PL 443917 A1 2/8 Estrowa pochodna betulinowa, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie w przemysle kosmetycznym jako srodka antybakteryjnego Przedmiotem wynalazku jest nowa pochodna betulinowa oraz sposób wytwarzania nowej pochodnej 313,28-dikaproilo-lup-20(29)-en i jej zastosowanie jako srodka kosmetycznego. Ze stanu techniki (PL 218 589 B 1) znane sa nowe mono- i di estry betuliny z aminokwasami potencjalnie przeznaczone do zastosowan medycznych oraz sposób wytwarzania tych zwiazków. Dokument ujawnia sposób wytwarzania mono- oraz diestrów betuliny z aminokwasami o wzorze ogólnym 1, polegajacy na tym, ze równowaznik molowy betuliny poddaje sie reakcji z 1-4 równowaznikami molowymi aminokwasu z zablokowana grupa aminowa (Bac) i wolna grupa karboksylowa, korzystnie wybranego z grupy obejmujacej takie aminokwasy jak glicyna, alanina, fenyloalanina, leucyna, metionina lub lizyna oraz 1-4 równowaznikami molowymi odczynnika sprzegajacego w postaci 1, 1 ' karbonylodiimidazolu (COi). Reakcje prowadzi sie korzystnie przez 24-48 godzin w temperaturze wrzenia w rozpuszczalniku, w postaci bezwodnego tetrahydrofuranu (THF). Korzystnie utrzymuje sie przy tym calkowita ilosc rozpuszczalnika w granicach od 2 do 5 ml na 0.25 mM betulinowego substratu. Dokument PL 216 420 B1 ujawnia sposób otrzymywania nowych diestrów betuliny ze sprzezonymi kwasami linolowymi, o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku w opisie, gdzie R oznacza reszte kwasu (9c, 11 t)-oktadekadienowego albo reszte kwasu (10t, 12c)-oktadekadienowego polegajacy na tym, ze mieszanine sprzezonych kwasów linolowych poddaje sie estryfikacji z betulina za pomoca czynnika sprzegajacego w obecnosci 4-dimetylamino-pirydyny w chlorku metylenu. PL 443917 A1 3/8 Przedmiotem wynalazku jest estrowa pochodna betulinowa 313,28-dikaproilo-lup- (29)-en o wzorze 1. 48 ~o 50 47 45 43 l2 -1 33 , ....... 21 20 wzór1 O 36 41 19 35~7 39 42 \ 38 o 40 Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób wytwarzania nowej pochodnej betulinowej 313,28-dikaproilo-lup-20(29)-enu o wzorze 1, w którym betuline poddaje sie reakcji z uzyciem chlorku kwasu kapronowego jako reagenta i bezwodnej pirydyny, chlorku metylenu jako srodowiska reakcji, przy czym reakcje prowadzi sie w temperaturze pokojowej. Korzystnie, po zakonczeniu procesu odparowuje sie rozpuszczalniki. Korzystnie, przebieg reakcji kontroluje sie przy wykorzystaniu chromatografii cienkowarstwowej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnej betuliny 313,28- dikaproilo-lup-20(29)-enu w przemysle kosmetycznym jako srodka antybakteryjnego. Przyklad 1 W kolbie Erlenmeyera ze szlifem umieszczono 0.5 g (1.13 mmol) betuliny, która rozpuszczano w 3 ml bezwodnej pirydyny i 20 ml chlorku metylenu, i dodano 2 ml (15.19 mmol) chlorku kwasu kapronowego. Powstala mieszanine PL 443917 A1 4/8 zatkano korkiem szklanym i pozostawiono na 24 h. Juz po chwili bezbarwny roztwór zmienial zabarwienie na zólty, nastepnie pomaranczowy i dalej czerwony. Po 5 dobach nastapilo praktycznie calkowite przereagowanie co stwierdzono za pomoca TLC. Do kolby z roztworem dodano okolo 20 ml chlorku metylenu, 1 O ml MeOH i 0.1 g wegla aktywnego. Po intensywnym zamieszaniu, zawartosc kolby przesaczono przez zwitek waty z zelem krzemionkowym. Bezbarwny roztwór odparowano pod zmniejszonym cisnieniem (obrotowa wyparka prózniowa) na wrzacej lazni wodnej. Pozostalosc rozpuszczono w cykloheksanie i naniesiono na kolumne wypelniona 20 tlenku glinu (typ 504 C, Fiuka) i 3 Florsilu (Fiuka). Kolumne przemyto cykloheksanem (50ml) i eluowano zwiazek mieszanina heksan-octan etylu 20 : 1. Po polaczeniu odpowiednich frakcji (na podstawie TLC) i odparowaniu rozpuszczalnika uzyskano czysty zwiazek. Wydajnosc syntezy wynosi 95% (po oczyszczeniu ok. 78% ). Czystosc po syntezie jest okolo 64%, do badan biologicznych pochodna nalezy oczyscic na kolumnie wypelnionej 20 tlenku glinu (typ 504 C, Fiuka) i 3 Florsilu (Fiuka). W syntezie z wykorzystaniem bezwodnika propionowego otrzymuje sie produkt o wydajnosc 83% (po oczyszczaniu ok. 46%). Otrzymany osad, który odsaczono na lejku Buchnera, przemyto obficie woda i kilkakrotnie przekrystalizowano z mieszaniny metanol-chlorek metylenu 4 : 1. SCHEMAT REAKCJI _i( OH -4 .. chlorek kapriolu o~ o HO Produkt otrzymany powyzszym sposobem posiada nastepujace wlasciwosci fizyczne i spektralne: PL 443917 A1 /8 Wzór sumaryczny: C42H70Q4 Masa molowa: 639.00 1 H NMR (600 MHz, CDCh, J, ppm) 4.46 (dd, lH, J = 10.22; J = 5.64; przy C-3); 2.44 (td, lH, J = 10.76; J= 5.83; przy C-19); 3.82 i 4.25 (d, lH, J = 11.28; przy C-28); 4.58 i 4.68 (m, lH; przy C-29); 1.68 (s, 3H, przy C-30); 13 C NMR (150 MHz, CDCh, J, ppm) 174.59; 173.84; 150.18; 109.86; 80.54; 62.49; 55.34; 50.23; 48.74; 47.71; 46.37; 42.65; 40.83; 38.32; 37.81; 37.52; 37.04; 34.81; 34.57; 34.48; 34.08; 31.35; 31.33; 29.76; 29.54; 27.94; 27.00; 25.11; 24.84; 24.75; 23.71; 22.33; 20.77; 19.10; 18.14; 16.56; 16.15; 16.01; 14.72; 13.9. Przyklad 2 Aktywnosc pochodnej betuliny Dla powyzszej pochodnej betuliny zostala wyznaczona wartosc Minimalnego Stezenia Hamujacego (MIC). Szczep gronkowca zlocistego Staphylococcus aureus ATCC11632 zostal zakupione z kolekcji Polskiej Akademii Nauk (Wroclaw, Polska). Odczynniki chemiczne pochodzily z Sigma Aldrich Co. (St. Louis, USA), a podloza mikrobiologiczne z firmy Biocorp, Polska. Szczepy bakteryjne byly przechowywane na skosach z agarem odzywczym i w celu przeprowadzania oznaczen przesiewane na zestalone podloze Muellera Hintona. 24-godzinne hodowle bakteryjne byly zawieszane w bulionie Muellera Hintona, a gestosc zawiesiny dostosowywana do standardu McFarlanda 0,5. Inkubacje prowadzono w minimum 3 powtórzeniach z zastosowaniem odrebnych hodowli bakteryjnych na mikroplytkach (TPP, Szwajcaria). Wyjsciowa gestosc zawiesiny bakteryjnej wynosila 10 jtk/ml. Plytki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C na wytrzasarce obrotowej ELMI DTS-4 Skyline. Wyniki odczytywano przy dlugosci fali 650 nm z zastosowaniem czytnika mikroplytek Tecan z oprogramowaniem Magellan. MIC byl zdefiniowany jako najnizsze stezenie badanego zwiazku, calkowicie hamujace wzrost szczepu bakteryjnego. Przeprowadzone przez nas badania pozwolily na wykazanie aktywnosci antybakteryjnej badanej pochodnej betuliny wzgledem szczepu gronkowca zlocistego (patogen skóry), zalecanego przez PAN do tego typu oznaczen mikrobiologicznych. Juz dodatek 50 µg/ml badanej pochodnej do próby inkubacyjnej pozwalal na obserwowalne zahamowanie wzrostu szczepu (do PL 443917 A1 6/8 % ), a jego stezenie wynoszace 125 µg/m L ograniczalo wzrost o polowe wzgledem próby kontrolnej. Wartosc MIC pochodnej w powyzszych warunkach inkubacyjnych wynosila 250 µg/ml. Jest to znaczacy wzrost aktywnosci w stosunku do substancji wyjsciowej - betuliny, która nie posiadala aktywnosci antybakteryjnej w tych warunkach inkubacyjnych. Produkty zawierajace betuline, kwas betulinowy lub ogólnie ujety 'ekstrakt z kory brzozowej' sa obecnie powszechne w przemysle kosmetycznym ze wzgledy na wykazywane wlasciwosci antyseptyczne i wspomagajace regeneracje tkanek. Charakterystyka antybakteryjna opisywanej pochodnej betuliny wskazuje równiez na potencjalne korzysci jej zastosowania - efektywnosc antybakteryjna wzgledem gronkowca zlocistego pozwoli na organicznie zmian patogennych skóry powodowanych przez te bakterie. Ponadto dzieki aktywnosci bakteriostatycznej pochodna bedzie mogla pelnic funkcje konserwantu, ograniczajac wzrost szczepów bakteryjnych, w niepozadany sposób nanoszonych do stosowanych kosmetyków. PL 443917 A1 7/8 Zastrzezenia patentowe 1. Estrowa pochodna betulinowa 313,28-dikaproilo-lup-20(29)-en o wzorze 1. 48 ,n ,o ~ ~o 50 47 45 43 l2 -1 33 , ....... 21 20 wzór1 O 36 41 19 35~7 39 42 \ 38 o 40 2. Sposób wytwarzania nowej pochodnej betulinowej 313,28-dikaproilo-lup- (29)-enu znamienny tym, ze betuline poddaje sie reakcji z uzyciem chlorku kwasu kapronowego jako reagenta i bezwodnej pirydyny, chlorku metylenu jako srodowiska reakcji, przy czym reakcje prowadzi sie w temperaturze pokojowej. 3. Sposób wedlug zastrz. 2 znamienny tym, ze po zakonczeniu procesu odparowuje sie rozpuszczalniki. 4. Sposób wedlug zastrz. 2 znamienny tym, ze przebieg reakcji kontroluje sie przy wykorzystaniu chromatografii cienkowarstwowej. . Zastosowanie pochodnej betuliny 313,28-dikaproilo-lup-20(29)-enu w przemysle kosmetycznym jako srodka antybakteryjnego. PL 443917 A1 8/8 al. Niepod leglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NRP.443917 Klasyfikacja zgloszenia: C07J 63/00, A61K 31/56, A61P 31/04 Podklasy w któiychprowadzono poszukiwania: C07J A61K A61P Bazy komputerowe w których prowadzono poszukiwania: EPODOC WPI bazy UPRP Kategoria dokumentu A A A Dokumenty - z podana identyfikacja PL 393 254 Al (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU, Wroclaw , PL) 23-05-2011 PL 393 257 Al (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU, Wroclaw , PL) 23-05-2011 PL 434 161 Al (UNIWERSYTET MEDYCZNY IM.PIASTÓW SLASKICH WE WROCLAWIU , Wroclaw , PL) 06-12-2021 D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, Odniesienie do zastrz. 1-5 1-5 1-5 L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo(-wa) , lub przytocw ny w celu ustalenia daty publikacji innego cytowanego dokumentu lub z innego szczególnego powodu, O - dokument odnoszacy sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za nowy lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Andrzej Jurkiewicz Ekspert Data: 27.09.2023 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 28.02.2023 r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL PL