Kompozycja farmaceutyczna na bazie formulacji hydrozelowych do zastosowania jako dwuskladnikowy preparat stymulujacy regeneracje tkanek Przedmiotem wynalazku jest jednoczesne zastosowanie w kompozycji dwóch mieszanin hydrozelowych na bazie alginianu zawierajacych zebularyne i kwas retinowy - kompozycja dwóch formulacji zawierajacych kazda skladnik aktywny, które po podaniu do organizmu ulegaja biodegradacji i stopniowo uwalniaja substancje czynne zebularyne i kwas retinowy, które pobudzaja regeneracje tkanek. Wynalazek znajduje zastosowanie jako preparat stymulujacy procesy regeneracyjne tkanek, zwlaszcza skóry, w wypadkach, gdy podanie miejscowe leku regeneracyjnego jest nieskuteczne, gdyz nie zapewnia odpowiedniej penetracji leku do tkanki i w wypadku uszkodzen wymagajacych dlugotrwalego dostarczania leku. Przykladami takich uszkodzen sa przewlekle rany skóry i neuropatie obwodowe. Regeneracja tkanek oznacza proces odtwarzania uszkodzonych lub utraconych tkanek prowadzacy do przywrócenia pierwotnej struktury. Procesy regeneracji moga zachodzic w organizmie samorzutnie lub w efekcie terapii. W organizmach ludzi, jak i innych ssaków, niezbedna do normalnego funkcjonowania jest regeneracja fizjologiczna, jak w przypadku regularnego odnawiania naskórka, nablonka jelita, nablonka endometrium czy tkanek watroby. Uszkodzenia tkanek przez czynniki zewnetrzne, wskutek urazów mechanicznych, oparzen, dzialania toksyn, promieniowania, niedokrwienia lub operacji chirurgicznych moga byc naprawione poprzez dzialanie naturalnych mechanizmów regeneracji tkanek, jednak efektywnosc tych endogennych procesów regeneracyjnych nie zawsze jest wystarczajaca do pelnego i prawidlowego odtworzenia utraconych struktur, albo postep procesów naprawczych jest zbyt powolny i nie zachodzi w normalnym dla danego typu uszkodzenia czasie. Przykladowo skóra ma zdolnosci regeneracyjne, ale na skutek powiklan cukrzycowych, niedokrwienia, chemioterapii, odlezyn, gojenie ran skóry moze byc znacznie opóznione, tj. przekraczac 3 miesiace. W ciezszych przypadkach niegojace sie rany moga miec nawet charakter chroniczny. W przypadku nieregenerujacych sie uszkodzen podejmowane sa próby interwencji terapeutycznych. Jedna z opcji terapeutycznych jest farmakologiczna aktywacja zablokowanego potencjalu regeneracyjnego. Bardzo PL 439912 A1 2/16obiecujacym, ale stosunkowo slabo zbadanym podejsciem jest zastosowanie inhibitorów epigenetycznych w polaczeniu z aktywatorami transkrypcji. Polaczone podanie inhibitora metylotransferazy DNA - zebularyny i aktywatora transkrypcji - kwasu retinowego umozliwilo efektywna indukcje regeneracji malzowiny usznej u myszy w przypadku uszkodzei1, których naprawa nie nastepuje samorzutnie (Sass, P., et al. 2019, EBioMedicine 46: 317-329). Jednak procesy naprawcze moga byc dlugotrwale, stad potrzeba czestego podawania leków stymulujacych regeneracje. Wielokrotne podawanie leku np. w postaci zastrzyków jest klopotliwe, ale tez wiaze sie ze skokowymi zmianami poziomu leku, które moga byc zle tolerowane przez organizm i które nie sa korzystne dla procesu regeneracji. Dotychczas opracowany schemat podania zebularyny i kwasu retinowego, przedstawiony w zgloszeniu patentowym PL423672. Opisano kompozycje farmaceutyczna zawierajaca zebularyne i/lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól jak i kwas retinowy i/lub metabolity kwasu retinowego i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, oraz co najmniej jeden znany dopuszczalny farmaceutycznie nosnik i/lub rozcienczalnik do zastosowanie jako srodek do pobudzania regeneracji lub goJema ran wywolanych przez uszkodzenia mechaniczne, chemiczne, termiczne, operacje chirurgiczne lub stany patologiczne. Ta kompozycja wymagala jednakze wykonania 7 zastrzyków dootrzewnowych zebularyny w ciagu 10 dni i 6 zastrzyków dootrzewnowych zebularyny w ciagu 11 dni, co jest klopotliwe w wykonaniu i nie zapewnia stopniowego uwalniania substancji czynnej. Stad potrzeba opracowania skuteczniej szych sposobów regeneracji tkanek. Przedmiotem wynalazku jest jednoczesne zastosowanie w kompozycji dwóch formulacji hydrozelowych - mieszanin na bazie hydrozelu alginianowego zawierajacych zebularyne - skladnik aktywny biologicznie oraz alginian sodowy stanowiacych pierwsza formulacje, kwas retinowy - skladnik aktywny biologicznie oraz alginian sodowy stanowiacych druga formulacje, które podane podskórnie do organizmu ulegaja biodegradacji i stopniowo uwalniaja zawarte w nich substancje czynne, czyli zebularyne i kwas retinowy aktywujace regeneracje tkanek. Jako "jednoczesne uzycie" rozumie sie podanie bezposrednio po sobie do tego zastosowania medycznego - regeneracji tkanek celem jednoczesnego zastosowania obu skladników biologicznie aktywnych np. w dwóch iniekcjach podskórnych lub w postaciach do podania bezposrednio do miejsca uszkodzenia ale podanych po sobie bez zwloki. Wynalazek dotyczy, zatem kompozycji farmaceutycznej - zestawu - zawierajacej obie formulacje. Pierwsza formulacja zawiera PL 439912 A1 3/16alginian sodowy oraz zebularyne, a druga formulacja zawiera kwas retinowy i alginian sodowy. Na podstawie doswiadczen ustalono proporcje substancji zebularyny i kwasu retinowego do alginianu w kazdej formulacji. W pierwszej formulacji zebularyna jest w proporcji odpowiadajacej od 60 do 240 mg na 1 ml hydrozelu alginianowego zawierajacego 10-20 mg samego alginianu sodowego w 1 ml wody, czyli 1-2% roztwór alginianu sodowego; a w formulacii drugiej kwas retinowy jest w proporcji od l do 4 mg na l ml hydrozelu alginianowego - zawierajacego 10-20 mg samego alginianu sodowego w I ml wody, czyli l-2°ó roztwór alginianu sodowego. Korzystnie, formulacja z kwasem retinowy ma dodatkowo olej np. rzepakowy. Wynalazek polega na jednoczesnym zastosowaniu formulacji hydrozelowych zebularyny i kwasu retinowego na bazie alginianu przygotowanych np. w postaci dwóch podskórnych iniekcji lub podania bezposrednio do miejsca uszkodzenia. Wprowadzone pod skóre hydrozelowe formulacje zebularyny i kwasu retinowego stopniowo uwalniaja substancje czynne ulegajace jednoczesnie biodegradacji. Uwalniane stopniowo substancje czynne, zebularyna i kwas retinowy lacznie pobudzaja regeneracje tkanek w miejscach uszkodzenia oddalonych od miejsca iniekcji Wynalazek umozliwia podanie leków w postaci biodegradowalnych biokompatybilnych kompozycji hydrozelowych, dzieki czemu lek po jednorazowym podaniu uwalniany jest stopniowo, nawet przez wiele dni. Opis bardziej szczególowy skladu formulacji Hydrozelowe fonnulacje uzyskano w sposób nastepujacy. Formulacje hydrozelowa zebularyny przygotowano przez zawieszenie od 60 do 240 mg zebularyny na I ml hydrozelu alginianowego. Formulacje hydrozelowa kwasu retinowego przygotowano przez zawieszenie od I do 4 mg na 1 ml hydrozelu alginianowego. Formulacja zawierajaca do 240 mg zebularyny w 1 ml 1-2% hydrozelu alginianowego sodowego, wykazuje sie duza lepkoscia, ale pozostaje plynna i mozna ja skutecznie wykorzystac do wykonania zastrzyków podskórnych lub podania bezposrednio do miejsca uszkodzenia. Opracowany zakres zas od 60 do 240 mg wykazuje sie skutecznoscia dzialania. Formulacja zawierajaca do 4 mg kwasu retinowego w 1 ml 1-2% hydrozelu alginianowego sodowego jest lepka, ale zachowuje plynna postac nadaje sie do wykonania zastrzyków podskórnych lub podania bezposrednio do miejsca uszkodzenia. Opracowany zakres zas od 1 do 4 mg wykazuje sie skutecznoscia dzialania. Zawartosc PL 439912 A1 4/16zebularyny i kwasu retinowego w przygotowanych formulacjach zostala dobrana z uwzglednieniem dawek aktywnych biologicznie oraz na podstawie eksperymentów, w których badano jaka ilosc substancji aktywnych mozna dodac do formulacji hydrozelowej zeby pozostala przydatna do iniekcji lub podania bezposrednio do miejsca uszkodzenia. Formulacje zebularyny i kwasu retinowego pozwalaly na jednorazowe podskórne podanie myszy laboratoryjnej maksymalnie 48 mg zebularyny w 0,2 ml hydrozelu (240 mg na 1ml) i maksymalnie 0,8 mg kwasu retinowego w 0,2 ml hydrozelu (4 mg na 1 ml), co odpowiada dawkom okolo 2000 mg/kg wagi ciala i 32 mg/kg wagi ciala. Do badania odpowiedzi regeneracyjnej wykorzystano model uszkodzenia malzm.viny usznej myszy, który pozwala na obserwacje regeneracji tkanki zlozonej obejmujacej skóre, chrzastke, miesnie, naczynia krwionosne, nerwy obwodowe i mieszki wlosowe. Formulacje hydrozelowe alginianu sodowego 2% z zebularyna i kwasem retinowym podane podskórnie umozliwily regeneracje malzowiny usznej u myszy. Szczegolowy opis doswiadczenia pokazano w przykladzie I. Poniewaz substancje czynne podane w hydrozelu uwalniaja sie stopniowo pod skóra, mimo wysokiej dawki sa dobrze tolerowane przez organizm Dzieki konsystencji hydrozele z substancja czynna moga zostac tez podane w bezposrednio do miejsca uszkodzenia. Wynalazek pokazano blizej w przykladach i na rysunkach, na których: Figura 1. - przedstawia mikroskopowe zdjecia formulacji hydrozelowych alginianu 2% z 240 mg zebularyny (Zeb) na l ml hydrozelu alginianowego - roztwór wodny alginianu sodowego, 4 mg kwasu retinowym (RA) na I ,O ml hydrozelu i 4 mg kwasu retinowego w O,l ml oleju rzepakowego na I ml hydrozelu alginianowego. Strzalkami wskazano krysztaly kwasu retinowego Pierwsza formulacja zawiera 240 mg zebularyny i 20 mg alginianu sodowego w 1 ml wody. Druga mieszanina zawiera 4 mg kwasu retinowego i 20 mg alginianu sodowego w 1 ml wody. Zawartosci zebularyny i kwasu retinowego znacznie przekraczaja zawartosci odpowiadajace rozpuszczalnosci tych zwiazków chemicznych w wodzie, które wedlug danych literaturowych wynosza do 50 mg/ml dla zebularyny (Sass, P., et al. 2019, EBioMedicine 46: 317-329) i 0,000063 mg/ml (0,21 microM) dla kwasu retinowego (Szuts EZ Harosi FI 1991 Archives of Biochemistry and Biophysics287:297-304). Oznacza to, ze hydrozel alginianowy umozliwia efektywne PL 439912 A1 /16podanie wielokrotnie wyzszych dawek zebularyny kwasu retinowego niz roztwory wodne o tej samej objetosci. Figura 2. - przedstawia rezultat badania ;n vitro uwalniania zebularyny (Zeb) z hydrozelu alginianowego w komorze Franza. Kwas retinowy nie uwalnia sie w komorze Franza, czyli in vitro. In vivo, pod skóra uwalnia sie w efekcie biodegradacji. Figura 3. - przedstawia przebieg zamykania otworów w malzowinie usznej wyznaczony w dniu uszkodzenia bezposrednio po jego wykonaniu i w 7, 14, 21, 28, 35 oraz 42 dniu po uszkodzeniu u 6 myszy po podaniu formulacji hydrozelu alginianowego 2% z zebularyna (Zeb) i kwasem retinowym (RA) zawieszonym w oleju rzepakowym (n=12 uszu) i 6 myszy kontrolnych (n=l 1 uszu). Istotnosc statystyczna wyników wyznaczono przy uzyciu dwuskrzydlowego testu l\Ianna-Whitneya. Róznice o istotnosci statystycznej p<0,05 sa oznaczone gwiazdka(*), p<0,01 dwiema gwiazdkami (**). Figura 4. - przedstawia reprezentatywna fotografie zamykania otworów w malzowinie usznej u myszy wykonane w 42 dniu po uszkodzeniu po podaniu 48 mg zebularyny (Zeb) w 0,2 ml 2% hydrozelu alginianowego i 0,8 mg kwasu retinowego (RA) rozpuszczonego w 20 µI oleju rzepakowego, a nastepnie zawieszonego w 0,2 ml 2% hydrozelu alginianowego (panel prawy) oraz zdjecie z analogicznie wykonanego eksperymentu kontrolnego, w którym podano jedynie nosnik (panel lewy). Figura 5. -przedstawia zdjecie mikroskopowe pokazujace wzrost nerwów obwodowych w obszarze regeneracji w malzowinie usznej po podaniu alginianowych formulacji zebularyny i kwasu retinowego w dniu 42 po uszkodzeniu. Obecnosc wlókien nerwowych w zregenerowanej tkance jest wykrywana przez barwienie za pomoca. specyficznego wobec neuronów znakowanego tluorescencyjnie przeciwciala przeciwko tubulinie beta 3 (fohh3) (na rysunku kolor bialy). Figura 6. - przedstawia zmiany ekspresji genów sygnalizacji Wnt obserwowane w regenerujacej sie malzowinie usznej u myszy po podskórnym podaniu formulacji hydrozelu alginianowego 2% z zebularyna (Zeb) i z kwasem retinowym (RA) i myszy kontrolnych po podaniu samego alginianu w dniu 7, 14 i 28 po uszkodzeniu. Srednie wartosci stosunku ekspresji genu wzgledem genów referencyjnych wyznaczono dla 3 myszy (n=6 uszu) dla kazdego z dni pomiarowych. Istotnosc statystyczna. wyników wyznaczono przy uzyciu dwuskrzydlowego testu Manna-Whitneya. Róznice o istotnosci statystycznej p <0,05 sa. oznaczone gwiazdka. (*), p <0,01 sa oznaczone dwiema gwiazdkami (**). Slupki bledów odpowiadaja wartosci bledu standardowego sredniej SEM. PL 439912 A1 6/16Przyklad l Przygotowanie i badanie formulacji hydrozeli alginianowych Formulacje hydrozeli alginianowych zostaly sporzadzone w nastepujacy sposób. W pierwszej kolejnosci przygotowano 2% roztwór alginianu sodowego w ten sposób, ze mg czystego alginianu sodowego zawieszano w l ml wody. Formulacje zebularyny przygotowano przez zawieszenie 240 mg zebularyny w I ml 20,ó alginianu sodowego poprzez 30 s homogenizacje w mlynie kulowym stosujac porcelanowe kulki 2 mm przy szybkosci 4 m/s w temp. pokojowej. Formulacje kwasu retinowego przygotowano na dwa sposoby: albo przez zawieszenie 4 mg kwasu retinowego w 1 ml 2% alginianu sodowego, albo przez zawieszenie 4 mg kwasu retinowego rozpuszczonego w O, 1 ml oleju rzepakowego w 1 ml 2% alginianu sodowego przygotowanego wczesniej. W obu przypadkach zawiesiny homogenizowano w mlynie kulowym stosujac porcelanowe kulki 2 mm przy szybkosci 4 m/s w temp. pokojowej. Uzyskane formulacje poddano badaniu mikroskopowemu, które wykazalo homogennosc formulacji alginianowych zebularyny oraz formulacji alginianowej kwasu retinowego z dodatkiem w oleju rzepakowego. Homogennosc formulacji hydrozelowej zebularyny potwierdzaja obserwacje mikroskopowe, które nie wykazuja obecnosci krysztalów lub aglomeratów (Fig 1). Formulacja kwasu retinowego bez dodatku oleju rzepakowego zawierala niewielkie, niewidoczne golym okiem krysztaly kwasu retinowego o równomiernej dystrybucji w hydrozelu (Fig. 1). Fommlacja z olejem ma inna postac, przypominajaca emulsje. Taki obraz mikroskopowy formulacji hydrozelowej kwasu retinowego wskazuje, ze kwas retinowy nie ulega wprawdzie rozpuszczeniu w hydrozelu, co jest typowe dla substancji hydrofobowych, do jakich nalezy ten zwiazek chemiczny, ale poniewaz male krysztaly kwasu retinowego sa rozproszone w calej objetosci hydrozelu, wraz z biodegradacja alginianu, kwas retinowy bedzie sie stopniowo uwalnial do organizmu. Wszystkie trzy formulacje nadawaly sie do sporzadzenia zastrzyków. Badanie wykonane w komorze Franza wykazalo, ze zebularyna stopniowo uwalnia sie z alginianu 2% (Fig. 2), natomiast kwas retinowy, w warunkach komory Franza nie uwalnial sie z formulacji alginianowych. Ta formulacja dziala skutecznie, poniewaz pod skóra alginian ulega biodegradacji i w ten sposób uwalnia kwas retinowy, a wiec brak uwalniania w komorze Franza nie jest niekorzystny. O uwalnianiu sie zebularyny swiadczy wzrastajacy w czasie poziom zebularyny wyrazony jednostkami arbitralnymi PL 439912 A1 7/16(a.u). Przykladowo po l 20 min poziom uwolnionej zebularyny byl wyzszy dwukrotnie (4x10E11 a.u.) niz po 1 h (2x10E11 a.u.). Po 50 h (3000 min) poziom zebularyny osiagnal maksymalna wartosc 1x10E12 a.u. wyzsza o rzad niz po 30 min (1x10E11 a.u.) Przyklad 2 Pobudzenie regeneracji tkanki zlozonej po podaniu kompozycji to jest dwóch formulacji hydrozelowych alginianu z zebularyna 1 z kwasem retinowym, których sposób otrzymywania opisano w przykladzie 1 Ocene przydatnosci formulacji hydrozelu alginianowego z zebularyna i z kwasem retinowym, zawierajacych do 240 mg zebularyny i do 4 mg kwasu retinowego na l ml 2 % hydrozelu alginianowego do pobudzenia proces regeneracji tkanki zlozonej przeprowadzono stosujac model uszkodzenia malzowiny usznej u myszy. Uszkodzenie tkanki wykonano za pomoca laboratoryjnego dziurkacza nozyczkowego poprzez wyciecie otworów o srednicy 2 mm w srodkowej czesci malzowiny usznej. Uzyto samic myszy ze szczepu BALB/c w wieku 8-1 O tygodni w dniu rozpoczecia eksperymentu. Zwierzeta rozdzielono losowo na dwie grupy po 6 osobników. Myszom z pierwszej grupy podano podskórnie w dniu zranienia bezposrednio po wykonaniu zranienia 48 mg zebularyny w 0,2 ml hydrozelu alginianowego 2~o oraz 0,8 mg kwasu retinowego rozpuszczonego zawieszonego w 0,2 ml hydrozelu alginianowego 2% w postaci dwóch bezposrednio po sobie wykonanych zastrzyków. Myszom z drugiej grupy, grupy kontrolnej, podawano podskórnie sam nosnik. Protokól eksperymentów na zwierzetach zostal zatwierdzony przez Lokalna Komisje Etyczna ds. Doswiadczen na Zwierzetach przy Uniwersytecie Technologiczno-Przyrodniczym w Bydgoszczy (nr zgody 50/2016). Uszy byly fotografowane przez 6 tygodni w odstepach tygodniowych. W celu oceny postepów regeneracji powierzchnie otworów w malzowinie usznej wyznaczano przy uzyciu komputerowej analizv dokumentacji fotograficznej. Srednie wartosci procentowe zamkniecia otworu w malzowinie usznej wyznaczone w dniu 42 po uszkodzeniu wynosily dla myszy kontrolnych i myszy po podaniu hydrozelowych formulacji zebularyny i kwasu retinowego odpowiednio 41,73±8,47% SEM i 74,13±2,79 SEM%, p=0,005. Przebieg postepu procesu regeneracyjnego przedstawia Fig. 3. Istotna statystycznie poprawe zarastania otworów w malzowinie usznej u myszy traktowanych hydrozelowa formulacja zebularyny i kwasu retinowego odnotowywano od 7 do 42 dnia po zranieniu. Efekt regeneracji tkanki zlozonej pod podaniu formulacji PL 439912 A1 8/16hydrozelowej alginianu z zebularyna i kwasem retinowym ilustruja reprezentatywne fotografie uszu myszy wykonane w dni 42 po uszkodzeniu Fig. 4, gdzie zmniejszenie rozmiaru otworu stanowi miare odpowiedzi regeneracyjnej. W odtworzonej tkance malzowiny usznej mial miejsce intensywny wzrost drobnych nerwów obwodowych (Fig. 5), co pokazuje silny sygnal pochodzacy od znakowanych fluorescencyjnie przeciwcial przeciwko specyficznej dla neuronów tubulinie beta 3 wystepujacy w calym obszarze odtworzonej. Unerwienie tkanki jest wazne, poniewaz tkanka pozbawiona unerwienia nie jest w pelni funkcjonalna. Po sekcjach zwierzat post-mortem w dniu 42 me znaleziono pod skóra formulacji alginianowych, co wskazuje, ze ulegaja one biodegradacji. Biodegradacja nosnika hydrozelowego tlumaczy dzialanie biologiczne kwasu retinowego w ustroju zwierzecia, mimo ze nie uwalnia sie in vitm. Przyklad 3. Efekt podania hydrozelowych formulacji zebularyny i kwasu retinowego w alginianie na ekspresje genów sygnalizacji Wnt W celu oceny efektu podania hydrozelowych formulacji zebularyny i kwasu retinowego w alginianie na dzialanie sygnalizacji Wnt, której aktywacja jest typowa podczas procesów regeneracyjnych, porównano poziomy transkryptów wybranych genów Wnt w regionie uszkodzenia malzowiny usznej u myszy poddanych dzialaniu tych formulacji myszy kontrolnych, które otrzymaly jedynie nosnik w dniu 7, 14 i 42 po zranieniu. Oznaczenia wykonano dla panelu 13 kluczowych genów sygnalizacji Wnt: A(/3, Dv/2, Fo~ll, Gsk3ct, L!p5, L!p6, Prickle2, S.ftpl, Sfip-1, Tcf3, TV11t-/.a, TVnt5a, VVnt7u. W tym celu po eksperymentach, jak opisano w Przykladzie 2, zwierzeta poddano eutanazji w dniu 7, 14 i 42 po zranieniu. Pobrane tkanki zabezpieczono w odczynniku RNAlater, a nastepnie przechowywano w temp. -80°C. Pierscienie otaczajace rany wycieto z malzowiny usznej stosujac 3 mm sztance biopsyjne. Po dezintegracji tkanek za pomoca recznego homogenizatora mechanicznego, RNA izolowano za pomoca zestawu RNeasy (Qiagen). Poziomy transkryptów wyznaczono metoda ilosciowego PCR w czasie rzeczywistym wzgledem transkryptów referencyjnych Tbp i Actb. Sekwencje nukleotydowe starterów do PCR zestawiono w Tabeli 1. PL 439912 A1 9/16Istotny statystycznie wzrost ekspresji genów Wnt po podaniu formulacji hydrozelowych zebularyny i kwasu retinowego wzgledem mysz kontrolnych zaobserwowano w dniu 7 dla genów Fosll, J,1p5 i Wnt4a. w dniu 14 dla genów A(/3, Prickle2, Tcf3, vVnt5a, a w dniu 42 dla wiekszosci badanych genów tj. Atj3, Dv/2, Fosll, L!p5, L1p6, I'rickle2, Sflpl, ~jip-1, W11Ca (Fig. 6). Przyklady potwierdzaja, ze: Mieszanina po podaniu do orgamzmu ulega biodegradacji zapewmaJac stopnimve uwalnianie kwasu retinowego i zebularyny, co umozliwia pobudzenie regeneracji tkanek, srodek leczniczy stymuluje wzrost nerwów, srodek aktywuje transkrypcje genów sygnalizacji komórkowej istotnych dla regeneracji. Opisano biodegradacje na koncu przykladu 2. Nie znajduje sie hydrozelu po sekcji pod skóra zwierzat. Tabela 1 Sekwencje nukleotydowe starterów uzytych do badania poziomów wybranych transkryptów metoda PCR w czasie rzeczywistym. Gen Starter sensowny Starter antysensowny Actb GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 1hp GAGAGCCACGGACAACTGCG GGGAACTTCACATCACAGCTC A(/3 TTTGCTAACCTGACACCCTTTG AGAGGACATCCGATGGCAGA /)v/2 GTAGGCGAGACGAAGGTGATT CGCTGCAAAACGCTCTTGAA l·'osll ATGTACCGAGACTACGGGGAA CTGCTGCTGTCGATGCTTG Gsk3a CAAGTTCCCCCAGATCAAAGC GGCTAGAGCAGAGTGCAATGG L1p5 ACGTCCCGT AAGGTTCTCTTC GCCAGTAAATGTCGGAGTCTAC L!p6 TGCAAACAGACGGGACTTGAG CGGGGACAATAATCCAGAAACAA Prickle2 CATCAGCAAGCTCATGTTTGAC ACCCAGGCGTACTCTTCCA ~'fipl TACTGGCCCGAGATGCTCAA GAGGCTTCCGTGGTATTGGG Sfip-1 TCCATCCTGGTGGCGTTATG GCATCCGGGTGATGTTCCA fr/3 TTTGACCCTAGCCGGACATAC GCATAGGCATTCCGCTCAC Wnt4a GTCAGGATGCTCGGACAACAT CACGTCTTTACCTCGCAGGA Wnt5a AATGAAGCAGGCCGTAGGA AGCCAGCACGTCTTGAGG Wnt7a TCAGTTTCAGTTCCGAAATGGC CCCGACTCCCCACTTTGAG PL 439912 A1 /16Zastrzezeni a patentowe 1. Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca dwie formulacje hydrozelowe z substancjami czynnymi biologicznie do jednoczesnego zastosowania, z których jedna mieszanina zawiera nie mniej niz 60 mg zebularyny na 1 ml hydrozelu alginianowego sodowego i nie wiecej niz 240 mg zebularyny na 1 ml hydrozelu alginianowego sodowego, a druga mieszanina zawiera nie mmeJ niz I mg kwasu retinowego na I ml hydrozelu alginianowego sodowego i nie wiecej niz 4 mg kwasu retinowego na I ml hydrozelu alginianowego sodowego, przy czym substancje czynne biologicznie, czyli zebularyna i kwas retinowy z kazdej formulacji po podaniu do organizmu uwalniajac sie stopniowo wskutek biodegradacji hydrozelu umozliwia ich laczne dzialanie do zastosowania do pobudzenia regeneracji tkanek 2. Kompozycja wedlug zastrz. 1, znamienna tym, ze alginian sodowy jest od 1 do 2% roztworem w wodzie. PL 439912 A1 11/16Zeb alginian 2% Fig. I. Fig. 2. PL 439912 A1 12/16Postep regeneracji (zamkniecia rany) 100% ** ** ** ** 80% 60% 40% r , , ! , , ,t ---l ---+ ---l % ... , ...... J.' -20% I , Jr , 1 , _ 40 % d:0 d7 d14 d21 d28 d35 -o- Kontrola -e--Zeb+RA/olej Fig. 3. ,. • - ~~---- Fig 4. d42 PL 439912 A1 13/16Fig. 5. PL 439912 A1 14/16140% :i ! 120'K, .,: "' ~ 100"/4 ::; E 80% o "§ 60 st % 11- 40% 160% ::i 140% C. ~ 120'% .,. ., 100(1,/~ C ~ E 80% o 60'% "i,i o 0.. 40% % O'% Markery sygnalizacji Wnt d7 Markery sygnalizacji Wnt d14 . Markery sygnalizacji Wnt d42 ** Fig. 6. _. Zeb+RA Alginian 2¾ CAlginian 2'Yo Zeb+RA Alginian 2% O Alginian 2% Zeb+RA .Alginian 2% ? Alginian 2% PL 439912 A1 /16al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA NR P.439912 Klasyfikacja zgloszenia: A61K47 /36 (2006.01), A61K31/7068 (2006.01), A61K31/203 (2006.01), A61Pl 7 /02 [2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: A61K, A61P Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: bazy danych UPRP, EPOQUENET Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz. A PL423672A1: UNIWERSYTET GDANSKI: POLITECHNIKA GDANSKA: 1, 2 GDANSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY: INST BIOLOGII DOSWIADCZALNEJ IM M. NENCKIEGO PAN: MEDVENTURES sp. z o.o. [PL]: 2019-06-03 A Sass P, Sosnowski P, Podolak-Popinigis J, Górnikiewicz B, Kaminska J, 1, 2 Deptula M, Nowicka E, Wardowska A, Ruczynski J, Rekowski P, Rogujski P, Filipowicz N, Mieczkowska A, Peszynska-Sularz G, Janus L, Skowron P, Czupryn A Mucha P, Piotrowski A, Rodziewicz-Motowidlo S, Pikula M, Sachadyn P. Epigenetic inhibitor zebularine activates ear pinna wound closure in the mouse. EBioMedicine. 2019 Aug;46:317-329. doi: .1016/j.ebiom.2019.07.01 O. Epub 2019 Jul 11 ? Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stano\\'iacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszehstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia claty publikacji innego L')'tcnvanego doku1nentu lub z innego szczególnego pcnvoclu, O - dokument odnoszaty sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, r - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia rnsad lub teorii lezacych u podstaw \\ynal8zku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za no\\Y lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, y dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany ,rynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom ,\ynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Liliana Nogala Ekspert data 31.08.2022r. /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektroniczne_go Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane zastrzezen patentowych nr z dnia 2020-12-20 PL 439912 A1 16/16 PL PL PL