PL440401A1 - Panel białkowy do sposobu diagnozowania płynów opłucnowych i sposób analizy płynów opłucnowych do diagnozowania etiologii płynu opłucnowego - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie dotyczy panelu białkowego do sposobu diagnozowania płynów opłucnowych z zastosowaniem opartej na spektrometrii mas (MS) multipleksowanej celowanej proteomiki z wykorzystaniem metod MS selektywnego, wielokrotnego lub równoległego monitorowania reakcji (SRM, MRM, PRM). Zgłoszenie również dotyczy sposobu analizy płynów opłucnowych do diagnozowania etiologii płynu opłucnowego.

Description

Panel bialkowy do sposobu diagnozowania plynów oplucnowych i sposób analizy plynów oplucnowych do diagnozowani etiologii plynu oplucnowego Wynalazek dotyczy panelu bialkowego do sposobu diagnozowania plynów oplucnowych z zastosowaniem opartej na spektrometrii mas (MS) multipleksowanej celowanej proteomiki z wykorzystaniem metod MS selektywnego, wielokrotnego lub równoleglego monitorowania reakcji (SRM, MRM, PRM). Wynalazek równiez dotyczy sposobu analizy plynów oplucnowych do diagnozowani etiologii plynu oplucnowego.

Plyn oplucnowy powstaje wskutek nieprawidlowego (nadmiernego) gromadzenia sie plynu w jamie oplucnowej. Jego powstawanie najczesciej towarzyszy nowotworom pluca, w tym gruczolakoraka pluc (ADC), raka plaskonablonkowego (SCC), drobnokomórkowego raka pluc (SCLC), oraz innym nowotworom zlosliwym, zapaleniu pluc, gruzliczemu zapaleniu oplucnej, a takze niewydolnosci serca i nerek, jednak znacznie rzadziej wystepuje równiez w przebiegu 30 innych jednostek chorobowych (Feller­ Kopman i Light, 2018; Mercer i in„ 2019). Plyny oplucnowe sa skutecznie rozrózniane na podstawie parametrów biochemicznych surowicy krwi i plynu oplucnowego oraz kryteriów Lighta. na plvnv przesiekowe zwykle powodowane chorobami ukladowymi (takimi jak niewydolnosc serca, nerek, watroby), i wysiekowe. zwykle powodowane chorobami pluc lub oplucnej (np rak pluca, grnzlica oplucnej, zapalenie pluc) (Fellcr­ Kopman i Light, 2018).

Istotne wyzwanie diagnostyczne stanowi dalsze róznicowanie ,vysi<;:ków, np. spowodowanych novvotworem od wysieków gruzliczych lub spowodowanych zapaleniem pluc od wysieków gruzliczych, co wynika z podobie11stwa ich profili biochemicznych i komórkowych. Na przyklad nowotworom i chorobom zwiazanym z przewleklym stanem zapalnym, takim jak gruzlica, na ogól towarzyszy wysiek limfocytarny, podczas gdy wysieki wywolane zapaleniem pluc i niektóre wysieki gruzlicze, charakteryzuja sie wysokim poziomem neutrofili (Mercer i in., 2019).

Ustalenie etiologii plynu jest kluczowe dla wdrozenia odpowiedniego leczenia, jednak obecnie stosowana diagnostyka jest procesem czasochlonnym czesto prowadzacym do inwazyjnych procedur, takich jak torakoskopia, których w wielu przypadkach mozna bylo uniknac. Plyn oplucnowy jest rutynowo usuwany podczas PL 440401 A1 2/71maloinwazyjnej procedury torakocentezy. w celach terapeutycznych (zlagodzenia dusznosci) i diagnostycznych oraz, ze wzgledu na jego umiejscowienie w poblizu stanu patologicznego, jest idealnym zródlem potencjalnych markerów nowotworu pluca oraz innych chorób pluc i oplucnej o podlozu zapalnym (Mercer i in .. 2019).

Nalezy podkreslic, ze obecnie stosowane testy kliniczne pozwalaja na diagnostyke bardzo nielicznych stanów patologicznych na podstawie analizy wysieków. Stosowane testy diagnostyczne wysieków. cechuja sie wvsoka specyficznoscia, lecz ich istotnym ograniczeniem jest niska czulosc (Mercer i in .. 2019). np. badanie cytologiczne osadu do diagnostyki wysieków nowotworowych ma czulosc ponizej 60 %. W przypadku gmzlicy oplucnej na wyniki testów opatiych na metodach mikrobiologicznych, bedacych „zlotym standardem". czeka sie az dwa tygodnie. a ich czulosc wynosi ponizej 63 %, podczas gdy czulosc szybkiego lcslu genetycznego w kierunku Mycohaclerium luhcrculosis w plynie oplucnowym (Xpert l'vITB/RIF) wynosi ponizej 23 % (Jose M. Porcel, 2016, 2018).

Choroby infekcyjne pluc i oplucnej odznaczaja sie wysoka smiertelnoscia, a metoda bedaca „zlotym standardem" w ich diagnostyce, czyli hodowla patogenów w wysieku. ma czulosc ponizej 60 o/c i wymaga duzo czasu (Mercer i in., 2019). Ponadto testy biochemic,me wysieków nowotworowych i infekcyjnych moga dawac podobne wyniki.

Zostalo to doskonale przedstawione obecnie w prospektywnym badaniu. w którym testowano na duzej gmpie plynów oplucnowych poziom biomarkerów oraz innych parametrów laboratoryjnych stosowanych w praktyce klinicznej. Na podstawie analizy statystycznej otrzymanych wyników wyloniono szesc klastrów plynów oplucnowych - nowotworowych. gmzliczych. ropnych. zwiazanych z niewydolnoscia serca. zapaleniem pluc o róznym stopniu zac1wansowania ornz wieloma innymi chorobami (Fcrrciro i in., 2020) Jednak ,vykazano, ze plyny o tej samej etiologii czesto byly przydzielane do osobnych grup, podczas gdy wyst9powalo grupowanie razem plynów o róznych etiologiach. Powyzsze wyniki podkreslaja. jak wielkim wyzwaniem jest klasyfikacja plynów oplucnowych i wskazuja na ogromne znaczenie w zastosowaniu do tego celu multipleksowanych paneli markerów. W ostatnich latach zaproponowano wiele markerów bialkowych stosowanych w praktyce klinicznej oraz potencjalnych markerów, wylonionych eksperymentalnie, aby wspomóc rozróznianie etiologii plynów, a tym samym wdrazanie odpowiedniego leczenia (Chen i in., 2014; Liu i in., 2015; Jose M. Parcel, 2018).

Przykladowo w zgloszeniu CN107064524A opublikowanym 18 sierpnia 2017 r. opisano uklad do wykrywania poziomów IGKC, C9, AHSG i KNGl do róznicowania plynów oplucnowych gruzliczych i nowotworowych. Jednak w opisie tym testy PL 440401 A1 3/71immunoenzymatyczne stosuje sie zamiennie z oznaczeniem spektrometria mas. Podobnie w zgloszeniu CN109490556A opublikowanym 19 marca2019 r. opisano rozróznianie plynów oplucnowych gruzliczych i nowotworowych na podstawie poziomów markerów: AGPl. ORM2 i C9.

W opisie patenLowym opublikowanym w dn. 2 ma1a 2013 r. pod nr WO/2013/062515 opisano panel biomarkerów do testów diagnostycznych pod katem nowotworu pluc obejmujacv CA6 jako glówny marker nowotworowy we krwi w kombinacji z co najmniej jednym z 22 markerów nowotworowych w tym m. in. YWHAG.

MMP12. MMP7. KLK3-SERPINA3. CRP. C9 i inne.

Celowana proteomika oparta na metodach spektrometrii mas znajduje sie u progu wejscia do praktyki klinicznej i niezaprzeczalnie jest przyszloscia diagnostyki opartej na markerach bialkowych (Sabhagh i in .. 2016; Zhang i in .. 2019). Spektrometrie mas (MS) stosuje sie rutynowo w praktyce klinicznej do ilosciowego oznaczania malych czasteczek, a od niedawna pomiar peptydów/bialek przy uzyciu ukierunkowanych technologii opartych na spektrometrii mas. zastepuje lub uzupelnia przestarzale techniki oparte na reakcjach z przeciwcialami (Hoofnagle i Roth, 2013; Jannetto i Fitzgerald. 2016; Neuberl i in., 2020). Zastosowanie podejsc celowanej proteomiki opartej na metodach spektrometrii mas (trybu monitorowania wielu/wybranych. reakcji, MRM/SRM, ang. Multiplc/Sclcctcd Reaction Monitoring lub trybu równoczesnego monitorowania reakcji. PRM. ang. Parallel Reaction Monitoring) moze pomóc w przezwyciezeniu wielu kwestii (reakcje krzyzowe, zmienna specyficznosc przeciwcial, autoprzeciwciala wytwarzane w organizmie pacjenta, brak mozliwosci multipleksowania analiz. wysokie koszty opracowywania metody) towarzyszacych stosowaniu testów immunologicznych, które przez wiele lat pozostawaly „zlotym standardem" do ilosciowego oznaczania bialek (Hoofnaglc i Roth, 2013; Zhang i in., 2019).

Panele MRM/SRM/PRM z zastosowaniem standardów bedacych peptydami znakowanymi izotopowa, dostarczaja specyficznych infomrncji biologicznych, sa tansze i szybsze w opracowywaniu, zapewniaja wysoka specyficznosc i precyzje analiz, a takze charakteryzuja sie szerszym zakresem dynamicznym oraz mozliwoscia jednoczesnego pomiaru wielu bialek podczas pojedynczej, szybkiej analizy (Sabhagh i in., 2016; Zhang i in., 2019). W pelni zautomatyzowany i certyfikowany analizator kliniczny oparty na MRM-MS (Thermo Scientific™ Cascadion™) zostal niedawno wprowadzony do analizy zwiazków maloczasteczkowych (Horber i in., 2020) i nastepnym krokiem mogloby byc wprowadzenie analizatora klinicznego opartego na MRM-MS do ilosciowego oznaczania markerów bialkowych w ludzkim materiale biologicznym (Addona i in., 2020; Wright i PL 440401 A1 4/71Van Eyk, 2017). Stad ,v poprzedniej pracy twórcy opracowali lesl oparly na MRM-MS, do ilosciowego oznaczania wielu cytokeratyn nablonkowych (CK), obecnie stosowany do okreslania nowotworowych stanów patologicznych, aby pomóc w ustalaniu etiologii plynów oplucnowych.

W retrospektywnym badaniu plynów oplucnowych pobranych od pacjentów podczas torakocentezy. twórcy wykazali, ze test wedlug wynalazku skutecznie róznicuje plvny nowotworowe od plynów nienowotworowych (Domanski i in .. 2016). Opracowany przez twórców test, stanowi maloinwazyjna analize plynów oplucnowych. oparta na „plynnej biopsji", w przeciwienstwie do inwazyjnej procedury wyciecia guza lub hiop-;ji tkanki oplucnej. Umozliwia równiez klasyfikacje róznych podtypów nowotwom pluca i potencjalnie skraca czas potrzebny do postawienia diagnozy i wdrozenia ukienmkowanej terapii, co jest szczególnie wazne dla pacjentów, którzy nie moga zostac poddani zabiegowi chirurgicznemu (Domansk.i i in., 2016; Perzanowska i in .. 2018).

Obecnie panel MRM zostal rozszerzony do 53 bialek, z wprowadzeniem dodatkowych opracowanych markerów nowotworowych, gruzlicy stanu zapalnego/infekcji, bedace markerami stosowanymi pojedynczo w praktyce klinicznej oraz potencjalnymi markerami, opracowanymi w wyniku doswiadczen, a takze opublikowanymi w literaturze naukowej. do klasyfikacji plynów oplucnowych. Celem opracowania testu bylo zapewnienie optymalnego zestawu markerów (bialek i uzyskanych z nich peptydów), które umozliwiaja uzyskanie najbardziej wiarygodnych oznaczen przy uzyciu celowanej spektrometrii mas do diagnostyki etiologii plynu oplucnego, a takze latwego przeniesienia testu do standardowego analizatora klinicznego (MRM-MS). nieskomplikowanego protokolu przygotowani a próbki do analizy (bez etapów wzbogacania ani deplccji), a bedace celem bialka zostaly wyselekcjonowane ze wzgledu na ich poziom st9zenia w plynach oplucnowych (> 1 ng/ml), tak aby pomiar ich st9zen nic wymagal stosowania metod wzbogacania.

Istotnym, sposród analizowanych bialek w panelu bialek jest k.adheryna-1 (CDHl) (E-kadheryna) bedaca skladnikiem polaczen przylegajacych, odgrywajaca wazna role w adhezji miedzykomórkow~ tkanek nablonka. Jest ona potencjalnym biomarkerem do diagnostyki zaawansowanego raka jelita grubego, w surowicy krwi (Weif3 i in., 2011).

Odnotowano, ze jej poziom jest podwyzszony w plynach nowotworowych i zostala wybrana jako jeden z szesciu najlepszych, potencjalnych biomarkerów oprócz inhibitora proteazy typu Kunitz 1 (SPINTl), mucyny-1 (MUCl/CA 15-3), trombospondyny-4 (THBS4), antygen CD166 (ALCAM) i domeny sushi, czynnika von Willebranda typu A EGF i bialka 1 zawierajacego domene pentraksyny (SVEPl) (C.-D. Chen i in., 2014).

PL 440401 A1 /71Chen i in. przeprowadzili analize MR1I na 82 plynach oplucnowych i zastosowali etap wzbogacenia próbki. Odnotowali SPINTl (AUC: 0,916), CDHl (AUC: 0,815) i MUCl (AUC: 0,807) jako glówne markery pozwalajace na rozróznienie plynów nowotworowych, spowodowanych wylacznie przez gruczolakoraka. Ponadto, jako kontrole w tym badaniu zastosowali plyny gruzlicze, plyny parapneumoniczne i paranowotworowe (plyny oplucnowe zwiazane z nowotworem pluca, ale bez stwierdzonych przerzutów). co zapewne podwyzszylo uzyskane wartosci AUC. Na podstawie modelu regresji logistycznej wybrali najlepszy panel 3-markerowy, skladajacy sie z SPINTI, SVEPl i THBS4 (AlJC: 0,951 ).

SVEPl jest wazna czasteczka adhezyjna komórek, regulujaca adhezje miedzykomórkowa, uczestniczaca w progresji raka (L. Chen i in., 2020; Shur i in , 2007).

THBS4 jest zewnatrzkomórkowym bialkiem wiazacym wapn, bioracym udzial w interakcjach komórka-komórka i komórka-macierz, i stwierdzono jego nadekspresje w zrebie nowotworowym gruczolakoraka zoladka typu rozlanego wydzielanym przez fibroblasty zwiazane z rakiem oraz w podscielisko inwazyjnego raka sutka (Forster i in., 2011; McCart Reed i in., 2013).

MUCl, znany równiez jako antygen nowotworowy 15-3 (CA 15-3), jest duza glikoproteina przezblonowa, ulegajaca ekspresji na powierzchni wierzcholkowej najprostszych komórek wydzielniczych nablonka, która ulega autoodszczepieniu na dwie podjednostki (MUCl-N i MLCl-Cl (Hattrup i Gendler. 2008). a jego nadekspresja wvstepuje w róznych nowotworach, w tym nowotworze pluca (Nath i Mukherjee, 2014).

Krazacy MUCl-N stosuje sie jako serologiczny marker (CA 15-3) w praktyce klinicznej clo monitorowania rab sutka (Kufo, 2009). CA 15-3 stosowany w praktyce klinicznej, oceniano w panelu wraz z trzema innymi markerami nmvotworowymi (CEA, CA 125 i CYFRA 21-1 (CK-19)) pod katem uzytecznosci do diagnostyki plynów nowotworowych, a CA 15-3 analizowany samodzielnie, mial najlepsza sposród nich czulosc na poziomie % (przy 100 % swoistosci). Polaczenie wszystkich czterech markerów razem dalo czulosc 54 % (Jose Manuel Parcel i in., 2004).

Hemopeksyna (HPX) jest powszechnie wystepujaca glikoproteina osocza wiazaca hem, z ta wazna fizjologiczna rola wymagana do zapobiegania uszkodzeniom oksydacyjnym podczas hemolizy (Tolosano i Altruda, 2002). Stwierdzono, ze poziom HPX byl wyzszy w plynach nowotworowych (gruczolakorak/ niedrobnokomórkowy rak pluca) w porównaniu z plynami gruzliczymi/ parapneumonicznymi (Rodnguez-Pifieiro i in., 2010; Z. Wang i in., 2012), ale jest to takze bialko reagujace w ostrej fazie, indukowane po zapaleniu (Tolosano i Altruda, 2002).

PL 440401 A1 6/71Mezolclina (MSLN) jest normalnie produkowany glównie przez komórki mezotelialne, lecz takze jest antygenem zwiazanym z nowotworem, ulegajacym nadeksprcsji na róznych zlosliwych komórkach nowotworowych, w tym zlosliwym miedzybloniaku oplucnej (ereaney i Robinson, 2017). Jest to marker surowicy stosowany do monitorowania miedzybloniaka oplucnej. Badania wykazuja takze jego wyzsze poziomy w plynach oplucnowych u pacjentów z zlosliwym miedzybloniakiem oplucnej, natomiast odnotowano takze wiele falszywie dodatnich wynikow w innych plynach nowotworowych (Hooper i in .. 2013; Miettinen i Sarlomo-Rikala, 2003) Analiza guzów pluca wykazala, ze MSLJ\ ulegal nadekspresji w polowie gmczolakoraków, w rakach wielkokomórkowych i raku plaskonablonkowym, ale nadekspresja nie wystepowala w raku drobnokomórkowym (\1ettinen i Sarlomo-Rikala, 2003).

W ARS jest indukowana inte1feronem-'Y, cytoplazmatyczna forma syntetazy tryptofanylo-tRNA. W ARS byla podwyzszona w ludzkich makrofagach zakazonych Mycobacterium tuberculosis oraz w surowicy krwi pacjentów z aktywna gruzlica pluc, bedac jednym z trzech najlepszych, potencjalnych biomarkerów gruzlicy (De Groote i in., 2017; Diaz i in., 2016).

Chemokina CXCLlO (CXCLlO), znana równiez jako bialko indukowane interferonem-')' 10 kDa (IP-10), jest cytokina nalezaca do rodziny chemokin exe (M Liu i in, 20 I I). Przyciaga do miejsc objetych stanem zapalnym monocyty aktywowane limfocyty T. i sprzyja selektywnemu wzmocnieniu odpowiedzi Th I zwiekszonej produkcji IFN-y. Podwyzszony poziom CXCL l O w plynach gruzliczych, podobnie jak eeaminaza adenozynowa ADA i TFN-y, wskazuje na ostra chorobe i sugeruje sie jej uzycie jako cloclatkowcgo markera cliagnostycznego (K.-Y. Chen i in., 2016; Dhecla i in., 2009; Roofchayee i in, 2021) Siedem wczesniej szych badan, w których stezenie CXCLl O mierzono metoda ELISA, vYykazalo srednia czulosc 84 o/c i swoistosc 90 % w identyfikacji plynu gruzliczego (Jose l\I. Porcel, 2016).

ADA reprezentowana przez dwa izoenzymy (ADAl i ADA2), bierze udzial w metabolizmie puryn i katalizuje dearninacje adenozyny do inozyny, czasteczki sygnalowej, która ma kluczowe znaczenie dla rozwoju ukladu limfatycznego (Cristalli i in., 2001).

ADA 1 stanowi wiekszosc wewnatrzkomórkowej aktywnosci ADA, podczas gdy ADA2 jest wydzielana specyficznie przez uklad komórek monocytów-makrofagów oraz limfocyty Ti jest dominujacym izoenzymem w plynach gruzliczych (Bielsa i in., 2013; Cristalli i in., 2001; Zemlin i in., 2009). Przydatnosc pomiaru calkowitej aktywnosci ADA w diagnostyce gruzlicy oplucnej zostala po raz pierwszy opisana w 1978 roku i do dzis pozostaje najbardziej wyspecjalizowanym biomarkerem plynu gruzliczego (Jose M.

PL 440401 A1 7/71Parcel, 2016). Z p1ecw metaanaliz wynika, ze pon11ar aktywnosci ADA w plynie oplucnowym ma czulosc 92 % i swoistosc 90 % (Jose M. Porcel, 2016). Wykazano, ze pomiar aktywnosci ADA2 jest lepszy niz pomiar calkowitej aktywnosci (Zemlin i in., 2009), jednak w testach stosowanych w praktyce klinicznej nadal mierzy sie calkowita aktywnosc ADA.

Bialko S100A9 (S100A9) jest bialkiem wiazacym wapn., które wystepuje glównie jako heterodimer S 1 O0A8/ A9 (kalprotektyna) i jest wydzielane przez neutrofile i monocyty modulujac procesy zapalne poprzez stvmulowanie rekrntacji leukocytów i indukowanie wydzielania cytokin, majace potencjal jako marker diagnostyczny dla chorób zwiazanych ze stanem zapalnym (S. Wang i in., 2018).

Surowicze bialko amyloidu P (APCS) (skladnik surowiczy amyloidu P lub SAP) jest bialkiem osocza, które podobnie jak bialko C-rcaktywnc (CRP) nalezy do rodziny pentraksyn bialek wiazacych ligandy zalezne od vvapnia i jest zwiazane z kilkoma patogennymi stanami amyloidu (Pcpys, 2018). Hamuje on przemieszczanie sie neutrofili do tkanek, sprzyja rozwiazywaniu stanów zapalnych i zwlóknienia, promuje fagocytoze i reguluje róznicowanie makrofagów (Pilling i Gorner, 2018). Wyzsze poziomy Sl00A9 i APCS wykryto w plynach parapneumonicznych (a takze w plynach gruzliczych w przypadku APCS) w porównaniu z plvnami nowotworowymi (gruczolakoraka) (Z. Wang i in., 2012).

CRP jest bialkiem ostrej fazy zapalenia, wykorzystywanym w praktyce klinicznej jako marker infekcji i incydentów sercowo-naczyniowych (Sproston i Ashworth, 2018).

Byl on podwyzszony w plynach infekcyjnych, w tym gruzliczych, parapneumonicznych i ropniakach, w porównaniu do plynów nowotworowych i przesieków (Tzhakian i in, 2016; J.M. Parcel i in., 2009; Watanabe i in, 2018). Metaanaliza 18 publikacji wykazala rozsadna zdolnosc diagnostyczna CRP dla plynów parapncumonicznych (AUC: 0,88, czulosc 80 ~o, swoistosc 82 o/c) (Li i in., 2019).

Wimentyna (VIM) to posrednie bialko filamentowe typu III zaangazowane w utrzymywanie integralnosci komórkowej i inne procesy, takie jak przylaczanie, migracja i sygnalizacja komórek (Ramos i in., 2020; Satelli i Li, 2011). Klasycznie, jest markerem przejscia nablonkowo-mezenchymalnego (EMT), wiaze sie ze zlym rokowaniem i stwierdzono jego nadekspresje w róznych nowotworach nablonkowych, w tym raku pluca (Satelli i Li, 2011). VIM byl podwyzszony na powierzchni ludzkich monocytów zakazonych M. tuberculosis i jako ligand posredniczyl w ich lizie przez komórki NK (Diaz i in., 2016; Garg i in., 2006).

PL 440401 A1 8/71Galek.tyna 1 (LGALSl) to lek.tyna o funkcjach przeciwzapalnych (Camby i in., 2006; Sundblad i in., 2017). Jej nadekspresja zostala zaobserwowana w ostrym i przewleklym zapaleniu, ale takze w kilku typach nowotworów, w tym raku pluca, gdzie moze wplywac na progresje nowotworu (Astorgues-Xcrri i in., 2014; Sundblad i in., 2017).

Mundt i in. wykazali nadekspresj e LGALS l w plynach zwiazanych z gruczolakorakiem w porównaniu z plynami zwiazanymi z miedzybloniakiem, podczas gdy Javadi i in. stwierdzili cos wprost przeciwnego, przv czym obaj twierdzili, ze LGALS I jest potencjalnym markerem miedzyhloniaka (.Javadi i in, 2020: Mundt i in, 2014) Metaloproteinaza 9 iMMP9. zelatynaza B) stymuluje lub hamuje proces degradacji macierzy zewnatrzkomórkowej (ECM), a jej nadekspresja jest zwiazana z róznymi nowotworami, a takze z ostrymi i przewleklymi chorobami zapalnymi oraz infekcjami (l\Jondal i in, 2020). MMP9 bylo podwyzszone w plynach gruzliczych w porównaniu z przesiekami i plynami nowotworowymi, i bylo wytwarzane przez komórki nablonkowe w ziarniniakach (Park i in., 2005; Jose M. Parcel i in .. 2016; Sheen i in., 2009).

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) jest niezbednym enzymem cytozolowym, odwracalnie przeksztalcajacym pirogronian w mleczan. Jest to homo- lub heterotelramer, tworzacy piec izoenzymów, rózniacych sie udzialem podjednostek LDHA i LDHB oraz rozmieszczeniem tkankowym (Urbanska i Orzechowski, 2019). LDH jest uwalniany przez uszkodzone komórki, a calkowity LDH w surowicy jest bardzo czulym, ale niespecyficznym markerem wielu stanów chorobowych (Erez i in, 2014). Aktywnosc LlJH stosuje sie do róznicowania przesieku i wysieku oplucnowego, przy czym wvsieki, zwlaszcza skomplikowane wysieki parapneumoniczne i grnzlicze, charakteryzuja sie wyzszym LDH (Feller-Kopman i Light, 2018; Jose M Parcel i Light, 2006) Ostatecznie opracowany test MR\1 obejmujacy panel 34 markerów bialkovvych zastosowano do analizy 209 plynów oplucnowych o znanej etiologii, w celu oceny uzytecznosci zastosowania tego sposobu do klasyfikacji plynów nowotworowych, gruzliczych, infekcyjnych oraz spowodowanych niewydolnoscia narzadów (innych niz pluca). Stosujac model klasyfikacji wieloklasowej, test wedlug wynalazku wykazuje wysoka zdolnosc do rozrózniania wyzej wymienionych typów plynów oplucnowych, a szczególnie plynów nowotworowych i gruzliczych, których róznicowanie jest bardzo istotne z medycznego punktu widzenia. Co wiecej test umozliwia odróznienie plynów nowotworowych i infekcyjnych od plynów spowodowanych niewydolnoscia narzadów, stanowiacych glównie przesieki, i obejmujacych szeroka game etiologii, które dotychczas byly pomijane przez wiele grup badawczych i czesto obnizaly swoistosc proponowanych testów lub biomarkerów (Pan i in., 2020; Jose M. Parcel i in., 2016).

PL 440401 A1 9/71S treszczcnie , v ynalazku Przedmiotem wynalazku jest panel bialkowy skladajacy sie z markerów bialkowych i odpowiadajacych im peptydów wymienionych w ponizszej tabeli 1.

Panel bialkowy wedlug wynalazku jest przeznaczony do sposobu 111 vitro diagnozowania plynów oplucnowych z zastosowaniem opartej na spektrometrii mas (MS) multipleksowanej proteomiki celowanej z wykorzystaniem metod MS selektywnego, wielokrotnego lub równoleglego monitorowania reakcji (SRM, MRM. PRM ).

W panelu wedlug wynalazku wykryty i oznaczony ilosciowo. zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: kadheryna-1 (CD Hl), tromhospondyna-4 (THBS4 ). mezotelina (MSLN). mucyna-1 (MUCl/CA 1 S-3). domena sushi, czynnik von Willehranda typu A EGF i bialko 1 zawierajace domene pentraksyny (SVEPl), inhibitor protea.r,y typu KuniL1_ 1 (SPINTl), hemopeksyna (HPX). antygen CD166 (ALCAM). kallistatyna (SERPINA4). keratyna 8 typu Il cyloszkielctu (CK-8), keratyna 18 typu I cytoszkieletu (CK-18), keratyna 19 typu I cytoszkicletu (CK-19), wskazuje na plyn nowotworowy, czyli plyn zwiazany z nowol worem.

W panelu wedlug wynalazku wykryty i oznaczony ilosciowo. zwiekszony poziom nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów w plynie oplucnowym: CDHl, MUCL THBS4. MSLN. HPX wskazuje na plyn nowotworowy. Korzystnie w panelu wedlug wynalazku wykryty okreslony ilosciowo, zwiekszony poz10m luh odpowiadajacych 1111 peptydów CDH 1 w plynie oplucnowym wskazuje na plyn nowotworowy.

W panelu wedlug wynalazku wrykryty i okreslony ilosciowo. zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: dcaminazy adenozyny 2 (ADA2), chcmokiny CXCLlO (CXCLlO) i syntetazy tryptofanylo-tRNA, cytoplazmatycznej (WARS) wskazuje na plyn gruzliczy, czyli plyn oplucnowy spowodowany zapaleniem oplucnej w wyniku infekcji Mycobacterium tuberculosis.

Korzystnie w panelu wedlug wynalazku wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom ADA2 i jej peptydów w plynie oplucnowym wskazuje na plyn gruzliczy.

W panelu wedlug wynalazku wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: wimentyny (VIM), galektyny 1 (LGALSl), osoczowego bialka amyloidu P (APCS), bialka SlOOA9, metaloproteinazy 9 (MMP9), dehydrogenazy mleczanowej A (LDHA) i bialka C­ reaktywnego (CRP), wskazuje na plyn parapneumoniczny, inaczej inny plyn infekcyjny.

PL 440401 A1 /71Korzystnie, w panelu wedlug wynalazku wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnov\ym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CRP, S100A9, VIM, a korzystniej CRP i S100A9, wskazuje na inny plyn infekcyjny.

W panelu wedlug wynalazku wykryty i okreslony ilosciowo, zmieniony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: HPX, LDHA dehydrogenazy mleczanowej B (LDHB). skladowych dopelniacza C3. C9. SYEPl wskazuje na plyn lagodny, wynikaja.cy z chorób innych niz nowotworv i infekcje Korzystnie w panelu wedlug wynalazku wykryty i okreslony ilosciowo, obnizony poziom w plynie oplucnmvym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA, LDHB, C3, C9, HPX wskazuje na plyn lagodny. Korzystniej w panelu wedlug wynalazku wykryty i okreslony ilosciowo, obnizony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA i C9, wskazuje na plyn lagodny.

Przedmiotem wynalazku jest panel bialkowy i sposób, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo markery bialkowe o sekwencjach wskazanych jako sekwencjach o numerach: 1 i 2. 4. 5 i 7, 8. 10 i 11. 14, 16 i 17, 18-20, 23. 24-26, 29, 30, 33-35, 36 i 37. 40 i 42. 44 i 45, 48, 50 i 51, 54 i 57, 58, 60 i 61, 63, 67-70. 71. 72 i 75. 79, 80-83. 84-86, 87-89. 90 i 91, 92-94. 95 i 97. 98-102 oraz 104-108 Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób in vitro analizy plynu oplucnowego do diagnozowania jego etiologii, w którym to sposobie wykrywa sie i oznacza ilosciowo panel bialek skladajacy sie z markerów bialkowych i odpowiadajacych im peptydów wymienionych w tabeli 1 w plynie oplucnowym pobranym od pacjenta, oraz w którym wykrywanie i oznaczenie ilosciowe przeprowadza sie przy uzyciu opartej na spektrometrii mas multipleksowej ukierunkowanej proteomiki, w której obecnosc lub zmiana poziomu bialka lub jego odpowiedniej kombinacji peptydowej, vYskazuje na etiologi9 plynu oplucnowego.

W sposobie wedlug wynalazku analize plynu oplucnowego przeprowadza sie przy uzyciu opartej na spektrometni mas (MS) multipleksowanej celowanej proteomiki z zastosowaniem metod MS selektywnego, wielokrotnego lub równoleglego monitorowania reakcji (SRM, MRM, PRM).

W sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym markerów bialkowych i odpowiadajacych im peptydów w porównaniu z poziomem stezenia bialek lub peptydów odniesienia oznaczonym w grupie odniesienia.

PL 440401 A1 11/71W sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CDHl, THBS4, MSLK, MUCl/CA 15-3. SVEPl. SPINTl, HPX, ALCAM, SERPINA4, CK-8, CK-18, CK-19, przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn nowolworowy. Korzystnie w sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydow: CDH L MUCI. THBS4. MSLN. HPX. przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn nowotworowy W sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym CDHl i jej odpowiednich peptydów, przy czym obecnosc i zwiekszony poziom CDHl wskazuje na plyn nowotworowy.

W sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: ADA2, CXCLlO i WARS, przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn gruzliczy, czyli plyn oplucnowy spowodowany zapaleniem oplucnej w wyniku infekcji Mycobaclerium luberculosis. Korzystnie w sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu ADA2 w plynie oplucnowym, prLy cLym jej obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn gruzliczy.

W sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: VIM. LGALS I. APCS. S 1 OOA9, MI\IP9, LDHA i CRP, przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn parapneumoniczny, inaczej inny plyn infekcyjny.

Korzystnie w sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza iloscimvo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CRP, S100A9, VIM, przy czym ich obecnosc i z,yi9k:szony poziom wskazuje na inny plyn infekcyjny. Korzystniej obecnosc i zwiekszony poziom CRP, S 100A9 i odpowiadajacych im peptydów wskazuje na inny plyn infekcyjny.

W sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: HPX, LDHA, LDHB, C3, C9, SVEPl, przy czym ich obecnosc i obnizony poziom wskazuje na plyn lagodny, wynikajacy z chorób innych niz nowotwory i infekcje.

Korzystnie w sposobie wedlug wynalazku wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA, LDHB, C3, C9, HPX, przy czym ich obecnosc i obnizony poziom PL 440401 A1 12/71wskazuje na plyn lagodny. Korzystniej obecnosc i obnizony poZiom LDHA 1 C9. 1 odpowiadajacych im peptydów wskazuje na plyn lagodny.

Przedmiot wynalazku zostal przedstawiony jako panel markerów bialkowych odpowiadajacych im peptydów wymienionych w tabeli 1.

Tabela 1: Markery bialkowe wykryte i zmierzone ilosciowo w plynie oplucnowym sposród 53 bialek testowanych w tym badaniu. Obejmuja one biomarkery stosowane w praktyce klinicznej oraz potencjalne biomarkery opublikowane w literaturze naukowej o potencjale diagnostycznym do okreslania etiologii plynów oplucnowych, wykrywania nowotworów lub chorób infekcyjnych w badaniach osocza knvi, przy uzyciu biochemicznych lub opartymi na przeciwcialach testach diagnostycznych, lub przy uzyciu technik badawczych, takich jak globalna i ukierunkowana spektrometria mas lub metody jedno- i multi-pleksowe oparte na przeciwcialach. Dwadziescia dziewiec bialek (ADA 1 i ADA.2 (reprezentujace ADA). C3, C9, CEA/CEAC.Alv15, CK-6, CK-7, CK-8, CK-14, CK- 17, CK-18, CK-19, CRP, GRP, IFNG, LDHA, LDHB i LDHC (reprezentujace LDH), MSLN, MUC-1/CA 15-3. MUC-16/CA-125, NSE, CDHl. MMP9, EPCAM, VIM, WFDC2/HE4, SPB3 /SCCA-1 i SPB4/SCCA-2 (reprezentujace SCCA)) reprezentuje markery stosowane w praktyce klinie.mej. Trzydziesci dwa, trzynascie i osiem bialek to odpowiednio potencjalne lub powszechnie stosowane markery nowotworowe, gruzlicze i infekcji lub stanu zapalnego. Pogrubienie peptydu wskazuje na najlepsze peptydy uzyte w tescie MWU i indywidulanych krzywych ROC (fig. 4 ).

PL 440401 A1 13/71Nazwa bialka Peptyd mierzony przez MRM Zglaszany Opis (skrót uzywany w tekscie) (Pozycja peptydu w bialku. Pogrubienie wskazuje zakres ( inne nazwy) peptydy uzyte w tescie MWU i indywidulanych stezei1 w [nazwa genu, identyfikator UniProtJ krzywych ROC) plynie oplucnowym Kadheryna-1 (CDHl) NTGVISVVTTGLDR (322-33S) SEQ ID NO: 1 408 - 872 Potencjalny marker plynu (Kadheryna nablonkowa, E- GQVPE~EANVVITTLK (382-397) SEQ ID NO: ng/ml nowotworowego. (C.-D. Chen i in., kadheryna, Cadherin-1, Epithelial 2 2014). Marker stosowane w praktyce cadherin, E-cadherin) GLDARPEVTR (77S-784) SEQ ID NO: 3 klinicznej do róznicowania raka sutka.

[CDHl, P12830] (Anatomie Pathology Lab Instruments Dlugosc: 882 aa, Masa (Da): 97456 by Roche Tissue Diagnostics. n.d. ).

Antygen CD166 (ALCAM) YEKPDGSPVFIAFR (58-71) SEQ ID NO: 4 478 - 913 Potencjalny marker plynu (CD166 antigen) VLHPLEGA VVIIFK ( 176-189) SEQ ID NO: 5 ng/ml nowotworowego. (C.-O. Chen i in., [ALCAM, Q13740] EGDNITLK (262-269) SEQ ID NO: 6 2014).

Dlugosc: 583 aa, Masa (Da): 65102 ESLTLIVEGKPQIK (406-419) SEQ ID NO: 7 Hemopeksyna (HPX) NFPSPVDAAFR (92-102) SEQ ID NO: 8 - Potencjalny marker plynu (Hemopexin) L YLVQGTQVYVFL TK (318-332) SEQ ID NO: 9 nowotworowego. (Rodriguez-Pifieiro i lHPX, P02790J GGYTLVSGYPK (333-343) SEQ ID NO: 10 in .. 201 O; Z. Wang i in .. 2012).

Dlugosc: 462 aa, Masa (Da): 51676 SGAQATWTELPWPHEK (387-402) SEQ ID NO: 11 Cytokeratyna 6 (CK-6) SGFSSVSVSR (KRT6A: 31-40) SEQ ID NO: 12 O - 12 Potencjalny marker plynu PL 440401 A1 14/71(Keratyna 6 typu II cytoszkieletu, ATGGGLSSVGGGSSTIK (KRT6B: 534-550) ng/mg bialka nowotworowego. (Domanski i in ..

Keratin type II cytoskeletal 6, SEQ ID NO: 13 2016). Marker nowotworowy raka cytokeratin-6) ADTLTDEINFLR (KRT6 A.B,C: 288-299) SEQ stosowany w patologii (Moll i in ..

[KRT6A, P02538], Dlugosc: 564 aa, ID NO: 14 2008).

Masa (Da): 60 045, [KRT6B, P04259], Dlugosc: 564 aa, Masa (Da): 60 067, [KRT6C, P48668], Dlugosc: 564 aa, Masa (Da): 60025 Cytokeratyna 7 (CK-7) LPDIFEAQIAGLR (137-149) SEQ ID NO: 15 O- 24 Potencjalny marker plynu (Keratyna 7 typu II cytoszkieletu, VDALNDEINFLR (215-226) SEQ ID NO: 16 ng/mg bialka nowotworowego. (Domanski i in ..

Keratin type II cytoskeletal 7, FETLQAQAGK (287-296) SEQ ID NO: 17 2016). Marker nowotworowy raka cytokeratin-7) stosowany w patologii (MoLI i in ..

[KRT7, P08729] 2008).

Dlugosc: 469 aa, Masa (Da): 51386 Cytokeratyna 8 (CK-8) LEGLTDEINFLR (214-225) SEQ ID NO: 18 O - 136 Potencjalny marker plynu (Keratyna 8 typu II cytoszkieletu, YEELQSLAGK (286-295) SEQ ID NO: 19 ng/mg bialka nowotworowego. (Domanski i in„ Keratin type II cytoskeletal 8, LSELEAALQR (353-362) SEQ ID NO: 20 2016). Marker nowotworowy raka cytokeratin-8) stosowany w patologii i marker [KRT8, P05787] serologiczny do monitorowania terapii Dlugosc: 483 aa, Masa (Da): 53704 (Barak i in .. 2004; Moll i in .. 2008).

PL 440401 A1 /71Cytokeratyna 18 (CK-18) DWSHYFK (125-131) SEQ ID NO: 21 O- 42 Potencjalny marker plynu (Keratyna 18 typu I cytoszkieletu, AQIFANTVDNAR (138-149) SEQ ID NO: 22 ng/mg bialka nowotworowego. (Domanski i in., Keratin type I cytoskeletal 18, AQYDELAR (254-261) SEQ ID NO: 23 2016). Marker nowotworowy raka cytokeratin-18) stosowany w patologii i marker [KRT18, P05783] serulugica1y uu munituruwania terapii Dlugosc: 430 aa, Masa (Da): 48058 (Barak i in., 2004; Moll i in., 2008).

Cytokeratyna 19 (CK-19) FGPGVAFR (25-32) SEQ ID NO: 24 O - 41 Potencjalny marker plynu (Keratyna 19 typu I cytoszkieletu, AALEDTLAETEAR (318-330) SEQ ID NO: 25 ng/mg bialka nowotworowego. (Domanski i in„ Keratin type I cytoskeletal 19, SLLEGQEDHYNNLSASK (382-398) SEQ ID 2016). Marker nowotworowy raka cytokeratin-19) NO: 26 stosowany w patologii i marker [KRT19, P08727] serologiczny do monitorowania terapii Dlugosc: 400 aa, Masa (Da): 44106 (Barak i in., 2004; Moll i in., 2008).

Inhibitor proteazy typu Kunitz 1 EGFINYLTR (135-143) SEQ ID NO: 27 19 - 63 Potencjalny marker plynu (SPINTl) TQGFGGSGIPK (154-164) SEQ ID NO: 28 ng/ml nowotworowego. (C.-D. Chen i in., (Kunitz-type protease inhibitor 1) YTSGFDELQR (372-381) SEQ ID NO: 29 2014).

[SPINTl, 043278] Dlugosc: 529 aa, Masa (Da): 58398 Mucyna-I (MUCl) QGGFLGLSNIK ( 1083-1093) SEQ ID NO: 30 352 - 4140 Potencjalny marker plynu (antygen nowotworowy 15-3, CA EGTTKVHDVETQFNQYK (1109-1125) SEQ ID ng/ml nowotworowego. (C.-D. Chen i in., -3, Mucin-1, Cancer antigen 15-3) NO: 31 2014; Jose Manuel Parcel i in., 2004).

[MUCl, P15941] NYGQT "DTFPA R (1190-1 200) SEQ TD NO: 32 Marker stosowany w praktyce PL 440401 A1 16/71Dlugosc: 1255 aa, Masa (Da): klinicznej do monitorowania terapii 122102 raka sutka (Kufo. 2009; Nath i Mukhc1jce. 2014).

Czynnik pochodzacy z nablonka LAAAVSNFGYDLYR (54-67) SEQ ID NO: 33 - Potencjalny marker plynu pigmentowego (SERPINFl) LQSLFDSPDFSK (334-345) SEQ ID NO: 34 nowotworowego. (Z. Wang i in., 2012).

(Pigment epithelium-derived factor) DTDTGALLFIGK (400-411) SEQ ID NO: 35 [SERPINFl, P36955] Dlugosc: 418 aa, Masa (Da): 46312 Domena Sushi, czynnik von LLSDFPVVPTATR (109-121) SEQ ID NO: 36 537 - 1038 Potencjalny marker plynu Willebranda typu A, EGF i bialko GAFQQAAQILLHAR (171-184) SEQ ID NO: 37 ng/ml nowotworowego. (C.-0. Chen i in .. zawierajace domene pentraksyny LLQTLETITNK (942-952) SEQ ID NO: 38 2014). 1 (SVEPl) (Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxin domain- containing protein 1) [SVEPl, Q4LDE5] Dlugosc: 3 571 aa, Masa (Da): 390170 Trombospondyna-4 (THBS4) SSA TIFGL YSSTDNSK (70-85) SEQ ID NO: 39 22 - 55 Potencjalny marker plynu (Thrombospondin-4) AFAGPSQKPETIELR (159-173) SEQ ID NO: 40 ng/ml nowotworowego. (C.-D. Chen i in., [THBS4, P35443] KPQDFLFRLK (178-187) SEQ ID NO: 41 2014).

PL 440401 A1 17/71Dlugosc: 961 aa, Masa (Da): 105869 NSLWHTGDTSDQVR (851-864) SEQ ID NO: 42 Galektyna 1 (LGALSl) SFVLNLGK (30-37) SEQ ID NO: 43 - Potencjalny marker plynu ( Galectin -1 ) DGGAWGTEQR (65-74) SEQ ID NO: 44 miedzybloniaka oplucnej (Javadi i in ..

[LGALSl, P09382] LPDGYEFK (101-108) SEQ ID NO: 45 2020; Mundi i in., 2014).

Dlugosc: 135 aa, Masa (Da): 14716 Mezotelina (MSLN) GLLPVLGQPllR (250-261) SEQ ID NO: 46 6 - 40 Petenci alnv marker plynu (Mesothelin) EIDESUFYK (310-319) SEQ ID NO: 47 nM miedzybloniaka oplucnej (Hooper i in ..

[MSLN, Q13421] VNAIPFTYEQLDVLK (339-353) SEQ ID NO: 2013). Marker surowicy stosowany w Dlugosc: 630 aa, Masa (Da): 68986 48 praktyce klinicznej do monitorowania IQSFLGGAPTEDLK (504-517) SEQ ID NO: 49 pacjentów z miedzvbloniakiem TDAVLPLTVAEVQK (536-549) SEQ ID NO: 50 (Creaney i Rohinson. 2017).

LLGPHVEGLK (550-559) SEQ ID NO: 51 Deaminaza adenozyny 2 (ADA2) TUFPPSMHFFQAK (77-90) SEQ ID NO: 52 - Klinicznie mierzona calkowita (Adenosine deaminase 2) LLPVYELSGEHHDEEWSVK (249-267) SEQ ID aktywnosc deaminazy adenozyny [ADA2, Q9NZK5] NO: 53 (ADA) w plynie oplucnuwym jest Dlugosc: 511 aa, masa (Da): 58934 FVETHPEFIGIK (276-287) SEQ ID NO: 54 markerem gruzliczego zapalenia LPYFFHAGETDWQGTSIDR (351-369) SEQ ID oplucnej. przy czym izoenzym ADA2 NO: 55 wykazuje lepsze rozróznianie (Jose M.

TGHGFALSK (382-390) SEQ ID NO: 56 Porcel. 2016: Zcmlin i in., 2009).

DIPIEVCPISNQVLK (402-416) SEQ rn NO: 57 PL 440401 A1 18/71Skladowa C9 dopelniacza (C9) TEHYEEQIEAFK (214-225) SEQ ID NO: 58 - Polencjalny serologiczny marker (Complement component C9) TSNFNAAISLK (232-242) SEQ ID NO: 59 gruzlicy (De Groole i in .. 2017). Marker [C9, P02748] LSPIYNLVPVK (473-483) SEQ ID NO: 60 stanu zapalnego stosowany w praklyce Dlugosc: 559 aa, Masa (Da): 63173 AIEDYINEFSVR (497-508) SEQ ID NO: 61 klinicznej.

Chemokina CXCLlO (CXCLlO) CTCISISNQPVNPR (30-43) SEQ ID NO: 62 670 - 4469 PoLencjalny marker plynu gruzliczego ( 1 O kDa bialko indukowane LEIIPASQFCPR (48-59) SEQ ID NO: 63 pg/ml (K.-Y. Chen i in .. 2016: Roofchayee i interferonem gamma, IP-10, 10 kDa VEIIATMK (60-67) SEQ ID NO: 64 in .. 2021). interferon gamma-induced protein) CLNPESK (74-80) SEQ ID NO: 65 [CXCLlO, P02778] Dlugosc: 98 aa, Masa (Da): 10881 Gelsolin (GSN) EVQGFESATFLGYFK (148-161) SEQ ID NO: 66 - Potencjalny marker plynu gmzliczego [GSN, P06396] HVVPNEVVVQR ( 178-188) SEQ ID NO: 67 (Lee i in .. 2017). Potencjalny Dlugosc: 782 aa, Masa (Da): 85698 QTQVSVLPEGGETPLFK (374-390) SEQ ID serologiczny marker gmzlicy (De NO: 68 Groote i in .. 2017).

AGALNSNDAFVLK (585-597) SEQ ID NO: 69 TGAQELLR 1616-623) SEQ ID NO: 70 Kalistatyna (SERPINA4) IAPANADFAFR (51-61) SEQ ID NO: 71 - Potencjalny serologiczny marker (Kallistatin) VGSALFLSHNLK (139-150) SEQ ID NO: 72 gmzlicy (De Groote i in„ 2017).

[SERPINA4, P29622] LFHTNFYDTVGTIQLTNDHVK (167-187) SEQ Dlugosc: 427 aa, Masa (Da): 48542 ID NO: 73 PL 440401 A1 19/71FSISGSYVLDQILPR (321-335) SEQ ID NO: 74 LGFTDLFSK (336-344) SEQ ID NO: 75 ATLDVDEAGTEAAAATSFAIK (366-386) SEQ ID NO: 76 Metaloproteinaza 9 (MMP9) AVIDDAFAR (135-143) SEQ ID NO: 77 3 - 35 Potencjalny marker plynu gruzliczego, i (Zelatynaza B, Gelatinase B, Matrix AFALWSAVTPLTFTR (144-158) SEQ ID NO: 78 ng/ml marker stanu zapalnego stosowany w metalloproteinase-9) LGLGADVAQVTGALR (604-618) SEQ ID NO: praktyce klinicznej (Park i in„ 2005; [MMP9, P14780] 79 Jose M. Porcel i in .. 2016; Sheen i in ..

Dlugosc: 707 aa, Masa (Da): 78458 2009).

Syntetaza tryptofanylo-tRNA, DLTLDQA YSYA VENAK (205-220) SEQ ID NO: - Potencjalny serologiczny marker cytoplazmatyczna (W ARS) 80 gruzlicy (De Groote i in .. 2017).

(Cytoplazmatyczna ligaza tryptofan- GIFGFTDSDCIGK (265-277) SEQ ID NO: 81 tRNA, Tryptophanyl-tRNA ISFPAIQAAPSFSNSFPQIFR (278-298) SEQ ID synthetase, TrpRS, Tryptophan-- NO: 82 tRNA ligase, cytoplasmic) ALIEVLQPLIAEHQAR (433-448) SEQ ID NO: [W ARS, P23381] 83 Dlugosc: 471 aa, Masa (Da): 53165 Skladowa C3 dopelniacza (C3) SNLDEDIIAEENIVSR (749-764) SEQ ID NO: 84 - Potencjalny marker plynu (Complement C3) VHQYFNVELIQPGA VK (1463-1478) SEQ ID parapneumonicznego (Z. Wang i in., [C3, P01024] NO: 85 2012). Marker stanu zapalnego Dlugosc: 1 663 aa, Masa (Da): TFISPIK (1583-1589) SEQ rn NO: 86 stosowany w praktyce klinic711ej.

PL 440401 A1 /71187148 Bialko C-reaktywne (CRP) ESDTSYVSLK (32-41) SEQ ID NO: 87 3 - 105 Potencjalny marker plynu infekcyjnego (C-reactive protein) GYSIFSYATK (66-75) SEQ ID NO: 88 mg/l (J. M. Porcel i in., 2009). Serologic,.-;ny [CRP, P02741] QDNEILIFWSK (77-87) SEQ ID NO: 89 marker stanu zapalnego i infekcji Dlugosc: 224 aa, Masa (Da): 25039 stosowany w praktyce klinicznej (Sproslon i Ashworth, 2018).

Bialko S100A9 (S100A9) NIETIINTFHQYSVK (11-25) SEQ 1D NO: 90 - Potenci alnv marker plynu (Protein S 100-A9) LGHPDTLNQGEFK (26-38) SEQ ID NO: 91 parapneumonicznego (Z. Wang i in., [SlOOA9, P06702] 2012).

Dlugosc: 114 aa, masa (Da): 13242 Osoczowe bialko amyloidu P A YSLFSYNTQGR (65-76) SEQ ID NO: 92 - Potencjalny marker plynu infekcyjnego (APCS) VGEYSLYIGR (87-96) SEQ ID NO: 93 (Z. Wang i in., 2012).

(Skladnik P amyloidu w surowicy, QGYFVEAQPK (140-149) SEQ ID NO: 94 Serum amyloid P-component) [APCS, P02743] Dlugosc: 223 aa, Masa (Da): 25387 Wimentyna (VIM) ILLAELEQLK (130- 139) SEQ ID NO: 95 - Potencjalny marker plynu infekcyjnego (Virnentin) FADLSEAANR (295-304) SEQ ID NO: 96 (Domanski i in., 2016). Marker [VIM, P08670] ISLPLPNFSSLNLR (411-424) SEQ ID NO: 97 nowotworowy stosowany w patologii Dlugosc: 466 aa, Masa (Da): 53652 (Anatomie Pathology Lah Tnstrumcnts hy Roche Tissuc Diagnostics, n.d.).

PL 440401 A1 21/71Dehydrogenaza mleczanowa A DYl\"VTANSK (82-90) SEQ ID NO: 98 - Stosowany w praktyce klinicznej do (LDHA) FIIPNVVK (119-126) SEQ ID NO: 99 klasyfikacji wysiekowego i (Lancuch A dehydrogenazy L- LLIVSNPVDILTYVA WK ( 133-149) SEQ ID przesiekowego plynu oplucnowego w mleczanowej, L-lactate NO: 100 oparciu o kryteria Light' a (Felkr- dehydrogenase A chain) VTLTSEEEAR (306-315) SEQ ID NO: 101 Kupman i Light, 2018; Jose M. Porcel i [LDHA, P00338] SADTLWGIQK (319-328) SEQ ID NO: 102 Light, 2006). Serologie.my marker stanu Dlugosc: 332 aa, Masa (Da): 36689 La.palnego stosowany w praktyce klinicznej 1.EreL i in., 2014).

Dehydrogenaza mleczanowa B LIAPVAEEEATVPNNK (8-23) SEQ ID NO: 103 - Stosowany w praktyce klinicznej do (LDHB) SLADELALVDVLEDK (44-58) SEQ ID NO: 104 klasyfikacji wysiekowego i (Lancuch B dehydrogenazy L- IVVVTAGVR (92-100) SEQ ID NO: 105 przesiekowego plynu oplucnowego w mleczanowej, L-lactate GLTSVINQK (300-308) SEQ ID NO: 106 oparciu o kryteria Light'a (Feller- dehydrogenase B chain) SADTLWDIQK (320-329) SEQ ID NO: 107 Kopman i Light, 2018; Jose M. Parcel i [LDHB, P07195] VIGSGCNLDSAR (Dla ''LDH" wspólny dla LDH Light, 2006). Serologiczny marker stanu Dlugosc: 334 aa, Masa (Da): 36638 A, B. i C: 158/159-169/170) SEQ ID NO: 108 zapalnego stosowany w praktyce klinicznej IEre;: i in"' 2014).

PL 440401 A1 22/71Wynalazek zostal przedstawiony na rysunku, na którym: Figura 1 przedstawia bialka istotnie podwyzszone w plynach nowotworowvch.

Wzgledne ilosci bialka w próbkach plynów oplucnowych pochodzacych od 209 pacjentów.

Istotnosc statystyczna ( wartosc p w tescie U Manna-Whitneya (MWU)) jest przedstawiona dla porównania plynów nowotworowych (RAK) z plynami gruzliczymi (PG), ,,innymi plynami infekcyjnymi" (IPI), ,,wszystkimi plynami infekcyjnymi" (WPI: lacznie plyny gruzlicze i ,,inne plyny infekcyjne") lub plynami zwiazanymi z niewydolnoscia narzadów (PL: ,.plyny lagodne") (czarne linie) oraz w porównaniu ze wszystkimi innymi plynami oplucnowymi lacznie (wartosc p pokazana miedzy „WPI" i ,.PL"). Wyniki nieistotne statystycznie (p>0,05) sa oznaczone jako N.I Pozostale v,ryniki testu MWU mozna znalezc w tabeli na fig. 4. Wykresy pudelkowe przedstawiaja mediane miedzykwartylowy Q3-Ql. przedzial Figura 2 przedstawia bialka istotnie podwyzszone w plynach gruzliczych i infekcyjnych. Wzgledne ilosci bialka w próbkach plynów oplucnowych pochodzacych od 209 pacjentów. Istotnosc statystyczna (wartosc p testu U Manna-Whitneya (MWU)) jest przedstawiona nad wykresami w celu porównania plynów gruzliczych (PG), ,,innych plynów infekcyjnych'' (IPI) lub „wszystkich plynów infekcyjnych" (lacznie plyny gruzlicze i ,,inne plyny infekcyjne": WPI) w porównaniu z plynami nowotworowymi (RAK), ,,innymi plynami infekcyjnymi" lub plynami zwiazanymi z niewydolnoscia narzadów (PL: .,plyny lagodne") (wartosc powyzej kazdej grupy). Ponizej wykresów podano wartosci p dla porównania plynów grnzliczych, ,,innych plynów infekcyjnych" lub .,wszystkich plynów infekcyjnych" z wszystkimi innymi plynami oplucnowymi lacznie.

Wyniki nieistotne statystycznie (p>0,0::;) sa oznaczone jako N.L Pozostale ,vyniki testu MWU mozna znalezc w tabeli na fig. 4. Wykresy pudelkowe przedstawiaja mediane i przedzial mi<;:dzykwartylowy Q3-Ql.

Figura 3 przedstawia wydajnosc klasyfikatora w rozróznianiu plynów oplucnowych na piec klas etiologicznych. (a) Krzywe ROC przedstawiajace skutecznosc diagnostyczna klasyfikatora rozrózniajacego plyny oplucnowe do jednej z pieciu klas etiologicznych.

Srednia wartosc AUC (linia) jest przedstawiona z zacienionym ± odchyleniem standardowym. Optymalny punkt odciecia %-czulosci/ %-swoistosci jest sugerowany przez maksymalna wartosc wskaznika Youdena (linia pionowa: Max J-index). Dla kazdej klasyfikacji wskazano 15 najbardziej istotnych cech (pomiary poszczególnych peptydów bialkowych lub srednie geometryczne z pomiarów wielu peptydów dla danego bialka) stosowanych przez klasyfikator (wykres wstawkowy), ze wskazaniem, czy mialy one wzrost Gasnoszary) lub spadek ( ciemnoszary) w danej grupie plynów oplucnowych. (b) PL 440401 A1 23/71Wykres przedstawiajacy srednie AUC klasyfikatora w funkcji liczby cech uzytych lacznie dla czterech klasyfikacji plynów oplucnowych: nowotworowych, gruzliczych, ,,innych infekcyjnych'' i „lagodnych''. f,"igura 4 przedstawia w tabeli markery bialkowe istotnie rózniace sie miedzy piecioma grupami plynów oplucnowych oraz ich potencjalna uzytecznosc diagnostyczna.

Przedstawiono je w kolejnosci istotnosci dla wszystkich mozliwych 26 porównan, na co wskazuje wartosc AUC z analizy krzvwej ROC. Przedstawiono wszvstkie istotne roznice w ilosciach markerów z wartoscia p <::::0,05 (test MWU), aby umozliwic porównanie wiekszosci markerów, a które dzialaly najlepiej, wyrózniono (wartosc p <::::0,01 test MWU (w kolorze szarym) i AUC::::, 0,700 (pogrnbienie)).

Figura 5 przedstawia wspólczynniki korelacji linimvej Pearsona przedstawiajace zgodnosc pomiedzy pomiarami ilosciowymi peptydów wybranych dla danego bialka w grupie 209 plynów oplucnowych, dla wszystkich bialek celowanych kilkoma peptydami (przedstawione w tabeli 1 ). Wykres pudelkowy przedstawia mediane i przedzial miedzykwartylowy Q3-Ql. Obserwacje odstajace „outliers" zaznaczono jako kólka (wykraczajace poza przedzial Ql-1.S:'IQR i Q3+1.5*IQR) oraz obserwacje ekstremalnie odstajace zaznaczono jako gwiazdki (wykraczajace poza przedzial Ql-3RQ i Q3+3RQ).

Do analizy uzyto wszystkich danych i uzyskano mediane ze wszystkich wspólczynników korelacji liniowej Pearsona (wa1tosc R) na poziomie 0.926 ± O 124 (mediana± odchylenie standardowe).

Figura 6 przedstawia bialka z istotnie obnizonym poziomem ilosciowym w plynach lagodnych Wzgledne poziomy bialek w 209 plynach oplucnowych Na wykresach pr7edstawiono ws7ystkie porównania istotne statystycznie (p <::::0,05, test Manna-Whitncya) pomiedzy grnpami plynów nowotworowych (RAK), plynów grnzliczych (PG) i plynów lagodnych (PL) wzglydcm plynów nowotworowych (RAK), plynów grnzliczych (PG), innych plynów infekcyjnych (IPI) oraz wszystkich plynów infekcyjnych (WPI), wartosci podano powyzej kazdej z grup. Ponizej wykresów zaprezentowano wszystkie istotne statystycznie wartosci p dla porównan indywidualnych pieciu grup plynów oplucnowych wzgledem pozostalych plynów. Wykresy pudelkowe przedstawiaja mediane i przedzial miedzykwartylowy Q3-Q1.

Figura 7 przedstawia bialka z istotnie podwyzszonym poziomem ilosciowym w plynach nowotworowych o mniejszej zdolnosci do rozrózniania plynów (a), oraz bialka o braku zdolnosci do rozrózniania plynów (brak istotnosci statystycznej) (b). Wzgledne poziomy bialek w 209 plynach oplucnowych. Wszystkie porównania istotne statystycznie (p :'.S0,05, test Manna-Whitneya) pomiedzy indywidualnymi grupami plynów zostaly PL 440401 A1 24/71przedstawione za pomoca klamer, a ponizej wykresów zaprezentowano wszystkie istotne statystycznie wa1tosci p dla porównan indywidualnych pieciu grup plynów wzgledem pozostalych plynów. Wykresy pudelkowe przedstawiaja mediane przedzial miedzykwartylowy QJ-Ql.

Figura 8 przedstawia wykresy pokazujace wartosc predykcyjna dodatnia (PPY) vs. czulosc dla kazdej z pieciu grup plynów oplucnowych. Zaprezentowane jako srednia wartosc PPV (czarna linia)± odchylenie standardowe (ciemnoszare pole).

Figura 9 przedstawia w fonnie tabeli testowane bialka z panelu 53 bialek. które nie zostaly wykryte w próbkach plynów oplucnowych. Panel piecdziesieciu trzech bialek skladal sie z markerów stosowanych w praktyce klinicznej oraz potencjalnych markerów opublikowanych w literaturze naukowej, które wykazaly wysoki potencjal w diagnostyce lub klasyfikacji plynów oplucnowych, diagnostyce nowotworów lub chorób infekcyjnych w próbkach osocza/surowicy krwi z zastosowaniem testów biochemicznych lub opartych na reakcji z przeciwcialami (immunotestów), stosowanych w praktyce klinicznej, lub indywidualnych i multipleksowych testów z zastosowaniem technik takich jak globalna i celowana proteomika oparta na spektometrii mas lub z zastosowaniem przeciwcial.

Dwadziescia dziewiec bialek (ADAl i ADA2 (reprezentujace ADA), C3, C9, CEA/CEACAM5. CK-6. CK-7. CK-8. CK-14. CK-17. CK-18. CK-19. CRP. GRP. IFNG.

LDHA, LDHB, and LDHC (reprezentujace LDH), MSLN, MUC-1/CA 15-3. MUC- 16/CA- I 25. NSE. CDHI. MMP9. EPCAM. VIM. WFDC2/HE4. SPB3/SCCA-l and SPB4/SCCA-2 freprezentujace SCCA)) reprezentuje testy stosowane w praktyce klinicznej. Trzydziesci dwa, trzynascie i osiem bialek to zatwierdzone lub potencjalne markery odpowiednio nowotworów. grnzlicy i infekcji/stanu zapalnego Przyklady Materialy i metody: 1) Próbki kliniczne plynów oplucnowych Próbki plynów pobrano podczas standardowego zabiegu torakopunkcji i sklasyfikowano w Mazowieckim Centrum Leczenia Chorób Pluc i Gruzlicy (MCLChPiG).

Badanie uzyskalo aprobate Komisji Bioetycznej przy Okregowej Izbie Lekarskiej w Warszawie (KB/928/14) oraz Komisji Bioetycznej przy Narodowym Instytucie Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji w Warszawie (nr. KBT-5/1/2019) oraz wszystkie badania przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Od kazdego pacjenta uzyskano pisemna swiadoma zgode. Próbki zostaly zidentyfikowane i zakodowane do analiz proteomicznych i byly traktowane zgodnie z praktykami na poziomie II bezpieczenstwa biologicznego. Trzysta szescdziesiat siedem próbek plynów, od PL 440401 A1 /71poszczególnych pacjentów, pobrano prospektywnie przez okres 5,7 lat i przetworzono jak opisano wczesniej (Domanski i in., 2016). z supcrnatantami przechowywanymi w -80 °C do czasu analizy. Starano sie zebrac wiekszosc plynów dostepnych w MCLChPiG, aby uzyskac rzeczywista reprezentacje czestosci wystepowania róznych typów plynów oplucnowych spotykanych w takim pojedynczym osrodku klinicznym. Wysieki klasyfikowano jako przesiekowe lub wysiekowe zgodnie z kryteriami Lighta. Rozpoznanie wvsieku zlosliwego lub zwiazanego z nowotworem opieralo sie na wykazaniu komarek nowotworowych w badaniu cytologicznym zassanego plynu lub badaniu histopatologicznym materialu z biopsji oplucnej, uzyskanego za pomoca wideotorakoskopii, wykonanego przez dwóch doswiadczonych patologów. Gruzlicze zapalenie oplucnej rozpoznano na podstawie potwierdzenia Mycobaeterium tuberculosis w plynie oplucnowym, plwocinie lub popluczynach oskrzelowo-pecherzykowych, lub jesli w biopsji oplucnej pobranej podczas wideotorakoskopii stwierdzono gruzlice. Do diagnozowania innych chorób zastosowano powszechnie przyjete kryteria kliniczne. Z analizy wykluczono sto piecdziesiat osiem plynów oplucnowych (65 plynów z rozpoznaniem ropniaka, 55 plynów o nieznanej etiologii, 8 plynów o dwóch lub wiecej etiologiach i 30 lagodnych plynów jako nieokreslone plyny oplucnowe z przesiekiem - nienowotworowe i niezakazne). Do analizy pobrano dwiescie dziewiec plynów ze zdiagnozowana etiologia. Zestawienie próbek i dane pacjenta przedstawiono w tabeli na fig. 4. Sto dziewiec plynów pochodzilo od pacjentów ze zdiagnozowana postacia raka (plyny zwiazane z nowotworem) i obejmowalo 82 ze zdiagnozowanym rakiem pluca (65 ze zdiagnozmvanym niedrobnokomórkowym rakiem pluca (NSCLC) (NSCLC: z :n podtypami A DC i 22 SCC) oraz 17 typów SCT .C) oraz 27 ze z nowotworem wtórnym (dziesiec zdiagnozowanych jako rak sutka, cztery zdiagnozov,ane jako mi9dzybloniak oplucnej, czte1y zdiagnozowane rak jajnika i jeden zdiagnozm,vany jako: czerniak zlosliwy, chloniak, bialaczka, rak neuroendokrynny, rak nerki, rak macicy, rak pecherza moczowego, rak prostaty i nieznana lokalizacja pierwotna). Dodatnie wyniki cytologii uzyskano w 23,6 % tych przypadków. Piecdziesiat osiem plynów pochodzilo od pacjentów z chorobami zakaznymi (wszystkie plyny infekcyjne) i obejmowalo 25 plynów parapneumonicznych, 24 plynów gruzliczych, 6 plynów zapalnych i 3 plyny ropniakowe (nie ropne, tj. brak wizualnej manifestacji ropy). Czterdziesci dwa plyny pochodzily od pacjentów z dolegliwosciami nienowotworowymi i nieinfekcyjnymi (,,plyny lagodne") i obejmowaly 27 plynów w wyniku niewydolnosci serca, cztery przesieki, piec plynów w wyniku niewydolnosci nerek, 2 plyny w wyniku zapalenia stawów, oraz po jednym z PL 440401 A1 26/71kazdego plynu zwiazanego z: zapaleniem trzustki, marskoscia watroby, zatorowoscia plucna i pourazowego. 2) Opracowanie, optymalizacja i analiza testu MRl\1 Selekcje peptydów proteotypowych do analizy MRM kazdego bialka docelowego i optymalizacje ustawieri MRM specyficznych dla peptydów i fragmentów przy uzyciu wzorca wewnetrznego peptvdów znakowanego stabilnym izotopem (SIS) przeprowadzono jak opisano wczesniej (Domanski i in .. 2016). Wyboru peptydów dokonano recznie i za pomoca oprogramowania PeptidePicker, stosujac wczesniej opisane kryteria (Mohammed i in .. 2014).

Wybrane peptydy proteotypowe spelnialy nastepujace warunki: unikalnosc sekwencji w proteomie czlowieka; liczne obserwacje V>' bibliotekach spektralnych; dlugosc nieprzekraczajaca 21 rcszl aminokwasowych oraz, jesli to mozliwe, niezawierajace aminokwasów latwo ulegajacych modyfikacji chemicznej (np. Cys, Met) lub sekwencji podatnych na modyfikacje (np. DP, DG). Peptydy wykluczono, gdy mialy niska wydajnosc trawienia, wysoka czestotliwosc polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), znane modyfikacje potranslacyjne (PTM) lub cechy biologiczne wplywajace na dokladnosc ich ponuaru.

Wybrane peptydy zsyntetyzowano jako peptydy SIS przy uzvciu znakowanych izotopowa aminokwasów na koncu C: 13 C6-, N4-Arg lub 13 C 6-.

N2-Lys (98 % wzbogacenie izotopowe) przez JPT Peptide Technologies GmbH (Berlin, Niemcy) jako SpikeTides_L. Analize MRI\I przeprowadzono na potrójnym kwadrupolu (TQ) MS od Waters Xevo (Waters, Milford, MA) sprzezonym z UPLC Waters nanoAcquity przez fródlo 7spray Nanotlow z emiterem 10 r1m SilicaTip PicoTip (New Ohjcctivc, MA, USA) i kolumna analityczna Waters nanoAcquity lJPLC BEH130 C18 (75 µm x 150 mm, wielkosc czastek 1,7 µm) w 40 °C oraz kolumna pulapkowa Waters Symmctry 100 C18 (180 µm x 20 111111, wielkosc czastek 5 µ111). Wszystkie rozpuszczalniki i modyfikatory byly klasy do LC-MS. Faza ruchoma A zawierala 0,1 7o kwasu mrówkowego (Sigma-Aldrich) w wodzie (J.T.Baker, Holandia). Peptydy wprowadzano na kolumne-pulapke z szybkoscia µ1/min i rozdzielono przy 350 nl/min przy uzyciu 60-minutowego przebiegu LC z gradientem acetonitrylu (JTBaker) z O, 1 % kwasem mrówkowym (faza ruchoma B) zmieniajacym sie od 1 % do 10 % od O do 10 minut i od 10 % do 45 % od 10 do 40 minut, po czym nastepuje przemycie 90 % B i równowazenie. Parametry MS obejmowaly napiecie kapilarne 3,5 kV, przeplyw gazu oczyszczajacego 100 1/h, przeplyw gazu stozkowego 5 1/h, gaz NanoFlow ustawiony na 50 kPa (0,5 bara) i temperature zródla 150 °C. Wstepne metody analityczne byly ukierunkowane na 53 bialka poprzez PL 440401 A1 27/71skanowanie w poszukiwaniu 205 endogennych peptydów i 205 komplementarnych peptydów SIS, przy uzyciu zoptymalizowanych parametrów LC-MRM. W celu zwiekszenia specyficznosci, kazdy z peptydów endogennych i SIS monitorowano za pomoca pieciu jonów fragmentacyjnych (lacznie 2050 przejsc). Ostateczna metoda zostala zredukowana do glównie wykrywalnych bialek i ukierunkowana na 34 markery z 105 peptydami i SIS kazdy w dwóch 60-minutowych analizach LC-MRl\il na próbke (818 przejsc) Poziom markera w próbce plvnu oplucnowego podaje sie jako wzgledna. ilosc bialka na objetosc plynu oplucnowego Wynika to ze zmierzonej wzglednej ilosci jednego lub wiekszej liczby peptydów (srednia geometryczna) na bialko, znormalizowanej wzgledem odpmviedniego peptydu(-ów) STS. Ilosc peptydu endogennego podaje sie jako stosunek powierzchni pików, bedacy suma powierzchni pod pikami wszystkich przejsc dla peptydu endogennego podzielona. przez sume powierzchni pików przejsc jego ciezkiego standardu. Aby umozliwic normalizacje danych intensywnosci miedzy próbkami pod wzgledem fluktuacji sygnalu _viS i róznic w przetwarzaniu próbek po trawieniu, do wszystkich próbek dodano równowazne ilosci peptydów STS. Przeprowadzono reczna kontrole sygnaló\V dla kazdej próbki, aby zapewnic prawidlowe wykrywanie pików, dokladna integracje i przejscia wolne od zaklócen. Metody MRM i analizy danych przeprowadzono w Skylinc-Daily Yer. 21 (oprogramowanie laboratoryjne MaeCossa). 3) Trawienie próbki plynu oplucnowego Praca z próbkami plynu oplucnowego przed trawieniem trypsyna. byla przeprowadzana w komorze laminarnej z filtrem HEPA i przy uzyciu koncówek filtrnjacych i ultraczystych odczynników (Sigma-Aldrich). Przygotowanie próbek i analizy MRM byly randomizowane Po rozmro1:eniu plynu oplucnowego wirowano przy 15000 x g przez 5 min w 4 °C Plyn oplucnowy analizowano z uwzglednieniem objetosci, biorac do analizy 2,5 µl kazdej próbki. Próbki denaturowano przez dodanie 97,5 µI 8,4 M mocznika w 50 mM buforze Trizma/chlorowodorek (pH 8,4, bufor Tris). Nastepnie redukowano je 2 µl 50 mM chlorowodorku tris(2-karbok~yctylo)fosfiny (TCEP) w 50 mM buforze Tris przez 30 min w 37 °C, a nastepnie alkilowano 2 µl 777 mM jodoacetamidu w 50 mM buforze Tris przez 30 min w 22 °C. Próbki inkubowano w wysokim stezeniu mocznika (7,88 M) w 37 °C przez 4 godziny. Nastepnie dodano 741 µI 50 mM buforu Tris w celu obnizenia stezenia mocznika do 0,969 M, a bialka strawiono 4 µg (5 µ1) zmodyfikowanej trypsyny o jakosci do sekwencjonowania (Promega nr kat. V5 l 11, Fitchburg, WI) w 37° C przez 16 godzin. Próbki nastepnie inkubowano w 60 °C przez 30 min, schlodzono do 37 °C i po raz drugi dodano 4 µg (5 µ1) zmodyfikowanej trypsyny, po czym inkubowano przez 2 godziny w 37 °C. Dodano mieszanine peptydów SIS, aby uzyskac ilosc PL 440401 A1 28/71poszczególnych SIS w zakresie od 62,5 do 625 fmol/µg strawionej substancji, i próbki zakwaszono 0.1 % kwasem mrówkowym (KM) do koncowej objetosci 1,0 ml. Peptydy odsolono przy uzyciu wkladów Oasis HLB 1 ml (1 O mg) (Waters), które zostaly przeplukane l ml metanolu o czystosci do LC-MS i l ml wody o czystosci do LC-MS.

Próbki wprowad.wno i przemyto 1 ml wody. a nastepnie eluowano w 200 µl 65 % acetonitrylu o czystosci LC-MS, 0.1 % kwasem mrówkowym. Eluowane próbki suszono za pomoca SpeedVac (Labconco) i ponownie zawieszano w 95 µI O, 1 % kwasu mrówkowego, poddawano dzialaniu ultradzwieków przez 5 min i wirowano przy 14000 x g przez 3 min. Do analizy nano-LC-MS-MRM wstrzyknieto 3,8 ~d próbki. Pomiedzy kazda próbka wykonywano dwie slepe próbki (0,1 % KM), a próbke QC regularnie analizowano w celu monitorowania wydajnosci systemu LC-MS. 4) Analiza statystyczna: Dane zostaly przetworzone przy uzyciu SPSS Statistics (wersja 27.0; IBM Corp., Armonk, ~Y). Dla porównan poziomu bialka wykonano nieparametryczny test U Manna-Whitney' a (MWU). Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) dla porównan parami przeprowadzono w programie SPSS, a pole pod krzywa (AUC) podano w celu wskazania potencjalu diagnostycznego. Klasyfikacji dokonano w ramach programu Scikit-learn w wersji 0.24.2 (Pedregosa i in .. 2012).

Klasyfikatory zostaly zbudowane przy uzyciu biblioteki XGBoost w wersji 1.2.0 (T. Chen i Guestrin, 2016). Wydajnosc klasyfikatora oszacowano przy uzyciu IO-krotnej warstwowej walidacji krzyzowej z dostrajaniem hiperparametrów w zagniezdzonej 5- krotnej walidacji krzyzowej. Dostrojone hiper-parametry to: 'learning_rate', 'max_depth'. 'min_child_weight'. 'suhsample', 'colsample_hytree', and 'n_estimators'. z pr7eprowad7onym pelnym przeszukiwaniem siatki Procedure walidacji krzyzowej powtórzono 10 razy z róznymi losowymi wartosciami ziarna 'seed'. Wstepne przetwarzanie danych przeprowadzono w pytli walidacji krzyzowej i obejmowalo funkcje skalowania do zerowej sredniej i jednostkowego odchylenia standardowego w zbiorze uczacym oraz imputacje brakujacych wartosci. Zastosowano metode imputacji k­ najblizszych sasiadów, przy domyslnym ustawieniu k=5. Rekurencyjna eliminacja cech zostala wykorzystana do oszacowania optymalnej liczby cech potrzebnych do klasyfikacji.

W tym eksperymencie zmniejszono rozmiar siatki hiperparametrowej z powodu wysokich kosztów obliczeniowych. W celu uzyskania listy najwazniejszych cech dla kazdej grupy osobny model wykonujacy jeden-kontra-reszta klasyfikacji binarnej zostal wytrenowany.

Dla porównania przeprowadzono walidacje pojedynczego podzialu ze stratyfikowanym (proporcje grup plynu oplucnowego sa takie same) losowym podzialem danych na zestawy 70 %/30 % trening/test.

PL 440401 A1 29/71Wyniki 1) Wybór bialek i opracowanie panelu do testu MRM: Przygotowano do badan panel piecdziesieciu trzech bialek (tabela 1 i fig. 9) obejmujacy biomarkery stosowane w praktyce klinie.mej oraz opublikowane w literaturze naukowej o potencjale diagnostycznym do okreslania etiologii plynów oplucnowych, wykrywania nowotworów lub chorób infekcyjnych w badaniach osocza krwi. Dwadziescia dziewiec bialek reprezentuje markery stosowane w praktyce klinicznej. Trzvdziesci dwa, trzynascie i osiem bialek to odpowiednio potencjalne luh powszechnie stosowane markery nowotworowe, grnzlicze i infekcji/stanu zapalnego. '\Jastepnie dla wybranych 53 bialek zbudowano specyficzne metody MRM.

Dla kazdego z markerów, do ilosciowej analizy celowanej wybrano od jednego do siedmiu peptydów tryptycznych odznaczajacych sie duza liczba obserwacji podczas eksperymentów, odnotowanych w proteomicznych bazach danych, posiadajacych unikalna sekwencje dla danego bialka w ludzkim proteomie oraz niezawierajacych modyfikowalnych aminokwasów (aby uniknac potencjalnych modyfikacji post­ translacyjnych lub polimorfizmów pojedynczego nukleotydu, które pogarszaja dokladnosc analizy ilosciowej), dajac lacznie 205 celowanych peptydów. Dla kazdego z celowanych peptydów zsyntetyzowano jego odpowiednik ze znakowana trwalym ciezkim izotopem reszta lizyny lub argininy, pelniacy role wzorca wewnetrznego (SIS), w celu zwiekszenia specyficznosci, precyzji i czulosci testu. Te syntetyczne standardy wewnetrzne zastosowano takze do empirycznej optymalizacji metod MRM skladajacych sie ze specyficznych dla peptydów, zoptymalizowanych metod skanowania MS, celujacych w precY7yjnic wyhrnnc peptydy rcporterowc i ich jony fragmentacyjne, aby umozliwic ilosciowe oznaczanie analitów z ,,ysoka specyficznoscia i precyzja (Domanski i in., 2016).

Dodatkowo, w celu zwi~kszcnia specyficznosci i precyzji testu, 98 % i 89 % markerów bialkowych analizowano za pomoca odpowiednio dwóch lub wiekszej liczby i trzech lub wiekszej liczby celowanych peptydów.

Dodanie równych ilosci syntetycznych standardów wewnetrznych (SIS) do wszystkich próbek plynów oplucnowych pozwolilo na normalizacje otrzymanych wyników oraz eliminacje efektów zwiazanych z preparatyka próbek po etapie trawienia i przebiegiem analiz LC-MS. Wzglednego pomiaru ilosciowego peptydów w plynach oplucnowych dokonano z zastosowaniem normalizacji do syntetycznych standardów wewnetrznych. Na podstawie wzglednych pomiarów ilosciowych peptydów celowanych dla danego bialka wyznaczono srednia wartosc dla danego bialka, reprezentujaca jego PL 440401 A1 /71poz10m w próbkach plynu. Wyniki analizy ilosciowej przedstawiono jako wzgledny poziom markerów na stala objetosc plynu oplucnowego.

Protokól przygotowania próbek do analizy oraz trawienia bialek zostal zoptymalizowany, tak aby zapewnic mozliwie najwyzsza czulosc testu dla markerów analizowanych w panelu oraz aby zapewnic, mozliwie najwyzsza (z technicznego punktu widzenia) efektywnosc trawienia bialek. Ze wzgledu na zróznicowanie w poziomie calkowitego stezenia bialek w plynach oplucnowych i potencjalnym wplvwie tego zjawiska na etap trawienia bialek trypsyna, która dostarcza zastepczych peptydów reporterowych, opracowano specyficzna dla plynów oplucnowych i prosta procedure trawienia bialek w roztworze, jak opisano w punkcie powyzej pt. ,,Trawienie próbki plynu oplucnowego". Jednak kazda procedura trawienia prowadzaca do uzyskania wskazanych peptydów moze byc zastosowana. Ogólnie, sklada sie ona z 4-gocLdnncgo etapu denaturacji bialek w moczniku o wysokim stezeniu oraz inkubacji w wysokiej temperaturze, po której nastepowalo drugie trawienie bialek w trypsynie, dodawanej w duzym nadmiarze, aby zapewnic maksymalna denaturacje oraz mozliwie najwyzsza efektywnosc trawienia bialek, co jest szczególnie istotne w przypadku bialek wykazujacych duza opornosc proteolityczna. Optymalizacja procedury trawienia bialek zwiekszyla takze czulosc testu. Dodatkowo, w celu nadzorowania przebiegu trawienia bialek, we wszystkich próbkach plynów oplucnowych, monitorowano poziom dwóch glównych bialek osocza, albuminy surowicy i transferryny, aby wykryc potencjalne problemy na etapie trawienia bialek. Aby ustalic mozliwosci detekcji 53 bialek z panelu, za pomoca standardowego instrumentu TQ LC -MS (ang. Triple Quadrupole Liquid Chromatography-Ma~s Spcctromctry), przeprowadzono wstepna analize MRM na „próbkach laczonych", skladajacych sie z kilku plynów o tej samej etiologii oraz na indywidualnych próbkach plynów, obejmujacych najcz9sciej wyst9pujace etiologie plynów oplucnowych: gruczolakorak pluca (ADC), rak plaskonablonkowy pluca (SCC), niedrobnokomórkowy (NSCLC) i drobnokomórkowy rak pluca (SCLC), miedzybloniak oplucnej, nowotwór sutka, gruzlica oplucnej, zapalenie pluc i niewydolnosc serca.

Na podstawie tych wyników do ostatecznego panelu zakwalifikowano 34 biomarkery mozliwe do detekcji za pomoca standardowego instrumentu TQ LC-MS oraz bedace bialkami istotnymi dla klasyfikacji plynów oplucnowych, celowanych 105 peptydami (i odpowiadajacych im syntetycznych standardów wewnetrznych) do analizy ilosciowej. W ostatecznym panelu, az 91 % markerów bialkowych bylo celowanych za pomoca dwóch lub wiecej peptydów. Nastepnie przeprowadzono analize MRM 209 PL 440401 A1 31/71próbek plynów oplucnowych pochodzacych od pacjentów po torakocentezie z Lastosowaniem opracowanego panelu, podczas której wykryto 29 celowanych bialek.

Poziomy wielu peptydów, celowanych dla pojedynczego bialka, w calym zestawie analizowanych próbek, wykazaly mediane wspólczynnika korelacji Pearsona (wartosc R) 0,926 ± SD O, 124, z rozkladem pokazanym na fig. 5, wskazujacym na wysoka zgodnosc miedzy wieloma peptydami celowanvmi dla danego bialka, ze zwiekszona zmiennoscia zwiazana z mniejsza abundancja markera. Peptydy z ogólnie bardzo niskimi sygnalami zostaly pominiete w koncowej analizie danych, a te które zostaly zastosowane. przedstawiono w tabeli 1. 2) Analiza MRM 209 próbek plynów oplucnowych od pacjentów i róznice w poziomach markerów bialkowych w pieciu grupach plynów oplucnowych oraz zdolnosci indywidualnych markerów do rozrózniania etiologii plynów: Do celów analizy statystycznej 209 próbek plynu oplucnowego podzielono na 5 grup: plyny nowotworowe (11=109), ,,wszystkie plyny infekcyjne" (gruzlica i inne choroby infekcyjne pluc/oplucnej, n=58). plyny spowodowane niewydolnoscia narzadów (innych niz pluca), stanowiace glównie przesieki (,,plyny lagodne·', n=42), z dalszym podzialem plynów infekcyjnych na plyny gruzlicze (n=24) i „inne plyny infekcyjne'' spowodowane chorobami infekcyjnymi pluc i oplucnej (n=34 ). W tabeli na fig. 4 przedstawiono bialka, których poziom w plynach roznil sie w sposób istotny statystycznie (p S 0,05: na podstawie testu Manna-Whitney'a (MWU)) pomiedzy 5 grupami plynów oraz prezentuje ich potencjalna uzytecznosc diagnostyczna na podstawie wartosci AUC (pole powierzchni pod krzywa) otrzymanych z analiz krzywych ROC. Tabela obejmuje wszystkie mozliwe porównania pomiedzy grnpami, dajac lacznie 26 porównan, a w obrebie danego porównania bialka sa przedstawione w kolejnosci od najwyzszej istotnosci statystycznej do wartosci p ::S0,05, aby zaprezentovvac porównanie wi9kszosci markerów. Podkreslono takze bialka, które uzyskaly najlepsze wyniki (p ::S 0,01 test lvIWU i AUC ::.::_ 0,700).

Analiza ilosciowa markerów bialkowych w próbkach plynu oplucnowego byla przeprowadzona na dana (stala) objetosc plynu, co jest powszechnie stosowane w laboratoriach diagnostycznych w analizach plynu oplucnowego i innych ludzkich plynach biologicznych. Odbywa sie to pomimo znanej zmiennosci calkowitego stezenia bialka wsród plynów oplucnowych, która w opisanym tu przypadku ksztaltowala sie nastepujaco: wszystkie plyny: 41,2 gil ± 9,31 SD, plyny nowotworowe: 41,4 gil ± 7,64 SD, plyny gruzlicze: 47,2 gil± 6,64 SD, ,,inne plyny infekcyjne" 47,8 gil± 5,36 SD i plyny zwiazane z niewydolnoscia narzadów: 28,3 gil± 9,26 SD.

PL 440401 A1 32/71W grupie plynów nowotworowych zaobserwowano istotnie podwyzszone poziomy szesciu bialek, które biora udzial w adhezji komórek i roz\voju nowotworu: kadheryna-1 (CDHl). trombospondyna-4 (THBS4), mezotclina (MSLN), mucyna-1 (MUC-1, CA 15- 3). domena Sushi, c,,;ynnik von Willebranda typu A EGf i bialko zawierajace domene penlraksyny 1 (SYEPl - ang. sushi von Willebrand faclor lype A EGF and pentraxin domain-containing protein 1 l oraz inhibitor proteazy typu Kunitz 1 ( SPlNT 1) (fig. 1).

Kazdy z szesciu wyzeJ wymienionych markerow bialkowych, pozwala na rozróznienie plynów nowotworowych od ,.wszystkich plynów infekcyjnych", plynów gruzliczych, „innych plynów infekcyjnych'' i od wszystkich plynów nienowotworowych lacznie (n= 100). z odnotowanymi wartosciami AUC w zakresie 0.650 do 0,822. Do rozrózniania plynów nowotworowych od nienowotworowych, najlepszymi biomarkerami okazaly sie bialka CDHl, 1\flTl, THBS4 i MSLN (AUC: 0,766 do 0,698). Natomiast najlepszym markerem do rozrózniania plynów nowotworowych od kazdej innej grupy plynów, bylo bialko CDHl (A.UC: 0,734-0,822). Bialka SVEPl, THBS4 i MSLN umozliwily skuteczne rozróznienie plynów nowotworowych od plynów gruzliczych, ,,innych plynów infekcyjnych" i „wszystkich plynów infekcyjnych'" (AUC: 0,705-0.777), natomiast znacmie gor,,;ej mozna bylo rozróznic na podstawie poziomów tych trzech bialek plyny nowotworowe od spowodowanych niewydolnoscia narzadów (,,plyny lagodne'') (np. dla SYEP I brak istotnosci statystycznej, a dla reszty niska istotnosc) Poziomy bialek MUC-1 oraz CK-8 i CK- I 8, które sa markerami nowotworowymi stosowanymi w praktyce klinicznej, byly istotnie podwyzszone w plynach nowotworowych i najlepiej sprawdzily sie w rozróznianiu plynów nowotworowych od plynów spowodowanych niewydolnoscia narzadów (AUC w zakresie 0,699-0,747) Sposród trzech wyzej wymienionych bialek, najlepszym biomarkerem okazal sie byc MUCl i umozliwial rozróznianie plynów nowotworowych od plynów gruzliczych, ,,innych plynów infekcyjnych", ,,wszystkich plynów infekcyjnych" z odnotowanymi wartosciami AUC w zakresie 0,671-0.673. Poziom bialka SPINT 1 byl istotnie wyzszy w plynach nowotworowych we wszystkich porównaniach pomiedzy grupami, ale jego zdolnosc do rozrózniania grup plynów byla znacznie nizsza. Podsumowujac, w opracowanym tescie opartym na spektrometrii mas, bialko CDHl jest najlepszym markerem nowotworowym, który skutecznie rozróznia plyny nowotworowe od kazdej innej grupy plynów. Dodatkowo, bialka THBS4, MSLN i SVEPl, wspieraja róznicowanie plynów nowotworowych od infekcyjnych, a MUCl róznicuje plyny nowotworowe od wszystkich nienowotworowych.

W grupie plynów gruzliczych, zaobserwowano wysoki poziom trzech potencjalnych biomarkerów gruzliczych: deaminazy adenozynowej (ADA2), chemokiny PL 440401 A1 33/71CXCLlO (CXCLlO) oraz cytoplazmatycznej syntetazy tryptofany Io-tRNA (W ARS), charakterystyczny tylko dla tej grupy plynów (fig. 2). Byly to jedyne markery, które pozwalaly na rozróznianie plynów gruzliczych od „innych plynów infekcyjnych" z wysoka istotnoscia statystyczna, z indywidualnymi wartosciami AUC w zakresie 0,784 do 0,876.

Ponadto, byly one takze najlepszymi markerami umozliwiajacymi rozróznienie plynów gruzliczych od wszystkich innych plynów lacznie (n=l85) z wartosciami AUC w zakresie 0.832-0,881 oraz byly jednymi z najlepszvch markerów umozliwiajacych rozróznienie plynów gruzliczych od nowotworowych i powodowanych niewydolnoscia narzadów (AUC: 0,828-0,906). Dodatkowe siedem bialek, które byly podwyzszone w grupie plynów gruzliczych, pozwalaly na ich rozróznianie od plynów nowotworowych, powodowanych nievvydolnoscia narzadów i grupy wszystkich innych plynów lacznie, ale ich poziomy byly takze podwyzszone w grupie „innych plynów infekcyjnych". Wspomniane wyzej bialka, stanowia przede wszystkim markery stanu zapalnego i sa nimi: wimentyna (VIJ\;1), galek.tyna 1 (LGALSl). surowicze bialko amyloidu P (APCS), bialko SIOOA9 (SlOOA9), metaloproteinaza 9 (MMP9), dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA) i bialko C-rcaktywne (CRP) (AUC: 0,674 do 0,867, najwyzsza wartosc AUC dla wimentyny). Powyzsze siedem bialek umozliwia rozróznianie „innych plynów infekcyjnych" od nowotworowych, zwiazanych z niewydolnoscia narzadów i grupy wszystkich innych plynów lacznie, (AUC: 0.650-0,873), a najlepszym markerem we wszystkich trzech porównaniach bylo bialko SI OOA9 (AUC: 0.773-0.873). Pomimo, ze grupie ,jnnych plynów infekcyjnych" nie przypisano zadnego markeru specvficznie podwyzszonego tylko w tej grupie, to hemopeksyna (HPX), której poziom byl wysoki takze w plynach nowotworowych (fig. 1), byla bialkiem, które umozliwialo rozróznienie „innych plynów infekcyjnych" od gruzliczych (Al.T: 0,707). Równiez w grupie „wszystkich plynów infekcyjnych", obejmujacej plyny gruzlicze i „inne plyny infekcyjne", zaobserwowano istotnie podwyzszone poziomy wyzej wymienionych dziesieciu bialek, które umozliwiaja rozróznienie „wszystkich plynów infekcyjnych" od plynów nowotworowych, zwiazanych z niewydolnoscia narzadów i grupy wszystkich innych plynów lacznie (AUC: 0,664- 0,858). Podsumowujac, plyny infekcyjne mozna skutecznie odróznic od innych plynów, dzieki podwyzszonemu poziomowi dziesieciu markerów bialkowych. Podwyzszone poziomy siedmiu z nich: SIOOA9, VIM, LGALSI, APCS, MMP9, LDHA i CRP, wskazuja na „wysiek infekcyjny" o dalej niewyjasnionej etiologii, przy czym bialko SIOOA9 jest najlepszym markerem dla grupy „innych plynów infekcyjnych". Dodatkowo plyny gruzlicze moga byc zidentyfikowane dzieki podwyzszonemu poziomowi bialek ADA2, CXCLlO, WARS (AUC: 0,826-0,906), specyficznemu tylko dla tej grupy, a najlepszym z PL 440401 A1 34/71markerów jest ADA2. Bialko ADA wystepuje w dwóch izoformach, ADAl oraz ADA2, których calkowita aktywnosc enzymatyczna jest mierzona w tescie diagnostycznym w kierunku gruzlicy, natomiast w opisanych badaniach izofonna ADAl nie zostala wykryta w zadnej z analizowanych próbek plynu oplucnowego.

Dodalkowo zaobserwowano podwyzszony poziom markerów, wspólny dla czterech grup plynów oplucnowych (plynów nowotworowych. plynów gruzliczych, ,jnnych plynów infekcvjnych'' i ,.wszystkich plvnów infekcyjnych'') i pozwalajacy na rozróznienie ich od plynów spowodowanych niewydolnoscia narzadów (,,plyny lagodne"), z odnotowanymi wartosciami AUC siegajacymi 0,880 (fig. 6). Wspomniane powyzej markery obejmowaly hemopeksyne (HPX), dehydrogenaze mleczanowa B (LDHB), dehydrogenaze mleczanmva (LDH: obejmujaca LDH-A, -B i -C). skladowa C3 dopelniacza (C3), skladowa C9 dopelniacza (C9) i czynnik pochodzacy z nablonka barwnikowego siatkówki (SERPINF1 ).

Polowa z tych bialek, to bialka osocza krwi, a ich podvvyzszony poziom w czterech grupach plynów oplucnowych, jest prawdopodobnie spowodowany tym, ze wiekszosc plynów zwiazanych z niewydolnoscia narzadów, stanowia przesieki, które charakteryzuja sie nizszym calkowitym stezeniem bialek osocza. Podkresla to takze fakt, ze poziomy wielu ze wspomnianych wczesniej, markerów specyficznych dla danej etiologii plynów (np. W ARS) sa wyzsze w kazdej z grup plynów, oprócz tych zwiazanych z niewydolnoscia narzadów. Jednak bialko SYEP I, które umozliwia rozróznianie plynów nowotworowych i infekcyjnych, okazalo sie byc takze jedynym markerem podwyzszonym w plynach zwiazanvch z niewydolnoscia narzadów (,,plyny lagodne") i pozwalalo na ich rozróznianie od wszystkich trzech grnp plynów infekcyjnych (AUC: 0,800-0,802). Pomimo, ze dla grnpy plynów zwiazanych z niewydolnoscia narzadów, nie zaobserwowano zadnego specyficznie podwyzszonego markern, to obnizony poziom wymienionych wczesniej szesciu bialek i podwyzszony poziom SVEPl, wykluczaja nowotworowa i infekcyjna etiologie plynu.

Inne markery, których poz10my byly podwyzszone, ale wykazaly mmeJsza zdolnosc do umozliwienia rozróznienia grup plynów, maja potencjal aby zostac markerami chorobowymi, przy zastosowaniu w przyszlosci bardziej czulych testów opartych na spektrometrii mas, np. antygen CDl 66 (ALCAM), cytokeratyna 19 (CK-19) i kali statyna (SERPINA4) byly podwyzszone w plynach nowotworowych (fig. 7), ale odnotowane wartosci AUC byly niskie (0,580-0,584). Inne bialka w tescie wedlug wynalazku nie wykazaly duzej istotnosci w rozróznianiu miedzy badanymi grupami plynów oplucnowych. CK-6 i CK-7 wykryto w kilku plynach nowotworowych, ale ich poziomy nie róznily sie z istotnoscia statystyczna. Gelsolin (GSN) wykryto uzyskujac dobry sygnal PL 440401 A1 /71pochodzacy od czterech peptydów we wszystkich próbkach, ale nie róznicowal zadnej z grup plynów oplucnowych. 3) Zastosowanie klasyfikatora wieloklasowego do klasyfikacji plynów oplucnowych: Uzyskane dane z eksperymentu przetestowano z zastosowaniem metodyki uczenia maszynowego typu „Boosted Trees'', w celu sprawdzenia jej mozliwosci do klasyfikacji plynow oplucnowych do jednej z czterech grup, odpowiadajacych etiologiom plvnu: plyn nowotworowy, gruzliczv, ,,inny infekcyjny" i zwiazany z niewydolnoscia narzadów (,,plyn lagodny") oraz ujawnienia najwazniejszych cech (ang top features) dla klasyfikacji. Dodatkowa piata grnpa ,,wszystkie plyny infekcyjne", zostala sztucznie stworzona przez polaczenie grnpy plynów grnzliczych i ,,innych plynów infekcyjnych".

Przedstawiono dane dotyczace abundancji bialka oraz poziomów indywidualnych peptydów, aby nie przegap1c potencjalnie lepiej dzialajacego markera, bedacego pojedynczym peptydem. Metoda Boosted Trees opiera sie na sekwencyjnym i progresywnym szkoleniu zestawu drzew decyzyjnych (ang. decision trees), w którym kazde drzewo dodawane do zestawu jest konstruowane w celu poprawy jakosci klasyfikacji w miejscu poprzednio blednie sklasyfikowanych instancji (ang. misclassified instances). Potwierdza to, ze wybrane przez klasyfikator najwazniejsze cechy, maja potezna zdolnosc przewidywania. Zastosowano dziesieciokrotna walidacje krzyzowa (ang. cross-validation) ze stratyfikacja powtórzona I O razy, skutecznie testujac I 00 losowych podzialów i usredniajac uzyskane wyniki. Pozwolilo to okreslic zakres mozliwosci klasyfikacji dostarczvlo wartosci odchylenia standardowego dla szacowanych parametrów. Ponadto. szczególna uwage poswiecono, aby uniknac nadmiernego dopasowania modelu (ang overfitting), dostrajajac hiperparametry w procedurze zagniezdzonej walidacji krzyzowej (ang. nested cross-validation).

Klasyfikator przewidywal ctiologi9 plynu oplucnowego, ze zdolnoscia do rozrózniania 5 grup plynów oplucnowych, okreslana jako „bardzo dobra'' (Mandrekar, 2010), z odnotowanymi wartosciami AUC w zakresie od 0,842 do 0,869 (fig. 3a). Aby zasugerowac optymalny punkt odciecia dla potencjalnego narzedzia diagnostycznego opartego na tym klasyfikatorze, podano maksymalna wartosc wskaznika Y oudena „Max J­ Tndex" oraz czulosc i swoistosc testu w tym punkcie. Przedstawiono równiez 15 najwazniejszych cech wykorzystywanych dla kazdej z klasyfikacji (fig. 3a). Zastosowanie wielu markerów do klasyfikacji plynów, wykazalo poprawe zdolnosci do ich rozrózniania, wnioskujac na podstawie odnotowanych wartosci AUC, a zwlaszcza na podstawie wzrostu czulosci testu przy jego 100 % swoistosci (przy braku wyników falszywie dodatnich: O FPR (ang. false positive rate)). Szczególnie skuteczne bylo przewidywanie nowotworowej PL 440401 A1 36/71oraz gruzliczej etiologii plynu z czuloscia testu na poziomie odpowiednio 55 o/c i 67 % (i przy braku wyników falszywie dodatnich). Klasyfikator odróznial plyny nowotworowe od pozostalych plynów z wartoscia AUC wynoszaca 0,863 ± 0,074 oraz czuloscia i swoistoscia na poziomie odpowiednio 71 % i 90 %. Najwazniejsza cecha dla klasyfikacji plynów nowotworowych byl poziom bialka CDHl, a nastepnymi w kolejnosci pod wzgledem waznosci byly podwyzszone poziomy bialek MUC 1, THBS4, MSLN i HPX.

Plyny gruzlicze zostaly odróznione od pozostalych plynow z wartoscia AUC na poziomie 0,859 ± O, 153 oraz 75 % czuloscia i 94 % swoistoscia Najwazniejszymi cechami dla tej klasyfikacji byly podwyzszone poziomy bialek ADA2, WARS i CXCLlO oraz ich indywidualnych peptydów. ,,Inne plyny infekcyjne" zostaly odróznione od pozostalych plynów z wartoscia AUC na poziomie AUC 0,863 ± 0,096 oraz 76 % czuloscia i 82 % swoistoscia. Wsród szesciu najwazniejszych cech dla klasyfikacji „innych plynów infekcyjnych" znalazly sie poziomy bialek CRP i SIOOA9 oraz ich indywidualnych peptydów. Przetestowano równiez zdolnosc klasyfikatora do identyfikacji „ wszystkich plynów infekcyjnych", w rezultacie osiagajac wartosc AUC na poziomie 0,869 ± 0,086 oraz 74 % czulosc i 86 % swoistosc. Najwazniejszymi cechami dla tej klasyfikacji byly podwyzszone poziomy bialek S l OOA9, VIM, W ARS i ADA2. Klasyfikator wykazal równiez dobra zdolnosc do rozrózniania plynów zwiazanych z niewydolnoscia narzadów (,,plyny lagodne''), które nie mialy zadnych specyficznie podwyzszonych markerów, z wartoscia AUC 0,842 ± O, l 00 oraz 77 % czuloscia i 77 % swoistoscia Dwiema najwazniejszymi cechami dla tej klasyfikacji byly obnizone poziomy bialek C9 i LDHA, a kolejno 10 dodatkowych cech obejmujacych obnizone poziomy bialek LDHA, C9, HPX, LDH i LDHR ora7 ich indywidualnych peptydów. Procedury walidacji krzyzowej, takie jak ta zastosowana tutaj, sa bardziej rygorystyczne przy szacowaniu wydajnosci klasyfikatorów, zwlaszcza gdy zbiór danych jest stosunkowo maly, niz klasyczne techniki walidacji z pojedynczym podzialem (Singh i in., 2021). Przeprowadzono tutaj jednak równiez podejscie ,,treningu/testowania", losowo dzielac 209 plynów proporcjonalnie na trening/test 70 %/30 %. Wyniki AUC byly bardzo zblizone do tych z procedury walidacji krzyzowej, przy czym trzy przypadki byly nawet wyzsze: AUC-nowotworowe = 0,833, AUC-gmzlica = 0,924, AUC-inne-infekcyjne = 0,890 i AUC-lagodne = 0,851.

Wazna do rozwazenia kwestia jest minimalna liczba markerów wymaganych w tescie lub minimalna liczba testów z jednym markerem potrzebna do zachowania tej samej zdolnosci do rozrózniania etiologii. Zbadanie wplywu liczby wszystkich cech, wykorzystywanych przez klasyfikator dla wszystkich czterech grup, na uzyskane wartosci AUC pokazuje, ze uzycie od 1 do 15 cech stopniowo zwieksza srednia wartosc AUC z PL 440401 A1 37/710,645 do 0,862 (fig. 3b). Zwiekszenie liczby cech powyzej 11 powoduje niewielki wzrost wartosci AUC, z 0,853 do 0,867 przy 20 cechach. Wykorzystanie 15 cech wydaje sie byc rozsadnym wyborem, które wymagaloby pomiaru tylko 10 bialek (CDHl, J\,IlJCl, THBS4, ADA2, W ARS, CRP, Sl00A9, C9, LDIIA i IIPX) i jest czyms, co mozna latwo osiagnac podczas jednej 30-60 minutowej, multipleksowanej analizy LC-MS-MRM. 4) Uzytecznosc diagnostyczna opracowanego testu opartego na zbudowanym klasyfikatorze: Opracowany model moze byc stosowany do klasyfikacji plynów oplucnowych na podstawie danych ilosciowych uzyskanych w analizie MRM panelu 29 bialek, jako wspomagajace narzedzie diagnostyczne. po przeprowadzeniu standardowych badan obrazowych i torakocentezie, w celu skrócenia czasu potrzebnego do diagnostyki etiologii plynów i wprowadzenia odpowiedniej terapii. Obliczono czestosc wystepowania (prewalcncje) pieciu etiologii plynów oplucnowych, testowanych przez klasyfikator. na podstawie calego zbioru zebranych próbek, stanowiacego 367 plynów pobranych od kohorty pacjentów (z tego samego szpitala), z wykluczeniem ropniaków, które sa latwe do zdiagnozowania, oraz z wykluczeniem plynów o nieLnanej etiologii (tabela 2 ponizej).

Znajomosc prewalencji poszczególnych etiologii pozwolila na oblicLenie, istotnych z diagnostycznego punk.tu widzenia, dodatnich i ujemnych wartosci predykcyjnych (odpowiednio PPY (ang. positive predietive value) i NPY (ang. negative predieitve value)), wskazników wiarygodnosci dodatniego wyniku testu (ang. positive likelihood ratio, LR-) oraz ujemnego wyniku testu (ang. negative likelihood ratio, LR-), a takze dokladnosci testu w wybranym punkcie odpowiadajacym optymalnej wartosci czulosci oraz swoistosci (Max J-index), dla kazdej z pieciu klasyfikacji (tabela 2). Klasyfikator najlepiej odróznia plyny nowotworowe i gnizlic?:e od pomstalych plynów, 7: dokladnoscia powyzej 80 %.

Dokladnosc klasyfikacji ,,innych plynów infekcyjnych", ,,wszystkich plynów infekcyjnych" i plynów zwiazanych z nie·wydolnoscia narzadów (,,plyny lagodne"), jest nieco nizsza i wynosi od 76,8 do 79,9 %. Potwierdzaja to równiez waitosci wskazników wiarygodnosci dodatniego wyniku testu - dla plynów gruzliczych LR+ wynosi 12,6, co oznacza, ze uzyskanie dodatniego wyniku testu (zaklasyfikowanie do grupy plynów gruzliczych przez klasyfikator) znacznie zwieksza prawdopodobienstwo, z przed testu, wystepowania u pacjenta gruzlicy. W przypadku plynów nowotworowych, LR+ jest nizszy niz dla gruzlicy i wynosi 7,07, co oznacza, na „umiarkowana do duzej" poprawy w stosunku do prawdopodobienstwa przed testem zdiagnozowania wystepowania nowotworu u pacjenta przy uzyskaniu dodatniego wyniku testu. Natomiast, dla „innych plynów infekcyjnych", ,,wszystkich infekcyjnych" oraz zwiazanych z niewydolnoscia narzadów, LR+ jest nizszy, w zakresie 3,28-5, 18, co wskazuje na „niskie do umiarkowanych" PL 440401 A1 38/71zdolnosci testu do popnnvy diagnostyki tych etiologii. Wskaznik wiarygodnosci ujemnego wyniku testu (LR-) jest dla wszystkich grup plynÓ\\i na podobnym poziomie (niewielkim do umiarkowanego), co oznacza, ze ujemny wynik testu tylko nie,-;nac,mie poprawia zdolnosc obecnego rozwiazania do wykluczenia plynu z danej grupy. Wartosci PPV /NPV wskazuja, ze dodatni wyniku testu na plyn nowotworowy daje 86% prawdopodobieristwa, ze plyn naprawde pochodzi od pacjenta z rakiem, natomiast ujemny wynik wiaze sie z 78 % prawdopodobienstwem. ze jest prawdziwy. Jesli chodzi o plynv gruzlicze, to we wzgledu na nizsza prewalencje gmzlicy oplucnej, dodatni wynik testu z prawdopodobienstwem 580ci prawidlowo identyfikuje plyn grnzliczy, natomiast ujemny wynik testu z prawdopodobienstwem 97 % prawidlowo wyklucza etiologie grnzlicy.

Podobnie jest w przypadku „innych plynów infekcyjnych", ,,wszystkich plynów infekcyjnych" oraz plynów zwiazanych z niewydolnoscia narzadów Tabela 2. Skutecznosc diagnostyczna klasyfikatora z wartosciami odciecia czulosci/swoistosci wybranymi przy maksymalnym wskazniku J (wskaznika Youdena) z uwzglednieniem czestosci wystepowania etiologii.

Pre""alen Czulosc Swoistosc PPV NPV Doklad- Etiologia LR+ LR- -cja ( %) ( %) ( %) % % DOSC % Plvnv 46,9 70,7 90,0 86,2 77,7 7,07 0.326 80,4 nowotworowe Plyny gruzlicze 9.8 74,5 94,1 57,8 97,1 12.6 0.271 84,3 Inne plyny 14,3 75.6 82,4 41,8 95,3 4,30 0.296 79,0 infekcyjne Wszystkie plyny 24,1 74.1 85,7 62,2 91,2 5,18 0.302 79,9 infekcyjne Plyny lagodne 29,0 77.1 76,5 57,3 89,1 3,28 0.299 76,8 Wybór optymalnych punktów odciecia (przy danej czulosci i swoistosci testu), moze róznic sie w zaleznosci od pytania diagnostycznego. W przypadku diagnostyki plynów oplucnowych, czesto sa one wybierane tak, aby test charakteryzowal sie jak najwyzsza swoistoscia (jak najnizszy wskaznik FPR), a tym samym umozliwil postawienie pewnej (jednoznacznej) diagnozy, kosztem uzyskania falszywie ujemnych wyników testu dla czesci pacjentów. Przykladem jest badanie cytologiczne plynu oplucnowego majace na celu zdiagnozowanie nowotworu zlosliwego u pacjentów ze 100 % specyficznoscia (O FPR). W opracowanym przez nas klasyfikatorze przy wyborze punktu odciecia odpowiadajacego 100 % swoistosci testu (0 FPR), czulosc testu wynosi 55 %, 67 %, 40 %, PL 440401 A1 39/7148 % i 29 % dla identyfikacji plynów oplucnowych zwiazanych odpowiednio z nowotworem, gruzlica, ,,inna choroba infekcyjna pluc lub oplucnej", ,, wszystkimi chorobami infekcyjnymi pluc i oplucnej" i niewydolnoscia narzadów (innych niz pluca).

Przedstawiono równiez krzywe PPV w funkcji czulosci testu, dla kazdej z pieciu klasyfikacji plynów, aby umozliwic wybór optymalnego punktu odciecia, dopasowany do konkretnego pytania diagnostycznego (fig. 8). Krzywe tego typu wskazuja jak wybrac optymalny punkt odciecia, aby nie stracie wiele na czulosci testu (czyli .,nie przeoczyc" pacjentów z dana choroba), jednoczesnie uzyskujac wysoki PPV dla hardziej precyzyjnej diagnozy, biorac takze pod uwage czestosc wystepowania danej choroby.

Wykazano, ze ukienmkowane testy oparte na spektometrii mas (LC-MS). w których stosuje sie syntetyczne peptydy STS jako standardy we\vnetrzne, maja niezrównana specyficznosc analityczna do ilosciowego oznaczania biomarkerów bialkowych, a jednoczesnie umozliwiaja rozróznianie izoform. modyfikacji post-translacyjnych (PTM) oraz wnosza takze inne, dodatkowe informacje biologiczne (Addona i in .. 2020; Ncubcrt i in., 2020; Wright i Van Eyk, 2017) Stanowi to wyrazny kontrast z biochemicznymi i opai1ymi na przeciwcialach testami diagnostycznymi, których problemy ze specyficznoscia, a takze inne ograniczenia zostaly niedawno mocno podkreslone (Baker, 2015; Hoofnaglc i Roth, 2013; Jannctto i Fitzgerald. 2016). Testy oparte na spektomctrii mas. takie jak tutaj opisane. bez etapów wzbogacania próbki, nie maja czulosci analitycznej zapewnianej przez testy oparte na przeciwcialach, jednak szybko sie to zmienia, ze wzgledu na rozwój spektrometrów, a wprowadzenie testów do analizy bialek opartych na spektometrii mas w laboratorium diagnostycznym. jest niewatpliwie pr7ys7loscia (Addona i in, 2020: Hoofnagle i Roth, 2013; Horber i in, 2020; Jannetto i Fitzgerald. 2016; Wright i Van Eyk, 2017).

W tej pracy ustalono, które z 53 bialek obecnie stosowanych w praktyce klinicznej lub bedacych potencjalnymi markerami bialkowymi, do okreslania etiologii plynu oplucnowego, z najwiekszym prawdopodobienstwem sprawdza sie w ukierunkowanym tescie opartym na spektrometrii mas. Obejmuja one okolo 20 bialek o sredniej i wysokiej abundancji, które mozna z latwoscia wykryc wykorzystujac prosta metode przygotowania próbki, co sprawia, ze podejscie wedlug wynalazku mozna bez trudu przeniesc do standardowego klinicznego systemu LC-MS.

Wykazano tutaj, ze podejscie multipleksowe z klasyfikatorem wieloklasowym wykorzystujacym do okolo 15 cech, ulepsza zdolnosc do rozrózniania plynów w porównaniu z zastosowaniem pojedynczych markerów. Ostatnio wykazano, ze przewidywanie etiologii plynu oplucnowego jest istotnym wyzwaniem, zaleznym od wielu PL 440401 A1 40/71czynników oraz ze analiza wielu biomarkerów diagnostycznych równoczesnie, pomaga w grupowaniu plynów oplucnowych (Ferreiro i in., 2020). Podobnie jak w prLcdstawionych tu wynikach, ponad polowa wysieków nowotworowych grupowala sie z przesiekami wysiekami infekcyjnymi, a wysieki infekcyjne czesto grupowaly sie z gruzliczymi innymi plynami oplucnowymi, podczas gdy wysieki gruzlicze skupialy sie glównie w odrebnej grupie. Pomimo tak duzego wyzwania, jakie stanowi róznicowanie etiologii plvnów oplucnowych, wykazano tutaj, ze podejscie oparte na spektometrii mas posiada wartosc diagnostyczna Wartosci AUC dla klasyfikacji p1ecrn gmp plynów oplucnowych, wynosza od 0,842 do 0,86CJ, przy sredniej dokladnosci prawidlowej diagnozy wynoszacej 80 %. Test jest najlepszy w diagnozowaniu wysieku gmzliczego (LR+: 12,6), a nastepnie w diagnozowaniu wysieku nowotworowego (LR+: 7,1). Natomiastjego zdolnosc do poprawy diagnostyki wysieków infekcyjnych i zwiazanych z niewydolnoscia narzadów (glównie przesieków), jest mniej sza. Mozliwosc wykluczenia danej etiologii byla niska dla wszystkich grup, co oznacza, ze brak obecnosci markerów w plynie nie jest tak dobry we wskazywaniu wyników prawdziwie ujemnych, jak jest wykrycie ich obecnosci we wskazywaniu wyników prawdziwie dodatnich. Powyzszy test bylby zatem najlepszy do róznicowania etiologii nowotworowej lub gruzliczej, co rzeczywiscie stanowi obecnie najwieksze wyzwanie, poniewaz oba plyny na ogól maja charakter wysieku limfocytarnego (Mercer i in, 2019). Badanie cytologiczne plynu do wykrywania wvsieków nowotworowych ma czulosc ponizej 60 %, natomiast testy plynu w kienmku gruzlicy oplucnej, takie jak metody mikrobiologiczne, trwaja tygodnie, a testy oparte na PCR maja czulosc ponizej 21-61 % (Jose M Porcel, '.2.016, 2018) W gmpie analizowanych przez nas próbek plynów oplucnowych dodatni wynik cytologii uzyskano jedynie dla 24 % wysi9ków nowot\vorowych. W przeciwienstwie do tego, test wedlug wynalazku (przy 100 o/c,. swoistosci) umozliwil zidentyfikowanie 55 7o wysieków nowotworowych i 67 % wysieków gruzliczych. Na podstawie tego jednoosrodkowego badania plynów oplucnowych pochodzacych od kohorty pacjentów po torakocentezie, mozna stwierdzic, ze zdolnosc diagnostyczna testu wedlug wynalazku dla wspomnianych wczesniej dwóch etiologii jest na tym samym poziomie lub lepsza od obecnie stosowanych testów laboratoryjnych, a przy tym wymaga mniej czasu na uzyskanie wyniku.

CDHl byl najlepszym markerem, specyficznym dla plynów nowotworowych.

Oprócz CDHl, róznicowanie plynów nowotworowych od plynów infekcyjnych (w tym gruzliczych), wspieraly THBS4, MSLN oraz SVEPl. MUCl, HPX, SPINTl, CK-8, CK- 18, CK-19, ALCAM (antygen CD166) i SERPINA4 dodatkowo odróznialy plyny PL 440401 A1 41/71nowotworowe, przy czym MUCl byl z nich najskuteczniejszy. Klasyfikator jako glówne cechy uzywal CDHl, Ml.Tl, THBS4, MSLN i HPX (w przedstawionej kolejnosci).

Jednak HPX byl równiez podwyzszony w „innych plynach infekcyjnych" i odróznial je od plynów gruzliczych SVEP l byl równiez jedynym podwyzszonym markerem i umozliwiajacym odróznienie plynów oplucnowych zwiazanych z niewydolnoscia narzadów (,.plyny lagodne'') od plynów infekcyjnych. SPINTl, CK-8. CK-18. CK-19.

ALCAM i SERPINA4 nie znalazly sie wsród 15 najwazniejszych cech. Moze to wynikac z ich mniejszej istotnosci lub z tego, ze klasyfikator uzywa „zachlannego algorytmu" do konstrnowania drzew, unikajac w ten sposób uzycia zbednych cech. Markery te moga dzialac lepiej z bardziej czulym spektrometrem mas lub przy wprowadzeniu etapu wzbogacania próbki, jak wykazano wczesniej dla markerów cytokeratynowych ze wzgledu na ich mniejsza abundancje w plynie oplucnowym (Domanski i in, 2016; Perzanowska i in., 2018).

CDHI (E-kadhcryna) bedaca skladnikiem polaczen przylegajacych odgrywa wazna role w adhezji miedzykomórkowej tkanek nablonka. Jest potencjalnym biomarkcrcm do diagnostyki zaawansowanego raka jelita grubego, w surowicy krwi (Weif3 i in., 2011).

Odnotowano, ze jej poziom jest podwyzszony w plynach nowotworowych i zostala wybrana jako jeden z szesciu najlepszvch, potencjalnych biomarkerów oprócz SPINTl, MUCL THBS4. ALCAM (antygen CDl66) i SVEPl (C.-D Chen i in, 2014), które przetestowano w przedstawionym tu badaniu. Przedstawione tu wyniki generalnie potwierdzaja wyniki Chen i in., chociaz róznia sie one osiagnietymi zdolnosciami do rozrózniania plynów. Chen i in. przeprowadzili analize J\;fRM na 82 plynach oplucnowych i zastosowali etap wzbogacenia próbki Odnotowali SPTNTl (AUC: 0,916), CDHl (AUC: 0,815) i MUCl (AUC: 0,807) jako glówne markery pozwalajace na rozróznienie plynów nowotworowych, spowodnwanych wylacznic przez grnczolakoraka. Ponadto, jako kontrole w tym badaniu zastosowali plyny gruzlicze, plyny parapneumoniczne i paranowotworowe (plyny oplucnowe zwiazane z nowotworem pluca, ale bez stwierdzonych przerzutów), co zapewne podwyzszylo uzyskane wartosci AUC. Na podstawie modelu regresji logistycznej wybrali najlepszy panel 3-markerowy, skladajacy sie z SPINTl, SVEPl i THBS4 (AUC: 0,951 ). W opisanym tu badaniu analizowano takze plyny oplucnowe zwiazane z niewydolnoscia narzadów (,,plyny lagodne"), stanowiacych glównie przesieki, które równiez wykazuja wyzszy poziom SVEPI, co czyni ten marker niespecyficznym dla plynów nowotworowych, lecz prawdopodobnie jego poziom jest nizszy w plynach infekcyjnych. SVEPI jest wazna czasteczka adhezyjna komórek, regulujaca adhezje miedzykomórkowa, uczestniczaca w progresji raka (L. Chen i in., 2020; PL 440401 A1 42/71Shur i in, 2007). THBS4 jest zewnatrzkomórkowym bialkiem vviazacym wapn, bioracym udzial w interakcjach komórka-komórka i komórka-macierz, i stwierdzono jego nadekspresje w zrebie nowotworowym gruczolakoraka zoladka typu rozlanego wydzielanym przez fibroblasty zwiazane z rakiem oraz w podscielisko inwazyjnego raka sutka (Forster i in., 2011: McCart Reed i in., 2013). MUCl, znany równiez jako antygen nowotworowy 15-3 (CA 15-3), jest duza glikoproteina przezblonowa, ulegajaca ekspresji na powierzchni wierzcholkowej najprostszvch komórek wydzielniczych nablonka, która ulega autoodszczepieniu na dwie podjednostki ( M UC I -N i MUC 1-C) 2008), a jego nadekspresja wystepuje w róznych nowotworach, w tym nowotworze pluca (Nath i Mukherjee, 2014). Krazacy TvtUCl-N, który zawiera peptyd analizowany w koncowym tescie wedlug wynalazku, jest uzywany jako serologiczny marker (CA 15-3) stosowany w praktyce klinic1:nej do monitorowania raka sutka (Kuf e, 2009). CA 15-3 stosO\,vany w praktyce klinicznej, w panelu wraz z trzema innymi markerami nowotworowymi (CEA, CA 125 i CYFRA 21-1 (CK-19); wszystkie badane w tescie wedlug wynalazku) oceniano pod katem uzytecznosci do diagnostyki plynów nowotworowych. a CA 15-3 analizowany samodzielnie, mial najlepsza sposród nich czulosc na poziomie 30 % (przy 100 % swoistosci). Polaczenie wszystkich czterech markerów razem dalo czulosc 54 % (Jose Manuel Parcel i in., 2004), co jest porównywalne do wyniku uzyskanego dla klasyfikatora wedlug wynalazku, wynoszacego SS % (przy O FPR). HPX jest powszechnie wystepujaca glikoproteina osocza wiazaca hem, z ta wazna fizjologiczna rola wymagana do zapobiegania uszkodzeniom oksvdacyjnym podczas hemolizy (Tolosano i Altrnda, 2002) Poziom HPX byl wyzszy w plynach nowotworowych (gruczolnkornk/ niedrobnokomórkowy rak pluca) w porównaniu z plynami gruzliczymi/ parapneumonicznymi (Rodriguez-Pifieiro i in., 2010; Z. Wang i in., 2012), ale jest to takze bialko reagujace w ostrej fazie, indukowane po zapaleniu (Tolosano i Altruda, 2002), co moze wyjasniac obserwacje tu opisane, ze jest ono równiez podwyzszone w innych plynach infekcyjnych. MSLN jest normalnie produkowany glównie przez komórki mezotelialne, lecz takze jest antygenem zwiazanym z nowotworem, ulegajacym nadekspresji na róznych zlosliwych komórkach nowotworowych, w tym zlosliwym miedzybloniaku oplucnej (Creaney i Robinson, 2017).

Jest to marker surowicy stosowany do monitorowania miedzybloniaka oplucnej. Badania wykazuja takze jego wyzsze poziomy w plynach oplucnowych u pacjentów z zlosliwym miedzybloniakiem oplucnej, natomiast odnotowano takze wiele falszywie dodatnich wyników w innych plynach nowotworowych (Hooper i in., 2013; Miettinen i Sarlomo­ Rikala, 2003). Analiza guzów pluca wykazala, ze MSLN ulegal nadekspresji w polowie PL 440401 A1 43/71gruczolakoraków, w rakach wielkokomórkowych i raku plaskonablonkowym, ale nadekspresja nie wystepowala w raku drobnokomórkowym (Mettinen i Sarlomo-Rikala, 2003). Zostalo to dokladnie zaobserwowane w opisanym lu badaniu. opartym tylko na analizie plynu oplucnowego i jest prawdopodobnie powodem, dla którego MSLN jcsl jednym z glównych markerów ogólnej klasyfikacji plynów nowotworowych.

ADA2, exeuo i WARS byly glównymi bialkami, które odróznialy plyny gmzlicze od wszystkich innych plynow oplucnowych i jedynymi bialkami, które istotnie odróznialy plyny gruzlicze od innych plynów infekcyjnych W ARS jest indukowana interferonem-y, cytoplazmatyczna forma syntetazy tryptofanylo-tRNA. W ARS byla podwyzszona w ludzkich makrofagach zakazonych Mycohacterium tuherculosis ora:,,: w surowicy krwi pacjentÓvY z aktywna gruzlica pluc, bedac jednym z trzech najlepszych, potencjalnych biomarkerów gruzlicy (De Groote i in, 2017; Diaz i in, 2016). W obecnym wynalazku po raL picnvszy stwierdzono, ze WARS jest równiez podwyzszona specyficznie, szczególnie w plynach gruzliczych, a przy wai1osci AUe wynoszacej 0,832 wykazuje wysoki potencja! do identyfikacji tych plynów. exeLI O, znana równiez jako bialko indukowane interferonem-y 10 kDa (IP-10), jest cytokina nalezaca do rodziny chemokin exe (J\L Liu i in., 2011). Przyciaga do miejsc objetych stanem zapalnym monocyty i aktywowane limfocyty T. i sprzyja selektywnemu wzmocnieniu odpowiedzi Th I i zwiekszonej produkcji IFN-y. Podwyzszony poziom exeL I O w plynach gruzliczych, podobnie jak ADA i IFN-y, wskazuje na ostra chorobe i jest sugerowany jako dodatkowy marker diagnostyczny ( K.-Y. Chen i in., 2016; Dheda i in., 2009; Roofchayee i in , 2021) Siedem wczesniej szych badan, w których stezenie CXCll O mierzono metoda FUSA, wykazalo srednia czulosc 84 % i swoistosc 90 % w identyfikacji plynu gmzliczcgo (Jose M. Parcel, 2016). Równiez przy 90 % swoistosci, odnotowana w opisanym tu badaniu czulosc dla CXCLlO wynosi 71 % (AUC: 0,880), ale uzycie klasyfikatora podnosi je odpowiednio do 94 % i 75 %. ADA2 miala najwyzsza moc dyskryminacyjna (AUC: 0,881) i byla najwyzej oceniana cecha klasyfikatora. Deaminaza adenozyn owa (ADA), reprezentowana przez dwa izoenzymy (ADAl i ADA2), bierze udzial w metabolizmie puryn i katalizuje deaminacje adenozyny do inozyny, czasteczki sygnalowej, która ma kluczowe znaczenie dla rozwoju ukladu limfatycznego (Cristalli i in., 2001). ADA 1 stanowi wiekszosc wewnatrzkomórkowej aktywnosci ADA, podczas gdy ADA2 jest wydzielana specyficznie przez uklad komórek monocytów-makrofagów oraz limfocyty Ti jest dominujacym izoenzymem w plynach gruzliczych (Bielsa i in., 2013; Cristalli i in., 2001; Zemlin i in., 2009). Przydatnosc pomiaru calkowitej aktywnosci ADA w diagnostyce gruzlicy oplucnej zostala po raz pierwszy opisana w 1978 roku i do dzis PL 440401 A1 44/71pozostaje najbardziej wyspecjalizowanym biomarkerem plynu gruzliczego (Jose M.

Parcel. 2016). Z pieciu metaanaliz wynika, ze pomiar aktywnosci ADA w plynie oplucnowym ma czulosc 92 % i swoistosc 90 % (Jose M. Parcel, 2016). Wykazano, ze pomiar aktywnosci ADA2 jest lepszy niz pomiar calkowitej aktywnosci (Zemlin i in., 2009). jednak w teslach stosowanych w praktyce klinicznej nadal mierzy sie calkowita aktywnosc ADA. Test wedlug wynalazku ma zdolnosc do rozrózniania dwóch izoenzymów i nie wykrvwano ADA I w zadnym z badanych plynów oplucnowych, z celowanymi trzema peptydami Pomimo, ze moze to byc kwestia limitu detekcji testu, fakt ten potwierdza, ze ADA2 dominuje w plynach gmzliczych. ADA 1 jest równiez wytwarzany przez neutrofile i wystepuje glównie w niegruzliczych plynach oplucnowych, takich jak zaawansowane plyny parapneumoniczne i ropniaki, i jest odpowiedzialny za wiekszosc testów falszywie dodatnich w niegruzliczych plynach oplucnowych (Jose M.

Parcel. 2016; Zcmlin i in. al., 2009). Pomimo, ze takie plyny oplucnowe sa zwykle latwe do odróznienia przez lekarzy i dlatego ropniaki zostaly wykluczone z opisanego Lu badania, monitorowanie obu izoenzymów moze zwiekszyc wartosc diagnostyczna.

Plyny parapneumoniczne sa wtórne do zapalenia pluc lub innych infekcji pluc i wymagaja szybkiej diagnozy, ze wzgledu na wyzsza smiertelnosc wsród pacjentów z towarzyszacym plynem oplucnowym (Feller-Kopman i Light, 2018). ,.Zlotym standardem" w diagnozowaniu infekcji oplucnej jest hodowla mikroorganizmu, jednak 40 % aspiratów daje falszywie ujemny wynik. a sama metoda wymaga znacznej ilosci czasu, natomiast wvniki szvbszych testów biochemicznych moga bvc podobne do tych uzyskanych dla plynów nowotworowych (Mercer i m, 2019) Siedem bialek zwiazanych z infekcja/zapaleniem w tescie wedlug wynalazku. S 1 OOA9, VTM, LGALS 1, APCS. MMP9, LDHA i CRP, bylo podwyzszonych w plynach gruzliczych i innych plynach infekcyjnych.

Inne plyny infekcyjne nic mialy zadnych specyficznych, podwyzszonych markerów, ale SlOOA9, APCS i CRP byly najwazniejszymi bialkami do ich klasyfikacji, w przeciwienstwie do tego, co obserwowano dla plynów gruzliczych. Ponadto niski poziom CXCLlO, ADA2 i W ARS oraz wyzszy poziom HPX skutecznie odróznial inne plyny infekcyjne od plynów gruzliczych. Klasyfikator wybral CRP, S100A9 i VIM jako najwazniejsze cechy do rozrózniania innych plynów infekcyjnych i mógl równie skutecznie odróznic te grupe (AUC: 0,863), tak jak plyny gruzlicze (AUC: 0,859) lub wszystkie plyny infekcyjne (AUC: 0,869). Dla porównania, modele prognostyczne oparte na klinicznych pomiarach CRP, IL-6 i liczby komórek neutrofili/leukocytów identyfikowaly plyny infekcyjne z wartoscia AUC na poziomie 0,898-0,909 (Ferreiro i in., 2019).

PL 440401 A1 45/71Sl00A9 jest bialkiem wiazacym wapn. które wystepuje glównie jako heterodimer S100A8/A9 (kalproleklyna) i jest wydzielane przez neutrofile i monocyty modulujac procesy zapalne poprzez stymulowanie rekrutacji leukocytów i indukowanie wydzielania cytokin, majace potencjal jako marker diagnostyczny dla chorób zwiazanych ze stanem zapalnym (S. Wang i in., 2018). APCS (skladnik surowiczy amyloidu P lub SAP) jesl bialkiem osocza, które podobnie jak CRP nalezy do rodziny pentraksyn bialek wiazacych ligandv zalezne od wapnia i jest zwiazane z kilkoma patogennvmi stanami amyloidu (Pepys. 2018) Hamuje przemieszczanie sie neutrofili do tkanek. sprzyja rozwiazywaniu stanów zapalnych i zwlóknienia. promuje fagocytoze i reguluje róznicowanie makrofagów (Pilling i Gorner, 2018). Wyzsze poziomy S100A9 i APCS wykryto w plynach parapneumonicznych (a takze w plynach gruzliczych w przypadku APCS) w porównaniu z plynami nowotworowymi (gruczolakoraka) (Z. Wang i in., 2012). Obserwacje te zostaly pot\vicrdzonc na wiekszym i bardziej zróznicowanym zestawie plynów oplucnowych wedlug wynalazku.

CRP jest bialkiem ostrej fazy zapalenia, wykorzystywanym w praktyce klinicLncj jako marker infekcji i incydentów sercowo-nacaniowych (Sproslon i Ashworth, 2018).

Byl on podwyzszony w plynach infekcyjnych, w tym gruzliczych, parapneumonicznych i ropniakach. w porównaniu do plynow nowotworowych i przesieków (lzhakian i in .. 2016; J.M. Porcel i in., 2009: Watanabe i in, 2018). Metaanaliza 18 publikacji wykazala rozsadna zdolnosc diagnostyczna CRP dla plynów parapneumonicznych (AUC: 0,88, czulosc 80 o/c:, swoistosc 82 o/c:) (Li i in., 2019) VIM to posrednie bialko filamentowe typu III zaangazowane w utrzymywanie integralnosci komórkowej i inne procesy. takie jak przylaczanie. migracja i sygnalizacja komórek (Ramos i in, 2020: Satelli i Li, 2011) Klasycznie, jest markerem przejscia nablonkowo-mczcnchymalncgo (EMT), wiaze sie ze zlym rokowaniem stwierdzono jego nadekspresj9 w róznych nowot,vorach nablonkowych, w tym raku pluca (Satelli i Li, 2011 ). VIM byl podwyzszony na powierzchni ludzkich monocytów zakazonych M. tubcrculosis i jako ligand posredniczyl w ich lizie przez komórki NK (Diaz i in., 2016; Garg i in., 2006). Chociaz sporadycznie obserwowano tu wysoki poziom VIM w plynach nowotworowych, w tym zwiazanych z gruczolakorakiem, rakiem plaskonablonkowym, rakiem drobnokomórkowym, miedzybloniakiem wtórnymi nowotworami, poziomy VIM byly przede wszystkim podwyzszone w plynach infekcyjnych, jak zaobserwowano we wczesniejszym badaniu (Domanski i in., 2016). Klasyfikator wybral VIM jako druga najwazniejsza ceche dla calej grupy plynów infekcyjnych, zaraz po S100A9. Zamiast markerem raka, sugeruje sie tu, aby VIM byl klasyfikowany jako marker infekcji w plynie oplucnowym, co jest równiez PL 440401 A1 46/71zgodne z badaniem przeprowadzonym przez Kanaji i in., w którym VIM nie odróznial plynów nowotworowych od plynów nienowotvvorowych (Kanaji i in„ 2019). LGALS 1, MMP9 i LDHA nie byly tak skuteczne w odróznianiu innych plynów infekcyjnych od wszystkich plynów oplucnowych jak wymienione wyzej markery, ale byly istotnie podwyzszone. LGALSl (Galectin-1) to lektyna o funkcjach przeciwzapalnych (Camby i in., 2006; Sundblad i in., 2017). Jej nadekspresja zostala zaobserwowana w ostrym i przewleklym zapaleniu, ale takze w kilku tvpach nowotworów, w tym raku pluca, gdzie moze wplywac na progresje nowotworu (Astorgues-Xeni i in., 2014; Sundblad i in., 2017).

Mundt i in. wykazali nadekspresje LGALS 1 w plynach zwiazanych z gmczolakorakiem w porównaniu z plynami zwiazanymi z miedzybloniakiem, podczas gdy Javadi i in. stwierdzili cos wprost przeciwnego, przy czym obaj twierdzili, ze LGALS 1 jest potencjalnym markerem miedzybloniaka (Javadi i in., 2020; Mundt i in., 2014). W przykladzie wedlug wynalazku zaobserwowano wyzszy poziom LGALSl w trzech z czterech plynów zvviazanych z miedzybloniakiem oplucnej i w niektórych plynach nowotworowych, ale byl on duzo bardziej widoczny w plynach infekcyjnych. lv1MP9 (zelatynaza B) stymuluje lub hamuje proces degradacji macierzy zewnatrzkomórkowej (ECM), a jej nadekspresja jest zwiazana z róznymi nowotworami, a tak.ze z ostrymi i przewleklymi chorobami zapalnymi oraz infekcjami (Mandal i in., 2020). MMP9 bylo podwyzszone w plynach gruzliczych w porównaniu z przesiekami plynami nowotworowymi, i bylo wytwarzane przez komórki nablonkowe w ziarniniakach (Park i in., 2005; Jose M. Porcel i in., 2016; Sheen i in .. 2009). W tych wczesniej szych badaniach nie analizowano zadnych innych plynów infekcyjnych, podczas gdy w opisanym tu hadaniu wykazano, ze ivfMP9, oprócz plynów gmzliczych, jest równiez podwyzszony w wysiekach parapneumonicznych. LDH jest niezbednym enzymem cytozolowym, odwracalnie przeksztalcajacym pirogronian w mleczan. Jest to homo- lub heterotetramer, tworzacy piec izoenzymów, rózniacych sie udzialem podjednostek LDHA i LDHB oraz rozmieszczeniem tkankowym (Urbanska i Orzechowski, 2019). LDH jest uwalniany przez uszkodzone komórki, a calkowity LDH w surowicy jest bardzo czulym, ale niespecyficznym markerem wielu stanów chorobowych (Erez i in., 2014). Aktywnosc LDH jest wykorzystywana w róznicowaniu przesieku i wysieku oplucnowego, przy czym wysieki, zwlaszcza skomplikowane wysieki parapneumoniczne i gruzlicze, charakteryzuja sie wyzszym LDH (Feller-Kopman i Light, 2018; Jose M. Porcel i Light, 2006). Opisane wyniki to potwierdzily i dodatkowo wykazaly, ze podjednostka LDHA dominuje w wysiekach infekcyjnych, a takze jest wyzsza w wysiekach infekcyjnych niz w wysiekach nowotworowych, w przeciwienstwie do LDHB.

PL 440401 A1 47/71Chociaz czesto okresla sie Je jako „lagodne" plyny oplucnowe, to przesieki zwiazane z niewydolnoscia serca, watroby i nerek wiaza sie z 25-50 % smiertelnoscia w ciagu roku (Fcllcr-Kopman i Light, 2018). Plyny oplucnowe zwiazane z niewydolnoscia narzadów, pomimo, ze nie posiadaja zadnych unikalnych, podwyzszonych markerów bialkowych i wykazuja najnizszy potencjal dyskryminacyjny, wciaz moga byc skutecznie róznicowane za pomoca niskich poziomów bialek, zwlaszcza C9, LDHA, HPX, LDHB i C3. Wydaje sie, ze jest to powodowane faktem, ze te plyny, bedace w wiekszosci przesiekami, maja nizsze calkowite stezenie bialek osocza Bialka C9 i C3 sa stosowane w praktyce klinicznej jako markery stanu zapalnego i sa równiez zglaszane odpowiednio jako potencjalny serologiczny marker grnzlicy i jako marker plynów parapneumonicznych (De Groote i in., 2017; Z. Wang i in., 2012). W opisanym tu badaniu wykazano, ze sa one dobrymi markerami „ogólnego wysieku", a ich poziomy sa nizsze w przypadku plynów zwiazanych z niewydolnoscia narzadów. SERPINA4, SERPINFl i GSN byly równiez sugerowane wczesniej jako potencjalne serologiczne i oplucnowe markery plynu gruzliczego lub plynu zwiazanego z nowotworem zlosliwym (De Groote i in., 2017; Lee i in., 2017; Z. Wangi in., 2012). Pomimo detekcji bialek SERPINFl i GSN, uzyskujac silne sygnaly pochodzace od wielu peptydów we wszystkich próbkach, nie sl wierdzono istotnego potencjalu dla nich jako markerów jakiejkolwiek specyficznej etiologii.

Podsumowujac, przeprowadzono tu porównanie stosowanych w praktyce klinicznej potencjalnych markerów do klasyfikacji etiologii plynu oplucnowego przy uzyciu ukiemnkowanej proteomiki opartej na spektrometrii mas, na zbiorze plynów oplucnowych, odzwierciedlajacym rzeczywiste wamnki panujace w klinice. Wybrano tu najhardziej obiecujace bialka, które sa odpowiednie do stosowania na platfonnach opartych na spektrometrach mas w laboratoriach diagnostycznych. Naleza do nich: CDHl, MUCl, THBS4 i lvISLN dla wysi9ków nowotworowych; ADA2, CXCLl O i WARS dla wysi9ków gruzliczych; CRP, SlOOA9 i VIlvI dla wysieków parapneumonicznych (,,inne plyny infekcyjne"); oraz C9, LDHA, HPX, LDHB i C3 dla plynów zwiazanych z niewydolnoscia narzadów (innych niz pluca - ,,plyny lagodne"), stanowiacych glównie przesieki.

Test i opracowany klasyfikator tworza narzedzie, które jest bardzo skuteczne w potwierdzaniu diagnozy, zwlaszcza w przypadku wysieku nowotworowego lub gruzliczego. Chociaz wydajnosc diagnostyczna panelu biomarkerów wedlug wynalazku byla bardzo podobna do obecnie stosowanych testów diagnostycznych, to tego typu test multipleksowy, mierzacy wiecej niz jeden marker chorobowy w jednej analizie, stanowi ogromny skok pod wzgledem skrócenia czasu do uzyskania diagnozy, umozliwiajacy diagnozowanie wielu etiologii za pomoca pojedynczego testu laboratoryjnego.

PL 440401 A1 48/71Ujawniono tu nowe informacje dla wielu markerów odnosnie ich ekspresji w plynie oplucnowym ze wzgledu na wieksza róznorodnosc badanych plynów i wykazano, ze spektrometria mas moze dostarczyc nowych informacji, specyficznych dla izoenzymów.

Takie testy oparte na spektrometrii mas, oparte na maloinwazyjnej i w wiekszosci przypadków koniecznej (z medycznego punktu widzenia), procedurze torakocentezy i pobieraniu próbki plynu oplucnowego, wykonywane we wczesnym etapie, moga szybko dostarczyc wiele pomocnych informacji i wskazówek w kierunku dalszvch mniej lub hardziej inwazyjnych procedur wymaganych do postawienia ostatecznej diagnozy i wdrozenia odpowiedniego dla danego pacjenta leczenia.

Tabela 3 . Etiologie badanych plynów oplucnowych (a), dane demograficzne badanej populacji (b) i schemat przedstawiajacy plyny wybrane do analizy oraz plyny odrzucone z badania (c). 158 plynów oplucnovvych zostalo odrzuconych z badania, w tym: 65 ropniaków (latwo diagnozowanych na podstawie ropnego wygladu), 55 plynów o nieznanej etiologii, 8 plynów z dwiema lub wiecej etiologiami oraz 30 plynów lagodnych (niezdefiniowane przesieki, plyny nienowotworowe i nieinfekcyjne). Do analizy wybrano 209 plynów oplucnowych o zdiagnozowanej etiologii. Lacznie 109 plynów pochodzilo od pacjentów ze zdiagnozowanym nowotworem (plyny nowotworowe): w tym 82 plyny od pacjentów z rakiem pluca (65 niedrobnokomórkowych raków pluca (NSCLC) z dalszym podzialem na 33 gruczolakoraki (ADC) i 22 raki plaskonablonkowe (SCC)) oraz 27 plynów od pacjentów z innymi (wtórnymi) nowotworami. 58 plynów pochodzilo od pacjentów z chorobami infekcyjnymi (wszystkie plynv infekcyjne), w tym 25 plvnów od pacjentów z zapaleniem pluc, 24 plyny od pacjentów z gruzlica (plyny grnzlicze), 6 plynów od pacjentów z zapaleniem oplucnej i 3 plyny ropne (bez widocznej ropy) 42 plyny oplucnowe nienowotworowe i nieinfekcyjne (plyny lagodne) pochodzily glównie od pacjentów z niev,rydolnoscia narzadów, w tym 27 plynów od pacjentów z niewydolnoscia serca, 5 plynów od pacjentów z niewydolnoscia nerek, 4 plyny przesiekowe (niezdefiniowane), 2 plyny od pacjentów z zapaleniem stawó\,\, i po jednym plynie od pacjentów z zapaleniem trzustki, marskoscia watroby, zatorowoscia plucna i po urazie. a b Nowotwory 109 Liczba Mediana pacjentów wieku (lata) Rak pluca 82 Nowotowory 67 NSCLC 65 Kobiety 42 PL 440401 A1 49/71ADC 33 Mezczyzni 67 sec 22 Infekcje 58 SCLC 17 Zapalenie pluc 60 Inne nowotwory 27 Kobiety 5 Infekcje 58 Mezczyzni 25 Zapalenie pluc 25 Gruzlica 55 Gruzlica 24 Kobiety Zapalenie oplucnej ó Mezczyzni 23 Ropniak oplucnej 3 Zapalenie pluc 51 Niewydolnosc narzadów 42 Kobiety 3 Niewydolnosc serca 27 Mezczyzni 3 Niewydolnosc nerek 5 Ropniak oplucnej 57 Przesiek 4 Kobiety 1 Zapalenie stawów 2 Mezczyzni 2 Zatorowosc plucna 1 Niewydolnosc 70,5 narzadów Zapalenie Lrzustki 1 Kobiety 10 Marskosc watroby 1 Mezczyzni 32 Uraz Bibliografia: Addona, T., Abbaticllo. S., i Carr. S. A. (2020). From Skcpticism to Emhracc: The Role of Targcted Mass Spcctromctry in Validating Proteomics. Clinical Chcmistry, 66(7). 973- 974.

Anatomie pathology lab instruments by Roche Tissue Diagnostics. (n.d.). pobrany 18 pazdziernika 2021, z https://diagnostics.roche.com/us/en/products/product- category/anatomical-pathology .html Astorgues-Xerri, L., Riveiro, M. E., Tijeras-Raballand, A., Serova, M., Neuzillet, C., i in. (2014). Unraveling galectin-1 as a novel therapeutic target for cancer. In Cancer Treatment Reviews (Tom 40, Nr 2, str. 307-319). W.B. Saunders.

Baker, M. (2015). Blame it on the Antibodies. Nature, 521, 274-275.

Barak, V., Goike, H., Panaretakis, K. W., i Einarsson, R. (2004). Clinical utility of PL 440401 A1 50/71cytokeratins as tumor markers. Clinical Biochemistry. 37(7), 529-540.

Biclsa. S., Palma. R .. Pardina. M .. Esquerda. A., Light. R. W., i in. (2013). Comparison of polymorphonudear- And lymphocyte-rich tuberculous plcural effusions. International Journal of Tubcrculosis and Lung Disease. 17(1).

Camby, L Le Mercier, M., Lefranc. F., i Kiss. R. (2006). Galectin-1: A small protein with major functions. ln Glycobiology (Tom 16. Nr 11). Glycobiology.

Chen, C.-D .. Wang, C.-L.. Yu. C.-J .. Chien, K.-Y .. Chen, Y.-T., i 111. (2014). Targeted proteomies pipeline reveals potentia! hiomarkers for the diagnosis of metastatic lung cancerin pleura! effusion. Journal of Proteome Research. 13(6). 2818-2829.

Chen, K.-Y.. Feng. P.-H .. Chang. C.-C.. Chen, T.-T., Chuang. H.-C., i in. (2016). Novel hiomarkcr analysis of pleura] effusion enhances diffcrcntiation of tuherculous from malignant plcural effusion. International Journal of General Medicine, 9, 183.

Chen, L., Liu, D., Yi, X., Qi. L.. Tian, X., i in. (2020). The novcl miR-1269b-regulated protein SVEPl induces hcpatoccllular carcinoma prolifcration and metastasis likcly tlu·ough the PBK/Akt pathway. Cell Death & Disease 2020 11:5, 11(5), 1-14.

Chen, T., i Guestrin, C. (2016). XGBoost: A scalable tree boosting system. Proceedings of the ACM SIGKDD International Conforence on Knowledge Discovery and Data Mining, 13-17-Augu, 785-794.

Creaney . .I .• i Robinson. B. W. S. (2017). Malignant Mesothelioma Biomarkers: From Discovery to Use in Clinical Practice for Diagnosis. Monito1ing. Screening. and Treatment. Chest. 152(1). 143-149.

Cristalli. G., Costanzi, S„ Lamhertueci, C., Lupidi. G .. Vittori, S., i in. (2001 ). Adenosine clcaminasc: Functiona 1 implications and cliffcrcnt classcs of inhihitors. In Mcclicina 1 Research Rcviews (Tom 21. Nr 2, str. 105-128). John Wilcy i Sons, Inc.

De Groote. M. A.. Sterling, D. G., Hraha, T .. Russell, T. M., Green, L. S., i in. (2017).

Discovery and validation of a six-marker serum protein signature for the diagnosis of active pulmonary tubcrculosis. Journal ofClinical Microbiology, 55(10), 3057-3071.

Dheda, K., Van-Zyl Smit, R. N., Sechi, L. A., Badri, M., Meldau, R., i in. (2009). Clinical diagnostic u tility of IP-1 O and LAM antigen levels for the diagnosis of tuberculous pleura! effusions in a high burden setting. PLoS ONE, 4(3).

Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., i Dobos, K. M. (2016). Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Scientific Reports, 6.

Domanski, D., Perzanowska, A., Kistowski, M., Wojtas, G., Michalak, A., i in. (2016). A Multiplexed Cytokeratin Analysis Using Targeted Mass Spectrometry Reveals Specific PL 440401 A1 51/71Profiles in Cancer-RclaLed Plcural Effusions. Neoplasia (New York, N.Y.), 18(7), 399-412.

Erez, A., Shental, O., Tchebiner, J. Z., Laufer-Perl, M., Wasserman, A„ i in. (2014).

Diagnostic and prognoslic value of very high serum laclate dehydrogenase in admittcd mcdical paticnls. Isracl Mcdical Association Journal, 16(7), 439-443.

Feller-Kopman, D„ i Light, R. (2018). Pleural Disease. New England Journal of Medicine, 378(8), 740-751.

Ferreiro. L., Lado-Baleato, Ó., Suarez-Antelo, J., Toubes, M., San Jose, M., i in. (2019).

Diagnosis of infeetious pleura! effusion using predictive models hased on pleura! fluid hiomarkers. Annals ofThoraeic Medicine, 14(4). 254-263.

Ferreiro. L., Lado-Baleato, O., Toubes, M. E., Suarez-Antelo, J.. Pose-Reino. A., i m. (2020). Jdcntifieation of Pleura] Responsc Pattcrns: A Cluster Analysis. Archivos de Bronconeumologia. 56(7), 426-434.

Forster, S., Gretschel, S., Jóns, T., Yashiro, l\L, i Kemmncr. W. (2011). THBS4, a novcl stromal molcculc of diffusc-type gastric adenoearcinomas, identified by transcriptome­ wide expression profiling. Modern Palhology, 24(10), 1390-1403.

Garg, A., Barnes. P. F.. Porgador, A., Roy. S., Wu. S., i in. (2006). Vimentin Expres~ed on Mycobaeterium tuberculosis -Infecled Human Monocytes Is Involved in Binding Lo the NKp46 Receptor. The Journal of lnnnunology, 177(9), 6192-6198.

Hattmp, C. L„ i Gendler. S. J. (2008). Structure and function of the cell surface (tethered) mueins. In Annual Review of Physiology (Tom 70, str. 431-457). Annu Rev Physiol.

Hoofnagle. A. N., i Roth, M. Y. (2013). Clinieal review: improving the measurement of serum thyroglohulin with mass spectrometry. The Journal of Clinical Endocrinology and Metaholism, 98(4), 1343-1352.

Hooper, C. E., Morley, A. J.. Virgo, P., Harvey. J. E., Kahan, B., i in. (2013). A prospcctivc trial cvaluating the role of mesothclin in undiagnoscd plcural effusions.

European Respiratory Journal, 41(1), 18-24.

Hórber, S., Peter, A. Lehmann, R., i Hoene. M. (2020). Evaluation of the first immunosuppressive drug assay available on a fully automated LC-MS/MS-based clinical analyzer suggests a new era in laboratory medicine. Clinieal Chemistry and Laboratory Medicine. lzhakian, S., Wasser, W. G., Fox, B. D., Vainshelboim, B., i Kramer, M. R. (2016). The diagnostic value of the pleura! fluid C-reactive protein in parapneumonic effusions.

Disease Markers, 2016.

Jannetto, P. J., i Fitzgerald, R. L. (2016). Effective use of mass spectrometry in the clinical laboratory. In Clinical Chemistry (Tom 62, Nr 1, str. 92-98). American Association for PL 440401 A1 52/71Clinical Chcmistry Inc.

Javadi. J., Dobra, K., i Hjcrpc, A. (2020). Multiplex soluble biomarker analysis from ple ural eff usion. Biomolcculcs, 10(8), 1-13.

Kanaji, N., Kadota, K., Tadokoro. A.. Inoue, T., Watanabe, N., i in. (2019). Serum CYFRA 21-1 but not Yimentin is Associated with Poor Prognosis in Advanced Lung Caneer Patients. The Open Respiratory Medieine Journal. 13(1), 31-38.

Kufe, D. W. (2009). Mucins in cancer: Function. prognosis and therapy. In Nature Reviews Cancer (Tom 9, Nr 12, str. 874-885). Nat Rev Cancer.

Lee. C. Y .. Hong, J. Y .. Lee, M. G .. i Suh, I. B. (2017). ldentification of 10 candidate hiomarkers distinguishing tuherculous and malignant pleura] fluid hy proteomic methods.

Yonsci Mcdical Journal, 58(6), 1144-1151.

Li. D .. Shen. Y.. Qin, J.. Wan. C., Zeng, N., i in. (2019). Diagnostic pcrfonnancc of C­ rcactive protein for parapncumonic plcural effusion: a mcta-analysis. Annals of Translational Medicine, 7(1), 1-1.

Liu, M .. Guo, S., Hibbcrt. J. M., Jain, V., Singh. N., i in. (2011). CXCLI0/IP-10 in infectious diseases pathogenesis and potentia! therapeutie implieations. In Cytokine and Growlh Faelor Reviews (Tom 22, Nr 3, str. 121-130). Elsevier.

Liu, P.-J., Chen. C.-D., Wang, C.-L.. Wu, Y.-C .. Hsu, C.-W., 1 111. (2015). ln-depth Proteomic Analysis of Six Types of Exudative Pleura! Effusions for Nonsmall Cell Lung Caneer Biomarker Discovery. Molecular & Cellula r Proteomics, 14(4 ), 917-932.

Mandrekar. .I. N. (20 IO). Reeeiver operating characteristic curve in diagnostic test assessment. Journal ofThoracic Oncology. 5(9), 1315-1316.

McCart Reed, A. E.. Song. S .. Kutasovic, J. R., Reid, L E., Valle. J. M., 1 m. (2013).

Thromhospondin-4 cxprcssion is activatcd during the stroma] responsc to invasive hreast canccr. Virchows Archiv, 463(4), 535-545.

Mercer, R. M., Corcoran, J. P., Parcel, J. M .. Rahman, N. M., i Psallidas, I. (2019).

Interpreting plcural fluid results. In Clinieal Medicine, Journal of the Royal College of Physicians of London (Tom 19, Nr 3, str. 213-217). Royal College of Physicians.

Miettinen, M., i Sarlomo-Rikala, M. (2003). Expression of calretinin, thrombomodulin, keratin 5, and mesothelin in lung carcinomas of different types: An immunohistochemical analysis of 596 tumors in comparison with epithelioid mesotheliomas of the pleura.

American Journal of Surgical Pathology, 27(2), 150-158.

Mohammed, Y., Domanski, D., Jackson, A. M., Smith, D. S., Deelder, A. M., i in. (2014).

PeptidePicker: A scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. Journal of Proteomics, 106, 151-161.

PL 440401 A1 53/71Moll, R .. Divo, M., i Langbein, L. (2008). The human keratins: biology and pathology.

Histochcmistry and Cell Biology, 129(6). 705-733.

Mondal, S., Adhikari. N., Bane1jce, S., Amin, S. A., i Jha, T. (2020). Matrix mctalloproteinasc-9 (MMP-9) and its inhibitors in canccr: A minircvicw. In European Journal of Me Mundt. F„ Johansson, H. J., Forshed. J.. Arslan, S .. Metintas, M., i in. (2014). Proteome Screening of Pleura] Effusions Identifies Galectin I as a Diagnostic Biomarker and Highlights Severa] Prognostic Biomarkers for Malignant Mesothelioma. Molecular & Cellular Proteomics, 13(3). 701-71).

Nath, S .. i Mukhe1jee, P. (2014). MUCl: a multifaceted oncoprotein with a key role in canccr progression. Trends in Molccular Medieinc, 20(6). 332-34'.?..

Ncubert. H., Shuford. C. M., Olah, T. V., Garofolo, F., Schultz. G. A„ i in. (2020). Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandcm mass spectrometry: Current state and future vision. Clinical Chemistry, 66(2), 282-301.

Pan. L., Zhang, X., Jia, H., Huang, M., Liu. F., i in. (2020). Label- Free Quantitative Proteomics ldentifies Novel Biomarkers for Distinguishing Tuberculosis Pleural Eff usion from Malignant Pleural Effusion. PROTEOMICS- Clinical Applications, 14(1), 1900001.

Park, K. J .. Hwang, S. C., Sheen. S. S„ Oh. Y. J.. Han, J. H., i in. (2005). Exprcssion of matrix rnetalloproteinase-9 in pleura! effusions of tuberculosis and lung cancer.

Respiration, 72(2), 166-175.

Pedregosa. F., Varoquaux, G., Chamfort, A .. Michel. V„ Thirion, l:3.. i in. (2012). Scikit­ leam: Machine Learning in Python. J Mach Learn Res„ 12, 2825-2830.

Pepys, M. B. ('.?.018). The pentraxins 1975-2018: Scrcnclipity. cliagnosties ancl clrugs.

Frontiers in Tmrnunology. 9(OCT), 2382.

Perzanowska, A„ Fatalska, A., Wojtas, G., Lewandowicz, A., Michalak, A., i in. (2018).

An MRM-Bascd Cytokeratin Marker Assay as a Tool for Canccr Studies: Application to Lung Cancer Pleura! Eff usions. Proteomics - Clinical Applications, 12(2).

Pilling, D., i Gorner, R. H. (2018). The development of serum amyloid p as a possible therapeutic. In Frontiers in Immunology (Tom 9, Nr OCT, p. 2328). Frontiers Media SA.

Porcel, J. M., Vives, M., Cao, G., Bielsa, S., Ruiz-Gonzalez, A., i in. (2009). Biornarkers of infection for the differentia! diagnosis of pleura! effusions. European Respiratory Journal, 34(6), 1383-1389.

Parcel, Jose M. (2016). Advances in the diagnosis of tuberculous pleuritis. In Annals of Translational Medicine (Tom 4, Nr 15, p. 9). AME Publishing Company.

Parcel, Jose M. (2018). Biomarkers in the diagnosis of pleura! diseases: a 2018 update. In PL 440401 A1 54/71Therapeutic Advances in Respiratory Disease (Tom 12). SAGE Publications Ltd.

Porcel, Jose M., Esquerda, A., Ma1tinez-Alonso, M., Biclsa, S., i Salud. A. (2016).

Idenlifying lhoracic malignancies through plcural fluid biomarkers: A predictive multivariate model. Medicine (United States), 95(10).

Pon..:el, Jose M, i LighL, R. W. (2006). Diagnostic approach to pleura! effusion in adulls.

American Family Physician. 7317), 1211-1220.

Porcel, Jose Manuel, Vives, M, Esquerda, A., Salud, A, Perez, B, i in. (2004). Use of a panel of tumor markers (careinoemhryonie antigen. eaneer antigen 125. earhohydrate antigen 15-3. and eytokeratin 19 fragments) in pleura! fluid for the differentia! diagnosis of henign and malignant effusions. Chest. 126(6). 1757-1763.

Ramos, I.. Stamatakis, K., Oestc, C. L.. i Perez-Sala, D. (2020). Vimcntin as a Multifaccted Player and Potentia] Therapeutic Target in Viral Infections. International Journal ofMolccular Scicnces 2020. Tom 21, Page 4675, 21(13), 4675.

Rodriguez-Pineiro, a. M., Blanco-Prieto, S., Sanchez-Otero, N., Rodriguez-Berrocal. F. J ., i Pa.ez de la Cadena, M. (201 O). On the identification of biomarkers for non-small cell lung cancer in serum and pleura! eff usion. Journal of Proteomics, 73(8), 1511-1522.

Roofchayee, N. D., Mai:jani. M .. Dezfuli, N. K.. Tabarsi, P .. Moniri, A., i in. (2021).

Potentia! diagnostic value of pleura! fluid cytokines levcls for tuberculous pleural effusion.

Scientific Reports, 11 (I).

Sahhagh. B .. Mindt. S .. Neumaier. M .. i Findeisen. P. (2016). Clinical applications of MS­ hased protein quantification. PROTEOMICS- Clinical Applications. 10(4). 323-345.

Satelli. A .. i Li, S. (2011). Vimentin in cancer and its potentia] as a molecular target for canccr thcrnpy. Ccllular and Mokcular Life Scienccs. 68(18), 3033-3046.

Sheen, P., O'Kane, C. 1\L, Chaudhary, K., Tovar, M., Santillan, C., i in. (2009). High MMP-9 activity chmacterises plcural tubcrculosis corrclating with granuloma formation.

European Respiratory Journal, 33(1), 134-141.

Shur, I., Zemer-Tov, E., Sacher. R., i Benayahu, D. (2007). SVEPl expression is regulated in estrogen-dependent rnanner. Journal ofCellular Physiology, 210(3), 732-739.

Singh, V., Pencina, M., Einstein, A. J., Liang, J. X., Berman, D. S., i in. (2021). Irnpact of train/test sample regimen on perfonnance estimate stability of maehine learning in cardiovascular irnaging. Scientific Reports, 11(1), 1-8.

Sproston, N. R., i Ashworth, J. J. (2018). Role of C-reactive protein at sites of inflarnmation and in:fection. In Frontiers in Imrnunology (Torn 9, Nr APR, p. 754).

Frontiers Media SA.

Sundblad, V., Morosi, L. G., Geffner, J. R., i Rabinovich, G. A. (2017). Galectin-1: A PL 440401 A1 55/71Jack-of-All-Tradcs in the Rcsolution of Acutc and Chronic Inflammation. The Journal of Immunology. 199(11), 3721-3730.

Tolosano, E .. i Altruda. F. (2002). Hcmopcxin: Structurc. function, and rcgulation. In DNA and Cell Diology (Tom 21, Nr 4. str. 297-306). DNA Cell Diol.

Urbanska, K., & Orzechowski. A. (2019). Unappreciated role of LDHA and LDHB to control apoptosis and autophagy in tumor cells. In International Journal of Molecular Sciences (Tom 20. Nr 9). Int J Mol Sci.

Wang. S .. Song. R .. Wang. Z .. .ling. Z .. Wang. S .. m. (2018). SIO0A8/A9 111 Inflammation. Frontiers in Immunology. 9(JUN).

Wang. Z., Wang, C .. Huang. X .. Shen. Y.. Shen. J., i in. (2012). Differentia! proteome profiling of pleura! cffusions from lung canccr and hcnign inflammatory discasc paticnts.

Biochimica cl Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, 1824(4), 692-700.

Watanabe, N., Ishii, T .. Kita, N., Kanaji. N., Nakamura, H .. i in. (2018). The uscfulncss of plcural fluid presepsin. C-reacli,e protein, and procalcitonin in distinguishing different causes of pleura! cffusions. BMC Pulmonary Medicine 2018 18: 1. 18(1). 1-9.

WeiJ3, J. V., Klein-Scory, S., Kubler, S., Reinacher-Schick, A., Stricker. I., i in. (2011).

Soluble E-cadherin as a serum biomarker candidate: Elevated levels in patients with late­ stagc colorcctal carcinoma and FAP. International Journal ofCanccr, 128(6). 1384-1392.

Wright I.. & Van Eyk. J. E. (2017). A Roadrnap to Successful Clinical Proteornics.

Clinical Chemistry. 63(1). 245-247.

Zernlin, A. E., Burgess. L. J., & Carstens, M. E. (2009). The diagnostic uti lity of adenosine dearninase isoenzyrnes in tuherculous pleura] effusions. International Journal of Tuhcrculosis and Lung Discasc. 13(2). 214-220.

Zhang. B., Whitcakcr, J. R., Hoofnaglc. A. N., Baird, G. S., Rodland, K. D., i in. (2019).

Clinical potentia! of mass spcctromctry-bascd protcogcnomics. In Nature Rcvicws Clinical Oncology (Vol. 16, Nr 4, str. 256-268). N aturc Publishing Group.

PL 440401 A1 56/71Zastrzezenia patentowe I. Panel bialkowy skladajacy sie z markerów bialkowych i odpowiadajacych im peptydów wymienionych w tabeli 1 do zastosowania w sposobie in vitro diagnozowania plynów oplucnowych. 2. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 1, do sposobu in vitro diagnozowania plynów oplucnowych, który to panel oznacza sie z Lastosowaniem opartej na spektrometrii mas (MS) multipleksowanej proteomiki celowanej L uzyciem metod MS selektywnego. wielokrotnego lub równoleglego monitorowania reakcji (SRM, MRM, PRM). 3. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia I albo 2, obejmujacy markery bialkowe o sekwencjach numer: 1 i 2, 4. 5 i 7, 8. 10 i 11. 14, 16 i 17, 18-20. 23. 24-26. 29, 30, 33-35. 36 i 37, 40 i 42, 44 i 45, 48, 50 i 51. 54 i 57, 58, 60 i 61, 63. 67-70, 71, 72 i 75. 79. 80-83. 84-86. 87-89, 90 i 91, 92-94, 95 i 97, 98-102 oraz 104-108. 4. Panel bialkowy wedlug któregokolwiek z zastrzezen 1 do 3. który obejmuje wykryty i owacmny ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: kadheryna-1 (CDHl), trombospondyna-4 (THBS4). mezotelina (MSLN), mucyna-I (MUCI/CA 15-3), domena sushi, czynnik von Willebranda, EGF i bialko I zawierajace domene pentraksyny (SVEPl). inhibitor proteazy typu Kunitz 1 (SPTNTl ), hemopeksyna (HPX), antygen CDl 66 (ALCAM). kalli statyna (SERPTNA4), keratyna 8 typu TT cytoszkiclctu (CK-8), keratyna 18 typu I cytoszkiclctu (CK-18), keratyna 19 typu I cytoszkiclctu (CK-19). który wskazuje na plyn nowotworowy. czyli plyn zwiazany z nowotworem.

. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 4, w którym wykryty i oznaczony ilosciowo. zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CDH 1. MUCI, THBS4. MSLN. HPX. wskazuje na plyn nowotworowy. 6. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 5, w którym wykryty i okreslony ilosciowo. zwiekszony poziom w plynie oplucnowym CDHl i odpowiadajacych jej peptydów wskazuje na plyn nowotworowy. 7. Panel bialkowy wedlug któregokolwiek z zastrzezen 1 do 3, w którym wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: deazminaza adenozynowa ADA2, chemokina 10 z motywem C-X-C (CXCLlO) i syntetaza tryptofanylo-tRNA, cytoplazmatyczna (WARS), wskazuje na plyn gruzliczy, czyli plyn oplucnowy spowodowany zapaleniem oplucnej w wyniku infekcji Mycobacterium tuberculosis.

PL 440401 A1 57/718. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 7, w którym wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poLiom w plynie oplucnowym ADA2 i odpowiadajacych jej peptydów wskazuje na plyn gruzliczy. 9. Panel bialkowy wedlug któregokolwiek z zastrzezen I do 3. w którym wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: wimentyna (VTM). galektyna 1 (LGALS 1 ), osoczowe bialko amyloidu P (APCS), bialko SlOOA9 (SlOOA9), mctaloprotcinaza 9 (MMP9). dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA) i bialko C-reaktywne (CRP), wskawje na plyn parnpneumoniczny lub inny plyn infekcyjny.

. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 9, w którym wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CRP, S 1 OOA 9. VIM, wskazuje na inny plyn infekcyjny. 11. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 1 O, wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym bialek lub odpowiadajacych im peptydó,v: CRP i S100A9. wskazuje na inny plyn infekcyjny. 12. Panel bialkowy wedlug któregokolwiek z zastrzezen 1 do 3, w którym wykryty i okreslony ilosciowo zmieniony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: hemopeksyna (HPX), dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA ), dehydrogenaza mleczanowa B (LDHB), skladowa C3 dopelniacza (C3). skladowa C9 dopelniacza (C9), domena Sushi, czynnik von Willehranda typu A, EGF i bialko zawierajace domene pentraksyny 1 (SVEPl ), wskazuje na plyn lagodny. wynikajacy z chorób innych niz nowotwory i infekcje. 13. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 12. w którym wykryty i okreslony ilosciowo, obnizony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA, LDHB, C3, C9, HPX wskazuje na plyn lagodny. 14. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 13. w którym wykryty i okreslony ilosciowo. obnizony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA i C9, wskazuje na plyn lagodny.

. Sposób in vitro analizy plynu oplucnowego do diagnozowania jego etiologii, w którym to sposobie wykrywa sie i oznacza ilosciowo w plynie oplucnowym pobranym od pacjenta panel markerów bialkowych wymienionych w tabeli 1, w tym odpowiadajacych im peptydów, w którym wykrywanie i oznaczenie ilosciowe przeprowadza sie przy uzyciu opartej na spektrometrii mas multipleksowej ukierunkowanej proteomiki, oraz na podstawie obecnosci i zmiany poziomu markera bialkowego lub jego odpowiedniej kombinacji peptydowej okresla sie etiologie plynu oplucnowego.

PL 440401 A1 58/7116. Sposób wedlug zastrzezenia 15, w którym analize plynu oplucnowego przeprowadza sie przy uzyciu opartej na spektrometrii mas (MS) multipleksowanej celowanej proteomiki z zastosowaniem metod MS selektywnego. wielokrotnego lub równoleglego monitorowania reakcji (SRM, MRM, PRM). 17. Sposób wedlug któregokolwiek z zastrzezen 15 albo 16, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym markerów bialkowych i odpowiadajacych im peptydów w porównaniu z poziomem stezenia bialek lub peptydów odniesienia oznaczonym w grupie odniesienia. 18. Sposób wedlug dowolnego z zastrzezen 15 do 17, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo markery bialkowe o sekwencjach numer: 1 i 2, 4, 5 i 7, 8, 10 i 11. 14. 16 i 17. 18-20. 23. 24-26. 29. 30. 33-35. 36 i 37. 40 i 42. 44 i 45. 48. 50 i 51. 54 i 57. 58. 60 i 61. 63. 67-70. 71. 72 i 75. 79. 80-83. 84-86. 87-89. 90 i 91, 92-94. 95 i 97. 98-102 oraz 104-108. 19. Sposób wedlug dowolnego z zastrzezen 15 do 18, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: kadheryna-1 (CDHl). trombospondyna-4 (THBS4). mezotelina (MSLN). mucyna-I (MUCl/CA 15-3), domena sushi, czynnik von Willebranda, EGF i bialko I zawierajace domene pentraksyny (SYEPI). inhibitor proteazy typu Kunitz I (SPINTI ). hemopeksyna (HPX). antygen CDl 66 (ALCAM). kalli statyna (SERPTNA4), keratyna 8 typu TT cytoszkieletu (CK-8), keratyna 18 typu I cytoszkieletu (CK-18), keratyna 19 typu I cytoszkiclctu (CK-19), przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn nowotworowy.

. Sposób wedlug zastrzezenia 19, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CDHl. MUCl. THBS4, MSLN. HPX. przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn nowotworowy. 21. Sposób wedlug zastrzezenia 20, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym CDHl i odpowiadajacych jej peptydów, przy czym obecnosc i zwiekszony poziom CDHl wskazuje na plyn nowotworowy. 22. Sposób wedlug któregokolwiek z zastrzezen od 15 do 18, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: deazminaza adenozynowa ADA2, chemokina z motywem C-X-C (CXCLIO) i syntetaza tryptofanylo-tRNA, cytoplazmatyczna (WARS), przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn gruzliczy, czyli PL 440401 A1 59/71plyn oplucnowy spowodowany zapaleniem oplucnej w wyniku infekcji Mycobactcrium tubcrculosis. 23. Sposób wedlug zastrzezenia 22, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu ADA2 lub odpowiadajacych jej peptydów w plynie oplucnowym, przy czym jej obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn grnzliczy. 24. Sposób wedlug któregokolwiek z zastrzezen od 15 do 18. w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnmvym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: wimcnlyna (VIM), galcklyna 1 (LGALS 1). osoczowe bialko amyloidu P (APCS), bialko S 1 00A9 (S l 00A9), mctaloprolcinaza 9 (MMP9J, dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA) i bialko C-reaktywne (CRP), przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn parapneumoniczny, inaczej inny plyn infekcyjny.

. Sposób wedlug zastrzezenia 24, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza iloscimvo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CRP. S100A9. VIM, przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na inny plyn infekcyjny. 26. Sposób wedlug zastrzezenia 25, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CRP. S 100A9. przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na inny plyn infekcyjny. 27. Sposób wedlug dowolnego z zastrzezen od 15 do 18, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: hcmopcksyna (HPX), dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA), dehydrogenaza mleczanowa B (LDHB ), skladowa C3 dopelniacza (C3). skladowa C9 dopelniacza (C9), domena Sushi, czynnik von Willebranda typu A, EGF i bialko zawierajace domene pentraksyny 1 (SVEPI ), przy czym ich obecnosc i zmieniony poziom wskazuje na plyn lagodny, wynikajacy z chorób innych niz nowotwory i infekcje. 28. Sposób wedlug zastrzezenia 27, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA, LDHB, C3, C9, HPX, przy czym ich obecnosc i obnizony poziom wskazuje na plyn lagodny. 29. Sposób wedlug zastrzezenia 28, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA i C9, przy czym ich obecnosc i obnizony poziom wskazuje na plyn lagodny.

PL 440401 A1 60/71",IUCI i ~ i t, ., ;, .•· [)/' 1l c·-O,CJ1 l i· .. ,, p.- ' -­ .:,;-- (),11:11 j, 4.;, ~ ~ i~i ~ ~. i j \ i •' [it- 1.:. ,..._ ••.

Figura 1 J .. •,l ., ~ ...

A o.r12l p; .. .. l U,1_,_:,i ,. ~l i ,.. .. t . ~ I ... i M:=:>Lf\ ~ ,• .• u _uu, Jr[ s: -. " ~ i "(: • ii' ~ i,()f > ·i : ..

CT "' PL 440401 A1 61/71?- o w w •' ,, ,j " RAK A A) ~ . . . '·, .. ~o OJ.

PG 'rf 1:· -------~--:. - . . ,\_ i , ' ·~ '• , ~ I_ t< ( '[' r.:r. !~. '•• i '.

I:= ... !_ ·, ,OC -0,006 <0,001 <0,001 PG lPl WPI PL ..

' .' • F._"; Pt. l. · .. : lA •' ' .,. ' i ; :, Figura 2 • + --xr -11 U,1· Jl U,1 ~ .. . . l ; ~ J,0.".3 N - I r., .:.. i I ""! :.1 '• ' ],'( - IP d' JDl f J(J~ - Ph IP Wi .. ; t i f J RAC ~ .

.: PL- -~- ~- N~RS ~O,>Jl IP" LG/>LS1 ~ ~- •.· \'· PI ~-'- •' ,.

:: ,: ., ·.·. PC li' _ut ;\ N "'· \.J\J 1 on 'l -.-i nn - PG Jr' l.'VP "'--' TPI PL 440401 A1 62/71Ptyny nowolwcrm\e vs. t-·ozostcve plyny tlr I'' Il ll l'!I! ----· • ,,,. """ • iii;;~ ••• ~, ... ,w,, • il Tli !I li ,~, A ll' lf ·•• • ll II IUJ [J·• !1'1 iii 11 • ! i»i ! is "' l ~Y•-·bt,-~c.. l"'l'i lrnc ply-w 1fokcy~'1e '/S. Pozost:'!!e plyry i" '"'"'' '""' '""""' ._.,,,~--- ·•:~.,._ _____________ 7 " il ill l!I W ..... ?il ii •i 9' Ja11ill,-C•••r·-···•· ...

~'\ " Ml l!II' l" .

Ili ... , I i;s: ~!:.

C UiiUhil Q~~ lin i o.o PJyriy l<:1,1od1e vs, Pozost~>e rlyry ,_ '.1/lf;~ 1JB·: -ff~: 11:, Bit ,V,l!W lli----------- 11, 11 i D: R W .., .... 8, IM t ll Ili .__. !li Wi!! ll -· ~•••·· •~rtl!f lH:'l ilf li :'fi li.--- Ili i .... .

, .. . I. 'llli I I' 11: 't " ~ i ~ I / p..11 •• Figura 3 I~ Ply1y ;ruilicze v~. Pa.::oslafe fYYfl'r I M Wf M il liil li li ~• Itr tli tli lit .___,.-i( JJV': ib' tl! llll li J; trf li µ-M iii li 1ll :;,i !l'J Jlt• r , ifi ~ _/tit .llli ...-if~ At iii.1 il ii;, iii \!1 11 ·•· •llifllll)llMllD1ll a •g tl llUUI f• -.11: 8 tl; I' ~~; ,, o· ~ ·VO:- ;i.,.;~ t-f V,;sz1-.:.tlm: p-'yn·r [nft~kr/jnc v-:,. Pr,z.o~rak plyny ,w,l\1111lftlf1.I..-Wlfliil'iii' 11! ~ W i~·· I!, ll Il ,it• li' .... ,,,,. .. ""' : li fil , Ilf il Wii lll r'.J. f. li ,. f ffl IIIU d l-- O.' .'.i.:2 d• PL 440401 A1 63/71Nowotworowe (n=109): Marker Wartosc AUC p MWU Nowotworowe vs.

Pozos tale (n=lOO) CDH1 <0,001 0,766 MUCl <0,001 0,703 THBS4 <0,001 0,701 MSLN <0,001 0,698 HPX <0,001 0,661 SVEPl <0,001 0,658 SPINTl <0,001 0,651 CK-18 0,001 0,630 CK-8 0,001 0,629 ALCAM 0,036 0,584 C3 0,037 0,584 CK-19 0,038 0,583 SERPI NA4 0,046 0,580 Pozostale vs. Nowot.: MMP9 <0,001 0,659 APCS 0,001 0,630 ADA2 0,002 0,627 VIM 0,006 0,610 cxcuo 0,024 0,591 S100A9 0,025 0,590 Nowot. vs. Gruzlicze: CDHl <0,001 0,822 SVEPl <0,001 0,765 THBS4 <0,001 0,758 MSLN <0,001 0,722 HPX 0,004 0,690 MUCl 0,008 0,673 CK-19 0,009 0,671 SPINTl 0,024 0,650 CK-8 0,052 0,627 Nowot. vs. Inne infekcyjne: SVEPl <0,001 0,777 MSLN <0,001 0,774 CDHl <0,001 0,766 THBS4 <0,001 0,705 MUCl 0,003 0,671 SPINTl 0,008 0,650 Nowot. vs. \Nszys. infek.: CDH1 <0,001 0,789 SVEPl <0,001 0,772 MSLN <0,001 0,752 THBS4 <0,001 0,726 MUCl <0,001 0,671 SPJNTl 0,002 0,650 Nowot. vs. Lagodne: HPX LDH MSLN VIM <0,001 0,810 <0,001 0,019 0,624 0,020 0,622 Figura 4 G!'Uilicze (nz24): Inne infekcyjne (n=34): Marker Wartosc Marker Wartosc AUC AUC p MWU p MWU Gruzlicze vs. Pozostale Inne infekcyjne vs. (n=l85): Pozos tale (n=l75): ADA2 <0,001 0,881 S100A9 <0,001 0,773 <0,001 0,880 APCS <0,001 0,715 WARS <0,001 0,832 CRP <0,001 0,712 VIM <0,001 0,800 VIM <0,001 0,707 LGALSl <0,001 0,767 LDHA 0,001 0,674 MMP9 <0,001 0,753 lGALSl 0,005 0,651 S100A9 <0,001 0,716 MMP9 0,006 0,650 lOHA 0,001 0,704 LDH 0,008 0,644 LDH 0,002 0,698 HPX 0,017 0,630 APCS 0,003 0,68S WARS 0,021 0,625 CRP 0,006 0,674 C9 0,023 0,623 LDHB 0,009 0,664 LDHB 0,034 0,615 (9 0,013 0,657 Pozostale vs. Inne, nfek.: ALCAM 0,035 0,632 SVEPl <0,001 0,751 Pozostale vs. Gruzlicze: MSLN <.0,001 0,723 CDHl <0,001 0,723 CDHl 0,004 0,655 SVEPl <0,001 0,715 THBS4 0,022 0,625 THBS4 0,001 0,705 MSLN 0,014 0,654 CK-19 0,014 0,654 Gruzlicze vs. Nowot.: Inne infekcyjne vs. Nowot.: ADA2 <0,001 0,889 S100A9 <0,001 0,786 <0,001 0,882 VIM <0,001 0,747 WARS <0,001 0,828 APCS <0,001 0,741 VIM <0,001 0,820 CRP <0,001 0,707 MMP9 <0,001 0,798 MMP9 <0,001 0,698 <0,001 0,775 LGALSl 0.003 0,671 S100A9 <0,001 0,748 lDHA 0.006 0,657 APCS <0,001 0,737 ADA2 0.007 0.655 CRP 0,002 0,700 WARS 0,007 0,654 LDHA 0.004 0,690 LDH 0.012 0,665 Inne infek. vs. Gruzlicze: C9 0,037 0,636 HPX 0,008 0,707 CK-19 0,034 0,664 Inne infek.: CK-8 0,045 0,656 <0,001 O,B76 ADA2 <0,001 0,826 WARS <0,001 0,784 ALCAM 0,031 0,668 VIM 0,048 0,653 Gruzlicze vs. Lagodne: Inne infek. vs.lagodne: <0,001 0,906 S100A9 <0,001 0,873 0,880 LDH <0,001 0,030 0,662 ALCAM 0,016 CK-18 0,034 ....... ., .. ~ Marker Wartosc AUC p MWU Wszystkie infekcyjne vs.

Pozos tale (n=l51): C3 0,011 0,613 Pozostale vs. infek.: SPI NTl 0,015 MUCl 0,043 0,590 infek. vs. Nowot.: C9 CK-18 MUCl O,Q20 0,609 0,024 0,634 0,049 0,616 Lagodne {n=42): Marker Wartosc AUC p MWU lagodne vs. Pozostale (n=l67): SVEPl 0,037 0,604 Pozostale vs. lagodne: LDH <0,001 0,818 LDHA <0,001 0,805 LDHB <0,001 0,799 HPX <0,001 0,789 C9 <0,001 0,773 C3 <0,001 0,772 WARS <0,001 0,740 Sl00A9 <0,001 0,728 CRP <0,001 0,704 CK·8 <0,001 0,701 MUCl <0,001 0,701 ALCAM <0,001 0,696 VIM <0,001 0,695 LGALSl <0,001 0,637 CK-18 <0,001 0,677 SERPINFl <0,001 0,672 CDHl 0,005 0,640 ADA2 0,010 0,628 SPI NTl 0,053 0,598 APCS 0,051 0.597 Lagodne vs. Nowot.: Brak lagodne vs. Gruzlicze: SVEPl <0,001 0,802 Lagodne vs. Inne infek.· SVEP1 <0,001 0,800 MSLN 0,004 0,692 Lagod. vs. Ws zys. infek.· SVEP1 <0,001 0,800 MSLN 0,004 0,670 PL 440401 A1 64/71Figura 5 PL 440401 A1 65/71HPX 00 C3 O, ''Jl Figura 6 fJ.(-, l i ~ ~ i : '1 . ., l ft! ' . li ~ ' \. J.. ...

.. O ~-09 C9 ,s;_Q ~:01 - ·. ,, f':.. lOH - ~•1 ..... ., I ... ' ~ ~ ~ ~ ~ ~ } + .• l ~I •• \ ·~ " .: ,· l. .,. ·, 0,[24 ..

.,. ~ I ~ ' ,. ., t •' ' ... ) ~ r ~ ' ~ ·: '.· ~ ., .J.

... ' I ,· PL 440401 A1 66/71ALCAM : I ( . ~ ' ~ f ~ ~ tr; ~ ..

.. ~ .L -4 .. :r ., ,,.

' ;. C,0:C b CK-6 ~· ,,. ~ 1 .,. '.': -,, ' • ,,. i .. cr ~ ~ I ,..,, '' ~ 1. '-1 .. • .. _./!. ., ".,. '" .,_ ,. ,.,,i< Figura 7 CK·l9 :, ..

., I ~ '7' ~ '.! •.

CK-7 ..• T T ,., .,. ~ ~ i s ,, ; t~ .. , 'i ~ y ' ...

• -'.I< ·' 7 ~ ~ r .L I I ; ..;: . i ·= ., :i.

J. \ ,. s " ' ., • ...

.,. SERPINA4 GSN PL 440401 A1 67/71Figura 8 Q.(, no Cn,..1ldc [ Jil, ll;l 'il'Uli lfl IH, It/Hll I Of Il :~•li !! ~ 1l~ ~ !I !!l~ ~ im 1 /ll I! fil ... ll lW lJi il .~i li • . il if.lil Jji il\'i iif '.fi ~-~ • fl 'll tl! 1. ,. •. "' Yil ll,!ij ~ '' 1H,Ult lllHI li Wl • a ......,-!N Jl!I W lUnUt an~ u•-•1t•,1P•.•1'1~~-~-1~.w.•~ !.~~-- - fil' 11111 if.\f,R ft,;:,.. ·,f,fi: .J;.-, .-. .ff~· 11!'/t, . ',"41'. .'/ft~·- ,. , ,JV· ,ut ,JJ!ft,- t'IIU [ 00'1~•·· •'/li' tl!!-~f~.,;i~. -!il o.r WJ l W! tlll "'l n M /ifl; lG (I lt fi !Il ll'i G iii .~ ;ff ii 11.lj li:\\: :t•· '.;'I,..' I LU Plyry zwiqz;;me z rlewydc!ncscia narzadów vs =-ozostale p-lyrv '" Ji ffi tir I ~li o• li/ Czulosc i~ ·• i -~··••1• ~-~---~ ~ ,, ••· l !iii Jl ij !!Iii 141 'li !l!I m. lLt ~.E,,.,'. Wf Jl;.t,: 'rJ';iit· 'i(t :I~ n~. •~•m il 111 I 1 I~ :-_: llllHlll/Jiaaa• - ~ O• 1, lllil: li il ,l!JI llfl. * Ili,/ .Iii,+ ii;l '.li Il ,,, ''1'"• "''• "'I ~'" "" '"' .,, ,.,,1 ig ; : , !Il· -~ :(, ~~ fi, lltl J,'Jtl ·Ml'f 0 JRJ: ,w, l ~- ,l ·\&~ ·• 111.l "li' fli Jl1 llifi'llllllilifr'"1 OC i() or UO 1.1.

PL 440401 A1 68/71Figura 9 Nazwa bialka (skrót uzywany w tekscie) Celowane peptydy do analizy MRM [nazwa genu, identyfikator U n i Prot] (Pozycja peptydu w bialku) Antygen karcynoembrionalny (CEA/CEACAMS) QIIGYVIGTQQATPGPAYSGR (78-98) [CEACAM5, P06731] SDLVNEEATGQFR (127-139} Dlugosc: 702 aa, Masa (Da): 76 795 NDTASYK {208-214} LQLSNDNR {369-376) INGIPQQHTQVLFIAK {629-644} Dipeptydylopeptydaza 4 (DPP4} FRPSEPHFTLDGNSFYI< (357-373) [DPP4, P27487] VLEDNSALDK (493-502) Dlugosc: 766 aa, Masa (Da): 88 279 LGTFEVEDQI EAAR (598-611) Kompleks replikacyjny DNA GINS3 bialko PSF3 LGAFFLER (43-50) (GINS3} SAGAETDNAVPQGSK (51-65) [GINS3, Q9BRX5] LELPLWLAK {66-74) Dlugosc: 216 aa, Masa (Da): 24 535 TVFSADPNVVDLH I< (98-111} IMDSSQNAYNEDTSALVAR (149-167} GQASQITASNLVQNYK (192-207) Czasteczka adhezyjna komórek nablonkowych LAVNCFVNNNR (34-44) (EPCAM} QCQCTSVGAQNTVICSK (45-61} [EPCAM, P16422] EKPYDSK (154-160} Dlugosc: 314 aa, Masa (Da): 34 932 TQNDVDIADVAYYFEI< (203-218) APEFSMQGLK (256-265) Enolaza swoista dla neuronów (NSE} GNPTVEVDLYTAK (16-28} [ENO2, P09104] AVDHINSTIAPALISSGLSVVEQEK (65-89} Dlugosc: 434 aa, Masa (Da): 47 269 YITGDQLGALYQDFVR (270-285) IEEELGDEAR (413-422) Peptyd uwalniajacy gastryne GRP (GRP} AVPLPAGGGTVLTK (23-36) [GRP, P07492] VPLPAGGGTVLTK (24-36) Dlugosc: 148 aa, Masa (Da): 16 213 STGESSSVSER (54-64) NLLGLI EAI< (83-91) NHQPPQPK (95-102) ALGNQQPSWDSEDSSNFK (103-120) LSAPGSQR (131-138) Receptor czynnika wzrostu hepatocytów (MET) EVFNILQAAYVSKPGAQLAR (312-331) [MET, P08581] GDLTIANLGTSEGR (448-461) Dlugosc: 1,390 aa, Masa (Da): 155 541 LNSELNIEWI< (903-912) Kalikreina 12 (KLK12} NSQPWQVGLFEGTSLR (31-46) [KLK12, Q9UKR0] LGEHSLSQLDWTEQIR (72-87) Dlugosc: 248 aa, Masa (Da): 26 734 Cytokeratyna 14 (CK-14} APSTYGGGLSVSSSR (42-56) [KRT14, P02533] DAEEWFFTK (301-309) Dlugosc: 472 aa, Masa (Da): 51 561 Cytokeratyna 16 (Cl(-16} APSTYGGGLSVSSR (42-55) [l Dlugosc: 473 aa, Masa (Da): 51 268 Cytokeratyna 17 (CK-17) ALEEANTELEVK (104-115) [KRT17, Q04695] AAPGVDLSR (243-251) Dlugosc: 432 aa, Masa (Da): 48 106 ASLEGNLAETENR (322-334) TIVEEVQDGI< (410-419) Antygen nowotworowy 125 (MUC-16/CA-125} DSLFINGYAPQNLSIR (14184-14199) [MUC16, Q8WXl7] ALFSS N LDPSL VEQVFLDK ( 14266-14284) Dlugosc: 14 507 aa, Masa (Da): 1519 175 VAIYEEFLR (14405-14413) Receptor typu fosfatazy bialkowo-tyrozynowej F YSIGGLSPFSEYAFR (374-388) (PTPRF) VLAFTAVGDGPPSPTIQVK (488-506) [PTPRF, P10586] TGEGFIDFIGQVHK (1811-1824) Dlugosc: 1 907 aa, Masa (Da): 212 879 PL 440401 A1 69/71Figura 9 cd.

Antygen raka plaskonablonkowego SCC 1 VLHFDQVTENTTGI( (56-69) (SPB3/SCCA-1) FYQTSVESVDFANAPEESR (126-144) [SPB3, P29508] QYTSFHFASLEDVQAK (215-230) Dlugosc: 390 aa, Masa (Da): 44 565 GLVLSGVLHK (322-331) Antygen raka plaskonablonkowego SCC 2 VLH FDQVTENTTEK (56-69) (SPB4/SCCA-2) FYQTSVESTDFANAPEESR (126-144) [SPB4, P48594] QYNSFNFALLEDVQAI( (215-230) Dlugosc: 390 aa, Masa (Da): 44 854 ETCVDLHLPR (277-286) Peptydy wspólne dla SPB3, SPB4: FMFDLFQQFR SPB3, SPB4 (11-20) STDAYELK SPB3, SPB4 (95-102) INSWVESQTNEK SPB3, SPB4 (147-158) TNSILFYGR SPB3, SPB4 (378-386) Czynnik koniczyny 3 (TFF3) VDCGYPHVTPK (54-64) [TFF3, Q07654] GCCFDSR (70-76) Dlugosc: 94 aa, Masa (Da): 10 181 Ludzkie bialko z komórek nablonkowych najadrza CCSAGCATFCSLPNDK (61-76) (WFDC2/HE4) EGSCPQVNINFPQLGLCR (77-94) [WFDC2, Q14508] DQCQVDSQCPGQMK (95-108) Dlugosc: 124 aa, Masa (Da): 12 993 Deaminaza Adenozyny (ADAl) VELHVHLDGSIKPETILYYGR (12-32) [ADA, P00813] YSPHLLANSK (102-111) Dlugosc: 363 aa, Masa (Da): 40 764 LGHGYHTLEDQALYNR (236-251) Katepsyna B (CTSB) NGPVEGAFSVYSDFLLYK (246-263) [CTSB, P07858] Dlugosc: 339 aa, Mass (Da): 37 822 Interferon gamma (IFNG) YFNAGHSDVADNGTLFLGILK (37-57) [IFNG, P01579] IMQSQIVSFYFK (67-78) Dlugosc: 166 aa, Masa (Da): 19 348 LTNYSVTDLNVQR (118-130) AIHELIQVMAELSPAAK (132-148) Interleukina 33 (I L33) VLLSYYESQHPSNESGDGVDGK (159-180) [IL33, 095760] DFWLHANNK (191-199) Dlugosc: 270 aa, Masa (Da): 30 759 EHSVELHI( (200-207) TDPGVFIGVI( (234-243) DNHLALII( (244-251) VDSSENLCTENILFK (252-266) Perforyna 1 (PRFl) FVPGAWLAGEGVDVTSLR (37-54) [PRFl, P14222] LISNYGTHFIR (215-225) Dlugosc: 555 aa, Masa (Da): 61 377 ALSQYLTDR (363-371) LFFGGQELR (441-449) TSTVWDNNNPIWSVR (450-464) LDFGDVLLATGGPLR (465-479) Czlonek nadrodziny receptora czynnika martwicy VAETPTYPWR (30-39) nowotworów 6B (TNFRSF6B) LVCAQCPPGTFVQRPCR (47-63) [TNFRSF6B, 095407] DSPTTCGPCPPR (65-76) Dlugosc: 300 aa, Masa (Da): 32 680 VPGAEECER (205-213) LLQALEAPEGWGPTPR (232-247) LTELLGAQDGALLVR (261-275) Dehydrogenaza mleczanowa lancuch C LIEDDENSQCK (12-22) (LDHC) DLADELALVDVALDK (43-57) [LDHC, P07864] IVIVTAGAR (91-99) Dlugosc: 332 aa, Masa (Da): 36 311 SIIPAIVHYSPDCK (119-132) SAETLWNIQK (319-328) PL 440401 A1 70/71al. Niepodlegiosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA WYNALAZKU NR P.440401 Klasyfikacja zgloszenia: G01N 33/68 (2006.01) Poszukiwania prowadzono w klasach: G01N Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: Epoquenet (Epodoc, Wpi, Em base, Medline, X-full); bazy UPRP, Google Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz.

A PL414159 Al; INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKIEJ 1-29 AKADEMII NAUK, Warszawa, [PL]; 2017-03-27 A CN109490556A; BEIJING CHEST HOSPITAL CAPITAL 1-29 MEDICAL UNIVERSITY, Beijing [CN] ET AL.; 2019-03-19 A CN107064524A; BEIJING CHEST HOSPITAL CAPITAL 1-29 MEDICAL UNIVERSITY, Beijing [CN] ET AL.; 2017-08-18 A J. M. Parcel et al.: "Biomarkers of infection for the differentia! 1-29 diagnosis of pleura! effusions", European Respiratory Journal; 2009 34: 1383-1389 ? Dalszy ciai::i: wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okresbjacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za pDsiadajacy szc;'.ególne rnaczenie; E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po cbcie zgloszenia; L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwsze1\stwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytm,rnnego dokumentu lub z innego szczególnego powodu; O - dokument odnoszacy sie do ujmvnienia ustnego przez rnstosmvm1ie, 1,1,ystawienie lub uja\\Tiienie w inny sposnb: P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa: T dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowm1y w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku: X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany 1,1,ymlazek nie moze byc uwazany za no1,1;y luh nie moze hyc uwazany za posiadajacy poziom 1,1,ymlazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie: Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany 1,1,ymlazek nie moze hyc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym luh kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy: & - dokument nalezacv do tej samej rodziny patentowej.

Sprawozdanie wykonala: dr Malgorzata Kozlowska Ekspert Koordynator Data: 28-10-2022 r. podpis: /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z dn. 16.02.2022 r.

PL 440401 A1 71/71

Claims (1)

Zastrzezenia patentowe I. Panel bialkowy skladajacy sie z markerów bialkowych i odpowiadajacych im peptydów wymienionych w tabeli 1 do zastosowania w sposobie in vitro diagnozowania plynów oplucnowych. 2. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 1, do sposobu in vitro diagnozowania plynów oplucnowych, który to panel oznacza sie z Lastosowaniem opartej na spektrometrii mas (MS) multipleksowanej proteomiki celowanej L uzyciem metod MS selektywnego. wielokrotnego lub równoleglego monitorowania reakcji (SRM, MRM, PRM). 3. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia I albo 2, obejmujacy markery bialkowe o sekwencjach numer: 1 i 2, 4. 5 i 7, 8. 10 i 11. 14, 16 i 17, 18-20. 23. 24-26. 29, 30, 33-35. 36 i 37, 40 i 42, 44 i 45, 48, 50 i 51. 54 i 57, 58, 60 i 61, 63. 67-70, 71, 72 i 75. 79. 80-83. 84-86. 87-89, 90 i 91, 92-94, 95 i 97, 98-102 oraz 104-108. 4. Panel bialkowy wedlug któregokolwiek z zastrzezen 1 do 3. który obejmuje wykryty i owacmny ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: kadheryna-1 (CDHl), trombospondyna-4 (THBS4). mezotelina (MSLN), mucyna-I (MUCI/CA 15-3), domena sushi, czynnik von Willebranda, EGF i bialko I zawierajace domene pentraksyny (SVEPl). inhibitor proteazy typu Kunitz 1 (SPTNTl ), hemopeksyna (HPX), antygen CDl 66 (ALCAM). kalli statyna (SERPTNA4), keratyna 8 typu TT cytoszkiclctu (CK-8), keratyna 18 typu I cytoszkiclctu (CK-18), keratyna 19 typu I cytoszkiclctu (CK-19). który wskazuje na plyn nowotworowy. czyli plyn zwiazany z nowotworem. 5. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 4, w którym wykryty i oznaczony ilosciowo. zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CDH 1. MUCI, THBS4. MSLN. HPX. wskazuje na plyn nowotworowy. 6. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 5, w którym wykryty i okreslony ilosciowo. zwiekszony poziom w plynie oplucnowym CDHl i odpowiadajacych jej peptydów wskazuje na plyn nowotworowy. 7. Panel bialkowy wedlug któregokolwiek z zastrzezen 1 do 3, w którym wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: deazminaza adenozynowa ADA2, chemokina 10 z motywem C-X-C (CXCLlO) i syntetaza tryptofanylo-tRNA, cytoplazmatyczna (WARS), wskazuje na plyn gruzliczy, czyli plyn oplucnowy spowodowany zapaleniem oplucnej w wyniku infekcji Mycobacterium tuberculosis.7/718. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 7, w którym wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poLiom w plynie oplucnowym ADA2 i odpowiadajacych jej peptydów wskazuje na plyn gruzliczy. 9. Panel bialkowy wedlug któregokolwiek z zastrzezen I do 3. w którym wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: wimentyna (VTM). galektyna 1 (LGALS 1 ), osoczowe bialko amyloidu P (APCS), bialko SlOOA9 (SlOOA9), mctaloprotcinaza 9 (MMP9). dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA) i bialko C-reaktywne (CRP), wskawje na plyn parnpneumoniczny lub inny plyn infekcyjny. 10. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 9, w którym wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CRP, S 1 OOA 9. VIM, wskazuje na inny plyn infekcyjny. 11. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 1 O, wykryty i okreslony ilosciowo, zwiekszony poziom w plynie oplucnowym bialek lub odpowiadajacych im peptydó,v: CRP i S100A9. wskazuje na inny plyn infekcyjny. 12. Panel bialkowy wedlug któregokolwiek z zastrzezen 1 do 3, w którym wykryty i okreslony ilosciowo zmieniony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: hemopeksyna (HPX), dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA ), dehydrogenaza mleczanowa B (LDHB), skladowa C3 dopelniacza (C3). skladowa C9 dopelniacza (C9), domena Sushi, czynnik von Willehranda typu A, EGF i bialko zawierajace domene pentraksyny 1 (SVEPl ), wskazuje na plyn lagodny. wynikajacy z chorób innych niz nowotwory i infekcje. 13. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 12. w którym wykryty i okreslony ilosciowo, obnizony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA, LDHB, C3, C9, HPX wskazuje na plyn lagodny. 14. Panel bialkowy wedlug zastrzezenia 13. w którym wykryty i okreslony ilosciowo. obnizony poziom w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA i C9, wskazuje na plyn lagodny. 15. Sposób in vitro analizy plynu oplucnowego do diagnozowania jego etiologii, w którym to sposobie wykrywa sie i oznacza ilosciowo w plynie oplucnowym pobranym od pacjenta panel markerów bialkowych wymienionych w tabeli 1, w tym odpowiadajacych im peptydów, w którym wykrywanie i oznaczenie ilosciowe przeprowadza sie przy uzyciu opartej na spektrometrii mas multipleksowej ukierunkowanej proteomiki, oraz na podstawie obecnosci i zmiany poziomu markera bialkowego lub jego odpowiedniej kombinacji peptydowej okresla sie etiologie plynu oplucnowego.8/7116. Sposób wedlug zastrzezenia 15, w którym analize plynu oplucnowego przeprowadza sie przy uzyciu opartej na spektrometrii mas (MS) multipleksowanej celowanej proteomiki z zastosowaniem metod MS selektywnego. wielokrotnego lub równoleglego monitorowania reakcji (SRM, MRM, PRM). 17. Sposób wedlug któregokolwiek z zastrzezen 15 albo 16, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym markerów bialkowych i odpowiadajacych im peptydów w porównaniu z poziomem stezenia bialek lub peptydów odniesienia oznaczonym w grupie odniesienia. 18. Sposób wedlug dowolnego z zastrzezen 15 do 17, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo markery bialkowe o sekwencjach numer: 1 i 2, 4, 5 i 7, 8, 10 i 11. 14. 16 i 17. 18-20. 23. 24-26. 29. 30. 33-35. 36 i 37. 40 i 42. 44 i 45. 48. 50 i 51. 54 i 57. 58. 60 i 61. 63. 67-70. 71. 72 i 75. 79. 80-83. 84-86. 87-89. 90 i 91, 92-94. 95 i 97. 98-102 oraz 104-108. 19. Sposób wedlug dowolnego z zastrzezen 15 do 18, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: kadheryna-1 (CDHl). trombospondyna-4 (THBS4). mezotelina (MSLN). mucyna-I (MUCl/CA 15-3), domena sushi, czynnik von Willebranda, EGF i bialko I zawierajace domene pentraksyny (SYEPI). inhibitor proteazy typu Kunitz I (SPINTI ). hemopeksyna (HPX). antygen CDl 66 (ALCAM). kalli statyna (SERPTNA4), keratyna 8 typu TT cytoszkieletu (CK-8), keratyna 18 typu I cytoszkieletu (CK-18), keratyna 19 typu I cytoszkiclctu (CK-19), przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn nowotworowy. 20. Sposób wedlug zastrzezenia 19, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CDHl. MUCl. THBS4, MSLN. HPX. przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn nowotworowy. 21. Sposób wedlug zastrzezenia 20, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym CDHl i odpowiadajacych jej peptydów, przy czym obecnosc i zwiekszony poziom CDHl wskazuje na plyn nowotworowy. 22. Sposób wedlug któregokolwiek z zastrzezen od 15 do 18, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: deazminaza adenozynowa ADA2, chemokina 10 z motywem C-X-C (CXCLIO) i syntetaza tryptofanylo-tRNA, cytoplazmatyczna (WARS), przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn gruzliczy, czyli9/71plyn oplucnowy spowodowany zapaleniem oplucnej w wyniku infekcji Mycobactcrium tubcrculosis. 23. Sposób wedlug zastrzezenia 22, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu ADA2 lub odpowiadajacych jej peptydów w plynie oplucnowym, przy czym jej obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn grnzliczy. 24. Sposób wedlug któregokolwiek z zastrzezen od 15 do 18. w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnmvym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: wimcnlyna (VIM), galcklyna 1 (LGALS 1). osoczowe bialko amyloidu P (APCS), bialko S 1 00A9 (S l 00A9), mctaloprolcinaza 9 (MMP9J, dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA) i bialko C-reaktywne (CRP), przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na plyn parapneumoniczny, inaczej inny plyn infekcyjny. 25. Sposób wedlug zastrzezenia 24, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza iloscimvo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CRP. S100A9. VIM, przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na inny plyn infekcyjny. 26. Sposób wedlug zastrzezenia 25, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: CRP. S 100A9. przy czym ich obecnosc i zwiekszony poziom wskazuje na inny plyn infekcyjny. 27. Sposób wedlug dowolnego z zastrzezen od 15 do 18, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poziomu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: hcmopcksyna (HPX), dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA), dehydrogenaza mleczanowa B (LDHB ), skladowa C3 dopelniacza (C3). skladowa C9 dopelniacza (C9), domena Sushi, czynnik von Willebranda typu A, EGF i bialko zawierajace domene pentraksyny 1 (SVEPI ), przy czym ich obecnosc i zmieniony poziom wskazuje na plyn lagodny, wynikajacy z chorób innych niz nowotwory i infekcje. 28. Sposób wedlug zastrzezenia 27, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA, LDHB, C3, C9, HPX, przy czym ich obecnosc i obnizony poziom wskazuje na plyn lagodny. 29. Sposób wedlug zastrzezenia 28, w którym wykrywa sie obecnosc i oznacza ilosciowo zmiane poz10mu w plynie oplucnowym nastepujacych bialek lub odpowiadajacych im peptydów: LDHA i C9, przy czym ich obecnosc i obnizony poziom wskazuje na plyn lagodny.0/71",IUCI i ~ i t, ., ;, .•· [)/' 1l c·-O,CJ1 l i· .. ,, p.- ' -­ .:,;-- (),11:11 j, 4.;, ~ ~ i~i ~ ~. i j \ i •' [it- 1.:. ,..._ ••. Figura 1 J .. •,l ., ~ ... A o.r12l p; .. .. l U,1_,_:,i ,. ~l i ,.. .. t . ~ I ... i M:=:>Lf\ ~ ,• .• u _uu, Jr[ s: -. " ~ i "(: • ii' ~ i,()f > ·i : .. CT "'1/71?- o w w •' ,, ,j " RAK A A) ~ . . . '·, .. ~o OJ. PG 'rf 1:· -------~--:. - . . ,\_ i , ' ·~ '• , ~ I_ t< ( '[' r.:r. !~. '•• i '. I:= ... !_ ·, ,OC -0,006 <0,001 <0,001 PG lPl WPI PL .. ' .' • F._"; Pt. l. · .. : lA •' ' .,. ' i ; :, Figura 2 • + --xr -11 U,1· Jl U,1 ~ .. . . l ; ~ J,0.".3 N - I r., .:.. i I ""! :.1 '• ' ],'( - IP d' JDl f J(J~ - Ph IP Wi .. ; t i f J RAC ~ . .: PL- -~- ~- N~RS ~O,>Jl IP" LG/>LS1 ~ ~- •.· \'· PI ~-'- •' ,. :: ,: ., ·.·. PC li' _ut ;\ N "'· \.J\J 1 on 'l -.-i nn - PG Jr' l.'VP "'--' TPI2/71Ptyny nowolwcrm\e vs. t-·ozostcve plyny tlr I'' Il ll l'!I! ----· • ,,,. """ • iii;;~ ••• ~, ... ,w,, • il Tli !I li ,~, A ll' lf ·•• • ll II IUJ [J·• !1'1 iii 11 • ! i»i ! is "' l ~Y•-·bt,-~c.. l"'l'i lrnc ply-w 1fokcy~'1e '/S. Pozost:'!!e plyry i" '"'"'' '""' '""""' ._.,,,~--- ·•:~.,._ _____________ 7 " il ill l!I W ..... ?il ii •i 9' Ja11ill,-C•••r·-···•· ... ~'\ " Ml l!II' l" . Ili ... , I i;s: ~!:. C UiiUhil Q~~ lin i o.o PJyriy l<:1,1od1e vs, Pozost~>e rlyry ,_ '.1/lf;~ 1JB·: -ff~: 11:, Bit ,V,l!W lli----------- 11, 11 i D: R W .., .... 8, IM t ll Ili .__. !li Wi!! ll -· ~•••·· •~rtl!f lH:'l ilf li :'fi li.--- Ili i .... . , .. . I. 'llli I I' 11: 't " ~ i ~ I / p..11 •• Figura 3 I~ Ply1y ;ruilicze v~. Pa.::oslafe fYYfl'r I M Wf M il liil li li ~• Itr tli tli lit .___,.-i( JJV': ib' tl! llll li J; trf li µ-M iii li 1ll :;,i !l'J Jlt• r , ifi ~ _/tit .llli ...-if~ At iii.1 il ii;, iii \!1 11 ·•· •llifllll)llMllD1ll a •g tl llUUI f• -.11: 8 tl; I' ~~; ,, o· ~ ·VO:- ;i.,.;~ t-f V,;sz1-.:.tlm: p-'yn·r [nft~kr/jnc v-:,. Pr,z.o~rak plyny ,w,l\1111lftlf1.I..-Wlfliil'iii' 11! ~ W i~·· I!, ll Il ,it• li' .... ,,,,. .. ""' : li fil , Ilf il Wii lll r'.J. f. li ,. f ffl IIIU d l-- O.' .'.i.:2 d•3/71Nowotworowe (n=109): Marker Wartosc AUC p MWU Nowotworowe vs. Pozos tale (n=lOO) CDH1 <0,001 0,766 MUCl <0,001 0,703 THBS4 <0,001 0,701 MSLN <0,001 0,698 HPX <0,001 0,661 SVEPl <0,001 0,658 SPINTl <0,001 0,651 CK-18 0,001 0,630 CK-8 0,001 0,629 ALCAM 0,036 0,584 C3 0,037 0,584 CK-19 0,038 0,583 SERPI NA4 0,046 0,580 Pozostale vs. Nowot.: MMP9 <0,001 0,659 APCS 0,001 0,630 ADA2 0,002 0,627 VIM 0,006 0,610 cxcuo 0,024 0,591 S100A9 0,025 0,590 Nowot. vs. Gruzlicze: CDHl <0,001 0,822 SVEPl <0,001 0,765 THBS4 <0,001 0,758 MSLN <0,001 0,722 HPX 0,004 0,690 MUCl 0,008 0,673 CK-19 0,009 0,671 SPINTl 0,024 0,650 CK-8 0,052 0,627 Nowot. vs. Inne infekcyjne: SVEPl <0,001 0,777 MSLN <0,001 0,774 CDHl <0,001 0,766 THBS4 <0,001 0,705 MUCl 0,003 0,671 SPINTl 0,008 0,650 Nowot. vs. \Nszys. infek.: CDH1 <0,001 0,789 SVEPl <0,001 0,772 MSLN <0,001 0,752 THBS4 <0,001 0,726 MUCl <0,001 0,671 SPJNTl 0,002 0,650 Nowot. vs. Lagodne: HPX LDH MSLN VIM <0,001 0,810 <0,001 0,019 0,624 0,020 0,622 Figura 4 G!'Uilicze (nz24): Inne infekcyjne (n=34): Marker Wartosc Marker Wartosc AUC AUC p MWU p MWU Gruzlicze vs. Pozostale Inne infekcyjne vs. (n=l85): Pozos tale (n=l75): ADA2 <0,001 0,881 S100A9 <0,001 0,773 <0,001 0,880 APCS <0,001 0,715 WARS <0,001 0,832 CRP <0,001 0,712 VIM <0,001 0,800 VIM <0,001 0,707 LGALSl <0,001 0,767 LDHA 0,001 0,674 MMP9 <0,001 0,753 lGALSl 0,005 0,651 S100A9 <0,001 0,716 MMP9 0,006 0,650 lOHA 0,001 0,704 LDH 0,008 0,644 LDH 0,002 0,698 HPX 0,017 0,630 APCS 0,003 0,68S WARS 0,021 0,625 CRP 0,006 0,674 C9 0,023 0,623 LDHB 0,009 0,664 LDHB 0,034 0,615 (9 0,013 0,657 Pozostale vs. Inne, nfek.: ALCAM 0,035 0,632 SVEPl <0,001 0,751 Pozostale vs. Gruzlicze: MSLN <.0,001 0,723 CDHl <0,001 0,723 CDHl 0,004 0,655 SVEPl <0,001 0,715 THBS4 0,022 0,625 THBS4 0,001 0,705 MSLN 0,014 0,654 CK-19 0,014 0,654 Gruzlicze vs. Nowot.: Inne infekcyjne vs. Nowot.: ADA2 <0,001 0,889 S100A9 <0,001 0,786 <0,001 0,882 VIM <0,001 0,747 WARS <0,001 0,828 APCS <0,001 0,741 VIM <0,001 0,820 CRP <0,001 0,707 MMP9 <0,001 0,798 MMP9 <0,001 0,698 <0,001 0,775 LGALSl 0.003 0,671 S100A9 <0,001 0,748 lDHA 0.006 0,657 APCS <0,001 0,737 ADA2 0.007 0.655 CRP 0,002 0,700 WARS 0,007 0,654 LDHA 0.004 0,690 LDH 0.012 0,665 Inne infek. vs. Gruzlicze: C9 0,037 0,636 HPX 0,008 0,707 CK-19 0,034 0,664 Inne infek.: CK-8 0,045 0,656 <0,001 O,B76 ADA2 <0,001 0,826 WARS <0,001 0,784 ALCAM 0,031 0,668 VIM 0,048 0,653 Gruzlicze vs. Lagodne: Inne infek. vs.lagodne: <0,001 0,906 S100A9 <0,001 0,873 0,880 LDH <0,001 0,030 0,662 ALCAM 0,016 CK-18 0,034 ....... ., .. ~ Marker Wartosc AUC p MWU Wszystkie infekcyjne vs. Pozos tale (n=l51): C3 0,011 0,613 Pozostale vs. infek.: SPI NTl 0,015 MUCl 0,043 0,590 infek. vs. Nowot.: C9 CK-18 MUCl O,Q20 0,609 0,024 0,634 0,049 0,616 Lagodne {n=42): Marker Wartosc AUC p MWU lagodne vs. Pozostale (n=l67): SVEPl 0,037 0,604 Pozostale vs. lagodne: LDH <0,001 0,818 LDHA <0,001 0,805 LDHB <0,001 0,799 HPX <0,001 0,789 C9 <0,001 0,773 C3 <0,001 0,772 WARS <0,001 0,740 Sl00A9 <0,001 0,728 CRP <0,001 0,704 CK·8 <0,001 0,701 MUCl <0,001 0,701 ALCAM <0,001 0,696 VIM <0,001 0,695 LGALSl <0,001 0,637 CK-18 <0,001 0,677 SERPINFl <0,001 0,672 CDHl 0,005 0,640 ADA2 0,010 0,628 SPI NTl 0,053 0,598 APCS 0,051 0.597 Lagodne vs. Nowot.: Brak lagodne vs. Gruzlicze: SVEPl <0,001 0,802 Lagodne vs. Inne infek.· SVEP1 <0,001 0,800 MSLN 0,004 0,692 Lagod. vs. Ws zys. infek.· SVEP1 <0,001 0,800 MSLN 0,004 0,6704/71Figura 55/71HPX 00 C3 O, ''Jl Figura 6 fJ.(-, l i ~ ~ i : '1 . ., l ft! ' . li ~ ' \. J.. ... .. O ~-09 C9 ,s;_Q ~:01 - ·. ,, f':.. lOH - ~•1 ..... ., I ... ' ~ ~ ~ ~ ~ ~ } + .• l ~I •• \ ·~ " .: ,· l. .,. ·, 0,[24 .. .,. ~ I ~ ' ,. ., t •' ' ... ) ~ r ~ ' ~ ·: '.· ~ ., .J. ... ' I ,·6/71ALCAM : I ( . ~ ' ~ f ~ ~ tr; ~ .. .. ~ .L -4 .. :r ., ,,. ' ;. C,0:C b CK-6 ~· ,,. ~ 5 1 .,. '.': -,, ' • ,,. i .. cr ~ ~ I ,..,, '' ~

1. '-1 .. • .. _./!. ., ".,. '" .,_ ,. ,.,,i< Figura 7 CK·l9 :, .. ., I ~ '7' ~ '.! •. CK-7 ..• T T ,., .,. ~ ~ i s ,, ; t~ .. , 'i ~ y ' ... • -'.I< ·' 7 ~ ~ r .L I I ; ..;: . i ·= ., :i. J. \ ,. s " ' ., • ... .,. SERPINA4 GSN7/71Figura 8 Q.(, no Cn,..1ldc [ Jil, ll;l 'il'Uli lfl IH, It/Hll I Of Il :~•li !! ~ 1l~ ~ !I !!l~ ~ im 1 /ll I! fil ... ll lW lJi il .~i li • . il if.lil Jji il\'i iif '.fi ~-~ • fl 'll tl! 1. ,. •. "' Yil ll,!ij ~ '' 1H,Ult lllHI li Wl • a ......,-!N Jl!I W lUnUt an~ u•-•1t•,1P•.•1'1~~-~-1~.w.•~ !.~~-- - fil' 11111 if.\f,R ft,;:,.. ·,f,fi: .J;.-, .-. .ff~· 11!'/t, . ',"41'. .'/ft~·- ,. , ,JV· ,ut ,JJ!ft,- t'IIU [ 00'1~•·· •'/li' tl!!-~f~.,;i~. -!il o.r WJ l W! tlll "'l n M /ifl; lG (I lt fi !Il ll'i G iii .~ ;ff ii 11.lj li:\\: :t•· '.;'I,..' I LU Plyry zwiqz;;me z rlewydc!ncscia narzadów vs =-ozostale p-lyrv '" Ji ffi tir I ~li o• li/ Czulosc i~ ·• i -~··••1• ~-~---~ ~ ,, ••· l !iii Jl ij !!Iii 141 'li !l!I m. lLt ~.E,,.,'. Wf Jl;.t,: 'rJ';iit· 'i(t :I~ n~. •~•m il 111 I 1 I~ :-_: llllHlll/Jiaaa• - ~ O• 1, lllil: li il ,l!JI llfl. * Ili,/ .Iii,+ ii;l '.li Il ,,, ''1'"• "''• "'I ~'" "" '"' .,, ,.,,1 ig ; : , !Il· -~ :(, ~~ fi, lltl J,'Jtl ·Ml'f 0 JRJ: ,w, l ~- ,l ·\&~ ·• 111.l "li' fli Jl1 llifi'llllllilifr'"1 OC i() or UO 1.1.8/71Figura 9 Nazwa bialka (skrót uzywany w tekscie) Celowane peptydy do analizy MRM [nazwa genu, identyfikator U n i Prot] (Pozycja peptydu w bialku) Antygen karcynoembrionalny (CEA/CEACAMS) QIIGYVIGTQQATPGPAYSGR (78-98) [CEACAM5, P06731] SDLVNEEATGQFR (127-139} Dlugosc: 702 aa, Masa (Da): 76 795 NDTASYK {208-214} LQLSNDNR {369-376) INGIPQQHTQVLFIAK {629-644} Dipeptydylopeptydaza 4 (DPP4} FRPSEPHFTLDGNSFYI< (357-373) [DPP4, P27487] VLEDNSALDK (493-502) Dlugosc: 766 aa, Masa (Da): 88 279 LGTFEVEDQI EAAR (598-611) Kompleks replikacyjny DNA GINS3 bialko PSF3 LGAFFLER (43-50) (GINS3} SAGAETDNAVPQGSK (51-65) [GINS3, Q9BRX5] LELPLWLAK {66-74) Dlugosc: 216 aa, Masa (Da): 24 535 TVFSADPNVVDLH I< (98-111} IMDSSQNAYNEDTSALVAR (149-167} GQASQITASNLVQNYK (192-207) Czasteczka adhezyjna komórek nablonkowych LAVNCFVNNNR (34-44) (EPCAM} QCQCTSVGAQNTVICSK (45-61} [EPCAM, P16422] EKPYDSK (154-160} Dlugosc: 314 aa, Masa (Da): 34 932 TQNDVDIADVAYYFEI< (203-218) APEFSMQGLK (256-265) Enolaza swoista dla neuronów (NSE} GNPTVEVDLYTAK (16-28} [ENO2, P09104] AVDHINSTIAPALISSGLSVVEQEK (65-89} Dlugosc: 434 aa, Masa (Da): 47 269 YITGDQLGALYQDFVR (270-285) IEEELGDEAR (413-422) Peptyd uwalniajacy gastryne GRP (GRP} AVPLPAGGGTVLTK (23-36) [GRP, P07492] VPLPAGGGTVLTK (24-36) Dlugosc: 148 aa, Masa (Da): 16 213 STGESSSVSER (54-64) NLLGLI EAI< (83-91) NHQPPQPK (95-102) ALGNQQPSWDSEDSSNFK (103-120) LSAPGSQR (131-138) Receptor czynnika wzrostu hepatocytów (MET) EVFNILQAAYVSKPGAQLAR (312-331) [MET, P08581] GDLTIANLGTSEGR (448-461) Dlugosc: 1,390 aa, Masa (Da): 155 541 LNSELNIEWI< (903-912) Kalikreina 12 (KLK12} NSQPWQVGLFEGTSLR (31-46) [KLK12, Q9UKR0] LGEHSLSQLDWTEQIR (72-87) Dlugosc: 248 aa, Masa (Da): 26 734 Cytokeratyna 14 (CK-14} APSTYGGGLSVSSSR (42-56) [KRT14, P02533] DAEEWFFTK (301-309) Dlugosc: 472 aa, Masa (Da): 51 561 Cytokeratyna 16 (Cl(-16} APSTYGGGLSVSSR (42-55) [l Dlugosc: 473 aa, Masa (Da): 51 268 Cytokeratyna 17 (CK-17) ALEEANTELEVK (104-115) [KRT17, Q04695] AAPGVDLSR (243-251) Dlugosc: 432 aa, Masa (Da): 48 106 ASLEGNLAETENR (322-334) TIVEEVQDGI< (410-419) Antygen nowotworowy 125 (MUC-16/CA-125} DSLFINGYAPQNLSIR (14184-14199) [MUC16, Q8WXl7] ALFSS N LDPSL VEQVFLDK ( 14266-14284) Dlugosc: 14 507 aa, Masa (Da): 1519 175 VAIYEEFLR (14405-14413) Receptor typu fosfatazy bialkowo-tyrozynowej F YSIGGLSPFSEYAFR (374-388) (PTPRF) VLAFTAVGDGPPSPTIQVK (488-506) [PTPRF, P10586] TGEGFIDFIGQVHK (1811-1824) Dlugosc: 1 907 aa, Masa (Da): 212 8799/71Figura 9 cd. Antygen raka plaskonablonkowego SCC 1 VLHFDQVTENTTGI( (56-69) (SPB3/SCCA-1) FYQTSVESVDFANAPEESR (126-144) [SPB3, P29508] QYTSFHFASLEDVQAK (215-230) Dlugosc: 390 aa, Masa (Da): 44 565 GLVLSGVLHK (322-331) Antygen raka plaskonablonkowego SCC 2 VLH FDQVTENTTEK (56-69) (SPB4/SCCA-2) FYQTSVESTDFANAPEESR (126-144) [SPB4, P48594] QYNSFNFALLEDVQAI( (215-230) Dlugosc: 390 aa, Masa (Da): 44 854 ETCVDLHLPR (277-286) Peptydy wspólne dla SPB3, SPB4: FMFDLFQQFR SPB3, SPB4 (11-20) STDAYELK SPB3, SPB4 (95-102) INSWVESQTNEK SPB3, SPB4 (147-158) TNSILFYGR SPB3, SPB4 (378-386) Czynnik koniczyny 3 (TFF3) VDCGYPHVTPK (54-64) [TFF3, Q07654] GCCFDSR (70-76) Dlugosc: 94 aa, Masa (Da): 10 181 Ludzkie bialko z komórek nablonkowych najadrza CCSAGCATFCSLPNDK (61-76) (WFDC2/HE4) EGSCPQVNINFPQLGLCR (77-94) [WFDC2, Q14508] DQCQVDSQCPGQMK (95-108) Dlugosc: 124 aa, Masa (Da): 12 993 Deaminaza Adenozyny (ADAl) VELHVHLDGSIKPETILYYGR (12-32) [ADA, P00813] YSPHLLANSK (102-111) Dlugosc: 363 aa, Masa (Da): 40 764 LGHGYHTLEDQALYNR (236-251) Katepsyna B (CTSB) NGPVEGAFSVYSDFLLYK (246-263) [CTSB, P07858] Dlugosc: 339 aa, Mass (Da): 37 822 Interferon gamma (IFNG) YFNAGHSDVADNGTLFLGILK (37-57) [IFNG, P01579] IMQSQIVSFYFK (67-78) Dlugosc: 166 aa, Masa (Da): 19 348 LTNYSVTDLNVQR (118-130) AIHELIQVMAELSPAAK (132-148) Interleukina 33 (I L33) VLLSYYESQHPSNESGDGVDGK (159-180) [IL33, 095760] DFWLHANNK (191-199) Dlugosc: 270 aa, Masa (Da): 30 759 EHSVELHI( (200-207) TDPGVFIGVI( (234-243) DNHLALII( (244-251) VDSSENLCTENILFK (252-266) Perforyna 1 (PRFl) FVPGAWLAGEGVDVTSLR (37-54) [PRFl, P14222] LISNYGTHFIR (215-225) Dlugosc: 555 aa, Masa (Da): 61 377 ALSQYLTDR (363-371) LFFGGQELR (441-449) TSTVWDNNNPIWSVR (450-464) LDFGDVLLATGGPLR (465-479) Czlonek nadrodziny receptora czynnika martwicy VAETPTYPWR (30-39) nowotworów 6B (TNFRSF6B) LVCAQCPPGTFVQRPCR (47-63) [TNFRSF6B, 095407] DSPTTCGPCPPR (65-76) Dlugosc: 300 aa, Masa (Da): 32 680 VPGAEECER (205-213) LLQALEAPEGWGPTPR (232-247) LTELLGAQDGALLVR (261-275) Dehydrogenaza mleczanowa lancuch C LIEDDENSQCK (12-22) (LDHC) DLADELALVDVALDK (43-57) [LDHC, P07864] IVIVTAGAR (91-99) Dlugosc: 332 aa, Masa (Da): 36 311 SIIPAIVHYSPDCK (119-132) SAETLWNIQK (319-328)0/71al. Niepodlegiosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA WYNALAZKU NR P.440401 Klasyfikacja zgloszenia: G01N 33/68 (2006.01) Poszukiwania prowadzono w klasach: G01N Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: Epoquenet (Epodoc, Wpi, Em base, Medline, X-full); bazy UPRP, Google Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz. A PL414159 Al; INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKIEJ 1-29 AKADEMII NAUK, Warszawa, [PL]; 2017-03-27 A CN109490556A; BEIJING CHEST HOSPITAL CAPITAL 1-29 MEDICAL UNIVERSITY, Beijing [CN] ET AL.; 2019-03-19 A CN107064524A; BEIJING CHEST HOSPITAL CAPITAL 1-29 MEDICAL UNIVERSITY, Beijing [CN] ET AL.; 2017-08-18 A J. M. Parcel et al.: "Biomarkers of infection for the differentia! 1-29 diagnosis of pleura! effusions", European Respiratory Journal; 2009 34: 1383-1389 ? Dalszy ciai::i: wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okresbjacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za pDsiadajacy szc;'.ególne rnaczenie; E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po cbcie zgloszenia; L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwsze1\stwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytm,rnnego dokumentu lub z innego szczególnego powodu; O - dokument odnoszacy sie do ujmvnienia ustnego przez rnstosmvm1ie, 1,1,ystawienie lub uja\\Tiienie w inny sposnb: P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa: T dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowm1y w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku: X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany 1,1,ymlazek nie moze byc uwazany za no1,1;y luh nie moze hyc uwazany za posiadajacy poziom 1,1,ymlazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie: Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany 1,1,ymlazek nie moze hyc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym luh kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy: & - dokument nalezacv do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonala: dr Malgorzata Kozlowska Ekspert Koordynator Data: 28-10-2022 r. podpis: /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z dn. 16.02.2022 r.1/71