PL438638A1

PL438638A1 - 2-Metylo-4-O-β-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy i sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-β-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego

Info

Publication number: PL438638A1
Application number: PL438638A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Krawczyk-Łebek; Edyta Kostrzewa-Susłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2023-02-06
Also published as: PL246798B1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 2-metylo-4-O-β-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy o wzorze 2. Zgłoszenie obejmuje także sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-β-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego charakteryzuje się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2'-metyloflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2-metylo-4-O-β-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy o wzorze 2 znajduje się we frakcji o dużej polarności, w piątym paśmie od linii startu.

Description

2-Metylo-4-O-/3-D-( 4' -O-metyloglukopiranozylo )-kwas benzoesowy i sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-/3-D-( 4' -O-metyloglukopiranozylo )-kwasu benzoesowego Przedmiotem wynalazku jest 2-metylo-4-O-/3-D-( 4' -0- metyloglukopiranozylo )-kwas benzoesowy o wzorze 2 przedstawionym na rysunku. Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-/3-0-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego. 2-Metylo-4-O-/3-D-( 4' -O-m etyloglukopiranozylo )-kwas benzoesowy moze znalezc zastosowanie jako konserwant w preparatach farmaceutycznych i kosmetycznych oraz produktach spozywczych. Wiele naturalnych zwiazków chemicznych wystepuje w postaci zmetylowanej lub glikozylowanej, o poprawIoneJ stabilnosci, rozpuszczalnosci w wodzie i aktywnosci. Metylacja i glikozylacja sa powszechne wsród zwiazków flawonoidowych, a obecnosc grupy metylowej powoduje ogromna poprawe ich wlasciwosci biologicznych takich jak aktywnosc przeciwdrobnoustrojowa czy przecwiutleniajaca (Brito Arias. M. Synthesis and Characterization of Glycosides. Springer 2007; M., Koirala, N.; Thuan, N.H.; Ghimire, G.P.; Thang, O.V.; Sohng, J.K. Methylation of flavonoids: Chemical structures, bioactivities, progress and perspectives for biotechnological production. Enzyme and Microbial Technology 2016, 86, 103-116). Kwas benzoesowy zostal dopuszczony jako substancja dodatkowa w zywnosci zgodnie z Rozporzadzeniem Ministra Zdrowia z dnia 18.09.2008 r., a Rozporzadzenie Komisji UE nr 231/2012 ustanawia jego PL 438638 A1 2/8specyfikacje jako dodatku w zywnosci. Znajduje sie równiez w wykazie substancji uniemozliwiajacych rozwój i przetrwanie mikroorganizmów w czasie przechowywania produktu, dozwolonych w produktach kosmetycznych (zalacznik V do Rozporzadzenia Parlamentu i Rady (WE) nr 1223/2009. Pochodna kwasu benzoesowego bedaca przedmiotem wynalazku, dzieki przylaczonej grupie metylowej 4' -O-metyloglukozie, wykazuje potencjal do zastosowania jako konserwant o poprawionej rozpuszczalnosci oraz zwiekszonej aktywnosci przeciwdrobnoustrojowej. Znany jest szczep lsaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgloszeniu patentowym o numerze P.416996. W ostatnich latach, w leczeniu róznych chorób i ich zapobieganiu, coraz wieksze znaczenie zyskuja zwiazki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przeksztalcen mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania zwiazków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, uzytecznych dla przemyslu farmaceutycznego, kosmetycznego i spozywczego. W dostepnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 2-metylo-4-O-,B-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego. Istota wynalazku jest 2-metylo-4-O-,B-D-( 4' -O-metyloglukopiranozylo ) kwas benzoesowy. Istota sposobu polega na tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2. Po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2'-metyloflawanon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda. Transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, przez co najmniej 96 godzin. Nastepnie produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda oraz oczyszcza chromatograficznie. 2-metylo-4- PL 438638 A1 3/8O-,6-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy znajduje sie we frakcji o duzej polarnosci, w piatym pasmie od linii startu. Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm 3 . Korzystnie takze jest, gdy proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformacje prowadzi sie przez 9 dni. Korzystnie równiez jest, gdy oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym z chloroformem i metanolem w stosunku objetosciowym 9: 1. Postepujac zgodnie z wynalazkiem, w wyniku dzialania ukladu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu /saria fumosorosea KCH J2, nastepuje rozszczepienie pierscienia C ukladu flawanonu oraz hydroksylacja przylaczenie 4-metoksy-,B-D-glukozy przy C-4 w nowopowstalej czasteczce kwasu o-metylobenzoesowego. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela sie z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcje rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda (octan etylu). Zasadnicza zaleta wynalazku jest otrzymanie 2-metylo-4-O-,6-D-( 4' -O metyloglukopiranozylo )-kwasu benzoesowego w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystujac mikroorganizm niebedacy patogenem ludzkim. Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umozliwia, w sposób przyjazny dla srodowiska, uzyskanie zwiazków o wiekszej biodostepnosci i aktywnosci biologicznej, niz uzyte substraty. Wynalazek jest blizej objasniony na przykladzie wykonania. Przyklad. Do kolby stozkowej o pojemnosci 2000 cm 3 , w której znajduje sie 500 cm 3 sterylnej pozywki zawierajacej 1 O g am inobaku i 30 g glukozy, wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje sie 50 mg 2' -metyloflawanonu o wzorze 1, rozpuszczonego PL 438638 A1 4/8w 1 cm 3 dimetylosulfotlenku. Transformacje prowadzi sie w 25 stopniach Celsjusza przy ciaglym wstrzasaniu przez 9 dni. Nastepnie mieszanine poreakcyjna ekstrahuje sie dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza sie chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objetosciowym 9: 1. Produkt znajduje sie we frakcji o duzej polarnosci, w piatym pasmie od linii startu. Na tej drodze otrzymuje sie 4,7 mg 2-metylo-4-O-,B-D-(4'-O metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego (wydajnosc 6,8%). Stopien konwersji substratu wedlug HPLC 99%. Uzyskany produkt charakteryzuje sie nastepujacymi danymi spektralnymi. Opis sygnalów pochodzacych z widma 1 H NMR (601 MHz, Aceton-dB) Sygnaly pochodzace od protonów Sygnaly pochodzace od protonów szkieletu flawonoidowego jednostki cukrowej o [ppm] J [Hz] H o [ppm] J [Hz] H 6,86 (d) 9,0 3 4,86(d) 7,8 1' 7,29 (dd) 9,0; 3,0 5 3,45 (tt) 5,3; 3,6 2' 7,62 (d) 2,9 6 3,61 (m) 3' 2,65 (s) 2-CH3 3,15(m) 4' 11,92 (s) COOH 3,50 (ddd) 9,6; 5,7; 5' 1,7 3,87 (m) 6' 3,68 (m) 3,55 (s) C4'-OCH3 4,64 (d) 3,6 C2'-0H 4,41 (d) 4,0 C3'-0H PL 438638 A1 /8Zastrzezenia patentowe 1. 2-metylo-4-O-,B-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy o wzorze 2. 2. Sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-,B-D-( 4' -O-metyloglukopiranozylo ) kwasu benzoesowego znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2, nastepnie po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2'-metyloflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2-metylo-4-O-,B-D-(4' O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy o wzorze 2 znajduje sie we frakcji o duzej polarnosci, w piatym pasmie od linii startu. 3. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg: 1 cm 3. 4. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. . Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 9 dni. 6. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym chloroform:metanol w stosunku objetosciowym 9:1. PL 438638 A1 6/83' 4' ' HO 3 HO 6 , o O~ ,,cH 3 ?,,,\J11,, .. ~ o 1 · Q}l, '''~~OH lsaria fumosorosea KCH J2 6 wzór1 wzór2 PL 438638 A1 7/8al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA NR P.438638 Klasyfikacja zgloszenia: C0?HlS/203 (2006.01), C12P19/44 (2006.01), C12Rl/645 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: C07H, C12P Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: EPODOC, WPI, BAZY DANYCH UPRP, STN: REGISTRY, CAPLUS, REAXYSFILEBib, REAXYSFILESub Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz. A JP2020141576 A (UNIV TOYAMA PREFECTURAL) 2020.09.1 O (par.[0011] 1-6 zwiazek 4HBAG) A Hsu FL, Yang LM. Chang SF, Wang LH, Hsu CY, Liu PC, Lin SJ. 1-6 Biotransformation of gal lic acid by Beauveria sulfurescens ATCC 7159. Appl Microbiol Biotechnol. 2007 Mar;74(3):659-66. doi: 10.1007/s00253-006-0692-z (fig.1 zwiazek 4) A Kei Shimoda, Shin-ya Yamane, Hidetada Hirakawa, Shinji Ohta,Toshifumi 1-6 Hirata. Biotransformation of phenolic compounds by the cultured cells of Catharanthus roseus. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 16 (2002) 275-281. https://doi.org/10.1016/S1381-1177(01 )00073-X (schemat 1 zwiazek 6b) ? Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stano\\'iacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszehstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia claty publikacji innego L')'tcnvanego doku1nentu lub z innego szczególnego pcnvoclu, O - dokument odnoszaty sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, r - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwsze11stwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszefotwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia rnsad lub teorii lezacych u podstaw \\ynal8zku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za no\\Y lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie. y dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany ,rynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom ,\ynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami. a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Agnieszka Ucinska Ekspert data 15.02.2022r. /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektroniczne_go Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z 30.07.2021 r. PL 438638 A1 8/8 PL PL

Claims

Zastrzezenia patentowe

1. 2-metylo-4-O-,B-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy o wzorze 2.

2. Sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-,B-D-( 4' -O-metyloglukopiranozylo ) kwasu benzoesowego znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2, nastepnie po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2'-metyloflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2-metylo-4-O-,B-D-(4' O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy o wzorze 2 znajduje sie we frakcji o duzej polarnosci, w piatym pasmie od linii startu.

3. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg: 1 cm 3.

4. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

5. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 9 dni.

6. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym chloroform:metanol w stosunku objetosciowym 9:1./83' 4' 5' HO 3 HO 6 , o O~ ,,cH 3 ?,,,\J11,, .. ~ o 1 · Q}l, '''~~OH lsaria fumosorosea KCH J2 6 wzór1 wzór2/8al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA NR P.438638 Klasyfikacja zgloszenia: C0?HlS/203 (2006.01), C12P19/44 (2006.01), C12Rl/645 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: C07H, C12P Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: EPODOC, WPI, BAZY DANYCH UPRP, STN: REGISTRY, CAPLUS, REAXYSFILEBib, REAXYSFILESub Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz. A JP2020141576 A (UNIV TOYAMA PREFECTURAL) 2020.09.1 O (par.[0011] 1-6 zwiazek 4HBAG) A Hsu FL, Yang LM. Chang SF, Wang LH, Hsu CY, Liu PC, Lin SJ. 1-6 Biotransformation of gal lic acid by Beauveria sulfurescens ATCC 7159. Appl Microbiol Biotechnol. 2007 Mar;74(3):659-66. doi: 10.1007/s00253-006-0692-z (fig.1 zwiazek 4) A Kei Shimoda, Shin-ya Yamane, Hidetada Hirakawa, Shinji Ohta,Toshifumi 1-6 Hirata. Biotransformation of phenolic compounds by the cultured cells of Catharanthus roseus. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 16 (2002) 275-281. https://doi.org/10.1016/S1381-1177(01 )00073-X (schemat 1 zwiazek 6b) ? Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stano\\'iacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszehstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia claty publikacji innego L')'tcnvanego doku1nentu lub z innego szczególnego pcnvoclu, O - dokument odnoszaty sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, r - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwsze11stwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszefotwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia rnsad lub teorii lezacych u podstaw \\ynal8zku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za no\\Y lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie. y dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany ,rynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom ,\ynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami. a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Agnieszka Ucinska Ekspert data 15.02.2022r. /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektroniczne_go Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z 30.07.2021 r./8