J1 .5 7 6 3' 4' ' 6' 4 3 HO _:)6" 4 " ,,, CH 3 O~o O ?,,f '.~1,,,,,~{0H 1" OK 3" wzór2 PL 438637 A1 8/9al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA NR P.438637 Klasyfikacja zgloszenia: C07H17 /065 (2006.01), C12P19/60 (2006.01), C12Rl/645 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: C07H, C12P Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: EPODOC, WPI, BAZY DANYCH UPRP, STN: REGISTRY, CAPLUS, REAXYSFILEBib, REAXYSFILESub Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz. A PL431178A1 (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 1-6 22.03.2021 A PL237335 B1 (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 1-6 06.04.2021 ? Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia. L - dokument. który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszehstwo(-wa). lub przytoczony w celu ustalenia claty publikacji innego L')'tcnvanego doku1nentu lub z innego szczególnego pcnvoclu, O - dokument odnoszaty sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie. wystawienie lub ujawnienie w inny sposób. r - dokument opublikowany przed data zgloszenia. ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy. opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem. ale cytowany w celu zrozumienia rnsad lub teorii lezacych u podstaw \\ynal8zku. X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za no\\Y lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, y dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany ,rynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom ,\ynalazczy. jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy. & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Agnieszka Ucinska Ekspert data 11.02.2022r. /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektroniczne_go Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z 30.07.2021 r. PL 438637 A1 9/9 PL PL

Claims

Zastrzezenia patentowe

1. 2-(2' -Metylofenylo )-4-O-,6-D-(4" -O-metyloglukopiranozylo )-chrom an o wzorze 2.

2. Sposób wytwarzania 2-(2' -metylofenylo )-4-O-,6-D-( 4" -O- metyloglukopiranozylo )-chromanu znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep Beauveria bassiana KCH J1 .5, nastepnie po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2' - metyloflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2-(2'-metylofenylo)-4- O-,6-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-chroman o wzorze 2 znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w trzecim pasmie od linii startu.

3. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg: 1 cm 3.

4. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

5. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 9 dni.

6. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym chloroform:metanol w stosunku objetosciowym 9:1./97 6 wzór1 3' 4' 5' Beauveria bassiana KCH J1 .5 7 6 3' 4' 5' 6' 4 3 HO _:)6" 4 " ,,, CH 3 O~o O ?,,f '.~1,,,,,~{0H 1" OK 3" wzór2/9al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA NR P.438637 Klasyfikacja zgloszenia: C07H17 /065 (2006.01), C12P19/60 (2006.01), C12Rl/645 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: C07H, C12P Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: EPODOC, WPI, BAZY DANYCH UPRP, STN: REGISTRY, CAPLUS, REAXYSFILEBib, REAXYSFILESub Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz. A PL431178A1 (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 1-6 22.03.2021 A PL237335 B1 (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 1-6 06.04.2021 ? Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia. L - dokument. który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszehstwo(-wa). lub przytoczony w celu ustalenia claty publikacji innego L')'tcnvanego doku1nentu lub z innego szczególnego pcnvoclu, O - dokument odnoszaty sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie. wystawienie lub ujawnienie w inny sposób. r - dokument opublikowany przed data zgloszenia. ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy. opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem. ale cytowany w celu zrozumienia rnsad lub teorii lezacych u podstaw \\ynal8zku. X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za no\\Y lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, y dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany ,rynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom ,\ynalazczy. jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy. & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Agnieszka Ucinska Ekspert data 11.02.2022r. /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektroniczne_go Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z 30.07.2021 r./9