PL443929A1 - Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, kompozycja go zawierająca, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujące ten szczep - Google Patents

Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, kompozycja go zawierająca, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujące ten szczep Download PDF

Info

Publication number
PL443929A1
PL443929A1 PL443929A PL44392923A PL443929A1 PL 443929 A1 PL443929 A1 PL 443929A1 PL 443929 A PL443929 A PL 443929A PL 44392923 A PL44392923 A PL 44392923A PL 443929 A1 PL443929 A1 PL 443929A1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
strain
weissella
cibaria
strains
kkp
Prior art date
Application number
PL443929A
Other languages
English (en)
Other versions
PL246440B1 (pl
Inventor
Magdalena Kowalczyk
Tawakalt AYODELE
Jakub Boreczek
Joanna RADZIWIŁŁ-BIEŃKOWSKA
Przemysław Sałański
Małgorzata ŁOBOCKA
Olha KOSTIUCHENKO
Jacek Bardowski
Original Assignee
Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk filed Critical Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk
Priority to PL443929A priority Critical patent/PL246440B1/pl
Priority to KR1020257030982A priority patent/KR20250156133A/ko
Priority to EP24764264.8A priority patent/EP4673528A1/en
Priority to CN202480016216.9A priority patent/CN121057809A/zh
Priority to JP2025550146A priority patent/JP2026509356A/ja
Priority to PCT/PL2024/050016 priority patent/WO2024181878A1/en
Publication of PL443929A1 publication Critical patent/PL443929A1/pl
Publication of PL246440B1 publication Critical patent/PL246440B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/06—Products with modified nutritive value, e.g. with modified starch content
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/047—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A61K31/721—Dextrans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C12P19/08—Dextran
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract
    • A23V2200/3204—Probiotics, living bacteria to be ingested for action in the digestive tract
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy szczep bakterii Weissella cibaria zdeponowany jako KKP 2094p, kompozycja go zawierająca, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania jako lek, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujące ten szczep szczególnie do zapobiegania i/lub leczenia, korzystnie leczenia nowotworu jelita, korzystnie nowotworu jelita grubego.

Description

PL 443929 A1 2/34 Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, kompozycja go zawierajaca, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujace ten szczep DZIEDZINA TECHNIKI Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii fermentacji mlekowej Weissella cibaria, zdeponowany w dniu 6 lutego 2023 (06.02.2023) jako KKP 2094p w kolekcji KKP tj. w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego (Instytut Biotechnologii Przemyslu Rolno­ Spozywczego im. prof. Waclawa Dabrowskiego - Panstwowy Instytut Badawczy w Warszawie, Polska) (IAFB, Culture Collection of Industrial Microorganisms, prof. Waclaw Dabrowski, IAFB-SRI). Przedmiotem wynalazku jest równiez kompozycja zawierajaca Weissella cibaria KKP 2094p, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujace ten szczep szczególnie do zapobiegania i/lub leczenia, korzystnie leczenia nowotworu jelita, korzystnie nowotworu jelita grubego.
Biomasa szczepu Weissella cibaria KKP 2094p sluzy do biotechnologicznego wytwarzania dekstranu, do prowadzenia zakwasów oraz do zastosowania jako probiotyk. Wyselekcjonowany pod katem optymalnego efektu technologicznego w biotechnologicznej produkcji dekstranu, korzystnych wlasciwosci technologicznych do produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie oraz pod katem korzystnych wlasciwosci prozdrowotnych do zastosowan probiotycznych i zdolnosci do przetrwania w warunkach imitujacych przewód pokarmowy.
Przedmiotem wynalazku jest równiez zastosowanie bakteryjnego szczepu Weissella ci baria KKP 2094p do wytwarzania dekstranu, do konstruowania kultur starterowych do produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie oraz jako szczep probiotyczny o korzystnych wlasciwosciach w srodowisku skóry, oraz przewodu pokarmowego. Szczep Weissella cibaria KKP 2094p wykazuje wysoka wydajnosc produkcji dekstranu, aktywnosci przeciwdrobnoustrojowe i przeciwnowotworowe, wysoka opornosc na sole zólciowe i niskie pH, mozna go stosowac do biotechnologicznego wytwarzania dekstranu, jako szczep o korzystnych wlasciwosciach technologicznych do produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie oraz jako szczep probiotyczny. PL 443929 A1 3/34 STAN TECHNIKI Po raz pierwszy bakterie z rodzaju Weissella odkryto w 1993 roku w fermentowanych kielbasach. Rodzaj ten zalicza sie do rodziny Lactobacillaceae, która nalezy do znanej grupy bakterii fermentacji mlekowej [z ang. lactic acid bacteria (LAB)] (Collins i wsp., 1993). Weissella spp. sa Gram-dodatnie, katalazo-ujemne, ich komórki o morfologii ziarniaków lub paleczek nie tworza endospor. Szczepy i gatunki Weissella od dawna sa izolowane z róznych srodowisk i maja rózne zastosowania aplikacyjne. Fermentowane produkty spozywcze, takie jak jogurt, zakwas i kimchi, sa jednymi ze zródel, z których mozna wyizolowac bakterie Weissella (Mun i Chang, 2020; Valerio i wsp., 2020). Szczepy Weissella odgrywaja kluczowa role w ksztaltowaniu smaku i tekstury zywnosci podczas fermentacji.
Wiekszosc literatury naukowej dotyczacej Weissella spp., w szczególnosci Weissella confusa i Weissella cibaria koncentruje sie na wytwarzaniu i charakterystyce egzopolisacharydów (EPS) (Hu i Ganzle, 2018).
W. confusa i W. cibaria moga wytwarzac dekstrany o duzych masach. Te polisacharydy zwiekszaja elastycznosc pieczywa, a ich zastosowanie w wypiekach bezglutenowych wydaje sie obiecujace (Wolter i wsp., 2014). W produktach kosmetycznych sa stosowane jako srodki nawilzajace i modyfikatory reologii (Yildiz i Karatas, 2018). Dekstran dziala kojaco, poprawia nawilzenie skóry. Jest stabilizatorem emulsji.
Zatrzymuje wilgoc na powierzchni skóry i zapobiega wysychaniu kosmetyków.
EPS produkowane przez LAB zyskaly popularnosc na przestrzeni lat ze wzgledu na ich mozliwe cechy funkcjonalne i technologiczne (Lynch i wsp., 2018). Wykazano, ze Weissella i Leuconostoc wytwarzaja znaczne ilosci EPS wsród LAB (Kavitake i wsp., 2016). W szczególnosci rodzaj Weissella jest odpowiedzialny za znaczna produkcje dekstranu (Kim i wsp., 2008). Weissella hellenica, W. confusa i W. cibaria to producenci EPS z rodzaju Weissella, który wytwarza wiele EPS o róznej strukturze i skladzie chemicznym.
Bakterie z rodzaju Weissella wykorzystuja szlak syntezy polisacharydów pozakomórkowych do produkcji glukanu, dekstranu, lewanu, galaktanu i fruktanu, które sa homo lub heteropolisacharydami (Zhou i wsp., 2018). Na produkcje EPS wplywa wiele cukrów, które obejmuja monosacharydy, takie jak glukoza, mannoza, galaktoza, fruktoza i oligosacharydy: laktoza; sacharoza, rafinoza. Wyjatkowe cechy technologiczne EPS LAB sprawiaja, ze zajmuja one istotna pozycje w przemysle spozywczym jako skuteczne emulgatory, zageszczacze, stabilizatory lub polepszacze tekstury (Han i wsp., 2016; Zhang i wsp., 2018). Buksa i wsp. wykazali ostatnio, ze 1,5% udzial dekstranu ogranicza tworzenie sie skrobi opornej w pastach skrobiowych podczas przechowywania. Prace te dostarczaja nowych informacji na temat utrudniania tworzenia opornej skrobi dzieki zastosowaniu EPS, które mozna wydajnie wytwarzac w zakwasie, poprawiajac w ten sposób wlasciwosci chleba na zakwasie (Buksa i wsp. 2021).
EPS maja równiez niesamowite wlasciwosci biologiczne poprzez dzialanie prebiotyczne, przeciwutleniajace, przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe i immunomodulujace (Badel i wsp., 2011; Saadat i wsp., 2019; Xu i wsp., 2017). Aby zostac sklasyfikowanym jako prebiotyk, substancje nie podlegajace trawieniu, w tym m.in. EPS musza bardziej stymulowac wzrost bakterii probiotycznych niz PL 443929 A1 4/34 bakterii obecnych w jelicie. Wykazano, ze dekstran wytwarzany przez W. cibaria stymuluje wzrost L. plantarum, L. acidophilus, 8. anima/is, 8. bifidum i 8. infantis bardziej niz f. coli i f. aerogenes (Baruah i wsp., 2016). Ta aktywnosc potwierdzila klasyfikacje dekstranu jako zwiazku prebiotycznego.
Dane literaturowe dotyczace róznych szczepów bakterii mlekowych wskazuja, iz ilosc produkowanych EPS jest zwykle wyzsza niz 1 g/I (Torino i wsp., 2015; Vasanthakumari i wsp., 2015) a w przypadku kilku szczepów osiaga wartosc okolo 10 g/I (Zeidan i wsp., 2017). Najwyzsza wydajnosc produkcji dekstranu odnotowano jako 24,8 g/I dla szczepu W. cibaria 27 wyizolowanego z kimchi (Kavitake i wsp., 2020).
Przeprowadzona ostatnio analiza EPS wytwarzanych przez wybrane cztery szczepy Weissella confusa/cibaria wykazala róznice w wydajnosci produkcji EPS w granicach od 3.2 g/I do 47.1 g/I i pozwolila na okreslenie rodzaju produkowanego EPS jako dekstran (Buksa i wsp. 2021).
Dostepnosc nowych szczepów LAB o wlasciwosciach pro-technologicznych ma wielkie znaczenie dla przemyslu. Dlatego badacze koncentruja sie na poszukiwaniu dzikich szczepów ze zródel naturalnych do projektowania nowych, interesujacych przemyslowo starterów, kultur pomocniczych lub bio-ochronnych, a takze probiotyków. Niedawne postepy w badaniach nad mikrobiomem, przyczynily sie do wzrostu zainteresowania i utorowaly droge do badania mechanizmów dzialania probiotyków (Tao i wsp., 2017).
Oprócz bakterii z dawnego rodzaju Lactobacillus znanych jest wiele innych niepatogennych szczepów LAB o renomowanym statusie GRAS (z ang. Generally Recognized as Safe), dostarczanym przez FDA w USA lub statusie QPS (z ang. Qualified Presumption of Safety) w Europie, które moga byc brane pod uwage przy wyborze nowych szczepów probiotycznych. Istnieje coraz wiecej dowodów na to, ze wybrane szczepy Weissella sp., które odgrywaja wazna role w wielu procesach fermentacji przemyslowej i spozywczej, przedstawiaja aktywnosc probiotyczna. Wiadomo, ze bakterie z rodzaju Weissella zamieszkuja jelita kregowców, m.in ludzi (Lee i wsp., 2012). Dotychczas stwierdzono, ze bakterie te wplywaja na przepuszczalnosc jelit (Prado i wsp., 2020), zmniejszaja depresje (Sandes i wsp., 2020), regeneruja komórki nablonka jelit (Prado i wsp., 2020), wplywaja na metabolizm (Elshaghabee i wsp .. , 2020) i moga zabijac szkodliwe bakterie (Dey i Kang, 2020). Ponadto wiadomo równiez, ze niektóre szczepy Weissella sp. maja korzystny wplyw na zdrowie czlowieka, m.in. na utrzymanie zdrowej jamy ustnej (Kang i wsp. 2019), leczenie atopowego zapalenia skóry i niektórych nowotworów (Teixeira i wsp., 2021), wykazuja dzialanie antytoksyczne, przeciwnowotworowe czy immunomodulujace (Yu i wsp., 2019a; 2019b; Le i wsp. 2020), ale do tej pory jest to grupa LAB, która nie znalazla sie na liscie gatunków o statusie QPS opublikowanej przez EFSA (Europejski Urzad ds. Bezpieczenstwa Zywnosci). Zastosowanie tych bakterii jako probiotyków wymaga przeprowadzenia analiz bezpieczenstwa (EFSA, 2018). Jest to powodem dotychczas ograniczonego wykorzystania tej grupy LAB jako komercyjne kultury starterowe w przemysle spozywczym czy jako szczepy probiotyczne.
Aby mikroorganizmy mogly byc stosowane jako probiotyki musza one byc niepatogenne i niewirulentne i nie moga posiadac genów opornosci na antybiotyki, w szczególnosci na ruchomych elementach PL 443929 A1 /34 genetycznych. Oprócz tego mikroorganizmy te powinny charakteryzowac sie cechami funkcjonalnymi wplywajacymi korzystnie na zdrowie gospodarza. Zdolnosc do zycia i przetrwania w warunkach przewodu pokarmowego, szczególnie przy wysokich stezeniach soli zólciowych i niskim pH, a takze adhezja do sluzu, macierzy zewnatrzkomórkowej lub komórek nablonka jelita to najwazniejsze cechy probiotyków wspierajace ich dzialanie, (Lee i wsp., 2015). W. cibaria moze wytwarzac kilka substancji o dzialaniu przeciwdrobnoustrojowym. Udokumentowano, ze szczep probiotyczny do stosowania w jamie ustnej (W. cibaria CMU) wykazywal dzialanie przeciwbakteryjne przeciwko patogennym bakteriom Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, oraz Fusobacterium nucleatum, zwiazane ze zdolnoscia do wytwarzania kwasów organicznych, H2O2, kwasów oleinowych i bialek, takich jak N-acetylomuraminaza (Lim i wsp., 2018). W innych badaniach, ten sam szczep (W. cibaria CMU) jak równiez szczep W. cibaria CMSl wykazaly dzialanie przeciwdrobnoustrojowe oraz hamujace tworzenie biofilmu przez szczepy bakterii chorobotwórczych powodujacych zakazenia górnych dróg oddechowych takich jak: Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis (Yeu i wsp., 2021).
Badania Patrone i wsp. (2021) wykazaly, ze supernatanty z hodowli szczepów W. cibaria SP7 i SP19 hamowaly wzrost Escherichia coli ATCC 25,922 i Salmonella enterica UC3605 co bylo zwiazane z niskim pH. Szczepy W. cibaria nie tylko wykazuja dzialanie antagonistyczne wobec bakterii chorobotwórczych, ale równiez moga wykazywac zwiekszona zdolnosc do skutecznego obnizania poziomu infekcji grzybiczych (Ndagano i wsp., 2011; lan i wsp., 2012).
Obecnie problem narastajacej antybiotykoopornosci wsród wielu patogenów bakteryjnych wymaga nowych strategii wykrywania opracowywania antybiotyków lub innych srodków przeciwdrobnoustrojowych stanowiacych alternatywe dla antybiotyków konwencjonalnych. Oporny na wiele antybiotyków 5. aureus jest jedna z najczestszych przyczyn ciezkich zakazen szpitalnych, a przewód pokarmowy jest waznym zródlem jego przenoszenia (Boyce i wsp., 2007; Onanuga i Temedie, 2011).
Jednoczesnie, gronkowce zostaly uznane za patogeny odpowiedzialne za biegunke zwiazana ze stosowaniem antybiotyków u ludzi (Boyce i Havill, 2005). Kolonizacja czlowieka przez fakultatywne patogeny bakteryjne, takie jak 5. aureus, stanowi glówny czynnik ryzyka infekcji inwazyjnych. W ostatnich latach wzrasta liczba infekcji powodowanych zarówno przez 5. aureus, jak i Staphylococcus epidermidis oraz inne koagulazo-negatywne gronkowce. Bakterie te moga byc przyczyna zapalenia stawów, sciegien, wsierdzia, kosci, pluc, ukladu moczowego, protez stawowych, zastawek serca, kateterów, zatruc pokarmowych i infekcji skóry, takich jak: liszajec zakazny, zapalenie mieszków wlosowych, czyraki, gronkowcowe zluszczajace zapalenie stawów (zespól SSSS - staphylococcal scalded skin syndrome), ale moga takze wtórnie infekowac zmiany skórne, np. owrzodzenia (Sokolowska-Wojdylo, 2021). W tym kontekscie bardzo pozadane jest m.in. opracowanie preparatów bazujacych na skladnikach naturalnych, które utrzymaja stan higieny skóry poprzez zabezpieczenie jej przed kolonizacja przez chorobotwórcze bakterie bez zaburzania skladu naturalnej, komensalnej mikrobioty oraz doustnych probiotyków PL 443929 A1 6/34 ograniczajacych rozwój gronkowców w przewodzie pokarmowym ludzi, a tym samym minimalizujacych ryzyko przenoszenia wieloantybiotykoopornych patogenów z jednego z ich glównych rezerwuarów w srodowisku.
Z publikacji opisu patentowego PL238153B1 znana jest kultura starterowa zawierajaca szczepy Lactobacillus plantarum B/00117, Lactobacillus plantarum B/00118 i Lactobacillus brevis opisana jako Zestaw 11 stosowana do wytworzenia zakwasów z maki razowej i zytniej oraz wypieku pieczywa z jej wykorzystaniem.
UJAWNIENIE WYNALAZKU W swietle opisanego stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest przezwyciezenie wskazanych niedogodnosci i dostarczenie wyselekcjonowanego nowego szczepu bakterii fermentacji mlekowej z rodzaju Weissella sp. o wysokiej wydajnosci produkcji EPS o korzystnych wlasciwosciach technologicznych do produkcji zakwasów i pieczywa, jednoczesnie posiadajacego dodatkowe korzystne wlasciwosci prozdrowotne do zastosowan probiotycznych i przeciwnowotworowych, zdolnosc do przetrwania w warunkach imitujacych przewód pokarmowy oraz potwierdzone bezpieczenstwo stosowania (dopuszczalny poziom opornosci na antybiotyki, brak genów opornosci na antybiotyki, brak genów wirulencji).
Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakterii Weissella cibaria, zdeponowanego w KKP (IAFB - Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego w Warszawie, Polska) pod nr depozytu KKP 2094p.
Wynalazek równiez dotyczy kompozycji zawierajacej nowy szczep bakterii Weissella cibaria, zdeponowany w KKP (IAFB - Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego w Warszawie, Polska) pod nr depozytu KKP 2094p.
Kompozycja jest korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ponadto dopuszczalny farmaceutycznie nosnik, przy czym korzystnie kompozycja jest w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego.
Wynalazek ponadto dotyczy kompozycji farmaceutycznej do zastosowania jako lek zawierajacej szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku oraz dopuszczalny farmaceutycznie nosnik do zastosowania jako lek.
Korzystnie kompozycja farmaceutyczna do zastosowania jako lek jest do zastosowania do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita, korzystnie do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita grubego, najkorzystniej gruczolakoraka jelita grubego. PL 443929 A1 7/34 Wynalazek dotyczy równiez suplementu diety zawierajacego szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku, przy czym suplement diety korzystnie jest w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego.
Wynalazek dotyczy równiez preparatu probiotycznego zawierajacego szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku, przy czym preparat probiotyczny korzystnie ponadto zawiera substancje prebiotyczne, korzystnie wybrane z oligosacharydów, polisacharydów, fruktooligosacharydów, laktulozy, inuliny, skrobi opornej, celulozy, hemicelulozy i pektyn, przy czym preparat korzystnie ponadto zawiera postbiotyki, korzystnie postbiotyki wybrane sa z krótkolancuchowych kwasów tluszczowych, enzymów, lipopolisacharydów, kwasów tejchojowych, witamin, kwasu maslowego, octanu, propionianu, dipeptydu muramilu, indlu, kwasu teichowego, laktocepin.
Preparat probiotyczny jest korzystnie w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego.
Wynalazek dotyczy równiez bakteryjnej kultury starterowej do wyrobu pieczywa, w której sklad wchodzi szczep Weissella cibaria wedlug wynalazku.
Wynalazek dotyczy równiez zakwasu do wyrobu pieczywa, który zawiera bakteryjna kulture starterowa wedlug wynalazku.
Wynalazek dotyczy równiez sposobu wytwarzania pieczywa, który obejmuje etap dodawania bakteryjnej kultury starterowej wedlug wynalazku i/lub zakwasu wedlug wynalazku.
Wynalazek dotyczy równiez pieczywa zawierajacego bakteryjna kulture starterowa wedlug wynalazku i/lub zakwas wedlug wynalazku lub wytworzonego z ich wykorzystaniem lub ich mieszaniny.
Wynalazek dotyczy równiez sposobu mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, który obejmuje etap, w którym szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku hoduje sie na plynnym podlozu bez dekstrozy (bez glukozy) z dodatkiem sacharozy, organicznym zródlem azotu zawierajacym aminokwasy i krótkie peptydy, witaminy z grupy B i sole mineralne.
W korzystnym sposobie hodowle prowadzi sie na podlozu MRS (bulion DeMan-Rogosa-Sharpe) lub innym podlozu dla bakterii mlekowych, korzystnie z dodatkiem 5-10%±2 wag. sacharozy.
Wynalazek dotyczy równiez preparatu bakteryjnego zawierajacego szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku do zastosowania jako skladnik czynny w probiotyku, preparacie terapeutycznym, zywnosci funkcjonalnej, suplemencie diety, do zastosowania jako skladnik aktywny leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita, korzystnie nowotworu jelita grubego. PL 443929 A1 8/34 Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku jako dodatku funkcjonalnego w zywnosci funkcjonalnej, dodatku funkcjonalnego do napoju spozywczego, jako skladnika aktywnego preparatu probiotycznego, preparatu bakteryjnego, suplementu diety, kompozycji farmaceutycznej.
Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku w przemysle spozywczym jako emulgator, zageszczacz, stabilizator lub polepszacz tekstury produktu spozywczego.
Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku do mikrobiologicznego wytwarzania egzopolisacharydów (EPS), korzystnie dekstranu.
Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku i/lub bakteryjnej kultury starterowej wedlug wynalazku do wytwarzania zakwasu do pieczywa.
Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku i/lub zakwasu do wyrobu pieczywa wedlug wynalazku do wytwarzania pieczywa.
Szczep Weissella cibaria IB83394 zdeponowany jako KKP 2094p bedacy przedmiotem wynalazku wykazuje korzystne wlasciwosci technologiczne i funkcjonalne stanowi przewage nad obecnie znanymi i wykorzystywanymi szczepami. Szczep ten, podobnie jak wczesniej opisany szczep Weissella confusa/cibaria EPS_3 - IB83326 (Buksa i wsp. 2021) o duzej wydajnosci produkcji EPS wyizolowany zostal z zakwasu piekarskiego i na podstawie uzyskanych przez twórców analogicznych wyników posiada zdolnosc wytwarzania EPS (dekstranu) na poziomie 50 g/I (dane niepublikowane). Ilosc EPS wytwarzanego przez szczep IB83326 oraz IB83394, jest wyzsza od opisywanych dla innych szczepów bakterii mlekowych z wyjatkiem szczepu W. confusa VP30 produkujacego dekstran na poziomie 60 g/I (Jin i wsp., 2019).
Jednakze nalezy podkreslic, ze wydajnosc surowego EPS dla szczepu VP30 nie byla porównywalna ze wzgledu na znaczna zawartosc zanieczyszczen. Opisane wyzej szczepy W. cibaria 27 i W. confusa VP30 o wysokiej wydajnosci produkcji dekstranu zostaly wyizolowane odpowiednio z kimchi oraz z kalu dziecka i moga nie byc przystosowane do srodowiska zakwasów piekarskich, w przypadku którego wykazano wczesniej korzystny wplyw EPS na jakosc wytwarzanego z zakwasu pieczywa. Oprócz zdolnosci do produkcji dekstranu szczep W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) charakteryzuje sie równiez innymi wykazanymi funkcjonalnymi wlasciwosciami (wlasciwosciami probiotycznymi): aktywnoscia przeciwdrobnoustrojowa i przeciwnowotworowa, wyjatkowa wysoka opornoscia na sole zólciowe i niskie pH w porównaniu do innych badanych przez twórców szczepów Weissella confusa/cibaria wyizolowanych z róznych zródel oraz obecnoscia wszystkich genów szlaku produkcji witaminy B12 i K2 jak równiez genów PL 443929 A1 9/34 szlaku odzyskiwania witaminy Bl. Zaden z opisanych w literaturze probiotycznych szczepów Weissella cibaria, nie wykazuje az tak wysokiej wydajnosci produkcji dekstranu, aktywnosci przeciwdrobnoustrojowej i przeciwnowotworowej oraz uzytecznych wlasciwosci fizykochemicznych jak wyselekcjonowany szczep W. ci baria IBB3394 (KKP 2094p) wedlug wynalazku. Ponadto, nalezy podkreslic, iz w przypadku W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) wedlug wynalazku w analizie probiogenomicznej wykazano opornosc na antybiotyki na poziomie zgodnym z wartosciami rekomendowanymi przez EFSA, jednoczesnie potwierdzajac brak genów opornosci na antybiotyki oraz brak genów wirulencji. Wykazano równiez brak cytotoksycznosci wytwarzanego przez szczep W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) egzopolisacharydu na badane linie komórkowe: ludzkiego nablonka jelitowego (gruczolakoraka jelita grubego) Caco-2 (ATCC HTB-37) i ludzkich embrionalnych komórek nablonka nerki HEK293 (ATTC CRL- 1573) oraz wykazano wlasciwosci przeciwnowotworowe W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p), szczególnie wobec raka jelita, szczególnie jelita grubego.
Istota wynalazku jest szczep bakterii fermentacji mlekowej Weissella cibaria IBB3394 (KKP 2094p) o wysokiej wydajnosci produkcji egzopolisacharydu, aktywnosci przeciwdrobnoustrojowej przeciwnowotworowej, doskonalych wlasciwosciach kwaszacych, bardzo dobrej przezywalnosci w warunkach imitujacych przewód pokarmowy, charakteryzujacy sie obecnoscia wszystkich genów wybranych szlaków produkcji lub odzyskiwania witamin, o potwierdzonym bezpieczenstwie.
Szczep Weissella cibaria (dla którego w niniejszym opisie stosowane jest oznaczenie wlasne IBB3394) zostal zdeponowany w dniu 6 lutego 2023 r. pod nr depozytu: KKP 2094p jako depozyt dla celów patentowych w KKP (Culture Collection of Industrial Microorganisms, prof. Waclaw Dabrowski IAFB-SRI) tj. w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego (Instytut Biotechnologii Przemyslu Rolno-Spozywczego im. prof. Waclawa Dabrowskiego - Panstwowy Instytut Badawczy w Warszawie).
Nowy, nieznany i nieopisany wczesniej szczep bakterii fermentacji mlekowej W. cibaria KKP 2094p wedlug wynalazku wykazuje korzystne wlasciwosci technologiczne dla produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie oraz wlasciwosci probiotyczne i przeciwnowotworowe, charakteryzuje sie wyjatkowo wysoka wydajnoscia produkcji dekstranu, wykazuje aktywnosc przeciwdrobnoustrojowa wobec 5. aureus i 5. epiderm idis oraz przeciw niepozadanym w pieczywie bakteriom przetrwalnikujacym (aktywnosc antagonistyczna wobec Bacillus cereus, Bacillus brevis i unikalna wobec Lysynibacillus fusiformis), hamuje proliferacje komórek raka jelita grubego, jest wysoce oporny na sole zólciowe i niskie pH, posiada wszystkie geny szlaku produkcji witaminy B12 i K2 jak równiez geny szlaku odzyskiwania witaminy Bl, ponadto, wykazuje dopuszczalny poziom opornosci na antybiotyki. W analizie probiogenomicznej tego szczepu nie stwierdzono genów opornosci na antybiotyki ani genów wirulencji co potwierdza jego bezpieczenstwo.
Szczep W. ci baria KKP 2094p zostal wyizolowany z zakwasu piekarskiego. PL 443929 A1 /34 Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu do biotechnologicznego wytwarzania dekstranu.
Korzystnie w sklad podloza hodowlanego dla W. cibaria KKP 2094p powinna wejsc sacharoza, organiczne zródlo azotu zawierajace aminokwasy i krótkie peptydy, witaminy z grupy B i potrzebne sole mineralne.
Przykladowo, odpowiednim podlozem do hodowli bakterii z rodzaju Weissella sp. umozliwiajacym produkcje EPS jest handlowa pozywka MRS (bulion DeMan-Rogosa-Sharpe) z dodatkiem sacharozy.
W korzystnym przykladzie wykonania sposobu wytwarzania dekstranu jest hodowla W. cibaria KKP 2094p na podlozu MRS bez dekstrozy (bez glukozy) z dodatkiem sacharozy, korzystnie sacharozy o stezeniu 10% wag. pozwalajacym na uzyskanie maksymalnej wydajnosci produkcji dekstranu.
Wynalazek dotyczy metody pozyskiwania dekstranu z hodowli szczepu W. cibaria KKP 2094p wedlug wynalazku.
Korzystnie uzyskane hodowle rozcienczano zimna, sterylna woda (1:1, v/v) oddzielono plyn pohodowlany od komórek poprzez wirowanie (15 151 ref, 4 °C, 15 min), a nastepnie w uzyskanym supernatancie ekstrahowano EPS. Precypitacje EPS przeprowadzano dwuetapowo dodajac kazdorazowo 4 objetosci schlodzonego 75 % etanolu. Po pierwszym etapie próbke wirowano, zawieszano osad w wodzie i dodawano druga porcje etanolu.
Wynalazek dotyczy równiez wykorzystania szczepu W. cibaria KKP 2094p, ze wzgledu na korzystne wlasciwosci technologiczne wykazywane przez ten szczep, do wytwarzania zakwasów i pieczywa na zakwasie (wytwarzanie dekstranu, aktywnosc antagonistyczna wobec niepozadanych w pieczywie bakterii przetrwalnikujacych).
Aktywnosc antagonistyczna testowano wobec niepozadanym w pieczywie bakteriom przetrwalnikujacym (Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis).
Wynalazek dotyczy równiez wykorzystania szczepu ze wzgledu na wlasciwosci probiotyczne.
W korzystnych przykladach wykonania szczep W. cibaria KKP 2094p, wykazal aktywnosc antagonistyczna wobec szczepów 5. aureus i 5. epidermidis, ale nie hamowal wzrostu szczepu reprezentujacego bakterie fermentacji mlekowej L. lactis.
Wykazano aktywnosc antagonistyczna hodowli nocnej szczepu W. cibaria KKP 2094p, jego zawiesiny komórek w PBS oraz supernatantu pohodowlanego tego szczepu wobec 5. aureus IBB4005 (tj. wieloopornego szczepu 5. aureus NCTC9789 [PS80] wykazujacego opornosc na amp Pen Asa Cad Mer).
Przy czym najkorzystniejsza aktywnosc zaobserwowano dla hodowli nocnej i zawiesiny komórek w PBS.
Wykazano, ze szczep W. cibaria KKP 2094p ma cechy uznawane za pozadane dla bakterii probiotycznych: opornosc na niskie pH, gwarantujaca przejscie bakterii do dalszych odcinków przewodu pokarmowego; opornosc na sole zólciowe, gwarantujaca przezycie bakterii w obecnosci soków trzustkowych. PL 443929 A1 11/34 Wykazano, ze wytwarzany przez szczep W. cibaria KKP 2094p dekstran nie jest cytotoksyczny wobec ludzkich linii komórkowych Caco-2 i nienowotworowych komórek nablonka nerek HEK293 ani nie wykazuje aktywnosci antagonistycznej wobec badanych szczepów bakterii 5. aureus i L. lactis.
Wykazano, ze szczep W. cibaria KKP 2094p hamowal proliferacje komórek raka jelita grubego, przy czym wykazana aktywnosc przeciwnowotworowa jest silniejsza niz aktywnosc znanych szczepów bakterii mlekowych (Lactococcus lactis zdeponowanych w PCM jako B/00311 i B/00312) o potwierdzonej aktywnosci antyproliferacyjnej (patent no. PL241568B1, Salanski i wsp. 2022).
Szczep W. cibaria KKP 2094p zostal zsekwencjonowany, a analiza probiogenomiczna potwierdzila brak obecnosci genów opornosci na antybiotyki i brak genów wirulencji a zatem potwierdzono mozliwosc probiotycznego i medycznego jego stosowania.
Analize bioinformatyczna szczepu W. cibaria KKP 2094p wykonano zgodnie z zaleceniami EFSA wykorzystujac rekomendowane programy i bazy danych.
W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „biomasa" rozumie sie biomase komórek szczepu bakterii Weissella cibaria KKP 2094p otrzymywana w wyniku namnozenia komórek w pozywkach cieklych lub na podlozach stalych o skladzie dostosowanym do wymogów kultur bakterii fermentacji mlekowej.
W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „potencjalnie probiotyczne" rozumie sie cechy wykazane w badaniach in vitro o mozliwym korzystnym wplywie na zdrowie gospodarza zgodnie z dostepnymi danymi literaturowymi, w szczególnosci: wytwarzanie EPS, aktywnosc przeciw bakteriom 5. aureus i 5. epidermidis, obnizanie pH srodowiska, opornosc na niskie pH i obecnosc soli zólciowych.
W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „aktywnosc przeciwdrobnoustrojowa" rozumie sie dzialanie antagonistyczne wobec bakterii 5. aureus i 5. epidermidis oraz wobec niepozadanym w pieczywie bakteriom przetrwalnikujacym (Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis).
W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „potwierdzone bezpieczenstwo" rozumie sie dopuszczalny poziom opornosci na rekomendowane przez EFSA 9 antybiotyków: ampicyline (AM), chloramfenikol (CL), klindamycyne (CM), kanamycyne (KM), gentamycyne (GM/CN), streptomycyne (SM), tetracykline (TC), wankomycyne (VA), erytromycyne (EM), oraz brak genów opornosci na antybiotyki, brak genów wirulencji w analizie probiogenomicznej wykonanej zgodnie z zaleceniami EFSA wykorzystujac rekomendowane programy i bazy danych.
W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „cytotoksyczny" rozumie sie cytotoksycznosc powyzej 10% i wynikajaca z niej przezywalnosc komórek ponizej 90% zgodnie z wartosciami zaproponowanymi prze EL­ Adawi i wsp. (2012) dla EPS wytwarzanych przez bakterie mlekowe.
W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „hodowla nocna" rozumie sie hodowle szczepu bakteryjnego zalozona z pojedynczej kolonii w odpowiednim podlozu inkubowana przez kilkanascie godzin. PL 443929 A1 12/34 W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „supernatant" rozumie sie plyn pohodowlany oddzielony od komórek bakterii.
W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „ekstrakt komórkowy" rozumie sie plyn uzyskany po rozbiciu przy uzyciu szklanych kulek komórek bakterii oddzielonych przez wirowanie z hodowli nocnej i zawieszonych w buforze PBS.
W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „zawiesina komórek w PBS" rozumie sie komórki bakterii uzyskane z hodowli nocnej poprzez zwirowanie, przeplukane i ponownie zawieszone w buforze PBS.
SZCZEGÓLOWE PRZEDSTAWIENIE WYNALAZKU Szczep Weissella cibaria IBB3394 zdeponowany jako KKP 2094p wedlug wynalazku wyizolowano jak przedstawiono w Przykladzie 1, poszukujac zdolnych do produkcji egzopolisacharydów (EPS) szczepów Weissella sp. pochodzacych z róznych srodowisk (roslin, fermentowanych roslin, fermentowanych produktów mlecznych). Szczep W. cibaria KKP 2094p zostal zidentyfikowany jako Weissella confusa/cibaria metoda sekwencjonowania genów kodujacych 16S rRNA. Przynaleznosc gatunkowa szczepu W. cibaria KKP 2094p okreslono nastepnie jako Weissella cibaria poprzez sekwencjonowanie genomu oraz metoda spektroskopii masowej z uzyciem aparatu MALDI TOF. Szczep W. cibaria KKP 2094p zostal wyselekcjonowany sposród wyizolowanych pieciu szczepów Weissella sp., w porównaniu równiez do szczepów tego rodzaju wyizolowanych wczesniej ze spontanicznych zakwasów piekarskich, na podstawie wyników analizy klasyfikujacej go do grupy szczepów o najwyzszej aktywnosci antagonistycznej wobec 5. aureus (Fig. 1) i jednoczesnie potwierdzajacej brak takiej aktywnosci wobec przedstawiciela bakterii mlekowych (Fig. 2), przeprowadzonej jak opisano w Przykladzie 2 oraz wyjatkowo wysokiej w porównaniu do pozostalych badanych szczepów (Fig. 3) opornosci na niskie pH i obecnosc soli zólciowych, w warunkach wykorzystanych w Przykladzie 3 do sprawdzenia przezywalnosci szczepów w warunkach imitujacych przewód pokarmowy. Dla szczepu W. cibaria KKP 2094p potwierdzono nastepnie aktywnosc antagonistyczna wobec innych szczepów 5. aureus oraz szczepów 5. epidermidis (Przyklad 4). W przykladzie tym wykazano równiez zdolnosc szczepu W. cibaria KKP 2094p do zakwaszania srodowiska.
Wykazano mozliwe wykorzystanie szczepu W. cibaria KKP 2094p jako szczepu potencjalnie probiotycznego posiadajacego aktywnosc przeciw 5. aureus (Fig. 4) i potwierdzono w Przykladzie 5 zarówno dla hodowli nocnej szczepu jak i zawiesiny komórek w PBS. Aktywnosc tego typu, jednak na nizszym poziomie zaobserwowano dla supernatantu, co wskazuje na to iz hamujacy efekt w stosunku do . aureus nie jest spowodowany wylacznie obnizaniem pH srodowiska. Ponadto, brak aktywnosci antagonistycznej w przypadku ekstraktu komórkowego, wskazuje na istotna, jak dotad niepoznana role odgrywana przez zywe komórki tego szczepu. W Przykladzie 6 wykazano dla szczepu W. ci baria KKP 2094p wyjatkowo silne dzialanie hamujace proliferacje komórek raka jelita grubego (Fig. 5), wskazujac na mozliwosc zastosowania szczepu w leczeniu raka przewodu pokarmowego. PL 443929 A1 13/34 Zaobserwowana w Przykladzie 4 dla szczepu W. cibaria KKP 2094p wedlug wynalazku, wyizolowanego z zakwasu piekarskiego (przystosowanego do zycia w takim srodowisku) zdolnosc do zakwaszania jak równiez wykazana w Przykladzie 7 aktywnosc antagonistyczna wobec niepozadanych w zakwasach i pieczywie bakterii przetrwalnikujacych (Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis) potwierdzaja mozliwosc wykorzystanie szczepu W. cibaria KKP 2094p ze wzgledu na korzystne wlasciwosci technologiczne do produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie. Wykorzystanie tego szczepu w tym celu jest równiez korzystne ze wzgledu na zdolnosc do wytwarzania EPS pelniacego istotna role w ksztaltowaniu wlasciwosci reologicznych i strukturalnych pieczywa.
Wyselekcjonowany szczep W. cibaria KKP 2094p posiadajacy zdolnosc do produkcji EPS, wykorzystano w Przykladzie 8 do wytworzenia EPS uzyskujac na podlozu z 10% sacharoza jedna z najwyzszych udokumentowanych wydajnosci biotechnologicznej produkcji dekstranu.
W Przykladzie 9 swiezo uzyskany EPS oraz EPS przechowywany w warunkach chlodniczych przez 6 miesiecy sprawdzono pod katem aktywnosci antagonistycznej wobec 5. aureus oraz szczepu bakterii mlekowych (Fig. 6). Zastosowany zakres stezen EPS od O do 20 mg/ml nie spowodowal znaczacego zahamowania wzrostu zadnego ze szczepów wskaznikowych, tym samym wskazujac iz taki EPS nie ma istotnej aktywnosci antagonistycznej wzgledem badanych szczepów bakterii.
Egzopolisacharydy stosowane jako dodatki do zywnosci i pasz powinny byc bezpieczne dla ludzi i zwierzat.
Cytotoksycznosc egzopolisacharydów wytwarzanych przez bakterie mlekowe nie powinna byc wyzsza niz %, co oznacza, ze odsetek komórek przezywajacych nie powinien byc nizszy niz 90% (EL-Adawi et al., 2012). Cytotoksycznosc egzopolisacharydu ze szczepu Weissella cibaria (KKP 2094p) byla badana zgodnie z opisem w Przykladzie 10 wzgledem dwóch ludzkich linii komórkowych pochodzacych z American Type Culture Collection: gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 (ATCC HTB-37) i nienowotworowych komórek, komórek nablonka nerek HEK293 (ATTC CRL-1573). Traktowanie linii komórkowych stezeniami egzopolisacharydu od 2,5 do 30% nie spowodowalo istotnego statystycznie zahamowania proliferacji, tym samym potwierdzajac brak cytotoksycznosci badanego EPS (Fig. 7-10).
Dla szczepu wykonano równiez analizy potwierdzajace bezpieczenstwo. W Przykladzie 11, test na wrazliwosc na antybiotyki potwierdzil poziom opornosci na akceptowalnym poziomie zgodnie z wytycznymi EFSA. W przypadku rodzaju Weissella, dla których nie podano specyficznych wartosci granicznych wyniki, zgodnie z rekomendacja, nalezy porównywac z wynikami dla najblizej filogenetycznie spokrewnionych bakterii (heterofermentatywnych laktobacillusów oraz leukonostoków). Dodatkowo, bezpieczenstwo szczepu (brak genów opornosci na antybiotyki oraz brak czynników wirulencji) zostalo potwierdzone w analizie probiogenomicznej opisanej w Przykladzie 12.
W Przykladzie 13, szczep W. cibaria KKP 2094p z powodzeniem wykorzystano do wytworzenia pieczywa na zakwasie, które uzyskalo lepsze oceny w porównaniu z pieczywem uzyskanym bez udzialu tego szczepu. PL 443929 A1 14/34 KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU Przykladowe realizacje wynalazku zaprezentowano na figurach rysunku, na których: Fig. 1 Przedstawia wynik badania aktywnosci antagonistycznej szczepów Weissella sp. przeciwko 5. aureus IBB4005. Liczac od lewej do prawej, od góry do dolu szalka (a) zawiera: 3714 (1), 3715 (2), 3716 (3), 3717 (4), 3277 (5), 3278 (6), 3279 (7), 3385 (8), 3386 (9), 3387 (10), 3388 (11), 3389 (12), 3393 (13), 3394 (14) (tj. W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) i K - szczep kontrolny (wytwarzajacy nizyne L. lactis IBB1339).
Natomiast szalka (b) zawiera: 3287 (15), 3325 (16), 3326 (17), 3327 (18), 3382 (19), 3383 (20), 3384 (21), 3280 (22), 3281 (23 ), 3282 (24,) 3284 (25), 3285 (26), 3286 (27) i K- szczep kontrolny (wytwarzajacy nizyne L. lactis IBB1339).
Fig. 2 Przedstawia wynik badania aktywnosci antagonistycznej szczepów Weissella sp. przeciwko L. lactis IL1403.Liczac od lewej do prawej, od góry do dolu szalka (a) zawiera: 3714 (1), 3715 (2), 3716 (3), 3717 (4), 3277 (5), 3278 (6), 3279 (7), 3385 (8), 3386 (9), 3387 (10), 3388 (11), 3389 (12), 3393 (13), 3394 (14) (tj. W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) i K- szczep kontrolny (wytwarzajacy nizyne L. lactis IBB1339).
Natomiast szalka (b) zawiera: 3287 (15), 3325 (16), 3326 (17), 3327 (18), 3382 (19), 3383 (20), 3384 (21), 3280 (22), 3281 (23 ), 3282 (24,) 3284 (25), 3285 (26), 3286 (27) i K-szczep kontrolny (wytwarzajacy nizyne L. lactis IBB1339).
Fig. 3 Przedstawia odpowiedz szczepów Weissella sp. na stres zwiazany z obecnoscia soli zólciowych i niskiego pH.
Fig. 4 Przedstawia wplyw W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) (hodowli nocnej, supernatantu, ekstraktu komórkowego, zywych komórek zawieszonych w buforze PBS) na przezywalnosc 5. aureus IBB4005.
Liczebnosc bakterii 5taphylococcus wyrazona w procentach przedstawiono wzgledem liczebnosci w kontroli w MRS (dla hodowli i supernatantu) lub PBS (dla komórek i ekstraktu). Obliczenia dla pomiaru po rozpoczeciu (To), po godzinie (T1h) i trzech godzinach (T3h) inkubacji.
Fig. 5 Przedstawia hamujacy wplyw szczepu Weissella sp. IBB3394 (KKP 2094p) na proliferacje komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 w porównaniu do wplywu dwóch innych szczepów bakterii mlekowych, w tym szczepu IBB109 o potwierdzonej wczesniej aktywnosci antyproliferacyjnej. Proliferacje komórek Caco-2 inkubowanych ze szczepami bakteryjnymi mierzono w odniesieniu do wolnej od bakterii hodowli komórkowej Caco-2 (100%) stosujac test kolorymetryczny BrdU. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy.
Fig. 6 Przedstawia wynik badania wplywu EPS produkowanego przez Weissella sp. IBB3394 (KKP 2094p) na wzrost 5. aureus IBB4005 (a) i L. lactis IL1403 (b). Swieze i przechowywane przez 6 miesiecy w warunkach chlodniczych próbki EPS (20, 10, 5, 2,5, O mg/ml) nakropiono powyzej linii, podczas gdy ponizej linii nakropiono kontrole pozytywne - z bakteriocyna nizyna w róznych stezeniach (100, 50, 20, 10, 5, 2,5 mg/ml), dolna czesc szalki od lewej do prawej. PL 443929 A1 /34 Fig. 7 Przedstawia wynik badania przezywalnosci komórek linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 po inkubacji z róznymi stezeniami egzopolisacharydu izolowanego z hodowli szczepu Weissella sp.
IB83394 (KKP 2094p) w stosunku do linii komórkowej niekoinkubowanej z egzopolisacharydem. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy.
Fig. 8 Przedstawia wynik badania przezywalnosci linii komórkowej nablonka nerki HEK293 po inkubacji z róznymi stezeniami egzopolisacharydu izolowanego z hodowli szczepu Weissella sp. IB83394 (KKP 2094p) w stosunku do linii komórkowej niekoinkubowanej z egzopolisacharydem. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy.
Fig. 9 Przedstawia wynik badania cytotoksycznosci egzopolisacharydu izolowanego z hodowli szczepu Weissella sp. IB83394 (KKP 2094p) na komórki linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 w stosunku do linii komórkowej niekoinkubowanej z egzopolisacharydem. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy.
Fig. 10 Przedstawia wynik badania cytotoksycznosci egzopolisacharydu izolowanego z hodowli szczepu Weisse//a sp. I8B3394 (KKP 2094p) na linii komórkowej nablonka nerki HEK293 w stosunku do linii komórkowej niekoinkubowanej z egzopolisacharydem. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy.
Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia sa w calosci niniejszym wlaczone, jako referencje. Ponizsze przyklady ilustruja wynalazek, nie ograniczajac go w zaden sposób.
SPOSOBY WYKONANIA WYNALAZKU Ponizsze przyklady umieszczono jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjasnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny byc utozsamiane z calym jego zakresem, który zdefiniowano w zalaczonych zastrzezeniach.
PRZYKLADY Przyklad 1 Izolacja i identyfikacja szczepów produkujacych EPS Poszukiwanie szczepów bakterii zdolnych do produkcji EPS przeprowadzono na podlozu selekcyjnym stalym MRS bez dekstrozy z dodatkiem 10% sacharozy, na które wysiewano posiewem redukcyjnym zakwas piekarski, sok z fermentowanej kapusty i ogórków, plyn uzyskany po dokladnym wyplukaniu fragmentów roslin w buforze PBS (pH 7,4), lub po zawieszeniu fermentowanych produktów mlecznych.
Plytki inkubowano w warunkach tlenowych w temp. 30 °C przez minimum 48 godzin. Pojedyncze kolonie bakterii o sluzowatej morfologii pasazowano na podloze stale MRS do uzyskania czystych kultur wyizolowanych bakterii, które to szczepy zdeponowano w Kolekcji IBB PAN (COLIBB, Polska).
Przynaleznosc gatunkowa okreslono metoda sekwencjonowania genów kodujacych 16S rRNA. Wsród bakterii produkujacych EPS wyizolowanych z podloza zawierajacego sacharoze wytypowano bakterie nalezace do Leuconostoc sp. (12 szczepów) i Weissella confusa/cibaria (5 szczepów). Na dalszym etapie PL 443929 A1 16/34 badan po okresleniu zaskakujacych wlasciwosci uzytkowych dla szczepu W. cibaria IB83394 potwierdzono jego przynaleznosc gatunkowa jako Weissella cibaria poprzez sekwencjonowanie genomu oraz metoda spektroskopii masowej z uzyciem aparatu MALDI TOF przy dokonywaniu depozytu tego szczepu do KKP (IAFB, Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego) gdzie zostal zdeponowany jako KKP 2094p.
Przyklad 2 Badanie przesiewowe szczepów Weissella sp. pod katem aktywnosci antagonistycznej wzgledem patogennego szczepu S. aureus Antagonistyczne dzialanie 5 szczepów Weissella sp. wyizolowanych jak opisano w Przykladzie 1 oraz 12 szczepów wyizolowanych wczesniej ze spontanicznych zakwasów piekarskich (Tabela 1) przeciwko patogennemu szczepowi 5. aureus I8B4005 (Fig. 1) i szczepowi L. lactis IL1403 reprezentujacemu bakterie mlekowe (Fig. 2) analizowano metoda nakrapiania na szalke ze szczepem wskaznikowym, wobec wytwarzajacego nizyne szczepu L. lactis I8B1339 jako kontroli pozytywnej.
Tabela 1. Szczepy Weissella confusa/cibaria uzyte w przykladzie.
Numer Zródlo izolacji Numer w "COLIBB" 1 ogórki malosolne (bazar "Zieleniak") 3714 2 ogórki malosolne 3715 3 rukola 3716 4 ziarna soi (suche) 3717 zakwas zytni 3277 6 zakwas zytni 3278 7 zakwas zytni 3279 8 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3385 9 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3386 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3387 11 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3388 12 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3389 13 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3393 14 zakwas piekarski 3394 zakwas zytni 3287 16 zakwas z pszenicy orkisz 3325 17 zakwas z pszenicy orkisz 3326 18 zakwas z pszenicy orkisz 3327 19 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3382 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3383 21 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3384 22 zakwas zytni 3280 23 zakwas zytni 3281 24 zakwas zytni 3282 zakwas zytni 3284 PL 443929 A1 17/34 26 zakwas zytni 3285 27 zakwas zytni 3286 Szczepy Weissella sp., L. lactis IB81339 (szczep kontrolny) i IL1403 (szczep wskaznikowy) z kolekcji szczepów IBB PAN (COLIBB, Polska) wysiano odpowiednio na szalkach z podlozem MRS, GM17 i BHI i inkubowano przez 48 godzin w 30 °C. 5. aureus I8B4005 (szczep wskaznikowy) równiez wysiano na szalce z podlozem BHI (laboratorium BSL2). Pojedyncza kolonia z kazdej szalki zaszczepiono plynna pozywka i inkubowano przez noc. Kultury robocze bakterii hodowano w bulionie MRS w 30 °C dla Weissella, w plynnym podlozu GM17 w 30°C dla L. lactis IB81339 oraz w bulionie BHI w warunkach tlenowych w 37 °C z wytrzasaniem i w 30 °C bez wytrzasania dla szczepów wskaznikowych, odpowiednio 5. aureus I8B4005 i L. lactis IL1403. Pólplynny agar BHI podgrzany do 55 °C (5 ml) zaszczepiono 100 µI hodowli nocnej (szczepy wskaznikowe: 5. aureus IB84005, L. lactis IL1403) i natychmiast wylano na duza szalke z podlozem stalym BHI i równomiernie rozprowadzono, aby pokryc powierzchnie. Po zwiazaniu agaru, 5 µI hodowli nocnych badanych kultur Weissella sp. i kontroli pozytywnej (szczepu L. lactis IB81339 wytwarzajacego nizyne) nanoszono na okreslone miejsca na szalce. Szalki pozostawiono do wchloniecia kropli i inkubowano przez noc w 37°C i w 30°C odpowiednio dla 5. aureus IB84005 i L. lactis IL1403. Eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach biologicznych. Antagonizm wobec szczepów wskaznikowych oceniano przez obserwacje stref zahamowania wzrostu.
Wielkosc i przezroczystosc takich stref rózni sie w zaleznosci od szczepu. Ogólnie zaobserwowano cztery rózne efekty: i.) wyrazne strefy zahamowania, ii.) strefy zahamowania z widocznym wzrostem badanego szczepu w srodku, iii.) niewyrazne strefy ze slabo widocznym wzrostem wskaznika i widocznym wzrostem badanego szczepu w srodku oraz iv.) brak stref zahamowania wzrostu wokól badanego szczepu. Pierwsze dwa efekty zostaly sklasyfikowane jako silne dzialanie antagonistyczne i oznaczone jako (+), trzeci efekt byl bakteriostatyczny (+/-), a ostatni efekt zostal scharakteryzowany jako brak aktywnosci antagonistycznej (-). Wynik uzyskany z trzech powtórzen (Tabela 2) wskazywaly, ze niektóre szczepy Weissella sp. byly w stanie zahamowac wzrost 5. aureus, niektóre okazaly sie bakteriostatyczne, podczas gdy inne nie hamowaly wzrostu 5. aureus. Jednoczesnie zaden z testowanych szczepów nie hamowal wzrostu szczepu bakterii mlekowej L. lactis IL1403 (Tabela 2).
Tabela 2. Wyniki badania aktywnosci antagonistycznej.
Aktywnosc antagonistyczna przeciwko Numer Numer w "COLIBB" L. lactis IL1403 5. aureus IB84005 Powt. 1 Powt. 2 Powt. 3 Powt. 1 Powt. 2 Powt. 3 o 1339 + + + + + + 1 3714 - - - + + + 2 3715 - - - + + + 3 3716 - - - + + + 4 3717 - - - + + + PL 443929 A1 18/34 3277 - - - + + + 6 3278 - - - + +/- +/- 7 3279 - - - + + + 8 3385 - - - + + + 9 3386 - - - - - - 3387 - - - - - - 11 3388 - - - +/- + + 12 3389 - - - +/- +/- +/- 13 3393 - - - + + + 14 3394 - - - + + + 3287 - - - + +/- +/- 16 3325 - - - + + + 17 3326 - - - + + + 18 3327 - - - + +/- + 19 3382 - - - + +/- +/- 3383 - - - +/- +/- +/- 21 3384 - - - + + + 22 3280 - - - + +/- +/- 23 3281 - - - + + +/- 24 3282 - - - + + + 3284 - - - + +/- +/- 26 3285 - - - +/- + +/- 27 3286 - - - +/- + +/- Przyklad 3. Test przezywalnosci szczepów Weissella sp. w niskim pH i w obecnosci soli zólciowych Jedna z waznych wlasciwosci definiujacych bakterie probiotyczne jest ich zdolnosc do przetrwania w przewodzie pokarmowym. Opornosc 5 szczepów Weissella sp. wyizolowanych jak opisano w Przykladzie 1 oraz 12 szczepów wyizolowanych wczesniej ze spontanicznych zakwasów piekarskich, na sole kwasów zólciowych (stres zwiazany z sola zólciowa) i niskie pH (stres kwasowy) badano w nastepujacy sposób.
Swiezo wyhodowane kolonie na podlozu IST-MRS [90% ISO-Sensitest broth (Oxoid) i 10% MRS (Merck)] dla kazdego izolatu bakteryjnego zawieszono w PBS, pH = 7,4 (PBS404, BioShop) i rozcienczono do 00600nm = 0,5 w 1 ml PBS, pH= 7,4 (kontrola); PBS, pH= 3 (stres kwasowy); oraz PBS, pH= 7,4, zawierajacy 3 g/1 dwóch soli kwasów zólciowych: cholanu sodu i dezoksycholanu sodu (B8756, Sigma-Aldrich) (stres zwiazany z solami zólciowymi). Próbki inkubowano przez godzine w temperaturze 37°C. Po inkubacji probówki odwirowano (3 minuty, 4°C, 10000 rpm) i zlano supernatant, a osad komórkowy zawieszono w 0,5 ml buforu PBS pH 7,4. Z kazdej próbki przygotowano rozcienczenia od 10- 1 do 10- 6 . Na szalkach z podlozem stalym IST-MRS nakrapiano po 20 µI rozcienczen. Szalki inkubowano przez 48 h w 30 °C w warunkach tlenowych. Eksperymenty przesiewowe pod katem charakterystyki szczepów w warunkach nasladujacych przewód pokarmowy przeprowadzono w trzech powtórzeniach biologicznych i obliczono srednia dla kazdego z warunków. Podatnosc na czynniki stresowe wyrazono jako spadek o rzedy wielkosci liczby jednostek tworzacych kolonie bakteryjne (CFU)/ml w porównaniu z warunkami kontrolnymi (pH PBS = 7,4). Uzyskane wyniki przedstawiono na wykresie (Fig. 3), na ich podstawie wybrano izolat IBB3394 PL 443929 A1 19/34 (zdeponowany nastepnie jako KKP 2094p) jako unikalny szczep najbardziej oporny na sole zólciowe i niskie pH.
Przyklad 4. Badanie wybranych szczepów Weissella sp. pod katem aktywnosci antagonistycznej wzgledem szczepów S. aureus i S. epidermidis Szesc szczepów bakterii mlekowych z rodzaju Weissella (confusa/cibaria) wytypowanych z Kolekcji Szczepów Bakteryjnych IBB PAN (COLIBB) przetestowano pod katem: • aktywnosci kwaszacej, w celu zbadania ewentualnego wplywu obnizenia pH na zahamowanie wzrostu szczepów 5. aureus i 5. epidermidis, • aktywnosci antagonistycznej wobec zywych komórek trzech patogennych szczepów 5. aureus w tym szczepu wieloopornego, • aktywnosci antagonistycznej wobec zywych komórek dwóch szczepów 5. epidermidis reprezentujacych gatunek bakterii wywolujacy zakazenia oportunistyczne (nie wywolujacy infekcji u ludzi zdrowych).
Testowane szczepy Weissella nakrapiane na podloze stale BHI z purpura bromokrezolowa (wskaznikiem kwasowosci) powodowaly zmiane zabarwienia podloza z fioletowo-purpurowej na zólta co swiadczy o zakwaszeniu podloza wokól strefy nakropien. Wartosci pomiaru pH hodowli nocnych szczepów wynosily od 4,23 do 4,89.
Test aktywnosci antagonistycznej wykonywano poprzez nakropienie po 5 µI plynnych hodowli nocnych szczepów Weissella na duze szalki (BHI z purpura bromokrezolowa) z wysianymi w formie murawki szczepami wskaznikowymi 5. aureus 1B84002, 18B4005 i 18B4009 oraz 5. epidermidis 6Pll6 i SL03. Szalki inkubowano 24 godziny w 37 °C. Wokól badanych szczepów Weissella zobserwowano strefy zahamowania wzrostu dla wszystkich wskaznikowych szczepów 5. aureus (Tabela 3) oraz 5. epidermidis (Tabela 4).
Tabela 3 Wyniki badania aktywnosci antagonistycznej wzgledem szczepów 5. aureus (srednie z dwóch powtórzen biol.). srednica srednica srednica srednica srednica srednica kropli strefy róznica kropli strefy róznica kropli strefy róznica na BHI z zahamowania na BHI z zahamowania na BHI z zahamowania lp numer w dla dla dla "COLIBB" purpura wzrostu 4002 purpura wzrostu 4005 purpura wzrostu 4009 po 24 h S. aureus [mm] po 24 h S. aureus [mm] po 24 h S. aureus [mm] szalka z 4002 na BHI z szalka z 4005 na BHI z szalka z 4009 na BHI z 4002 purpura 4005 purpura 4009 purpura 1 3287 7,50 9,50 2,00 8,00 9,50 1,50 7,75 9,50 1,75 2 3325 7,75 10,00 2,25 6,75 9,25 2,50 7,00 9,00 2,00 3 3326 7,25 10,25 3,00 7,75 10,25 2,50 7,50 9,00 1,50 4 3389 7,50 9,70 2,20 7,25 8,95 1,70 7,25 9,75 2,50 3393 7,25 9,05 1,80 7,50 9,55 2,05 7,25 9,75 2,50 6 3394 7,50 9,50 2,00 7,75 9,50 1,75 7,25 8,75 1,75 PL 443929 A1 /34 Tabela 4 Wyniki badania aktywnosci antagonistycznej wzgledem szczepów 5. epidermidis (srednie z dwóch powtórzen biol.). srednica strefy srednica strefy srednica kropli zahamowania róznica srednica kropli zahamowania numer w na BHI z wzrostu wzrostu róznica lp "COLIBB" S. epidermidis dla na BHI z S. epidermidis dla 5L03 purpura po 6Pll6 purpura po 24 24 h szalka z 6Pll6 na BHI z h szalka z 5L03 5L03 na BHI z 6Pll6 purpura purpura 1 3287 9,0 11,0 2,0 7,0 8,0 1,0 2 3325 8,8 10,0 1,2 7,0 9,0 2,0 3 3326 8,8 10,3 1,5 6,8 8,5 1,7 4 3389 9,3 12,0 2,7 7,0 8,0 1,0 3393 8,8 10,0 1,2 7,0 7,5 0,5 6 3394 8,8 10,0 1,2 7,0 8,5 1,5 Przyklad 5. Aktywnosc antagonistyczna szczepu W. cibaria 1B83394 {KKP 2094p) dla róznych form preparatu {hodowli, supernatantów, ekstraktów komórkowych, zywych komórek zawieszonych w buforze PBS) wobec zywych komórek szczepu S. aureus Eksperyment wykonano dla róznych wariantów: • Hodowla nocna szczepu W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) - 900 µI, • Supernatant - 900 µI plynnej hodowli nocnej W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) - wirowano 3 min, 13 tys. RPM, a nastepnie supernatant filtrowano przez filtr 0,45 µm, • Ekstrakt z komórek W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) osadzonych przez wirowanie (3 min, 13 tys. RPM) - osad zawieszano w 900 µI buforu PBS i rozbijano kulkami (3xl min, z przerwami na chlodzenie na lodzie po 1 min), nastepnie wirowano 10 min 14 tys. RPM w 4°C. Plyn znad kulek zbierano i dodawano do PBS (ok. 100 µI) do objetosci koncowej 900 µI.
• Zawiesina komórek w PBS - 900 µI plynnej hodowli nocnej W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) wirowano 3 min, 13 tys. RPM, nastepnie osad komórek zawieszano w 900 µI sterylnego PBS, ponownie wirowano 3 min, 13 tys. RPM a powstaly osad zawieszano w 900 µI sterylnego PBS.
Rozcienczenie w sterylnym PBS plynnych hodowli nocnych szczepu wskaznikowego 5. aureus IBB4005 (100 000x).
Inkubacja rozcienczonych hodowli nocnych 5taphylococcus (100 µI z rozczienczenia 10- ) z poszczególnymi wariantami dla szczepu W. cibaria IBB3394 oraz 900 µI PBS lub podloza MRS jako kontrola przez 3 h w temperaturze ok. 30 °C. Wysiewy na szalki LB po 100 µI z kazdego wariantu w dwóch powtórzeniach zaraz po rozpoczeciu inkubacji (To), po godzinie (T1h) i trzech godzinach (T3h). Szalki inkubowano w 42 °C (zeby wyeliminowac wzrost LAB) przez 24 h lub 48 h (wariant z hodowla nocna i komórkami). Doswiadczenie wykonywano w 2 powtórzeniach technicznych i minimum 2 powtórzeniach biologicznych. Wyniki zaprezentowano na wykresie (Fig. 4), na którym liczebnosc bakterii 5taphylococcus wyrazona w procentach przedstawiono wzgledem liczebnosci w kontroli (w MRS lub PBS). PL 443929 A1 21/34 Wyrazne dzialanie antagonistyczne zaobserwowano dla hodowli nocnej i komórek zawieszonych w buforze PBS. Aktywnosc przeciwgronkowcowa wykazywal ponadto supernatant, podczas gdy nie zaobserwowano takiego efektu dla ekstraktu komórkowego.
Przyklad 6. Aktywnosc antyproliferacyjna szczepu 1B83394 {KKP 2094p) wobec komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 Badanie hamowania proliferacji komórek raka jelita grubego wykonano wedlug metody opisanej przez Salanskiego i wsp. (2022), hodujac szczep Weissella sp. IBB3394 na podlozu MRS. Wyniki testu BrdU wykazaly, ze szczep IBB3394 silnie hamowal aktywnosc proliferacyjna komórek nowotworowych Caco-2 (Fig. 5).
Przyklad 7. Badanie szczepu 1B83394 {KKP 2094p) pod katem aktywnosci antagonistycznej wzgledem niepozadanych w pieczywie bakterii przetrwalni kujacych {Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis) Aktywnosc antagonistyczna szczepu IBB3394 (KKP 2094p) zbadano wzgledem bakterii przetrwalnikujacych, psujacych pieczywo zgodnie z metoda opisana dla szczepów wyizolowanych z zakwasu zytniego (Litwinek i wsp., 2022). W tym celu zaszczepiono podloze plynne Luria-Bertani (LB) (Difco Laboratories, Franklin Lakes, New Jersey, USA) bakteriami wskaznikowymi przetrwalnikujacymi (Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis) i hodowano przez noc. Nastepnie hodowle nocne uzyto do zaszczepienia uplynnionej i ostudzonej pozywki stalej LB, która natychmiast wylano na szalke. Po zastygnieciu podloza, 5 µI badanego szczepu wyhodowanego na podlozu plynnym MRS naniesiono na wybrane miejsca na szalce. Plytki pozostawiono do wchloniecia kropli i inkubowano przez noc w temperaturze 30 °C. Antagonizm w stosunku do szczepu uwidoczniono przez obserwacje strefy zahamowania wzrostu. Obecnosc strefy zahamowania oznaczano jako,,++","+" lub"+/-", w zaleznosci od wielkosci, natomiast brak aktywnosci antagonistycznej oznaczano jako"-". Uzyskany wynik porównano z wynikami otrzymanymi dla szczepów Weissella sp. wyizolowanych z zakwasów z maki zytniej (Litwinek i wsp., 2022). Na podstawie przeprowadzonej analizy stwierdzono, ze szczep IBB3394 (KKP 2094p) przejawia aktywnosc antagonistyczna oceniona na,,+" wzgledem wszystkich szczepów wskaznikowych, w tym unikalna wobec szczepu Lysynibacillus fusiformis. Aktywnosc ta byla wyzsza niz dla szczepów wyizolowanych z zakwasu zytniego, dla których zaobserwowano nieco slabsze hamowanie wzrostu Bacillus brevis przez wszystkie badane szczepy, aktywnosc antagonistyczna wobec Bacillus cereus dla 4 z 7 szczepów i brak takiej aktywnosci wzgledem Lysynibacillus fusiformis.
Przyklad 8. Charakterystyka egzopolisacharydu {EPS) wytwarzanego przez 1B83394 {KKP 2094p) Oznaczenie wydajnosci produkcji egzopolisacharydu (EPS) przez IBB3394 przeprowadzono dla szczepu hodowanego na podlozu MRS bez dekstrozy zawierajacym dodatek 5% lub 10% sacharozy. Produkcje, a nastepnie ekstrakcje, rozdzial i charakterystyke EPS wykonano zgodnie z metoda opisana przez Buksa i wsp. (2021). Wyniki analizy wydajnosci produkcji oraz charakterystyke EPS przedstawiono w Tabeli 5.
Wydajnosc produkcji surowego EPS dla szczepu IBB3394 byla wyzsza na podlozu z 10% sacharoza i PL 443929 A1 22/34 wyniosla blisko 50 g/1. W wyniku rozdzialu surowego EPS na kolumnach SEC wykryto frakcje o wysokiej masie molowej, która zidentyfikowano jako dekstran.
Tabela 5. Wydajnosc produkcji surowego egzopolisacharydu (EPS) i udzial procentowy reszt cukrowych po kwasowej hydrolizie preparatu surowego EPS.
Wydajnosc Udzial reszt cukrowych po hydrolizie kwasowej (%) produkcji EPS w Szczep podlozu z sacharoza (g s.m./I) Gie I Gal I Man I Fru I Suma EPS wytworzony w obecnosci 5% sacharozy w podlozu produkcyjnym IB83394 26.4±0.8 95.6±0.8 1 0.4±0.1 1 o.6±0.8 I 0.3±0.la 196.9±0.8 EPS wytworzony w obecnosci 10% sacharozy w podlozu produkcyjnym IB83394 48.9±0.9 94.9±0.8 I o.5±0.2 I 0.5±0.8 I o.3±0.2a 196.2±0.8 Przyklad 9. Badania wplywu EPS produkowanego przez Weissella sp. IBB3394 {KKP 2094p) na S. aureus IBB4005 i L. lactis IL1403 Ocene aktywnosci antagonistycznej EPS wytwarzanego przez szczep I8B3394, przeprowadzono metoda podobna do opisanej dla oznaczenia aktywnosci antagonistycznej szczepów Weissella sp. w Przykladzie 2. W tym przypadku na szalki ze szczepami wskaznikowymi nakrapiano okreslone stezenia (20, 10, 5, 2,5, O mg/ml) swiezego i przechowywanego przez 6 miesiecy w warunkach chlodniczych EPS wobec kontroli pozytywnych - nizyny w róznych stezeniach (100, 50, 20, 10, 5, 2,5 mg/ml). Wyniki uzyskane w odniesieniu do róznych stezen nizyny wskazuja, ze EPS z Weisse!la IB83394 dla wiekszosci badanych stezen nie hamowal wzrostu 5. aureus (Fig. 6a), z wyjatkiem stezenia 20 mg/ml, które wykazywalo bardzo niewielkie zahamowanie. Ponadto zaobserwowano, ze zadne stezenie EPS nie hamowalo wzrostu L. lactis IL1403 (Fig. 6b).
Przyklad 10. Badanie cytotoksycznosci egzopolisacharydu {EPS) izolowanego z hodowli szczepu Weissella sp. IBB3394 {KKP 2094p) Badanie przeprowadzono wedlug metody opisanej przez Vosough et al., 2021, z modyfikacjami. Linie komórkowe gruczolakoraka Caco-2 (ATCC HTB-37) oraz komórki embrionalne nablonka nerki linii HEK293 (ATTC CRL-1573) hodowano w warunkach optymalnych, zalecanych przez ATCC, tj. w 37°C, 5% CO2, wilgotnosc 95%. Podlozem (dalej zwanym podlozem dla linii komórkowych) stosowanym w hodowli byl MEM (Minimal Essential Medium; Gibco) wzbogacony 10% bydleca surowica plodowa, roztworem aminokwasów (NEAA - non-essential amino acid solution) (lX), 1 mM pirogronianem sodu, dodatkiem penicyliny (100 U/ml) i streptomycyny (100 µg/ml). Liczbe komórek linii komórkowych okreslano w komorze Thoma. Komórki rozcienczano w ww. podlozu dla linii komórkowych do uzyskania gestosci 10 komórek/ml i nanoszono na plytke 96-dolkowa po 100 µI zawiesiny komórek na dolek i inkubowano przez 24 godziny w warunkach optymalnych. Na plytki 96-dolkowe, zawierajace komórki Caco-2 lub HEK293 po 24-godzinnej hodowli znad których uprzednio zebrano pozywke, nakladano po 100 µI zawiesiny egzopolisacharydu o stezeniach 30, 20, 10, 5 i 2,5 mg/ml w podlozu dla linii komórkowych. Plytki inkubowano 24 godziny w 37 °C, 5% CO2 i wilgotnosci 95%, a nastepnie oceniano zywotnosc komórek linii PL 443929 A1 23/34 komórkowych metoda kolorymetryczna przy uzyciu komercyjnie dostepnego testu proliferacji Cell Proliferation Kit I, MTT (Roche). Pomiar absorbancji prowadzono przy dlugosciach fali 570 i 680 nm.
Doswiadczenie wykonywano w 10 powtórzeniach technicznych i 3 powtórzeniach biologicznych. Kontrole stanowily hodowle komórek Caco-2 i HEK293 traktowane podlozem bez egzopolisacharydu.
Przezywalnosc liczono z nastepujacego wzoru: Przezywalnosc[%] = OD próbki_ · 100%, natomiast OD kontroli cytotoksycznosc ze wzoru: Cytotoksycznosc[%] = 100% - Przezywalnosc[%]. Ze wzgledu na duza lepkosc zawiesiny egzopolisacharydu, stezenie 30 mg/ml zostalo wybrane jako najwyzsze mozliwe do zastosowania w tym doswiadczeniu. Analizy statystyczne przeprowadzono z uzyciem testów Shapiro­ Wilka i wieloczynnikowej analizy wariancji (ANOVA).
Wyniki przedstawiono na rysunkach (Fig. 7-10). Traktowanie linii komórkowych stezeniami egzopolisacharydu od 2,5 do 30% nie spowodowalo istotnego statystycznie zahamowania proliferacji, tym samym potwierdzajac brak cytotoksycznosci badanego EPS.
Przyklad 11. Test wrazliwosci na antybiotyki Ocene bezpieczenstwa wybranego szczepu Weissella sp. IBB3394 przeprowadzono wykonujac oznaczenie antybiotykowrazliwosci przy uzyciu pasków E-test (bioMerieux) zgodnie z zaleceniami producenta.
Badany szczep wysiano na podloze stale IST-MRS i inkubowano w temperaturze 30 °C w warunkach tlenowych. Uzyskane kolonie wykorzystano do przygotowania zawiesiny bakteryjnej w PBS o 00600nm = 0,25 - skala McFarlanda 1, która nastepnie rozprowadzano wymazówka po powierzchni szalek w róznych kierunkach, w celu zapewnienia, równomiernego rozprowadzenia szczepu. Na powierzchni szalki umieszczono paski z antybiotykiem i plytki inkubowano w temperaturze 30 °C przez 48 h w warunkach tlenowych. Wykonano oznaczenie opornosci szczepu na 9 antybiotyków (zgodnie z zaleceniami EFSA): ampicyline (AM), wankomycyne (VA), gentamycyne (GM), kanamycyne (KM), streptomycyne (SM), erytromycyne (EM), klindamycyne (CM), tetracykline (TC) i chloramfenikol (CL).
Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 6. Wykazano, ze minimalne stezenie hamujace (MIC) w stosunku do wszystkich badanych antybiotyków bylo ponizej wartosci granicznych rekomendowanej przez EFSA.
Tabela 6. Wyniki badania wrazliwosci szczepu IBB3394 (KKP 2094p) na antybiotyki.
Minimalne stezenie hamujace (MIC} Stezenia graniczne MIC rekomendowane przez EFSA [µg/ml] [µg/ml] Antybiotyk 18B3394 Lactobacillusy Leuconostoc spp. heterofermentatywne AM 0,38-0,5 2 2 VA >256 * * GM 4 16 16 KM 16 32 16 PL 443929 A1 24/34 SM 8 64 64 EM 0,094 1 1 CM 0.016 1 1 TC 2 8 8 CL 2-3 4 4 * Nie wymagane (opornosc naturalna) Przyklad 12. Analiza genomu szczepu 1B83394 {KKP 2094p) Ze szczepu Weissella IBB3394 wyizolowano DNA, który nastepnie zostal poddany sekwencjonowaniu calego genomu w Srodowiskowej Pracowni Sekwencjonowania i Syntezy DNA w IBB PAN z wykorzystaniem platformy lllumina MiSeq (lllumina, San Diego, USA) i sekwenatora GridlON (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, Wielka Brytania).
Do analizy bioinformatycznej wykorzystano rózne serwery, oprogramowanie i bazy danych. Serwis RAST zostal wykorzystany do oznaczenia sekwencji kodujacych (CDS) i niekodujacego RNA (Aziz i in., 2008).
Ogólna analiza sekwencji genomowej szczepu IBB3394 wykazala, ze szczep posiada kolisty chromosom DNA o wielkosci 2 488 843 bp i 44,8% zawartosci GC, podczas gdy liczba calkowitych sekwencji kodujacych (CDS) wynosila 2 313. Analiza sekwencji genomu szczepu wykazala, ze nalezy on do gatunku Weissella cibaria. Do analizy funkcjonalnej genów wykorzystano baze danych KEGG (Kanehisa i in., 2022) oraz automatyczna usluge adnotacji BlastKOALA (Kanehisa i in., 2016). Stwierdzono, ze szczep koduje 172 rózne szlaki metaboliczne. Wsród 30 kompletnych modulów szlaków znaleziono m.in. kompletne szlaki biosyntezy witamin, takich jak ryboflawina (witamina B12) i menachinon (witamina K2) oraz szlak odzyskiwania tiaminy (witamina Bl). Analize bezpieczenstwa przeprowadzono poprzez wyszukanie domniemanych czynników wirulencji za pomoca narzedzia VirulenceFinder. Ocene przeprowadzono porównujac sekwencje calego genomu IBB3394 ze znanymi genami wirulencji Enterococcus, E. coli, S. aureus i Listeria. Wynik wskazuje, ze w genomie IBB3394 nie ma genów wirulencji. W rezultacie stwierdzono, ze IBB3394 nie posiada zadnych toksycznych ani patogennych genów zwiazanych z dobrze znanymi patogenami Enterococcus, E. coli, S. aureus i Listeria. Wynik zostal równiez potwierdzony przez analize sekwencji calego genomu przy uzyciu innego serwera sieciowego do przewidywania patogennosci bakterii - PathogenFinder. To narzedzie nie sklasyfikowalo szczepu IBB3394 jako patogenu. Analiza genomu z wykorzystaniem róznych narzedzi bioinformatycznych rekomendowanych przez EFSA, takich jak ResFinder, CARO i RGI oraz KEGG, nie wykazala w szczepie IBB3394 obecnosci genów opornosci na antybiotyki (ARG). Poprzez analize sekwencyjna potwierdzono bezpieczenstwo wykorzystania szczepu jako probiotyku oraz szczepu do zastosowan przemyslowych, spozywczych i medycznych.
Przyklad 13. Wytwarzanie pieczywa na zakwasie zawierajacym Weissella cibaria 1B83394 {KKP 2094p) Pieczywo z dodatkiem drozy piekarskich wytworzono z wykorzystaniem maki zytniej pelnoziarnistej. PL 443929 A1 /34 Do wytworzenia zakwasów wykorzystano opisana w patencie PL238153B1 kulture starterowa zawierajaca szczepy Lactobacillus plantarum B/00117, Lactobacillus plantarum B/00118 i Lactobacillus brevis w proporcji 1:1:1 jako kontrole oraz ten sam zestaw uzupelniony o szczep W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) w proporcji 1:1:1:1 jako próbie badanej.
Zakwasy wytworzono jak w Przykladzie 3 opisanym w patencie PL238153B1.
Pieczywo przygotowano wedlug nastepujacej receptury (dla chlebów o wadze 0,5 kg).
Przygotowanie surowców i ich ilosci na okolo 1 kg ciasta: maka zytnia typ 2000 zakwas z maki zytniej typ 2000 drozdze piekarskie sól woda (temp. 38°() Wytwarzanie i sporzadzanie ciasta wlasciwego czas miesienia - wolne obroty czas miesienia - szybkie obroty temperatura ciasta wlasciwego Dzielenie, formowanie, ksztaltowanie ciasta wlasciwego masa kesa czas dzielenia i ksztaltowanie ciasta na kesy czas fermentacji ciasta wlasciwego w kesach Proces wypieku temperatura wypieku: czas wypieku 0,5 kg 0,17 kg 0,006 kg 0,012 kg okolo 0,31 kg 7 min. 3 min. do 35 °C 0,5 kg 45 min. do 90 min. 200°c 60 min.
Do oceny pieczywa stosowano metody opisane w PL238153B1. Otrzymane pieczywo poddano ocenie organoleptycznej wg PN-A-74108:1996, analize przeprowadzono metoda punktowa przez panel o sprawdzonej wrazliwosci sensorycznej. Po wypieczeniu wykonano analize wilgotnosci miekiszu oraz profilu tekstury miekiszu upieczonych chlebów. Dla wytworzonego pieczywa wyznaczono równiez trwalosc mikrobiologiczna. Otrzymane chleby przechowywano przez 7 dni w celu okreslenia zmian zachodzacych podczas starzenia sie pieczywa.
Dla chleba z dodatkiem zakwasu wytworzonego z W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) zaobserwowano zwiekszona elastycznosc miekiszu z zachowaniem chrupkosci skórki chleba, polepszenie smaku i zapachu otrzymanego chleba w porównaniu do kontroli. Pieczywo z dodatkiem W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) charakteryzowalo sie zwiekszona objetoscia bochenka i wyzsza wilgotnoscia miekiszu, znaczaco mniejsza twardoscia i zujnoscia miekiszu w porównaniu do pieczywa kontrolnego. Pieczywo na zakwasie suplementowanym W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) wykazuje taka sama trwalosc mikrobiologiczna (przez 3 dni) jak pieczywo kontrolne. Otrzymane pieczywo uzyskalo wyzsza ocene organoleptyczna od pieczywa kontrolnego. PL 443929 A1 26/34 LITERATURA: [1] Aziz i wsp. (2008). The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC genomics, 9(1):1-15. [2] Badel i wsp. (2011). New perspectives for lactobacilli exopolysaccharides, Biotechnol Adv, 29:54-66. [3] Baruah i wsp. (2016). Functional food applications of dextran from Weissella cibaria RBA12 from pummelo (Citrus maxima). Int J Food Microbiol, 242:124-31. [4] Boyce i Havill (2005). Nosocomial antibiotic-associa-ted diarrhea associated with enterotoxin-producing strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Am J Gastroenterol, 100:1828-34. [5] Boyce i wsp. (2007).
Widespread environmental contamination associated with patients with diarrhea and methicillin­ resistant Staphylococcus aureus colonization of the gastrointestinal tract. lnfect Control Hosp Epidemio!, 28:1142-7. [6] Buksa i wsp. (2021). Extraction, purification and characterisation of exopolysaccharides produced by newly isolated lactic acid bacteria strains and the examination of their influence on resistant starch formation. Food Chem, 362, 130221. [7] Collins i wsp. (1993). Taxonomic studies on same leuconostoc-like organisms from fermented sausages: description of a new genus Weissella for the Leuconostoc paramesenteroides group of species. J Appl Bacteriol, 75:595-603. [8] Dey i Kang (2020).
Weissella confusa DD_A7 pre-treatment to zebrafish larvae ameliorates the inflammation response against Escherichia coli 0157: H7. Microbiol Res, 237, 126489. [9] EFSA (2018) Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP),. Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms. EFSA J 16(3), e05206. [10] EL-Adawi i wsp. (2012). Cytotoxicity assay and antioxidant activities of the lactic acid bacterial strains. African J Microbiol Res, 6(8):1700-12. [11] Elshaghabee i wsp. (2020). Effect of oral administration of Weissella confusa on fecal and plasma ethanol concentrations, lipids and glucose metabolism in wistar rats fed high fructose and fat diet. Hepatic Med, 12:93-106. [12] Han i wsp. (2016). lmprovement of the texture of yogurt by use of exopolysaccharide producing lactic acid bacteria, BioMed Res Int, 7945675. [13] Hu i Ganzle (2018) Effect of temperature on production of oligosaccharides and dextran by Weissella cibaria M. Int J Food Microbiol 280:27-34. [14] Jin i wsp. (2019). Isolation and characterization of high exopolysaccharide-producing Weissella confusa VP30 from young children's feces. Microbl Cell Factories, 18, 110. [15] Kang i wsp. (2019). Safety evaluation of oral care probiotics Weissella cibaria CMU and CMSl by phenotypic and genotypie analysis. Int J Mol Sci, 20(11), 2693. [16] Kanehisa i wsp. (2022). KEGG mapping tools for uncovering hidden features in biological data. Protein Science, 31(1):47-53. [17] Kanehisa i wsp. (2016). BlastKOALA and GhostKOALA: KEGG tools for functional characterization of genome and metagenome sequences. J Mol Biol, 428(4):726-31. [18] Kavitake i wsp. (2020). Overview of exopolysaccharides produced by Weissella genus - A review. Int J of Bio/1 Macromol, 164:2964-73. [19] Kavitake, i wsp. (2016). Characterization of a novel galactan produced by Weissella confusa KR780676 from an acid ie fermented food. International journal of biologica/ macromolecules, 86, 681-689. [20] Kim i wsp. (2008). Characterization of exopolysaccharide (EPS) produced by Weissella hellenica SKkimchi3 isolated from kimchi. J Microbiol, 46(5):535-41. [21] lan i wsp. (2012). Bio-protective potentia! of lactic acid bacteria isolated from fermented wax gourd. Folia Microbiol, 57(2):99-105. [22] Le i wsp. (2020).
Synbiotic fermented soymilk with Weissella cibaria FB069 and xylooligosaccharides prevents proliferation in human colon cancer cells. J Appl Microbiol, 128(5):1486-96. [23] Lee i wsp. (2012). Probiotic properties of Weissella strains isolated from human faeces. Anaerobe, 18:96-102. [24] Lee i wsp. (2015).
Multifunctional effect of probiotic Lactococcus lactis KC24 isolated from kimchi. LWT- Food Sci Techno!, 64:1036-1041. [25] Lim, i wsp. (2018). Characterization of antibacterial cell-free supernatant from oral care probiotic Weissella cibaria, CMU. Mo/ecu/es, 23(8), 1984. [26] Litwinek i wsp. (2022). Developing lactic acid bacteria starter cultures for wholemealrye flour bread with improved functionality, nutritional value, taste, appearance and safety. PLoS ONE 17(1), e0261677. [27] Lynch i wsp. (2018). Lactic acid bacteria exopolysaccharides in foods and beverages: isolation, properties, characterization, and health benefits, Annu Rev Food Sci Techno!, 9:155-76. [28] Mun i Chang (2020). Characterization of Weissella koreensis SK isolated from kim chi fermented at low temperature (around O degrees C) based on complete genome sequence and corresponding phenotype. Microorganisms, 8, 1147. [29] Ndagano i wsp. (2011).
Antifungal activity of 2 lactic acid bacteria of the Weissella genus isolated from food. J Food Sci, 76(6):M305-M311. [30] Onanuga i Temedie (2011). Multidrug-resistant intestinal Staphylococcus aureus among self-medicated healthy adults in Amassoma, South-South, Nigeria. J Health Popu/ Nutr, PL 443929 A1 27/34 29(5):446-53. [31] Patrone i wsp. (2021). Integrated phenotypic-genotypic analysis of candidate probiotic Weissella ci baria strains isolated from dairy cows in Kuwait. Probiotics Antimicrob Proteins, 13(3), 809-23.
[32] Prado i wsp. (2020). Weissella paramesenteroides WpK4 ameliorate the experimental amoebic colitis by increasing the expression of M UC-2 and the intestinal epithelia I regeneration. J Appl Microbiol, 129(6): 1706-19. [33] Vosough i wsp. (2021). Evaluation of antioxidant, antibacterial and cytotoxicity activities of exopolysaccharide from Enterococcus strains isolated from traditional lranian Kishk. Food Measure, :5221-30. [34] Saadat i wsp. (2019). A comprehensive review of anticancer, immunomodulatory and health beneficial effects of the lactic acid bacteria exopolysaccharides, Carbohydr Polym, 217:79-89. [35] Salanski i wsp. (2022). Health-promoting nature of L. lactis 18B109 and 18B417 strains exhibiting proliferation inhibition and stimulation of interleukin-18 expression in colorectal cancer cells-insights at physiological and genomie level. Front Microbiol, 1825. [36] Sandes i wsp. (2020). Weissella paramesenteroides WpK4 plays an immunobiotic role in gut-brain axis, reducing gut permeability, anxiety­ like and depressive-like behaviors in murine models of colitis and eh ro nic stress. Food Res Int, 137, 109741.
[37] Sokolowska-Wojdylo (2021). Infekcje gronkowcowe skóry - problem wciaz aktualny. Wiadomosci dermatologiczne 11, 24 wrzesnia 2021 [38] Tao i wsp. (2017). Database and bioinformatics studies of probiotics. J Agric Food Chem, 65(35): 7599-606. [39] Teixeira i wsp. (2021). Weissella: an emerging bacterium with promising health benefits. Probiotics Antimicrob Proteins, 13:915-25. [40] Torino i wsp. (2015). Biopolymers from lactic acid bacteria. Novel applications in foods and beverages. [Review]. Front Microbiol, 6, 834. [41] Valerio i wsp. (2020). Effect of Amaranth and Quinoa Flours on exopolysaccharide production and protein profile of liquid sourdough fermented by Weissella cibaria and Lactobacillus plantarum. Front Microbiol 11, 967. [42] Vasanthakumari i wsp. (2015). Physicochemical characterization of an exopolysaccharide produced by a newly isolated Weissella cibaria. Appl Biochem Biotechnol, 176(2):440-53. [43] Wolter i wsp. (2014) Evaluation of exopolysaccharide producing Weissella cibaria MGl strain for the production of sourdough from various flours. Food Microbiol 37:44-50. [44] Xu i wsp. (2017). In situ synthesis of exopolysaccharides by Leuconostoc spp. and Weissella spp. and their rheological impacts in fava bean flour. Int J Food Microbiol, 248:63-71. [45] Yeu i wsp. (2021).
Antimicrobial and antibiofilm activities of Weissella cibaria against pathogens of upper respiratory tract infections. Microorganisms, 9(6), 1181. [46] Yildiz i Karatas (2018). Microbial exopolysaccharides: Resources and bioactive properties. Process Biochemistry, 72:41-6. [47] Yu i wsp. (2019a). Antagonistic and antioxidant effect of probiotic Weissella cibaria JW15. Food Sci Biotechnol, 28:851-5. [48] Yu i wsp. (2019b). Anti-lnflammatory potentia! of probiotic strain Weissella cibaria JW15 isolated from kimchi through regulation of NF-KB and MAPKs pathways in LPS-induced RAW 264.7 cells. J Microbiol Biotechnol, 29:1022-32. [49] Zeidan i wsp. (2017). Polysaccharide production by lactic acid bacteria: From genes to industrial applications. FEMS Microbiol Rev, 41(Supp_l):S168-S200. [SO] Zhang i wsp. (2018) Characterization of a yogurt-quality improving exopolysaccharide from Streptococcus thermophilus AR333, Food Hydroco/1, 81 :220-8. [51] Zhou i wsp. (2018) Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: structure, bioactivity and associations: a review, Carbohydr Polym, 207:317-32. PL 443929 A1 28/34 ZASTRZEZENIA PATENTOWE 1. Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, zdeponowany w IAFB (Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego w Warszawie, Polska) pod nr depozytu KKP 2094p. 2. Kompozycja zawierajaca nowy szczep bakterii Weissella cibaria, zdeponowany w IAFB pod nr depozytu KKP 2094p. 3. Kompozycja wedlug zastrz. 2, znamienna tym, ze jest kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ponadto dopuszczalny farmaceutycznie nosnik, przy czym korzystnie kompozycja jest w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego. 4. Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca szczep bakterii Weissella cibaria jak okreslony w zastrz. 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 3 oraz dopuszczalny farmaceutycznie nosnik do zastosowania jako lek.
. Kompozycja farmaceutyczna wedlug zastrz. 4, znamienna tym, ze jest do zastosowania jako lek do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita, korzystnie do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita grubego, najkorzystniej gruczolakoraka jelita grubego. 6. Suplement diety zawierajacy szczep bakterii Weissella cibaria jak okreslony w zastrz. 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 3, przy czym suplement diety korzystnie jest w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego. 7. Preparat probiotyczny zawierajacy szczep bakterii Weissella ci baria jak okreslony w zastrz. 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 3, przy czym preparat probiotyczny korzystnie ponadto zawiera substancje prebiotyczne, korzystnie wybrane z oligosacharydów, polisacharydów, fruktooligosacharydów, laktulozy, inuliny, skrobi opornej, celulozy, hemicelulozy i pektyn, przy czym preparat korzystnie ponadto zawiera postbiotyki, korzystnie postbiotyki wybrane sa z krótkolancuchowych kwasów tluszczowych, enzymów, lipopolisacharydów, kwasów tejchojowych, witamin, kwasu maslowego, octanu, propionianu, dipeptydu muramilu, indlu, kwasu teichowego, laktocepin. 8. Preparat probiotyczny wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze jest w postaci w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego. 9. Bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, znamienna tym, ze w jej sklad wchodzi szczep Weissella ci baria jak okreslony w zastrz. 1.
. Zakwas do wyrobu pieczywa, znamienny tym, ze zawiera bakteryjna kulture starterowa jak okreslona w zastrz. 9. 11. Sposób wytwarzania pieczywa znamienny tym, ze obejmuje etap dodawania bakteryjnej kultury starterowej jak okreslonej w zastrz. 9 i/lub zakwasu jak okreslonego w zastrz. 10. PL 443929 A1 29/34 12. Pieczywo, znamienne tym, ze zawiera bakteryjna kulture starterowa jak okreslona w zastrz. 9 i/lub zakwas jak okreslony w zastrz. 10. 13. Sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, znamienny tym, ze obejmuje etap, w którym szczep bakterii Weissella cibaria jak okreslony w zastrz 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 2 hoduje sie na plynnym podlozu bez dekstrozy (bez glukozy) z dodatkiem sacharozy, organicznym zródlem azotu zawierajacym aminokwasy i krótkie peptydy, witaminy z grupy B i sole mineralne. 14. Sposób wedlug zastrz. 13, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie na podlozu MRS (bulion DeMan­ Rogosa-Sharpe), podlozu dla bakterii mlekowych, korzystnie z dodatkiem 5-10%±2 wag. sacharozy.
. Preparat bakteryjny zawierajacy szczep bakterii Weissella cibaria jak okreslonej w zastrz 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 2 do zastosowania jako skladnik czynny w probiotyku, preparacie terapeutycznym, zywnosci funkcjonalnej, suplemencie diety, do zastosowania jako skladnik aktywny leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita, korzystnie nowotworu jelita grubego. 16. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 jako dodatku funkcjonalnego w zywnosci funkcjonalnej, dodatku funkcjonalnego do napoju spozywczego, jako skladnika aktywnego preparatu probiotycznego, preparatu bakteryjnego, suplementu diety, kompozycji farmaceutycznej. 17. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 w przemysle spozywczym jako emulgator, zageszczacz, stabilizator lub polepszacz tekstury produktu spozywczego. 18. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 do mikrobiologicznego wytwarzania egzopolisacharydów (EPS), korzystnie dekstranu. 19. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 i/lub bakteryjnej kultury starterowej jak okreslonej w zastrz. 9 do wytwarzania zakwasu do pieczywa.
. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 i/lub zakwasu do wyrobu pieczywa jak okreslonego w zastrz. 10 do wytwarzania pieczywa. PL 443929 A1 /34 FIG.1 FIG. 2 PL 443929 A1 31/34 -; o lilll -; ,___, ? -; w :::r o C. o :e iii" :::, o n ::, l:IJ Ili C: "C ro ...
:::, Il.) .... l:IJ :::, .... ro ;;:;- Ili .... .... !lJ ;;:;- ...
N l:IJ ~- 1'D !!!, :::, "'C w o, ;;:;- VI O 3 O, ... li) " :ie I-" N .i:,. Cil 00 O o o o o o o * * * * * * o * o * o * l~~ o * il~ .I * ......
N o * ,___, N N * "T1 G') .,::a w w I sx:i o I Spadek w rzedach wielkosci liczby bakterii I _:--J o I ,en o I I ,U"I o I I I I ,.f::> o I !-'J o I I _!'J o I I !-" o I o o ~ IBB3714 IBB3715 IBB3716 I8B3717 IBB3277 IBB3278 IBB3279 I8B3385 IBB3386 IBB3387 IB83388 IB83389 IBB3393 IBB3394 I8B3287 I8B3325 IBB3326 IBB3327 I8B3382 I8B3383 IBB3384 IBB3280 IB83281 IBB3282 1B83284 IBB3285 I8B3286 "T1 G') w PL 443929 A1 32/34 2.5 - ]2.0 I ~ < 1.5 - ca "o' s:: 1.0 ca .c ~ o fi) 0.5 .c o.o FIG. 5 Kontrola 3394 IB6109 IL6288 FIG. 6 PL 443929 A1 33/34 FIG. 7 FIG. 8 Caco-2 HEK293 100 100 ~ ~ •O •O •li) •li) o o C: C: I 50 «i 50 ::: >, •N ·N QI QI t::! t::! D.. D.. o o Kontrola 2,5 5 10 20 30 Kontrola 2,5 5 10 20 30 Stezenie EPS [mgfml] Stezenie EPS [mgfml] FIG. 9 FIG.10 Caco-2 HEK293 -10 ....... 10 ~ '::§!.
L 2...
•(J •U •fi) •li) o o C C N N (.) (.) >, >, fi) li) ~ -li:: o o - .... o o .. >, o .... >, o (.) (.) 2,5 5 10 20 30 2,5 5 10 20 30 Stezenie EPS [mg/ml] Stezenie EPS [mg/ml] PL 443929 A1 34/34 al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.443929 Klasyfikacja zgloszenia: Cl2N 1/20, Cl2R 1/01, A61K 35/744, A61K 31/721, A61P 35/00, Cl2P 19/08, A21D 8/04, A21D 13/06 Podklasy w których prowadzono poszukiwania: Cl2Nl Cl2Rl A61K35 A61K31 A61P35 Cl2Pl9 A21D8 A21Dl3 Bazy komputerowe w których prowadzono poszukiwania: EPODOC WPI bazy UPRP STN Kategoria dokumentu Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie do zastrz.
A PL4 l 1242 A (Instytut Biotechnologii Przemyslu Rolno-Spozywczego im. 1-20 Waclawa Dabrowskiego , Warszawa) 16-02-2015 zastrzezenia 1-15, przyklady A EP4098271 Al (LISCURE BIOSCI CO LTD [KR]) 07-12-2022 1-20 zastrz. 1-15, Fig. 1-5 A EP38957 17 Al (KOREA FOOD RES INST) 20-10-2021 1-20 zastrz. 1-3, abstrakt A Ahmed, S.; Singh, S. ; Singh, V.; Roberts, K.D. ; Zaidi, A.; Rodriguez-Palacios, A., 1-20 The Weissella Genus: Clinically Treatable Bacteria with Antimicrobial/Probiotic Effects on Inflammation and Cancer, Microorganisms, 2022, 10, 2427, https://doi.org/10.3390/ rnicroorganismsl0122427 abstrakt, str. 10-11 O Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A- dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytowanego dokumentu lub z innego szczególnego powodu, O - dokument odnoszacy sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za nowy lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej.
Sprawozdanie wykonali-a: Ewa Waszkowska Ekspert Data: 29.05.2023 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 28.02.2023r.
Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego

Claims (20)

PL 443929 A1 2/34 Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, kompozycja go zawierajaca, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujace ten szczep DZIEDZINA TECHNIKI Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii fermentacji mlekowej Weissella cibaria, zdeponowany w dniu 6 lutego 2023 (06.02.2023) jako KKP 2094p w kolekcji KKP tj. w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego (Instytut Biotechnologii Przemyslu Rolno­ Spozywczego im. prof. Waclawa Dabrowskiego - Panstwowy Instytut Badawczy w Warszawie, Polska) (IAFB, Culture Collection of Industrial Microorganisms, prof. Waclaw Dabrowski, IAFB-SRI). Przedmiotem wynalazku jest równiez kompozycja zawierajaca Weissella cibaria KKP 2094p, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujace ten szczep szczególnie do zapobiegania i/lub leczenia, korzystnie leczenia nowotworu jelita, korzystnie nowotworu jelita grubego. Biomasa szczepu Weissella cibaria KKP 2094p sluzy do biotechnologicznego wytwarzania dekstranu, do prowadzenia zakwasów oraz do zastosowania jako probiotyk. Wyselekcjonowany pod katem optymalnego efektu technologicznego w biotechnologicznej produkcji dekstranu, korzystnych wlasciwosci technologicznych do produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie oraz pod katem korzystnych wlasciwosci prozdrowotnych do zastosowan probiotycznych i zdolnosci do przetrwania w warunkach imitujacych przewód pokarmowy. Przedmiotem wynalazku jest równiez zastosowanie bakteryjnego szczepu Weissella ci baria KKP 2094p do wytwarzania dekstranu, do konstruowania kultur starterowych do produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie oraz jako szczep probiotyczny o korzystnych wlasciwosciach w srodowisku skóry, oraz przewodu pokarmowego. Szczep Weissella cibaria KKP 2094p wykazuje wysoka wydajnosc produkcji dekstranu, aktywnosci przeciwdrobnoustrojowe i przeciwnowotworowe, wysoka opornosc na sole zólciowe i niskie pH, mozna go stosowac do biotechnologicznego wytwarzania dekstranu, jako szczep o korzystnych wlasciwosciach technologicznych do produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie oraz jako szczep probiotyczny. PL 443929 A1 3/34 STAN TECHNIKI Po raz pierwszy bakterie z rodzaju Weissella odkryto w 1993 roku w fermentowanych kielbasach. Rodzaj ten zalicza sie do rodziny Lactobacillaceae, która nalezy do znanej grupy bakterii fermentacji mlekowej [z ang. lactic acid bacteria (LAB)] (Collins i wsp., 1993). Weissella spp. sa Gram-dodatnie, katalazo-ujemne, ich komórki o morfologii ziarniaków lub paleczek nie tworza endospor. Szczepy i gatunki Weissella od dawna sa izolowane z róznych srodowisk i maja rózne zastosowania aplikacyjne. Fermentowane produkty spozywcze, takie jak jogurt, zakwas i kimchi, sa jednymi ze zródel, z których mozna wyizolowac bakterie Weissella (Mun i Chang, 2020; Valerio i wsp., 2020). Szczepy Weissella odgrywaja kluczowa role w ksztaltowaniu smaku i tekstury zywnosci podczas fermentacji. Wiekszosc literatury naukowej dotyczacej Weissella spp., w szczególnosci Weissella confusa i Weissella cibaria koncentruje sie na wytwarzaniu i charakterystyce egzopolisacharydów (EPS) (Hu i Ganzle, 2018). W. confusa i W. cibaria moga wytwarzac dekstrany o duzych masach. Te polisacharydy zwiekszaja elastycznosc pieczywa, a ich zastosowanie w wypiekach bezglutenowych wydaje sie obiecujace (Wolter i wsp., 2014). W produktach kosmetycznych sa stosowane jako srodki nawilzajace i modyfikatory reologii (Yildiz i Karatas, 2018). Dekstran dziala kojaco, poprawia nawilzenie skóry. Jest stabilizatorem emulsji. Zatrzymuje wilgoc na powierzchni skóry i zapobiega wysychaniu kosmetyków. EPS produkowane przez LAB zyskaly popularnosc na przestrzeni lat ze wzgledu na ich mozliwe cechy funkcjonalne i technologiczne (Lynch i wsp., 2018). Wykazano, ze Weissella i Leuconostoc wytwarzaja znaczne ilosci EPS wsród LAB (Kavitake i wsp., 2016). W szczególnosci rodzaj Weissella jest odpowiedzialny za znaczna produkcje dekstranu (Kim i wsp., 2008). Weissella hellenica, W. confusa i W. cibaria to producenci EPS z rodzaju Weissella, który wytwarza wiele EPS o róznej strukturze i skladzie chemicznym. Bakterie z rodzaju Weissella wykorzystuja szlak syntezy polisacharydów pozakomórkowych do produkcji glukanu, dekstranu, lewanu, galaktanu i fruktanu, które sa homo lub heteropolisacharydami (Zhou i wsp., 2018). Na produkcje EPS wplywa wiele cukrów, które obejmuja monosacharydy, takie jak glukoza, mannoza, galaktoza, fruktoza i oligosacharydy: laktoza; sacharoza, rafinoza. Wyjatkowe cechy technologiczne EPS LAB sprawiaja, ze zajmuja one istotna pozycje w przemysle spozywczym jako skuteczne emulgatory, zageszczacze, stabilizatory lub polepszacze tekstury (Han i wsp., 2016; Zhang i wsp., 2018). Buksa i wsp. wykazali ostatnio, ze 1,5% udzial dekstranu ogranicza tworzenie sie skrobi opornej w pastach skrobiowych podczas przechowywania. Prace te dostarczaja nowych informacji na temat utrudniania tworzenia opornej skrobi dzieki zastosowaniu EPS, które mozna wydajnie wytwarzac w zakwasie, poprawiajac w ten sposób wlasciwosci chleba na zakwasie (Buksa i wsp. 2021). EPS maja równiez niesamowite wlasciwosci biologiczne poprzez dzialanie prebiotyczne, przeciwutleniajace, przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe i immunomodulujace (Badel i wsp., 2011; Saadat i wsp., 2019; Xu i wsp., 2017). Aby zostac sklasyfikowanym jako prebiotyk, substancje nie podlegajace trawieniu, w tym m.in. EPS musza bardziej stymulowac wzrost bakterii probiotycznych niz PL 443929 A1 4/34 bakterii obecnych w jelicie. Wykazano, ze dekstran wytwarzany przez W. cibaria stymuluje wzrost L. plantarum, L. acidophilus, 8. anima/is, 8. bifidum i 8. infantis bardziej niz f. coli i f. aerogenes (Baruah i wsp., 2016). Ta aktywnosc potwierdzila klasyfikacje dekstranu jako zwiazku prebiotycznego. Dane literaturowe dotyczace róznych szczepów bakterii mlekowych wskazuja, iz ilosc produkowanych EPS jest zwykle wyzsza niz 1 g/I (Torino i wsp., 2015; Vasanthakumari i wsp., 2015) a w przypadku kilku szczepów osiaga wartosc okolo 10 g/I (Zeidan i wsp., 2017). Najwyzsza wydajnosc produkcji dekstranu odnotowano jako 24,8 g/I dla szczepu W. cibaria 27 wyizolowanego z kimchi (Kavitake i wsp., 2020). Przeprowadzona ostatnio analiza EPS wytwarzanych przez wybrane cztery szczepy Weissella confusa/cibaria wykazala róznice w wydajnosci produkcji EPS w granicach od 3.2 g/I do 47.1 g/I i pozwolila na okreslenie rodzaju produkowanego EPS jako dekstran (Buksa i wsp. 2021). Dostepnosc nowych szczepów LAB o wlasciwosciach pro-technologicznych ma wielkie znaczenie dla przemyslu. Dlatego badacze koncentruja sie na poszukiwaniu dzikich szczepów ze zródel naturalnych do projektowania nowych, interesujacych przemyslowo starterów, kultur pomocniczych lub bio-ochronnych, a takze probiotyków. Niedawne postepy w badaniach nad mikrobiomem, przyczynily sie do wzrostu zainteresowania i utorowaly droge do badania mechanizmów dzialania probiotyków (Tao i wsp., 2017). Oprócz bakterii z dawnego rodzaju Lactobacillus znanych jest wiele innych niepatogennych szczepów LAB o renomowanym statusie GRAS (z ang. Generally Recognized as Safe), dostarczanym przez FDA w USA lub statusie QPS (z ang. Qualified Presumption of Safety) w Europie, które moga byc brane pod uwage przy wyborze nowych szczepów probiotycznych. Istnieje coraz wiecej dowodów na to, ze wybrane szczepy Weissella sp., które odgrywaja wazna role w wielu procesach fermentacji przemyslowej i spozywczej, przedstawiaja aktywnosc probiotyczna. Wiadomo, ze bakterie z rodzaju Weissella zamieszkuja jelita kregowców, m.in ludzi (Lee i wsp., 2012). Dotychczas stwierdzono, ze bakterie te wplywaja na przepuszczalnosc jelit (Prado i wsp., 2020), zmniejszaja depresje (Sandes i wsp., 2020), regeneruja komórki nablonka jelit (Prado i wsp., 2020), wplywaja na metabolizm (Elshaghabee i wsp .. , 2020) i moga zabijac szkodliwe bakterie (Dey i Kang, 2020). Ponadto wiadomo równiez, ze niektóre szczepy Weissella sp. maja korzystny wplyw na zdrowie czlowieka, m.in. na utrzymanie zdrowej jamy ustnej (Kang i wsp. 2019), leczenie atopowego zapalenia skóry i niektórych nowotworów (Teixeira i wsp., 2021), wykazuja dzialanie antytoksyczne, przeciwnowotworowe czy immunomodulujace (Yu i wsp., 2019a; 2019b; Le i wsp. 2020), ale do tej pory jest to grupa LAB, która nie znalazla sie na liscie gatunków o statusie QPS opublikowanej przez EFSA (Europejski Urzad ds. Bezpieczenstwa Zywnosci). Zastosowanie tych bakterii jako probiotyków wymaga przeprowadzenia analiz bezpieczenstwa (EFSA, 2018). Jest to powodem dotychczas ograniczonego wykorzystania tej grupy LAB jako komercyjne kultury starterowe w przemysle spozywczym czy jako szczepy probiotyczne. Aby mikroorganizmy mogly byc stosowane jako probiotyki musza one byc niepatogenne i niewirulentne i nie moga posiadac genów opornosci na antybiotyki, w szczególnosci na ruchomych elementach PL 443929 A1 5/34 genetycznych. Oprócz tego mikroorganizmy te powinny charakteryzowac sie cechami funkcjonalnymi wplywajacymi korzystnie na zdrowie gospodarza. Zdolnosc do zycia i przetrwania w warunkach przewodu pokarmowego, szczególnie przy wysokich stezeniach soli zólciowych i niskim pH, a takze adhezja do sluzu, macierzy zewnatrzkomórkowej lub komórek nablonka jelita to najwazniejsze cechy probiotyków wspierajace ich dzialanie, (Lee i wsp., 2015). W. cibaria moze wytwarzac kilka substancji o dzialaniu przeciwdrobnoustrojowym. Udokumentowano, ze szczep probiotyczny do stosowania w jamie ustnej (W. cibaria CMU) wykazywal dzialanie przeciwbakteryjne przeciwko patogennym bakteriom Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, oraz Fusobacterium nucleatum, zwiazane ze zdolnoscia do wytwarzania kwasów organicznych, H2O2, kwasów oleinowych i bialek, takich jak N-acetylomuraminaza (Lim i wsp., 2018). W innych badaniach, ten sam szczep (W. cibaria CMU) jak równiez szczep W. cibaria CMSl wykazaly dzialanie przeciwdrobnoustrojowe oraz hamujace tworzenie biofilmu przez szczepy bakterii chorobotwórczych powodujacych zakazenia górnych dróg oddechowych takich jak: Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis (Yeu i wsp., 2021). Badania Patrone i wsp. (2021) wykazaly, ze supernatanty z hodowli szczepów W. cibaria SP7 i SP19 hamowaly wzrost Escherichia coli ATCC 25,922 i Salmonella enterica UC3605 co bylo zwiazane z niskim pH. Szczepy W. cibaria nie tylko wykazuja dzialanie antagonistyczne wobec bakterii chorobotwórczych, ale równiez moga wykazywac zwiekszona zdolnosc do skutecznego obnizania poziomu infekcji grzybiczych (Ndagano i wsp., 2011; lan i wsp., 2012). Obecnie problem narastajacej antybiotykoopornosci wsród wielu patogenów bakteryjnych wymaga nowych strategii wykrywania opracowywania antybiotyków lub innych srodków przeciwdrobnoustrojowych stanowiacych alternatywe dla antybiotyków konwencjonalnych. Oporny na wiele antybiotyków 5. aureus jest jedna z najczestszych przyczyn ciezkich zakazen szpitalnych, a przewód pokarmowy jest waznym zródlem jego przenoszenia (Boyce i wsp., 2007; Onanuga i Temedie, 2011). Jednoczesnie, gronkowce zostaly uznane za patogeny odpowiedzialne za biegunke zwiazana ze stosowaniem antybiotyków u ludzi (Boyce i Havill, 2005). Kolonizacja czlowieka przez fakultatywne patogeny bakteryjne, takie jak 5. aureus, stanowi glówny czynnik ryzyka infekcji inwazyjnych. W ostatnich latach wzrasta liczba infekcji powodowanych zarówno przez 5. aureus, jak i Staphylococcus epidermidis oraz inne koagulazo-negatywne gronkowce. Bakterie te moga byc przyczyna zapalenia stawów, sciegien, wsierdzia, kosci, pluc, ukladu moczowego, protez stawowych, zastawek serca, kateterów, zatruc pokarmowych i infekcji skóry, takich jak: liszajec zakazny, zapalenie mieszków wlosowych, czyraki, gronkowcowe zluszczajace zapalenie stawów (zespól SSSS - staphylococcal scalded skin syndrome), ale moga takze wtórnie infekowac zmiany skórne, np. owrzodzenia (Sokolowska-Wojdylo, 2021). W tym kontekscie bardzo pozadane jest m.in. opracowanie preparatów bazujacych na skladnikach naturalnych, które utrzymaja stan higieny skóry poprzez zabezpieczenie jej przed kolonizacja przez chorobotwórcze bakterie bez zaburzania skladu naturalnej, komensalnej mikrobioty oraz doustnych probiotyków PL 443929 A1 6/34 ograniczajacych rozwój gronkowców w przewodzie pokarmowym ludzi, a tym samym minimalizujacych ryzyko przenoszenia wieloantybiotykoopornych patogenów z jednego z ich glównych rezerwuarów w srodowisku. Z publikacji opisu patentowego PL238153B1 znana jest kultura starterowa zawierajaca szczepy Lactobacillus plantarum B/00117, Lactobacillus plantarum B/00118 i Lactobacillus brevis opisana jako Zestaw 11 stosowana do wytworzenia zakwasów z maki razowej i zytniej oraz wypieku pieczywa z jej wykorzystaniem. UJAWNIENIE WYNALAZKU W swietle opisanego stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest przezwyciezenie wskazanych niedogodnosci i dostarczenie wyselekcjonowanego nowego szczepu bakterii fermentacji mlekowej z rodzaju Weissella sp. o wysokiej wydajnosci produkcji EPS o korzystnych wlasciwosciach technologicznych do produkcji zakwasów i pieczywa, jednoczesnie posiadajacego dodatkowe korzystne wlasciwosci prozdrowotne do zastosowan probiotycznych i przeciwnowotworowych, zdolnosc do przetrwania w warunkach imitujacych przewód pokarmowy oraz potwierdzone bezpieczenstwo stosowania (dopuszczalny poziom opornosci na antybiotyki, brak genów opornosci na antybiotyki, brak genów wirulencji). Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakterii Weissella cibaria, zdeponowanego w KKP (IAFB - Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego w Warszawie, Polska) pod nr depozytu KKP 2094p. Wynalazek równiez dotyczy kompozycji zawierajacej nowy szczep bakterii Weissella cibaria, zdeponowany w KKP (IAFB - Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego w Warszawie, Polska) pod nr depozytu KKP 2094p. Kompozycja jest korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ponadto dopuszczalny farmaceutycznie nosnik, przy czym korzystnie kompozycja jest w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego. Wynalazek ponadto dotyczy kompozycji farmaceutycznej do zastosowania jako lek zawierajacej szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku oraz dopuszczalny farmaceutycznie nosnik do zastosowania jako lek. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna do zastosowania jako lek jest do zastosowania do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita, korzystnie do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita grubego, najkorzystniej gruczolakoraka jelita grubego. PL 443929 A1 7/34 Wynalazek dotyczy równiez suplementu diety zawierajacego szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku, przy czym suplement diety korzystnie jest w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego. Wynalazek dotyczy równiez preparatu probiotycznego zawierajacego szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku, przy czym preparat probiotyczny korzystnie ponadto zawiera substancje prebiotyczne, korzystnie wybrane z oligosacharydów, polisacharydów, fruktooligosacharydów, laktulozy, inuliny, skrobi opornej, celulozy, hemicelulozy i pektyn, przy czym preparat korzystnie ponadto zawiera postbiotyki, korzystnie postbiotyki wybrane sa z krótkolancuchowych kwasów tluszczowych, enzymów, lipopolisacharydów, kwasów tejchojowych, witamin, kwasu maslowego, octanu, propionianu, dipeptydu muramilu, indlu, kwasu teichowego, laktocepin. Preparat probiotyczny jest korzystnie w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego. Wynalazek dotyczy równiez bakteryjnej kultury starterowej do wyrobu pieczywa, w której sklad wchodzi szczep Weissella cibaria wedlug wynalazku. Wynalazek dotyczy równiez zakwasu do wyrobu pieczywa, który zawiera bakteryjna kulture starterowa wedlug wynalazku. Wynalazek dotyczy równiez sposobu wytwarzania pieczywa, który obejmuje etap dodawania bakteryjnej kultury starterowej wedlug wynalazku i/lub zakwasu wedlug wynalazku. Wynalazek dotyczy równiez pieczywa zawierajacego bakteryjna kulture starterowa wedlug wynalazku i/lub zakwas wedlug wynalazku lub wytworzonego z ich wykorzystaniem lub ich mieszaniny. Wynalazek dotyczy równiez sposobu mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, który obejmuje etap, w którym szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku hoduje sie na plynnym podlozu bez dekstrozy (bez glukozy) z dodatkiem sacharozy, organicznym zródlem azotu zawierajacym aminokwasy i krótkie peptydy, witaminy z grupy B i sole mineralne. W korzystnym sposobie hodowle prowadzi sie na podlozu MRS (bulion DeMan-Rogosa-Sharpe) lub innym podlozu dla bakterii mlekowych, korzystnie z dodatkiem 5-10%±2 wag. sacharozy. Wynalazek dotyczy równiez preparatu bakteryjnego zawierajacego szczep bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycje wedlug wynalazku do zastosowania jako skladnik czynny w probiotyku, preparacie terapeutycznym, zywnosci funkcjonalnej, suplemencie diety, do zastosowania jako skladnik aktywny leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita, korzystnie nowotworu jelita grubego. PL 443929 A1 8/34 Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku jako dodatku funkcjonalnego w zywnosci funkcjonalnej, dodatku funkcjonalnego do napoju spozywczego, jako skladnika aktywnego preparatu probiotycznego, preparatu bakteryjnego, suplementu diety, kompozycji farmaceutycznej. Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku w przemysle spozywczym jako emulgator, zageszczacz, stabilizator lub polepszacz tekstury produktu spozywczego. Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku do mikrobiologicznego wytwarzania egzopolisacharydów (EPS), korzystnie dekstranu. Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku i/lub bakteryjnej kultury starterowej wedlug wynalazku do wytwarzania zakwasu do pieczywa. Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu bakterii Weissella cibaria wedlug wynalazku i/lub kompozycji wedlug wynalazku i/lub zakwasu do wyrobu pieczywa wedlug wynalazku do wytwarzania pieczywa. Szczep Weissella cibaria IB83394 zdeponowany jako KKP 2094p bedacy przedmiotem wynalazku wykazuje korzystne wlasciwosci technologiczne i funkcjonalne stanowi przewage nad obecnie znanymi i wykorzystywanymi szczepami. Szczep ten, podobnie jak wczesniej opisany szczep Weissella confusa/cibaria EPS_3 - IB83326 (Buksa i wsp. 2021) o duzej wydajnosci produkcji EPS wyizolowany zostal z zakwasu piekarskiego i na podstawie uzyskanych przez twórców analogicznych wyników posiada zdolnosc wytwarzania EPS (dekstranu) na poziomie 50 g/I (dane niepublikowane). Ilosc EPS wytwarzanego przez szczep IB83326 oraz IB83394, jest wyzsza od opisywanych dla innych szczepów bakterii mlekowych z wyjatkiem szczepu W. confusa VP30 produkujacego dekstran na poziomie 60 g/I (Jin i wsp., 2019). Jednakze nalezy podkreslic, ze wydajnosc surowego EPS dla szczepu VP30 nie byla porównywalna ze wzgledu na znaczna zawartosc zanieczyszczen. Opisane wyzej szczepy W. cibaria 27 i W. confusa VP30 o wysokiej wydajnosci produkcji dekstranu zostaly wyizolowane odpowiednio z kimchi oraz z kalu dziecka i moga nie byc przystosowane do srodowiska zakwasów piekarskich, w przypadku którego wykazano wczesniej korzystny wplyw EPS na jakosc wytwarzanego z zakwasu pieczywa. Oprócz zdolnosci do produkcji dekstranu szczep W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) charakteryzuje sie równiez innymi wykazanymi funkcjonalnymi wlasciwosciami (wlasciwosciami probiotycznymi): aktywnoscia przeciwdrobnoustrojowa i przeciwnowotworowa, wyjatkowa wysoka opornoscia na sole zólciowe i niskie pH w porównaniu do innych badanych przez twórców szczepów Weissella confusa/cibaria wyizolowanych z róznych zródel oraz obecnoscia wszystkich genów szlaku produkcji witaminy B12 i K2 jak równiez genów PL 443929 A1 9/34 szlaku odzyskiwania witaminy Bl. Zaden z opisanych w literaturze probiotycznych szczepów Weissella cibaria, nie wykazuje az tak wysokiej wydajnosci produkcji dekstranu, aktywnosci przeciwdrobnoustrojowej i przeciwnowotworowej oraz uzytecznych wlasciwosci fizykochemicznych jak wyselekcjonowany szczep W. ci baria IBB3394 (KKP 2094p) wedlug wynalazku. Ponadto, nalezy podkreslic, iz w przypadku W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) wedlug wynalazku w analizie probiogenomicznej wykazano opornosc na antybiotyki na poziomie zgodnym z wartosciami rekomendowanymi przez EFSA, jednoczesnie potwierdzajac brak genów opornosci na antybiotyki oraz brak genów wirulencji. Wykazano równiez brak cytotoksycznosci wytwarzanego przez szczep W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) egzopolisacharydu na badane linie komórkowe: ludzkiego nablonka jelitowego (gruczolakoraka jelita grubego) Caco-2 (ATCC HTB-37) i ludzkich embrionalnych komórek nablonka nerki HEK293 (ATTC CRL- 1573) oraz wykazano wlasciwosci przeciwnowotworowe W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p), szczególnie wobec raka jelita, szczególnie jelita grubego. Istota wynalazku jest szczep bakterii fermentacji mlekowej Weissella cibaria IBB3394 (KKP 2094p) o wysokiej wydajnosci produkcji egzopolisacharydu, aktywnosci przeciwdrobnoustrojowej przeciwnowotworowej, doskonalych wlasciwosciach kwaszacych, bardzo dobrej przezywalnosci w warunkach imitujacych przewód pokarmowy, charakteryzujacy sie obecnoscia wszystkich genów wybranych szlaków produkcji lub odzyskiwania witamin, o potwierdzonym bezpieczenstwie. Szczep Weissella cibaria (dla którego w niniejszym opisie stosowane jest oznaczenie wlasne IBB3394) zostal zdeponowany w dniu 6 lutego 2023 r. pod nr depozytu: KKP 2094p jako depozyt dla celów patentowych w KKP (Culture Collection of Industrial Microorganisms, prof. Waclaw Dabrowski IAFB-SRI) tj. w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego (Instytut Biotechnologii Przemyslu Rolno-Spozywczego im. prof. Waclawa Dabrowskiego - Panstwowy Instytut Badawczy w Warszawie). Nowy, nieznany i nieopisany wczesniej szczep bakterii fermentacji mlekowej W. cibaria KKP 2094p wedlug wynalazku wykazuje korzystne wlasciwosci technologiczne dla produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie oraz wlasciwosci probiotyczne i przeciwnowotworowe, charakteryzuje sie wyjatkowo wysoka wydajnoscia produkcji dekstranu, wykazuje aktywnosc przeciwdrobnoustrojowa wobec 5. aureus i 5. epiderm idis oraz przeciw niepozadanym w pieczywie bakteriom przetrwalnikujacym (aktywnosc antagonistyczna wobec Bacillus cereus, Bacillus brevis i unikalna wobec Lysynibacillus fusiformis), hamuje proliferacje komórek raka jelita grubego, jest wysoce oporny na sole zólciowe i niskie pH, posiada wszystkie geny szlaku produkcji witaminy B12 i K2 jak równiez geny szlaku odzyskiwania witaminy Bl, ponadto, wykazuje dopuszczalny poziom opornosci na antybiotyki. W analizie probiogenomicznej tego szczepu nie stwierdzono genów opornosci na antybiotyki ani genów wirulencji co potwierdza jego bezpieczenstwo. Szczep W. ci baria KKP 2094p zostal wyizolowany z zakwasu piekarskiego. PL 443929 A1 10/34 Wynalazek dotyczy równiez zastosowania szczepu do biotechnologicznego wytwarzania dekstranu. Korzystnie w sklad podloza hodowlanego dla W. cibaria KKP 2094p powinna wejsc sacharoza, organiczne zródlo azotu zawierajace aminokwasy i krótkie peptydy, witaminy z grupy B i potrzebne sole mineralne. Przykladowo, odpowiednim podlozem do hodowli bakterii z rodzaju Weissella sp. umozliwiajacym produkcje EPS jest handlowa pozywka MRS (bulion DeMan-Rogosa-Sharpe) z dodatkiem sacharozy. W korzystnym przykladzie wykonania sposobu wytwarzania dekstranu jest hodowla W. cibaria KKP 2094p na podlozu MRS bez dekstrozy (bez glukozy) z dodatkiem sacharozy, korzystnie sacharozy o stezeniu 10% wag. pozwalajacym na uzyskanie maksymalnej wydajnosci produkcji dekstranu. Wynalazek dotyczy metody pozyskiwania dekstranu z hodowli szczepu W. cibaria KKP 2094p wedlug wynalazku. Korzystnie uzyskane hodowle rozcienczano zimna, sterylna woda (1:1, v/v) oddzielono plyn pohodowlany od komórek poprzez wirowanie (15 151 ref, 4 °C, 15 min), a nastepnie w uzyskanym supernatancie ekstrahowano EPS. Precypitacje EPS przeprowadzano dwuetapowo dodajac kazdorazowo 4 objetosci schlodzonego 75 % etanolu. Po pierwszym etapie próbke wirowano, zawieszano osad w wodzie i dodawano druga porcje etanolu. Wynalazek dotyczy równiez wykorzystania szczepu W. cibaria KKP 2094p, ze wzgledu na korzystne wlasciwosci technologiczne wykazywane przez ten szczep, do wytwarzania zakwasów i pieczywa na zakwasie (wytwarzanie dekstranu, aktywnosc antagonistyczna wobec niepozadanych w pieczywie bakterii przetrwalnikujacych). Aktywnosc antagonistyczna testowano wobec niepozadanym w pieczywie bakteriom przetrwalnikujacym (Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis). Wynalazek dotyczy równiez wykorzystania szczepu ze wzgledu na wlasciwosci probiotyczne. W korzystnych przykladach wykonania szczep W. cibaria KKP 2094p, wykazal aktywnosc antagonistyczna wobec szczepów 5. aureus i 5. epidermidis, ale nie hamowal wzrostu szczepu reprezentujacego bakterie fermentacji mlekowej L. lactis. Wykazano aktywnosc antagonistyczna hodowli nocnej szczepu W. cibaria KKP 2094p, jego zawiesiny komórek w PBS oraz supernatantu pohodowlanego tego szczepu wobec 5. aureus IBB4005 (tj. wieloopornego szczepu 5. aureus NCTC9789 [PS80] wykazujacego opornosc na amp Pen Asa Cad Mer). Przy czym najkorzystniejsza aktywnosc zaobserwowano dla hodowli nocnej i zawiesiny komórek w PBS. Wykazano, ze szczep W. cibaria KKP 2094p ma cechy uznawane za pozadane dla bakterii probiotycznych: opornosc na niskie pH, gwarantujaca przejscie bakterii do dalszych odcinków przewodu pokarmowego; opornosc na sole zólciowe, gwarantujaca przezycie bakterii w obecnosci soków trzustkowych. PL 443929 A1 11/34 Wykazano, ze wytwarzany przez szczep W. cibaria KKP 2094p dekstran nie jest cytotoksyczny wobec ludzkich linii komórkowych Caco-2 i nienowotworowych komórek nablonka nerek HEK293 ani nie wykazuje aktywnosci antagonistycznej wobec badanych szczepów bakterii 5. aureus i L. lactis. Wykazano, ze szczep W. cibaria KKP 2094p hamowal proliferacje komórek raka jelita grubego, przy czym wykazana aktywnosc przeciwnowotworowa jest silniejsza niz aktywnosc znanych szczepów bakterii mlekowych (Lactococcus lactis zdeponowanych w PCM jako B/00311 i B/00312) o potwierdzonej aktywnosci antyproliferacyjnej (patent no. PL241568B1, Salanski i wsp. 2022). Szczep W. cibaria KKP 2094p zostal zsekwencjonowany, a analiza probiogenomiczna potwierdzila brak obecnosci genów opornosci na antybiotyki i brak genów wirulencji a zatem potwierdzono mozliwosc probiotycznego i medycznego jego stosowania. Analize bioinformatyczna szczepu W. cibaria KKP 2094p wykonano zgodnie z zaleceniami EFSA wykorzystujac rekomendowane programy i bazy danych. W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „biomasa" rozumie sie biomase komórek szczepu bakterii Weissella cibaria KKP 2094p otrzymywana w wyniku namnozenia komórek w pozywkach cieklych lub na podlozach stalych o skladzie dostosowanym do wymogów kultur bakterii fermentacji mlekowej. W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „potencjalnie probiotyczne" rozumie sie cechy wykazane w badaniach in vitro o mozliwym korzystnym wplywie na zdrowie gospodarza zgodnie z dostepnymi danymi literaturowymi, w szczególnosci: wytwarzanie EPS, aktywnosc przeciw bakteriom 5. aureus i 5. epidermidis, obnizanie pH srodowiska, opornosc na niskie pH i obecnosc soli zólciowych. W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „aktywnosc przeciwdrobnoustrojowa" rozumie sie dzialanie antagonistyczne wobec bakterii 5. aureus i 5. epidermidis oraz wobec niepozadanym w pieczywie bakteriom przetrwalnikujacym (Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis). W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „potwierdzone bezpieczenstwo" rozumie sie dopuszczalny poziom opornosci na rekomendowane przez EFSA 9 antybiotyków: ampicyline (AM), chloramfenikol (CL), klindamycyne (CM), kanamycyne (KM), gentamycyne (GM/CN), streptomycyne (SM), tetracykline (TC), wankomycyne (VA), erytromycyne (EM), oraz brak genów opornosci na antybiotyki, brak genów wirulencji w analizie probiogenomicznej wykonanej zgodnie z zaleceniami EFSA wykorzystujac rekomendowane programy i bazy danych. W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „cytotoksyczny" rozumie sie cytotoksycznosc powyzej 10% i wynikajaca z niej przezywalnosc komórek ponizej 90% zgodnie z wartosciami zaproponowanymi prze EL­ Adawi i wsp. (2012) dla EPS wytwarzanych przez bakterie mlekowe. W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „hodowla nocna" rozumie sie hodowle szczepu bakteryjnego zalozona z pojedynczej kolonii w odpowiednim podlozu inkubowana przez kilkanascie godzin. PL 443929 A1 12/34 W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „supernatant" rozumie sie plyn pohodowlany oddzielony od komórek bakterii. W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „ekstrakt komórkowy" rozumie sie plyn uzyskany po rozbiciu przy uzyciu szklanych kulek komórek bakterii oddzielonych przez wirowanie z hodowli nocnej i zawieszonych w buforze PBS. W niniejszym zgloszeniu przez okreslenie „zawiesina komórek w PBS" rozumie sie komórki bakterii uzyskane z hodowli nocnej poprzez zwirowanie, przeplukane i ponownie zawieszone w buforze PBS. SZCZEGÓLOWE PRZEDSTAWIENIE WYNALAZKU Szczep Weissella cibaria IBB3394 zdeponowany jako KKP 2094p wedlug wynalazku wyizolowano jak przedstawiono w Przykladzie 1, poszukujac zdolnych do produkcji egzopolisacharydów (EPS) szczepów Weissella sp. pochodzacych z róznych srodowisk (roslin, fermentowanych roslin, fermentowanych produktów mlecznych). Szczep W. cibaria KKP 2094p zostal zidentyfikowany jako Weissella confusa/cibaria metoda sekwencjonowania genów kodujacych 16S rRNA. Przynaleznosc gatunkowa szczepu W. cibaria KKP 2094p okreslono nastepnie jako Weissella cibaria poprzez sekwencjonowanie genomu oraz metoda spektroskopii masowej z uzyciem aparatu MALDI TOF. Szczep W. cibaria KKP 2094p zostal wyselekcjonowany sposród wyizolowanych pieciu szczepów Weissella sp., w porównaniu równiez do szczepów tego rodzaju wyizolowanych wczesniej ze spontanicznych zakwasów piekarskich, na podstawie wyników analizy klasyfikujacej go do grupy szczepów o najwyzszej aktywnosci antagonistycznej wobec 5. aureus (Fig. 1) i jednoczesnie potwierdzajacej brak takiej aktywnosci wobec przedstawiciela bakterii mlekowych (Fig. 2), przeprowadzonej jak opisano w Przykladzie 2 oraz wyjatkowo wysokiej w porównaniu do pozostalych badanych szczepów (Fig. 3) opornosci na niskie pH i obecnosc soli zólciowych, w warunkach wykorzystanych w Przykladzie 3 do sprawdzenia przezywalnosci szczepów w warunkach imitujacych przewód pokarmowy. Dla szczepu W. cibaria KKP 2094p potwierdzono nastepnie aktywnosc antagonistyczna wobec innych szczepów 5. aureus oraz szczepów 5. epidermidis (Przyklad 4). W przykladzie tym wykazano równiez zdolnosc szczepu W. cibaria KKP 2094p do zakwaszania srodowiska. Wykazano mozliwe wykorzystanie szczepu W. cibaria KKP 2094p jako szczepu potencjalnie probiotycznego posiadajacego aktywnosc przeciw 5. aureus (Fig. 4) i potwierdzono w Przykladzie 5 zarówno dla hodowli nocnej szczepu jak i zawiesiny komórek w PBS. Aktywnosc tego typu, jednak na nizszym poziomie zaobserwowano dla supernatantu, co wskazuje na to iz hamujacy efekt w stosunku do 5. aureus nie jest spowodowany wylacznie obnizaniem pH srodowiska. Ponadto, brak aktywnosci antagonistycznej w przypadku ekstraktu komórkowego, wskazuje na istotna, jak dotad niepoznana role odgrywana przez zywe komórki tego szczepu. W Przykladzie 6 wykazano dla szczepu W. ci baria KKP 2094p wyjatkowo silne dzialanie hamujace proliferacje komórek raka jelita grubego (Fig. 5), wskazujac na mozliwosc zastosowania szczepu w leczeniu raka przewodu pokarmowego. PL 443929 A1 13/34 Zaobserwowana w Przykladzie 4 dla szczepu W. cibaria KKP 2094p wedlug wynalazku, wyizolowanego z zakwasu piekarskiego (przystosowanego do zycia w takim srodowisku) zdolnosc do zakwaszania jak równiez wykazana w Przykladzie 7 aktywnosc antagonistyczna wobec niepozadanych w zakwasach i pieczywie bakterii przetrwalnikujacych (Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis) potwierdzaja mozliwosc wykorzystanie szczepu W. cibaria KKP 2094p ze wzgledu na korzystne wlasciwosci technologiczne do produkcji zakwasów i pieczywa na zakwasie. Wykorzystanie tego szczepu w tym celu jest równiez korzystne ze wzgledu na zdolnosc do wytwarzania EPS pelniacego istotna role w ksztaltowaniu wlasciwosci reologicznych i strukturalnych pieczywa. Wyselekcjonowany szczep W. cibaria KKP 2094p posiadajacy zdolnosc do produkcji EPS, wykorzystano w Przykladzie 8 do wytworzenia EPS uzyskujac na podlozu z 10% sacharoza jedna z najwyzszych udokumentowanych wydajnosci biotechnologicznej produkcji dekstranu. W Przykladzie 9 swiezo uzyskany EPS oraz EPS przechowywany w warunkach chlodniczych przez 6 miesiecy sprawdzono pod katem aktywnosci antagonistycznej wobec 5. aureus oraz szczepu bakterii mlekowych (Fig. 6). Zastosowany zakres stezen EPS od O do 20 mg/ml nie spowodowal znaczacego zahamowania wzrostu zadnego ze szczepów wskaznikowych, tym samym wskazujac iz taki EPS nie ma istotnej aktywnosci antagonistycznej wzgledem badanych szczepów bakterii. Egzopolisacharydy stosowane jako dodatki do zywnosci i pasz powinny byc bezpieczne dla ludzi i zwierzat. Cytotoksycznosc egzopolisacharydów wytwarzanych przez bakterie mlekowe nie powinna byc wyzsza niz 10%, co oznacza, ze odsetek komórek przezywajacych nie powinien byc nizszy niz 90% (EL-Adawi et al., 2012). Cytotoksycznosc egzopolisacharydu ze szczepu Weissella cibaria (KKP 2094p) byla badana zgodnie z opisem w Przykladzie 10 wzgledem dwóch ludzkich linii komórkowych pochodzacych z American Type Culture Collection: gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 (ATCC HTB-37) i nienowotworowych komórek, komórek nablonka nerek HEK293 (ATTC CRL-1573). Traktowanie linii komórkowych stezeniami egzopolisacharydu od 2,5 do 30% nie spowodowalo istotnego statystycznie zahamowania proliferacji, tym samym potwierdzajac brak cytotoksycznosci badanego EPS (Fig. 7-10). Dla szczepu wykonano równiez analizy potwierdzajace bezpieczenstwo. W Przykladzie 11, test na wrazliwosc na antybiotyki potwierdzil poziom opornosci na akceptowalnym poziomie zgodnie z wytycznymi EFSA. W przypadku rodzaju Weissella, dla których nie podano specyficznych wartosci granicznych wyniki, zgodnie z rekomendacja, nalezy porównywac z wynikami dla najblizej filogenetycznie spokrewnionych bakterii (heterofermentatywnych laktobacillusów oraz leukonostoków). Dodatkowo, bezpieczenstwo szczepu (brak genów opornosci na antybiotyki oraz brak czynników wirulencji) zostalo potwierdzone w analizie probiogenomicznej opisanej w Przykladzie 12. W Przykladzie 13, szczep W. cibaria KKP 2094p z powodzeniem wykorzystano do wytworzenia pieczywa na zakwasie, które uzyskalo lepsze oceny w porównaniu z pieczywem uzyskanym bez udzialu tego szczepu. PL 443929 A1 14/34 KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU Przykladowe realizacje wynalazku zaprezentowano na figurach rysunku, na których: Fig. 1 Przedstawia wynik badania aktywnosci antagonistycznej szczepów Weissella sp. przeciwko 5. aureus IBB4005. Liczac od lewej do prawej, od góry do dolu szalka (a) zawiera: 3714 (1), 3715 (2), 3716 (3), 3717 (4), 3277 (5), 3278 (6), 3279 (7), 3385 (8), 3386 (9), 3387 (10), 3388 (11), 3389 (12), 3393 (13), 3394 (14) (tj. W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) i K - szczep kontrolny (wytwarzajacy nizyne L. lactis IBB1339). Natomiast szalka (b) zawiera: 3287 (15), 3325 (16), 3326 (17), 3327 (18), 3382 (19), 3383 (20), 3384 (21), 3280 (22), 3281 (23 ), 3282 (24,) 3284 (25), 3285 (26), 3286 (27) i K- szczep kontrolny (wytwarzajacy nizyne L. lactis IBB1339). Fig. 2 Przedstawia wynik badania aktywnosci antagonistycznej szczepów Weissella sp. przeciwko L. lactis IL1403.Liczac od lewej do prawej, od góry do dolu szalka (a) zawiera: 3714 (1), 3715 (2), 3716 (3), 3717 (4), 3277 (5), 3278 (6), 3279 (7), 3385 (8), 3386 (9), 3387 (10), 3388 (11), 3389 (12), 3393 (13), 3394 (14) (tj. W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) i K- szczep kontrolny (wytwarzajacy nizyne L. lactis IBB1339). Natomiast szalka (b) zawiera: 3287 (15), 3325 (16), 3326 (17), 3327 (18), 3382 (19), 3383 (20), 3384 (21), 3280 (22), 3281 (23 ), 3282 (24,) 3284 (25), 3285 (26), 3286 (27) i K-szczep kontrolny (wytwarzajacy nizyne L. lactis IBB1339). Fig. 3 Przedstawia odpowiedz szczepów Weissella sp. na stres zwiazany z obecnoscia soli zólciowych i niskiego pH. Fig. 4 Przedstawia wplyw W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) (hodowli nocnej, supernatantu, ekstraktu komórkowego, zywych komórek zawieszonych w buforze PBS) na przezywalnosc 5. aureus IBB4005. Liczebnosc bakterii 5taphylococcus wyrazona w procentach przedstawiono wzgledem liczebnosci w kontroli w MRS (dla hodowli i supernatantu) lub PBS (dla komórek i ekstraktu). Obliczenia dla pomiaru po rozpoczeciu (To), po godzinie (T1h) i trzech godzinach (T3h) inkubacji. Fig. 5 Przedstawia hamujacy wplyw szczepu Weissella sp. IBB3394 (KKP 2094p) na proliferacje komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 w porównaniu do wplywu dwóch innych szczepów bakterii mlekowych, w tym szczepu IBB109 o potwierdzonej wczesniej aktywnosci antyproliferacyjnej. Proliferacje komórek Caco-2 inkubowanych ze szczepami bakteryjnymi mierzono w odniesieniu do wolnej od bakterii hodowli komórkowej Caco-2 (100%) stosujac test kolorymetryczny BrdU. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy. Fig. 6 Przedstawia wynik badania wplywu EPS produkowanego przez Weissella sp. IBB3394 (KKP 2094p) na wzrost 5. aureus IBB4005 (a) i L. lactis IL1403 (b). Swieze i przechowywane przez 6 miesiecy w warunkach chlodniczych próbki EPS (20, 10, 5, 2,5, O mg/ml) nakropiono powyzej linii, podczas gdy ponizej linii nakropiono kontrole pozytywne - z bakteriocyna nizyna w róznych stezeniach (100, 50, 20, 10, 5, 2,5 mg/ml), dolna czesc szalki od lewej do prawej. PL 443929 A1 15/34 Fig. 7 Przedstawia wynik badania przezywalnosci komórek linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 po inkubacji z róznymi stezeniami egzopolisacharydu izolowanego z hodowli szczepu Weissella sp. IB83394 (KKP 2094p) w stosunku do linii komórkowej niekoinkubowanej z egzopolisacharydem. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy. Fig. 8 Przedstawia wynik badania przezywalnosci linii komórkowej nablonka nerki HEK293 po inkubacji z róznymi stezeniami egzopolisacharydu izolowanego z hodowli szczepu Weissella sp. IB83394 (KKP 2094p) w stosunku do linii komórkowej niekoinkubowanej z egzopolisacharydem. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy. Fig. 9 Przedstawia wynik badania cytotoksycznosci egzopolisacharydu izolowanego z hodowli szczepu Weissella sp. IB83394 (KKP 2094p) na komórki linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 w stosunku do linii komórkowej niekoinkubowanej z egzopolisacharydem. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy. Fig. 10 Przedstawia wynik badania cytotoksycznosci egzopolisacharydu izolowanego z hodowli szczepu Weisse//a sp. I8B3394 (KKP 2094p) na linii komórkowej nablonka nerki HEK293 w stosunku do linii komórkowej niekoinkubowanej z egzopolisacharydem. Slupki bledów przedstawiaja blad standardowy. Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia sa w calosci niniejszym wlaczone, jako referencje. Ponizsze przyklady ilustruja wynalazek, nie ograniczajac go w zaden sposób. SPOSOBY WYKONANIA WYNALAZKU Ponizsze przyklady umieszczono jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjasnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny byc utozsamiane z calym jego zakresem, który zdefiniowano w zalaczonych zastrzezeniach. PRZYKLADY Przyklad 1 Izolacja i identyfikacja szczepów produkujacych EPS Poszukiwanie szczepów bakterii zdolnych do produkcji EPS przeprowadzono na podlozu selekcyjnym stalym MRS bez dekstrozy z dodatkiem 10% sacharozy, na które wysiewano posiewem redukcyjnym zakwas piekarski, sok z fermentowanej kapusty i ogórków, plyn uzyskany po dokladnym wyplukaniu fragmentów roslin w buforze PBS (pH 7,4), lub po zawieszeniu fermentowanych produktów mlecznych. Plytki inkubowano w warunkach tlenowych w temp. 30 °C przez minimum 48 godzin. Pojedyncze kolonie bakterii o sluzowatej morfologii pasazowano na podloze stale MRS do uzyskania czystych kultur wyizolowanych bakterii, które to szczepy zdeponowano w Kolekcji IBB PAN (COLIBB, Polska). Przynaleznosc gatunkowa okreslono metoda sekwencjonowania genów kodujacych 16S rRNA. Wsród bakterii produkujacych EPS wyizolowanych z podloza zawierajacego sacharoze wytypowano bakterie nalezace do Leuconostoc sp. (12 szczepów) i Weissella confusa/cibaria (5 szczepów). Na dalszym etapie PL 443929 A1 16/34 badan po okresleniu zaskakujacych wlasciwosci uzytkowych dla szczepu W. cibaria IB83394 potwierdzono jego przynaleznosc gatunkowa jako Weissella cibaria poprzez sekwencjonowanie genomu oraz metoda spektroskopii masowej z uzyciem aparatu MALDI TOF przy dokonywaniu depozytu tego szczepu do KKP (IAFB, Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego) gdzie zostal zdeponowany jako KKP 2094p. Przyklad 2 Badanie przesiewowe szczepów Weissella sp. pod katem aktywnosci antagonistycznej wzgledem patogennego szczepu S. aureus Antagonistyczne dzialanie 5 szczepów Weissella sp. wyizolowanych jak opisano w Przykladzie 1 oraz 12 szczepów wyizolowanych wczesniej ze spontanicznych zakwasów piekarskich (Tabela 1) przeciwko patogennemu szczepowi 5. aureus I8B4005 (Fig. 1) i szczepowi L. lactis IL1403 reprezentujacemu bakterie mlekowe (Fig. 2) analizowano metoda nakrapiania na szalke ze szczepem wskaznikowym, wobec wytwarzajacego nizyne szczepu L. lactis I8B1339 jako kontroli pozytywnej. Tabela 1. Szczepy Weissella confusa/cibaria uzyte w przykladzie. Numer Zródlo izolacji Numer w "COLIBB" 1 ogórki malosolne (bazar "Zieleniak") 3714 2 ogórki malosolne 3715 3 rukola 3716 4 ziarna soi (suche) 3717 5 zakwas zytni 3277 6 zakwas zytni 3278 7 zakwas zytni 3279 8 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3385 9 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3386 10 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3387 11 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3388 12 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3389 13 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3393 14 zakwas piekarski 3394 15 zakwas zytni 3287 16 zakwas z pszenicy orkisz 3325 17 zakwas z pszenicy orkisz 3326 18 zakwas z pszenicy orkisz 3327 19 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3382 20 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3383 21 zakwas z pszenicy zwyczajnej 3384 22 zakwas zytni 3280 23 zakwas zytni 3281 24 zakwas zytni 3282 25 zakwas zytni 3284 PL 443929 A1 17/34 26 zakwas zytni 3285 27 zakwas zytni 3286 Szczepy Weissella sp., L. lactis IB81339 (szczep kontrolny) i IL1403 (szczep wskaznikowy) z kolekcji szczepów IBB PAN (COLIBB, Polska) wysiano odpowiednio na szalkach z podlozem MRS, GM17 i BHI i inkubowano przez 48 godzin w 30 °C. 5. aureus I8B4005 (szczep wskaznikowy) równiez wysiano na szalce z podlozem BHI (laboratorium BSL2). Pojedyncza kolonia z kazdej szalki zaszczepiono plynna pozywka i inkubowano przez noc. Kultury robocze bakterii hodowano w bulionie MRS w 30 °C dla Weissella, w plynnym podlozu GM17 w 30°C dla L. lactis IB81339 oraz w bulionie BHI w warunkach tlenowych w 37 °C z wytrzasaniem i w 30 °C bez wytrzasania dla szczepów wskaznikowych, odpowiednio 5. aureus I8B4005 i L. lactis IL1403. Pólplynny agar BHI podgrzany do 55 °C (5 ml) zaszczepiono 100 µI hodowli nocnej (szczepy wskaznikowe: 5. aureus IB84005, L. lactis IL1403) i natychmiast wylano na duza szalke z podlozem stalym BHI i równomiernie rozprowadzono, aby pokryc powierzchnie. Po zwiazaniu agaru, 5 µI hodowli nocnych badanych kultur Weissella sp. i kontroli pozytywnej (szczepu L. lactis IB81339 wytwarzajacego nizyne) nanoszono na okreslone miejsca na szalce. Szalki pozostawiono do wchloniecia kropli i inkubowano przez noc w 37°C i w 30°C odpowiednio dla 5. aureus IB84005 i L. lactis IL1403. Eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach biologicznych. Antagonizm wobec szczepów wskaznikowych oceniano przez obserwacje stref zahamowania wzrostu. Wielkosc i przezroczystosc takich stref rózni sie w zaleznosci od szczepu. Ogólnie zaobserwowano cztery rózne efekty: i.) wyrazne strefy zahamowania, ii.) strefy zahamowania z widocznym wzrostem badanego szczepu w srodku, iii.) niewyrazne strefy ze slabo widocznym wzrostem wskaznika i widocznym wzrostem badanego szczepu w srodku oraz iv.) brak stref zahamowania wzrostu wokól badanego szczepu. Pierwsze dwa efekty zostaly sklasyfikowane jako silne dzialanie antagonistyczne i oznaczone jako (+), trzeci efekt byl bakteriostatyczny (+/-), a ostatni efekt zostal scharakteryzowany jako brak aktywnosci antagonistycznej (-). Wynik uzyskany z trzech powtórzen (Tabela 2) wskazywaly, ze niektóre szczepy Weissella sp. byly w stanie zahamowac wzrost 5. aureus, niektóre okazaly sie bakteriostatyczne, podczas gdy inne nie hamowaly wzrostu 5. aureus. Jednoczesnie zaden z testowanych szczepów nie hamowal wzrostu szczepu bakterii mlekowej L. lactis IL1403 (Tabela 2). Tabela 2. Wyniki badania aktywnosci antagonistycznej. Aktywnosc antagonistyczna przeciwko Numer Numer w "COLIBB" L. lactis IL1403 5. aureus IB84005 Powt. 1 Powt. 2 Powt. 3 Powt. 1 Powt. 2 Powt. 3 o 1339 + + + + + + 1 3714 - - - + + + 2 3715 - - - + + + 3 3716 - - - + + + 4 3717 - - - + + + PL 443929 A1 18/34 5 3277 - - - + + + 6 3278 - - - + +/- +/- 7 3279 - - - + + + 8 3385 - - - + + + 9 3386 - - - - - - 10 3387 - - - - - - 11 3388 - - - +/- + + 12 3389 - - - +/- +/- +/- 13 3393 - - - + + + 14 3394 - - - + + + 15 3287 - - - + +/- +/- 16 3325 - - - + + + 17 3326 - - - + + + 18 3327 - - - + +/- + 19 3382 - - - + +/- +/- 20 3383 - - - +/- +/- +/- 21 3384 - - - + + + 22 3280 - - - + +/- +/- 23 3281 - - - + + +/- 24 3282 - - - + + + 25 3284 - - - + +/- +/- 26 3285 - - - +/- + +/- 27 3286 - - - +/- + +/- Przyklad 3. Test przezywalnosci szczepów Weissella sp. w niskim pH i w obecnosci soli zólciowych Jedna z waznych wlasciwosci definiujacych bakterie probiotyczne jest ich zdolnosc do przetrwania w przewodzie pokarmowym. Opornosc 5 szczepów Weissella sp. wyizolowanych jak opisano w Przykladzie 1 oraz 12 szczepów wyizolowanych wczesniej ze spontanicznych zakwasów piekarskich, na sole kwasów zólciowych (stres zwiazany z sola zólciowa) i niskie pH (stres kwasowy) badano w nastepujacy sposób. Swiezo wyhodowane kolonie na podlozu IST-MRS [90% ISO-Sensitest broth (Oxoid) i 10% MRS (Merck)] dla kazdego izolatu bakteryjnego zawieszono w PBS, pH = 7,4 (PBS404, BioShop) i rozcienczono do 00600nm = 0,5 w 1 ml PBS, pH= 7,4 (kontrola); PBS, pH= 3 (stres kwasowy); oraz PBS, pH= 7,4, zawierajacy 3 g/1 dwóch soli kwasów zólciowych: cholanu sodu i dezoksycholanu sodu (B8756, Sigma-Aldrich) (stres zwiazany z solami zólciowymi). Próbki inkubowano przez godzine w temperaturze 37°C. Po inkubacji probówki odwirowano (3 minuty, 4°C, 10000 rpm) i zlano supernatant, a osad komórkowy zawieszono w 0,5 ml buforu PBS pH 7,4. Z kazdej próbki przygotowano rozcienczenia od 10- 1 do 10- 6 . Na szalkach z podlozem stalym IST-MRS nakrapiano po 20 µI rozcienczen. Szalki inkubowano przez 48 h w 30 °C w warunkach tlenowych. Eksperymenty przesiewowe pod katem charakterystyki szczepów w warunkach nasladujacych przewód pokarmowy przeprowadzono w trzech powtórzeniach biologicznych i obliczono srednia dla kazdego z warunków. Podatnosc na czynniki stresowe wyrazono jako spadek o rzedy wielkosci liczby jednostek tworzacych kolonie bakteryjne (CFU)/ml w porównaniu z warunkami kontrolnymi (pH PBS = 7,4). Uzyskane wyniki przedstawiono na wykresie (Fig. 3), na ich podstawie wybrano izolat IBB3394 PL 443929 A1 19/34 (zdeponowany nastepnie jako KKP 2094p) jako unikalny szczep najbardziej oporny na sole zólciowe i niskie pH. Przyklad 4. Badanie wybranych szczepów Weissella sp. pod katem aktywnosci antagonistycznej wzgledem szczepów S. aureus i S. epidermidis Szesc szczepów bakterii mlekowych z rodzaju Weissella (confusa/cibaria) wytypowanych z Kolekcji Szczepów Bakteryjnych IBB PAN (COLIBB) przetestowano pod katem: • aktywnosci kwaszacej, w celu zbadania ewentualnego wplywu obnizenia pH na zahamowanie wzrostu szczepów 5. aureus i 5. epidermidis, • aktywnosci antagonistycznej wobec zywych komórek trzech patogennych szczepów 5. aureus w tym szczepu wieloopornego, • aktywnosci antagonistycznej wobec zywych komórek dwóch szczepów 5. epidermidis reprezentujacych gatunek bakterii wywolujacy zakazenia oportunistyczne (nie wywolujacy infekcji u ludzi zdrowych). Testowane szczepy Weissella nakrapiane na podloze stale BHI z purpura bromokrezolowa (wskaznikiem kwasowosci) powodowaly zmiane zabarwienia podloza z fioletowo-purpurowej na zólta co swiadczy o zakwaszeniu podloza wokól strefy nakropien. Wartosci pomiaru pH hodowli nocnych szczepów wynosily od 4,23 do 4,89. Test aktywnosci antagonistycznej wykonywano poprzez nakropienie po 5 µI plynnych hodowli nocnych szczepów Weissella na duze szalki (BHI z purpura bromokrezolowa) z wysianymi w formie murawki szczepami wskaznikowymi 5. aureus 1B84002, 18B4005 i 18B4009 oraz 5. epidermidis 6Pll6 i SL03. Szalki inkubowano 24 godziny w 37 °C. Wokól badanych szczepów Weissella zobserwowano strefy zahamowania wzrostu dla wszystkich wskaznikowych szczepów 5. aureus (Tabela 3) oraz 5. epidermidis (Tabela 4). Tabela 3 Wyniki badania aktywnosci antagonistycznej wzgledem szczepów 5. aureus (srednie z dwóch powtórzen biol.). srednica srednica srednica srednica srednica srednica kropli strefy róznica kropli strefy róznica kropli strefy róznica na BHI z zahamowania na BHI z zahamowania na BHI z zahamowania lp numer w dla dla dla "COLIBB" purpura wzrostu 4002 purpura wzrostu 4005 purpura wzrostu 4009 po 24 h S. aureus [mm] po 24 h S. aureus [mm] po 24 h S. aureus [mm] szalka z 4002 na BHI z szalka z 4005 na BHI z szalka z 4009 na BHI z 4002 purpura 4005 purpura 4009 purpura 1 3287 7,50 9,50 2,00 8,00 9,50 1,50 7,75 9,50 1,75 2 3325 7,75 10,00 2,25 6,75 9,25 2,50 7,00 9,00 2,00 3 3326 7,25 10,25 3,00 7,75 10,25 2,50 7,50 9,00 1,50 4 3389 7,50 9,70 2,20 7,25 8,95 1,70 7,25 9,75 2,50 5 3393 7,25 9,05 1,80 7,50 9,55 2,05 7,25 9,75 2,50 6 3394 7,50 9,50 2,00 7,75 9,50 1,75 7,25 8,75 1,75 PL 443929 A1 20/34 Tabela 4 Wyniki badania aktywnosci antagonistycznej wzgledem szczepów 5. epidermidis (srednie z dwóch powtórzen biol.). srednica strefy srednica strefy srednica kropli zahamowania róznica srednica kropli zahamowania numer w na BHI z wzrostu wzrostu róznica lp "COLIBB" S. epidermidis dla na BHI z S. epidermidis dla 5L03 purpura po 6Pll6 purpura po 24 24 h szalka z 6Pll6 na BHI z h szalka z 5L03 5L03 na BHI z 6Pll6 purpura purpura 1 3287 9,0 11,0 2,0 7,0 8,0 1,0 2 3325 8,8 10,0 1,2 7,0 9,0 2,0 3 3326 8,8 10,3 1,5 6,8 8,5 1,7 4 3389 9,3 12,0 2,7 7,0 8,0 1,0 5 3393 8,8 10,0 1,2 7,0 7,5 0,5 6 3394 8,8 10,0 1,2 7,0 8,5 1,5 Przyklad 5. Aktywnosc antagonistyczna szczepu W. cibaria 1B83394 {KKP 2094p) dla róznych form preparatu {hodowli, supernatantów, ekstraktów komórkowych, zywych komórek zawieszonych w buforze PBS) wobec zywych komórek szczepu S. aureus Eksperyment wykonano dla róznych wariantów: • Hodowla nocna szczepu W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) - 900 µI, • Supernatant - 900 µI plynnej hodowli nocnej W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) - wirowano 3 min, 13 tys. RPM, a nastepnie supernatant filtrowano przez filtr 0,45 µm, • Ekstrakt z komórek W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) osadzonych przez wirowanie (3 min, 13 tys. RPM) - osad zawieszano w 900 µI buforu PBS i rozbijano kulkami (3xl min, z przerwami na chlodzenie na lodzie po 1 min), nastepnie wirowano 10 min 14 tys. RPM w 4°C. Plyn znad kulek zbierano i dodawano do PBS (ok. 100 µI) do objetosci koncowej 900 µI. • Zawiesina komórek w PBS - 900 µI plynnej hodowli nocnej W. cibaria IBB3394 (KKP 2094p) wirowano 3 min, 13 tys. RPM, nastepnie osad komórek zawieszano w 900 µI sterylnego PBS, ponownie wirowano 3 min, 13 tys. RPM a powstaly osad zawieszano w 900 µI sterylnego PBS. Rozcienczenie w sterylnym PBS plynnych hodowli nocnych szczepu wskaznikowego 5. aureus IBB4005 (100 000x). Inkubacja rozcienczonych hodowli nocnych 5taphylococcus (100 µI z rozczienczenia 10- 5 ) z poszczególnymi wariantami dla szczepu W. cibaria IBB3394 oraz 900 µI PBS lub podloza MRS jako kontrola przez 3 h w temperaturze ok. 30 °C. Wysiewy na szalki LB po 100 µI z kazdego wariantu w dwóch powtórzeniach zaraz po rozpoczeciu inkubacji (To), po godzinie (T1h) i trzech godzinach (T3h). Szalki inkubowano w 42 °C (zeby wyeliminowac wzrost LAB) przez 24 h lub 48 h (wariant z hodowla nocna i komórkami). Doswiadczenie wykonywano w 2 powtórzeniach technicznych i minimum 2 powtórzeniach biologicznych. Wyniki zaprezentowano na wykresie (Fig. 4), na którym liczebnosc bakterii 5taphylococcus wyrazona w procentach przedstawiono wzgledem liczebnosci w kontroli (w MRS lub PBS). PL 443929 A1 21/34 Wyrazne dzialanie antagonistyczne zaobserwowano dla hodowli nocnej i komórek zawieszonych w buforze PBS. Aktywnosc przeciwgronkowcowa wykazywal ponadto supernatant, podczas gdy nie zaobserwowano takiego efektu dla ekstraktu komórkowego. Przyklad 6. Aktywnosc antyproliferacyjna szczepu 1B83394 {KKP 2094p) wobec komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 Badanie hamowania proliferacji komórek raka jelita grubego wykonano wedlug metody opisanej przez Salanskiego i wsp. (2022), hodujac szczep Weissella sp. IBB3394 na podlozu MRS. Wyniki testu BrdU wykazaly, ze szczep IBB3394 silnie hamowal aktywnosc proliferacyjna komórek nowotworowych Caco-2 (Fig. 5). Przyklad 7. Badanie szczepu 1B83394 {KKP 2094p) pod katem aktywnosci antagonistycznej wzgledem niepozadanych w pieczywie bakterii przetrwalni kujacych {Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis) Aktywnosc antagonistyczna szczepu IBB3394 (KKP 2094p) zbadano wzgledem bakterii przetrwalnikujacych, psujacych pieczywo zgodnie z metoda opisana dla szczepów wyizolowanych z zakwasu zytniego (Litwinek i wsp., 2022). W tym celu zaszczepiono podloze plynne Luria-Bertani (LB) (Difco Laboratories, Franklin Lakes, New Jersey, USA) bakteriami wskaznikowymi przetrwalnikujacymi (Bacillus cereus, Bacillus brevis i Lysynibacillus fusiformis) i hodowano przez noc. Nastepnie hodowle nocne uzyto do zaszczepienia uplynnionej i ostudzonej pozywki stalej LB, która natychmiast wylano na szalke. Po zastygnieciu podloza, 5 µI badanego szczepu wyhodowanego na podlozu plynnym MRS naniesiono na wybrane miejsca na szalce. Plytki pozostawiono do wchloniecia kropli i inkubowano przez noc w temperaturze 30 °C. Antagonizm w stosunku do szczepu uwidoczniono przez obserwacje strefy zahamowania wzrostu. Obecnosc strefy zahamowania oznaczano jako,,++","+" lub"+/-", w zaleznosci od wielkosci, natomiast brak aktywnosci antagonistycznej oznaczano jako"-". Uzyskany wynik porównano z wynikami otrzymanymi dla szczepów Weissella sp. wyizolowanych z zakwasów z maki zytniej (Litwinek i wsp., 2022). Na podstawie przeprowadzonej analizy stwierdzono, ze szczep IBB3394 (KKP 2094p) przejawia aktywnosc antagonistyczna oceniona na,,+" wzgledem wszystkich szczepów wskaznikowych, w tym unikalna wobec szczepu Lysynibacillus fusiformis. Aktywnosc ta byla wyzsza niz dla szczepów wyizolowanych z zakwasu zytniego, dla których zaobserwowano nieco slabsze hamowanie wzrostu Bacillus brevis przez wszystkie badane szczepy, aktywnosc antagonistyczna wobec Bacillus cereus dla 4 z 7 szczepów i brak takiej aktywnosci wzgledem Lysynibacillus fusiformis. Przyklad 8. Charakterystyka egzopolisacharydu {EPS) wytwarzanego przez 1B83394 {KKP 2094p) Oznaczenie wydajnosci produkcji egzopolisacharydu (EPS) przez IBB3394 przeprowadzono dla szczepu hodowanego na podlozu MRS bez dekstrozy zawierajacym dodatek 5% lub 10% sacharozy. Produkcje, a nastepnie ekstrakcje, rozdzial i charakterystyke EPS wykonano zgodnie z metoda opisana przez Buksa i wsp. (2021). Wyniki analizy wydajnosci produkcji oraz charakterystyke EPS przedstawiono w Tabeli 5. Wydajnosc produkcji surowego EPS dla szczepu IBB3394 byla wyzsza na podlozu z 10% sacharoza i PL 443929 A1 22/34 wyniosla blisko 50 g/1. W wyniku rozdzialu surowego EPS na kolumnach SEC wykryto frakcje o wysokiej masie molowej, która zidentyfikowano jako dekstran. Tabela 5. Wydajnosc produkcji surowego egzopolisacharydu (EPS) i udzial procentowy reszt cukrowych po kwasowej hydrolizie preparatu surowego EPS. Wydajnosc Udzial reszt cukrowych po hydrolizie kwasowej (%) produkcji EPS w Szczep podlozu z sacharoza (g s.m./I) Gie I Gal I Man I Fru I Suma EPS wytworzony w obecnosci 5% sacharozy w podlozu produkcyjnym IB83394 26.4±0.8 95.6±0.8 1 0.4±0.1 1 o.6±0.8 I 0.3±0.la 196.9±0.8 EPS wytworzony w obecnosci 10% sacharozy w podlozu produkcyjnym IB83394 48.9±0.9 94.9±0.8 I o.5±0.2 I 0.5±0.8 I o.3±0.2a 196.2±0.8 Przyklad 9. Badania wplywu EPS produkowanego przez Weissella sp. IBB3394 {KKP 2094p) na S. aureus IBB4005 i L. lactis IL1403 Ocene aktywnosci antagonistycznej EPS wytwarzanego przez szczep I8B3394, przeprowadzono metoda podobna do opisanej dla oznaczenia aktywnosci antagonistycznej szczepów Weissella sp. w Przykladzie 2. W tym przypadku na szalki ze szczepami wskaznikowymi nakrapiano okreslone stezenia (20, 10, 5, 2,5, O mg/ml) swiezego i przechowywanego przez 6 miesiecy w warunkach chlodniczych EPS wobec kontroli pozytywnych - nizyny w róznych stezeniach (100, 50, 20, 10, 5, 2,5 mg/ml). Wyniki uzyskane w odniesieniu do róznych stezen nizyny wskazuja, ze EPS z Weisse!la IB83394 dla wiekszosci badanych stezen nie hamowal wzrostu 5. aureus (Fig. 6a), z wyjatkiem stezenia 20 mg/ml, które wykazywalo bardzo niewielkie zahamowanie. Ponadto zaobserwowano, ze zadne stezenie EPS nie hamowalo wzrostu L. lactis IL1403 (Fig. 6b). Przyklad 10. Badanie cytotoksycznosci egzopolisacharydu {EPS) izolowanego z hodowli szczepu Weissella sp. IBB3394 {KKP 2094p) Badanie przeprowadzono wedlug metody opisanej przez Vosough et al., 2021, z modyfikacjami. Linie komórkowe gruczolakoraka Caco-2 (ATCC HTB-37) oraz komórki embrionalne nablonka nerki linii HEK293 (ATTC CRL-1573) hodowano w warunkach optymalnych, zalecanych przez ATCC, tj. w 37°C, 5% CO2, wilgotnosc 95%. Podlozem (dalej zwanym podlozem dla linii komórkowych) stosowanym w hodowli byl MEM (Minimal Essential Medium; Gibco) wzbogacony 10% bydleca surowica plodowa, roztworem aminokwasów (NEAA - non-essential amino acid solution) (lX), 1 mM pirogronianem sodu, dodatkiem penicyliny (100 U/ml) i streptomycyny (100 µg/ml). Liczbe komórek linii komórkowych okreslano w komorze Thoma. Komórki rozcienczano w ww. podlozu dla linii komórkowych do uzyskania gestosci 10 5 komórek/ml i nanoszono na plytke 96-dolkowa po 100 µI zawiesiny komórek na dolek i inkubowano przez 24 godziny w warunkach optymalnych. Na plytki 96-dolkowe, zawierajace komórki Caco-2 lub HEK293 po 24-godzinnej hodowli znad których uprzednio zebrano pozywke, nakladano po 100 µI zawiesiny egzopolisacharydu o stezeniach 30, 20, 10, 5 i 2,5 mg/ml w podlozu dla linii komórkowych. Plytki inkubowano 24 godziny w 37 °C, 5% CO2 i wilgotnosci 95%, a nastepnie oceniano zywotnosc komórek linii PL 443929 A1 23/34 komórkowych metoda kolorymetryczna przy uzyciu komercyjnie dostepnego testu proliferacji Cell Proliferation Kit I, MTT (Roche). Pomiar absorbancji prowadzono przy dlugosciach fali 570 i 680 nm. Doswiadczenie wykonywano w 10 powtórzeniach technicznych i 3 powtórzeniach biologicznych. Kontrole stanowily hodowle komórek Caco-2 i HEK293 traktowane podlozem bez egzopolisacharydu. Przezywalnosc liczono z nastepujacego wzoru: Przezywalnosc[%] = OD próbki_ · 100%, natomiast OD kontroli cytotoksycznosc ze wzoru: Cytotoksycznosc[%] = 100% - Przezywalnosc[%]. Ze wzgledu na duza lepkosc zawiesiny egzopolisacharydu, stezenie 30 mg/ml zostalo wybrane jako najwyzsze mozliwe do zastosowania w tym doswiadczeniu. Analizy statystyczne przeprowadzono z uzyciem testów Shapiro­ Wilka i wieloczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). Wyniki przedstawiono na rysunkach (Fig. 7-10). Traktowanie linii komórkowych stezeniami egzopolisacharydu od 2,5 do 30% nie spowodowalo istotnego statystycznie zahamowania proliferacji, tym samym potwierdzajac brak cytotoksycznosci badanego EPS. Przyklad 11. Test wrazliwosci na antybiotyki Ocene bezpieczenstwa wybranego szczepu Weissella sp. IBB3394 przeprowadzono wykonujac oznaczenie antybiotykowrazliwosci przy uzyciu pasków E-test (bioMerieux) zgodnie z zaleceniami producenta. Badany szczep wysiano na podloze stale IST-MRS i inkubowano w temperaturze 30 °C w warunkach tlenowych. Uzyskane kolonie wykorzystano do przygotowania zawiesiny bakteryjnej w PBS o 00600nm = 0,25 - skala McFarlanda 1, która nastepnie rozprowadzano wymazówka po powierzchni szalek w róznych kierunkach, w celu zapewnienia, równomiernego rozprowadzenia szczepu. Na powierzchni szalki umieszczono paski z antybiotykiem i plytki inkubowano w temperaturze 30 °C przez 48 h w warunkach tlenowych. Wykonano oznaczenie opornosci szczepu na 9 antybiotyków (zgodnie z zaleceniami EFSA): ampicyline (AM), wankomycyne (VA), gentamycyne (GM), kanamycyne (KM), streptomycyne (SM), erytromycyne (EM), klindamycyne (CM), tetracykline (TC) i chloramfenikol (CL). Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 6. Wykazano, ze minimalne stezenie hamujace (MIC) w stosunku do wszystkich badanych antybiotyków bylo ponizej wartosci granicznych rekomendowanej przez EFSA. Tabela 6. Wyniki badania wrazliwosci szczepu IBB3394 (KKP 2094p) na antybiotyki. Minimalne stezenie hamujace (MIC} Stezenia graniczne MIC rekomendowane przez EFSA [µg/ml] [µg/ml] Antybiotyk 18B3394 Lactobacillusy Leuconostoc spp. heterofermentatywne AM 0,38-0,5 2 2 VA >256 * * GM 4 16 16 KM 16 32 16 PL 443929 A1 24/34 SM 8 64 64 EM 0,094 1 1 CM 0.016 1 1 TC 2 8 8 CL 2-3 4 4 * Nie wymagane (opornosc naturalna) Przyklad 12. Analiza genomu szczepu 1B83394 {KKP 2094p) Ze szczepu Weissella IBB3394 wyizolowano DNA, który nastepnie zostal poddany sekwencjonowaniu calego genomu w Srodowiskowej Pracowni Sekwencjonowania i Syntezy DNA w IBB PAN z wykorzystaniem platformy lllumina MiSeq (lllumina, San Diego, USA) i sekwenatora GridlON (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, Wielka Brytania). Do analizy bioinformatycznej wykorzystano rózne serwery, oprogramowanie i bazy danych. Serwis RAST zostal wykorzystany do oznaczenia sekwencji kodujacych (CDS) i niekodujacego RNA (Aziz i in., 2008). Ogólna analiza sekwencji genomowej szczepu IBB3394 wykazala, ze szczep posiada kolisty chromosom DNA o wielkosci 2 488 843 bp i 44,8% zawartosci GC, podczas gdy liczba calkowitych sekwencji kodujacych (CDS) wynosila 2 313. Analiza sekwencji genomu szczepu wykazala, ze nalezy on do gatunku Weissella cibaria. Do analizy funkcjonalnej genów wykorzystano baze danych KEGG (Kanehisa i in., 2022) oraz automatyczna usluge adnotacji BlastKOALA (Kanehisa i in., 2016). Stwierdzono, ze szczep koduje 172 rózne szlaki metaboliczne. Wsród 30 kompletnych modulów szlaków znaleziono m.in. kompletne szlaki biosyntezy witamin, takich jak ryboflawina (witamina B12) i menachinon (witamina K2) oraz szlak odzyskiwania tiaminy (witamina Bl). Analize bezpieczenstwa przeprowadzono poprzez wyszukanie domniemanych czynników wirulencji za pomoca narzedzia VirulenceFinder. Ocene przeprowadzono porównujac sekwencje calego genomu IBB3394 ze znanymi genami wirulencji Enterococcus, E. coli, S. aureus i Listeria. Wynik wskazuje, ze w genomie IBB3394 nie ma genów wirulencji. W rezultacie stwierdzono, ze IBB3394 nie posiada zadnych toksycznych ani patogennych genów zwiazanych z dobrze znanymi patogenami Enterococcus, E. coli, S. aureus i Listeria. Wynik zostal równiez potwierdzony przez analize sekwencji calego genomu przy uzyciu innego serwera sieciowego do przewidywania patogennosci bakterii - PathogenFinder. To narzedzie nie sklasyfikowalo szczepu IBB3394 jako patogenu. Analiza genomu z wykorzystaniem róznych narzedzi bioinformatycznych rekomendowanych przez EFSA, takich jak ResFinder, CARO i RGI oraz KEGG, nie wykazala w szczepie IBB3394 obecnosci genów opornosci na antybiotyki (ARG). Poprzez analize sekwencyjna potwierdzono bezpieczenstwo wykorzystania szczepu jako probiotyku oraz szczepu do zastosowan przemyslowych, spozywczych i medycznych. Przyklad 13. Wytwarzanie pieczywa na zakwasie zawierajacym Weissella cibaria 1B83394 {KKP 2094p) Pieczywo z dodatkiem drozy piekarskich wytworzono z wykorzystaniem maki zytniej pelnoziarnistej. PL 443929 A1 25/34 Do wytworzenia zakwasów wykorzystano opisana w patencie PL238153B1 kulture starterowa zawierajaca szczepy Lactobacillus plantarum B/00117, Lactobacillus plantarum B/00118 i Lactobacillus brevis w proporcji 1:1:1 jako kontrole oraz ten sam zestaw uzupelniony o szczep W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) w proporcji 1:1:1:1 jako próbie badanej. Zakwasy wytworzono jak w Przykladzie 3 opisanym w patencie PL238153B1. Pieczywo przygotowano wedlug nastepujacej receptury (dla chlebów o wadze 0,5 kg). Przygotowanie surowców i ich ilosci na okolo 1 kg ciasta: maka zytnia typ 2000 zakwas z maki zytniej typ 2000 drozdze piekarskie sól woda (temp. 38°() Wytwarzanie i sporzadzanie ciasta wlasciwego czas miesienia - wolne obroty czas miesienia - szybkie obroty temperatura ciasta wlasciwego Dzielenie, formowanie, ksztaltowanie ciasta wlasciwego masa kesa czas dzielenia i ksztaltowanie ciasta na kesy czas fermentacji ciasta wlasciwego w kesach Proces wypieku temperatura wypieku: czas wypieku 0,5 kg 0,17 kg 0,006 kg 0,012 kg okolo 0,31 kg 7 min. 3 min. do 35 °C 0,5 kg 45 min. do 90 min. 200°c 60 min. Do oceny pieczywa stosowano metody opisane w PL238153B1. Otrzymane pieczywo poddano ocenie organoleptycznej wg PN-A-74108:1996, analize przeprowadzono metoda punktowa przez panel o sprawdzonej wrazliwosci sensorycznej. Po wypieczeniu wykonano analize wilgotnosci miekiszu oraz profilu tekstury miekiszu upieczonych chlebów. Dla wytworzonego pieczywa wyznaczono równiez trwalosc mikrobiologiczna. Otrzymane chleby przechowywano przez 7 dni w celu okreslenia zmian zachodzacych podczas starzenia sie pieczywa. Dla chleba z dodatkiem zakwasu wytworzonego z W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) zaobserwowano zwiekszona elastycznosc miekiszu z zachowaniem chrupkosci skórki chleba, polepszenie smaku i zapachu otrzymanego chleba w porównaniu do kontroli. Pieczywo z dodatkiem W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) charakteryzowalo sie zwiekszona objetoscia bochenka i wyzsza wilgotnoscia miekiszu, znaczaco mniejsza twardoscia i zujnoscia miekiszu w porównaniu do pieczywa kontrolnego. Pieczywo na zakwasie suplementowanym W. cibaria IB83394 (KKP 2094p) wykazuje taka sama trwalosc mikrobiologiczna (przez 3 dni) jak pieczywo kontrolne. Otrzymane pieczywo uzyskalo wyzsza ocene organoleptyczna od pieczywa kontrolnego. PL 443929 A1 26/34 LITERATURA: [1] Aziz i wsp. (2008). The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC genomics, 9(1):1-15. [2] Badel i wsp. (2011). New perspectives for lactobacilli exopolysaccharides, Biotechnol Adv, 29:54-66. [3] Baruah i wsp. (2016). Functional food applications of dextran from Weissella cibaria RBA12 from pummelo (Citrus maxima). Int J Food Microbiol, 242:124-31. [4] Boyce i Havill (2005). Nosocomial antibiotic-associa-ted diarrhea associated with enterotoxin-producing strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Am J Gastroenterol, 100:1828-34. [5] Boyce i wsp. (2007). Widespread environmental contamination associated with patients with diarrhea and methicillin­ resistant Staphylococcus aureus colonization of the gastrointestinal tract. lnfect Control Hosp Epidemio!, 28:1142-7. [6] Buksa i wsp. (2021). Extraction, purification and characterisation of exopolysaccharides produced by newly isolated lactic acid bacteria strains and the examination of their influence on resistant starch formation. Food Chem, 362, 130221. [7] Collins i wsp. (1993). Taxonomic studies on same leuconostoc-like organisms from fermented sausages: description of a new genus Weissella for the Leuconostoc paramesenteroides group of species. J Appl Bacteriol, 75:595-603. [8] Dey i Kang (2020). Weissella confusa DD_A7 pre-treatment to zebrafish larvae ameliorates the inflammation response against Escherichia coli 0157: H7. Microbiol Res, 237, 126489. [9] EFSA (2018) Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP),. Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms. EFSA J 16(3), e05206. [10] EL-Adawi i wsp. (2012). Cytotoxicity assay and antioxidant activities of the lactic acid bacterial strains. African J Microbiol Res, 6(8):1700-12. [11] Elshaghabee i wsp. (2020). Effect of oral administration of Weissella confusa on fecal and plasma ethanol concentrations, lipids and glucose metabolism in wistar rats fed high fructose and fat diet. Hepatic Med, 12:93-106. [12] Han i wsp. (2016). lmprovement of the texture of yogurt by use of exopolysaccharide producing lactic acid bacteria, BioMed Res Int, 7945675. [13] Hu i Ganzle (2018) Effect of temperature on production of oligosaccharides and dextran by Weissella cibaria 10 M. Int J Food Microbiol 280:27-34. [14] Jin i wsp. (2019). Isolation and characterization of high exopolysaccharide-producing Weissella confusa VP30 from young children's feces. Microbl Cell Factories, 18, 110. [15] Kang i wsp. (2019). Safety evaluation of oral care probiotics Weissella cibaria CMU and CMSl by phenotypic and genotypie analysis. Int J Mol Sci, 20(11), 2693. [16] Kanehisa i wsp. (2022). KEGG mapping tools for uncovering hidden features in biological data. Protein Science, 31(1):47-53. [17] Kanehisa i wsp. (2016). BlastKOALA and GhostKOALA: KEGG tools for functional characterization of genome and metagenome sequences. J Mol Biol, 428(4):726-31. [18] Kavitake i wsp. (2020). Overview of exopolysaccharides produced by Weissella genus - A review. Int J of Bio/1 Macromol, 164:2964-73. [19] Kavitake, i wsp. (2016). Characterization of a novel galactan produced by Weissella confusa KR780676 from an acid ie fermented food. International journal of biologica/ macromolecules, 86, 681-689. [20] Kim i wsp. (2008). Characterization of exopolysaccharide (EPS) produced by Weissella hellenica SKkimchi3 isolated from kimchi. J Microbiol, 46(5):535-41. [21] lan i wsp. (2012). Bio-protective potentia! of lactic acid bacteria isolated from fermented wax gourd. Folia Microbiol, 57(2):99-105. [22] Le i wsp. (2020). Synbiotic fermented soymilk with Weissella cibaria FB069 and xylooligosaccharides prevents proliferation in human colon cancer cells. J Appl Microbiol, 128(5):1486-96. [23] Lee i wsp. (2012). Probiotic properties of Weissella strains isolated from human faeces. Anaerobe, 18:96-102. [24] Lee i wsp. (2015). Multifunctional effect of probiotic Lactococcus lactis KC24 isolated from kimchi. LWT- Food Sci Techno!, 64:1036-1041. [25] Lim, i wsp. (2018). Characterization of antibacterial cell-free supernatant from oral care probiotic Weissella cibaria, CMU. Mo/ecu/es, 23(8), 1984. [26] Litwinek i wsp. (2022). Developing lactic acid bacteria starter cultures for wholemealrye flour bread with improved functionality, nutritional value, taste, appearance and safety. PLoS ONE 17(1), e0261677. [27] Lynch i wsp. (2018). Lactic acid bacteria exopolysaccharides in foods and beverages: isolation, properties, characterization, and health benefits, Annu Rev Food Sci Techno!, 9:155-76. [28] Mun i Chang (2020). Characterization of Weissella koreensis SK isolated from kim chi fermented at low temperature (around O degrees C) based on complete genome sequence and corresponding phenotype. Microorganisms, 8, 1147. [29] Ndagano i wsp. (2011). Antifungal activity of 2 lactic acid bacteria of the Weissella genus isolated from food. J Food Sci, 76(6):M305-M311. [30] Onanuga i Temedie (2011). Multidrug-resistant intestinal Staphylococcus aureus among self-medicated healthy adults in Amassoma, South-South, Nigeria. J Health Popu/ Nutr, PL 443929 A1 27/34 29(5):446-53. [31] Patrone i wsp. (2021). Integrated phenotypic-genotypic analysis of candidate probiotic Weissella ci baria strains isolated from dairy cows in Kuwait. Probiotics Antimicrob Proteins, 13(3), 809-23. [32] Prado i wsp. (2020). Weissella paramesenteroides WpK4 ameliorate the experimental amoebic colitis by increasing the expression of M UC-2 and the intestinal epithelia I regeneration. J Appl Microbiol, 129(6): 1706-19. [33] Vosough i wsp. (2021). Evaluation of antioxidant, antibacterial and cytotoxicity activities of exopolysaccharide from Enterococcus strains isolated from traditional lranian Kishk. Food Measure, 15:5221-30. [34] Saadat i wsp. (2019). A comprehensive review of anticancer, immunomodulatory and health beneficial effects of the lactic acid bacteria exopolysaccharides, Carbohydr Polym, 217:79-89. [35] Salanski i wsp. (2022). Health-promoting nature of L. lactis 18B109 and 18B417 strains exhibiting proliferation inhibition and stimulation of interleukin-18 expression in colorectal cancer cells-insights at physiological and genomie level. Front Microbiol, 1825. [36] Sandes i wsp. (2020). Weissella paramesenteroides WpK4 plays an immunobiotic role in gut-brain axis, reducing gut permeability, anxiety­ like and depressive-like behaviors in murine models of colitis and eh ro nic stress. Food Res Int, 137, 109741. [37] Sokolowska-Wojdylo (2021). Infekcje gronkowcowe skóry - problem wciaz aktualny. Wiadomosci dermatologiczne 11, 24 wrzesnia 2021 [38] Tao i wsp. (2017). Database and bioinformatics studies of probiotics. J Agric Food Chem, 65(35): 7599-606. [39] Teixeira i wsp. (2021). Weissella: an emerging bacterium with promising health benefits. Probiotics Antimicrob Proteins, 13:915-25. [40] Torino i wsp. (2015). Biopolymers from lactic acid bacteria. Novel applications in foods and beverages. [Review]. Front Microbiol, 6, 834. [41] Valerio i wsp. (2020). Effect of Amaranth and Quinoa Flours on exopolysaccharide production and protein profile of liquid sourdough fermented by Weissella cibaria and Lactobacillus plantarum. Front Microbiol 11, 967. [42] Vasanthakumari i wsp. (2015). Physicochemical characterization of an exopolysaccharide produced by a newly isolated Weissella cibaria. Appl Biochem Biotechnol, 176(2):440-53. [43] Wolter i wsp. (2014) Evaluation of exopolysaccharide producing Weissella cibaria MGl strain for the production of sourdough from various flours. Food Microbiol 37:44-50. [44] Xu i wsp. (2017). In situ synthesis of exopolysaccharides by Leuconostoc spp. and Weissella spp. and their rheological impacts in fava bean flour. Int J Food Microbiol, 248:63-71. [45] Yeu i wsp. (2021). Antimicrobial and antibiofilm activities of Weissella cibaria against pathogens of upper respiratory tract infections. Microorganisms, 9(6), 1181. [46] Yildiz i Karatas (2018). Microbial exopolysaccharides: Resources and bioactive properties. Process Biochemistry, 72:41-6. [47] Yu i wsp. (2019a). Antagonistic and antioxidant effect of probiotic Weissella cibaria JW15. Food Sci Biotechnol, 28:851-5. [48] Yu i wsp. (2019b). Anti-lnflammatory potentia! of probiotic strain Weissella cibaria JW15 isolated from kimchi through regulation of NF-KB and MAPKs pathways in LPS-induced RAW 264.7 cells. J Microbiol Biotechnol, 29:1022-32. [49] Zeidan i wsp. (2017). Polysaccharide production by lactic acid bacteria: From genes to industrial applications. FEMS Microbiol Rev, 41(Supp_l):S168-S200. [SO] Zhang i wsp. (2018) Characterization of a yogurt-quality improving exopolysaccharide from Streptococcus thermophilus AR333, Food Hydroco/1, 81 :220-8. [51] Zhou i wsp. (2018) Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: structure, bioactivity and associations: a review, Carbohydr Polym, 207:317-32. PL 443929 A1 28/34 ZASTRZEZENIA PATENTOWE
1. Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, zdeponowany w IAFB (Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemyslowych, IBPRS-PIB im. prof. Waclawa Dabrowskiego w Warszawie, Polska) pod nr depozytu KKP 2094p.
2. Kompozycja zawierajaca nowy szczep bakterii Weissella cibaria, zdeponowany w IAFB pod nr depozytu KKP 2094p.
3. Kompozycja wedlug zastrz. 2, znamienna tym, ze jest kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ponadto dopuszczalny farmaceutycznie nosnik, przy czym korzystnie kompozycja jest w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego.
4. Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca szczep bakterii Weissella cibaria jak okreslony w zastrz. 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 3 oraz dopuszczalny farmaceutycznie nosnik do zastosowania jako lek.
5. Kompozycja farmaceutyczna wedlug zastrz. 4, znamienna tym, ze jest do zastosowania jako lek do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita, korzystnie do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita grubego, najkorzystniej gruczolakoraka jelita grubego.
6. Suplement diety zawierajacy szczep bakterii Weissella cibaria jak okreslony w zastrz. 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 3, przy czym suplement diety korzystnie jest w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego.
7. Preparat probiotyczny zawierajacy szczep bakterii Weissella ci baria jak okreslony w zastrz. 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 3, przy czym preparat probiotyczny korzystnie ponadto zawiera substancje prebiotyczne, korzystnie wybrane z oligosacharydów, polisacharydów, fruktooligosacharydów, laktulozy, inuliny, skrobi opornej, celulozy, hemicelulozy i pektyn, przy czym preparat korzystnie ponadto zawiera postbiotyki, korzystnie postbiotyki wybrane sa z krótkolancuchowych kwasów tluszczowych, enzymów, lipopolisacharydów, kwasów tejchojowych, witamin, kwasu maslowego, octanu, propionianu, dipeptydu muramilu, indlu, kwasu teichowego, laktocepin.
8. Preparat probiotyczny wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze jest w postaci w postaci plynnej, stalej, proszku, tabletki, kapsulki przeznaczonej do podawania doustnego.
9. Bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, znamienna tym, ze w jej sklad wchodzi szczep Weissella ci baria jak okreslony w zastrz. 1.
10. Zakwas do wyrobu pieczywa, znamienny tym, ze zawiera bakteryjna kulture starterowa jak okreslona w zastrz. 9.
11. Sposób wytwarzania pieczywa znamienny tym, ze obejmuje etap dodawania bakteryjnej kultury starterowej jak okreslonej w zastrz. 9 i/lub zakwasu jak okreslonego w zastrz. 10. PL 443929 A1 29/34
12. Pieczywo, znamienne tym, ze zawiera bakteryjna kulture starterowa jak okreslona w zastrz. 9 i/lub zakwas jak okreslony w zastrz. 10.
13. Sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, znamienny tym, ze obejmuje etap, w którym szczep bakterii Weissella cibaria jak okreslony w zastrz 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 2 hoduje sie na plynnym podlozu bez dekstrozy (bez glukozy) z dodatkiem sacharozy, organicznym zródlem azotu zawierajacym aminokwasy i krótkie peptydy, witaminy z grupy B i sole mineralne.
14. Sposób wedlug zastrz. 13, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie na podlozu MRS (bulion DeMan­ Rogosa-Sharpe), podlozu dla bakterii mlekowych, korzystnie z dodatkiem 5-10%±2 wag. sacharozy.
15. Preparat bakteryjny zawierajacy szczep bakterii Weissella cibaria jak okreslonej w zastrz 1 i/lub kompozycje jak okreslona w zastrz. 2 do zastosowania jako skladnik czynny w probiotyku, preparacie terapeutycznym, zywnosci funkcjonalnej, suplemencie diety, do zastosowania jako skladnik aktywny leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu jelita, korzystnie nowotworu jelita grubego.
16. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 jako dodatku funkcjonalnego w zywnosci funkcjonalnej, dodatku funkcjonalnego do napoju spozywczego, jako skladnika aktywnego preparatu probiotycznego, preparatu bakteryjnego, suplementu diety, kompozycji farmaceutycznej.
17. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 w przemysle spozywczym jako emulgator, zageszczacz, stabilizator lub polepszacz tekstury produktu spozywczego.
18. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 do mikrobiologicznego wytwarzania egzopolisacharydów (EPS), korzystnie dekstranu.
19. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 i/lub bakteryjnej kultury starterowej jak okreslonej w zastrz. 9 do wytwarzania zakwasu do pieczywa.
20. Zastosowanie szczepu bakterii Weissella cibaria jak okreslonego w zastrz 1 i/lub kompozycji jak okreslonej w zastrz. 2 i/lub zakwasu do wyrobu pieczywa jak okreslonego w zastrz. 10 do wytwarzania pieczywa. PL 443929 A1 30/34 FIG.1 FIG. 2 PL 443929 A1 31/34 -; o lilll -; ,___, ? -; w :::r o C. o :e iii" :::, o n ::, l:IJ Ili C: "C ro ... :::, Il.) .... l:IJ :::, .... ro ;;:;- Ili .... .... !lJ ;;:;- ... N l:IJ ~- 1'D !!!, :::, "'C w o, ;;:;- VI O 3 O, ... li) " :ie I-" N .i:,. Cil 00 O o o o o o o * * * * * * o * o * o * l~~ o * il~ .I * ...... N o * ,___, N N * "T1 G') .,::a w w I sx:i o I Spadek w rzedach wielkosci liczby bakterii I _:--J o I ,en o I I ,U"I o I I I I ,.f::> o I !-'J o I I _!'J o I I !-" o I o o ~ IBB3714 IBB3715 IBB3716 I8B3717 IBB3277 IBB3278 IBB3279 I8B3385 IBB3386 IBB3387 IB83388 IB83389 IBB3393 IBB3394 I8B3287 I8B3325 IBB3326 IBB3327 I8B3382 I8B3383 IBB3384 IBB3280 IB83281 IBB3282 1B83284 IBB3285 I8B3286 "T1 G') w PL 443929 A1 32/34 2.5 - ]2.0 I ~ < 1.5 - ca "o' s:: 1.0 ca .c ~ o fi) 0.5 .c o.o FIG. 5 Kontrola 3394 IB6109 IL6288 FIG. 6 PL 443929 A1 33/34 FIG. 7 FIG. 8 Caco-2 HEK293 100 100 ~ ~ •O •O •li) •li) o o C: C: I 50 «i 50 ::: >, •N ·N QI QI t::! t::! D.. D.. o o Kontrola 2,5 5 10 20 30 Kontrola 2,5 5 10 20 30 Stezenie EPS [mgfml] Stezenie EPS [mgfml] FIG. 9 FIG.10 Caco-2 HEK293 -10 ....... 10 ~ '::§!. L 2... •(J •U •fi) •li) o o C C N 5 N 5 (.) (.) >, >, fi) li) ~ -li:: o o - .... o o .. >, o .... >, o (.) (.) 2,5 5 10 20 30 2,5 5 10 20 30 Stezenie EPS [mg/ml] Stezenie EPS [mg/ml] PL 443929 A1 34/34 al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.443929 Klasyfikacja zgloszenia: Cl2N 1/20, Cl2R 1/01, A61K 35/744, A61K 31/721, A61P 35/00, Cl2P 19/08, A21D 8/04, A21D 13/06 Podklasy w których prowadzono poszukiwania: Cl2Nl Cl2Rl A61K35 A61K31 A61P35 Cl2Pl9 A21D8 A21Dl3 Bazy komputerowe w których prowadzono poszukiwania: EPODOC WPI bazy UPRP STN Kategoria dokumentu Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie do zastrz. A PL4 l 1242 A (Instytut Biotechnologii Przemyslu Rolno-Spozywczego im. 1-20 Waclawa Dabrowskiego , Warszawa) 16-02-2015 zastrzezenia 1-15, przyklady A EP4098271 Al (LISCURE BIOSCI CO LTD [KR]) 07-12-2022 1-20 zastrz. 1-15, Fig. 1-5 A EP38957 17 Al (KOREA FOOD RES INST) 20-10-2021 1-20 zastrz. 1-3, abstrakt A Ahmed, S.; Singh, S. ; Singh, V.; Roberts, K.D. ; Zaidi, A.; Rodriguez-Palacios, A., 1-20 The Weissella Genus: Clinically Treatable Bacteria with Antimicrobial/Probiotic Effects on Inflammation and Cancer, Microorganisms, 2022, 10, 2427, https://doi.org/10.3390/ rnicroorganismsl0122427 abstrakt, str. 10-11 O Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A- dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytowanego dokumentu lub z innego szczególnego powodu, O - dokument odnoszacy sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za nowy lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Ewa Waszkowska Ekspert Data: 29.05.2023 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 28.02.2023r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego
PL443929A 2023-02-28 2023-02-28 Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, kompozycja go zawierająca, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujące ten szczep PL246440B1 (pl)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL443929A PL246440B1 (pl) 2023-02-28 2023-02-28 Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, kompozycja go zawierająca, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujące ten szczep
KR1020257030982A KR20250156133A (ko) 2023-02-28 2024-02-23 신규 세균주 와이셀라 시바리아, 이를 포함하는 조성물, 사용을 위한 약제학적 조성물, 식이 보충제, 프로바이오틱 제제, 빵 제조를 위한 세균 스타터 배양균, 사워도우, 빵, 빵의 생산 방법, 덱스트란의 미생물학적 생산 방법, 세균 제제 및 이 균주를 사용한 응용
EP24764264.8A EP4673528A1 (en) 2023-02-28 2024-02-23 A new bacterial strain weissella cibaria, a composition comprising it, a pharmaceutical composition for use, a dietary supplement, a probiotic preparation, a bacterial starter culture for making bread, sourdough, bread, a method for the production of bread, a method for microbiological production of dextran, a bacterial preparation and applications using this strain
CN202480016216.9A CN121057809A (zh) 2023-02-28 2024-02-23 新型细菌菌株食窦魏斯氏菌、包含该细菌菌株的组合物、用于使用的药物组合物、膳食补充剂、益生菌制剂、用于制作面包的细菌发酵剂培养物、酸面团、面包、用于生产面包的方法、用于葡聚糖的微生物生产的方法、细菌制剂和使用该菌株的应用
JP2025550146A JP2026509356A (ja) 2023-02-28 2024-02-23 新規ワイセラ・シバリア細菌株、それを含む組成物、使用のための医薬組成物、栄養補助食品、プロバイオティクス調製物、パンを作製するための細菌スターター培養物、サワードウ、パン、パンの製造のための方法、デキストランの微生物産生のための方法、細菌調製物及びこの株を使用する用途
PCT/PL2024/050016 WO2024181878A1 (en) 2023-02-28 2024-02-23 A new bacterial strain weissella cibaria, a composition comprising it, a pharmaceutical composition for use, a dietary supplement, a probiotic preparation, a bacterial starter culture for making bread, sourdough, bread, a method for the production of bread, a method for microbiological production of dextran, a bacterial preparation and applications using this strain

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL443929A PL246440B1 (pl) 2023-02-28 2023-02-28 Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, kompozycja go zawierająca, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujące ten szczep

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL443929A1 true PL443929A1 (pl) 2024-09-02
PL246440B1 PL246440B1 (pl) 2025-01-27

Family

ID=92590035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL443929A PL246440B1 (pl) 2023-02-28 2023-02-28 Nowy szczep bakterii Weissella cibaria, kompozycja go zawierająca, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania, suplement diety, preparat probiotyczny, bakteryjna kultura starterowa do wyrobu pieczywa, zakwas, pieczywo, sposób wytwarzania pieczywa, sposób mikrobiologicznego wytwarzania dekstranu, preparat bakteryjny oraz zastosowania wykorzystujące ten szczep

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP4673528A1 (pl)
JP (1) JP2026509356A (pl)
KR (1) KR20250156133A (pl)
CN (1) CN121057809A (pl)
PL (1) PL246440B1 (pl)
WO (1) WO2024181878A1 (pl)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118995536B (zh) * 2024-10-23 2025-01-24 中国农业大学 对蝗虫微孢子虫有增效作用的食窦魏斯氏菌及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL411242A1 (pl) * 2015-02-16 2016-08-29 Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego Im. Prof. Wacława Dąbrowskiego Szczep Weisella cibaria, zawierająca go kultura starterowa, zakwas, pieczywo oraz sposób otrzymywania pieczywa i zastosowanie szczepu, kultury starterowej lub zakwasu do wytwarzania pieczywa
EP3895717A1 (en) * 2018-12-10 2021-10-20 Korea Food Research Institute Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising weissella cibaria wikim28 as active ingredient
EP4098271A1 (en) * 2020-01-31 2022-12-07 Liscure Biosciences Co., Ltd. Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising weissella cibaria wikim28 as active ingredient

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL411242A1 (pl) * 2015-02-16 2016-08-29 Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego Im. Prof. Wacława Dąbrowskiego Szczep Weisella cibaria, zawierająca go kultura starterowa, zakwas, pieczywo oraz sposób otrzymywania pieczywa i zastosowanie szczepu, kultury starterowej lub zakwasu do wytwarzania pieczywa
EP3895717A1 (en) * 2018-12-10 2021-10-20 Korea Food Research Institute Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising weissella cibaria wikim28 as active ingredient
EP4098271A1 (en) * 2020-01-31 2022-12-07 Liscure Biosciences Co., Ltd. Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising weissella cibaria wikim28 as active ingredient

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHMED, S.; SINGH, S.; SINGH, V.; ROBERTS, K.D.; ZAIDI, A.; RODRIGUEZ-PALACIOS, A.: "Microorganisms, 2022, 10, 2427", THE WEISSELLA GENUS: CLINICALLY TREATABLE BACTERIA WITH ANTIMICROBIAL/PROBIOTIC EFFECTS ON INFLAMMATION AND CANCER, DOI: https://doi.org/10.3390/ microorganisms10122427 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN121057809A (zh) 2025-12-02
WO2024181878A1 (en) 2024-09-06
JP2026509356A (ja) 2026-03-18
EP4673528A1 (en) 2026-01-07
KR20250156133A (ko) 2025-10-31
PL246440B1 (pl) 2025-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ryan et al. Sugar-coated: exopolysaccharide producing lactic acid bacteria for food and human health applications
Dec et al. Screening of Lactobacillus strains of domestic goose origin against bacterial poultry pathogens for use as probiotics
AU2011302135B2 (en) Bacillus subtilis isolate from corn
US11607435B2 (en) Probiotics Bifidobacteria strains
US9814242B2 (en) Bacillus subtilis isolate from corn and extracts that inhibit the growth of undesirable microorganisms in food products
Carrizo et al. Lactic acid bacteria from andean grain amaranth: a source of vitamins and functional value enzymes
Minervini et al. Wheat endophytic lactobacilli drive the microbial and biochemical features of sourdoughs
Çakır et al. The molecular and technological characterization of lactic acid bacteria in einkorn sourdough: Effect on bread quality
JP2019528738A (ja) 細菌
CN111565581A (zh) Iv型过敏用组合物
KR102677848B1 (ko) 김치 발효용 프로바이오틱스 및 이를 활용한 김치
Holubchyk et al. PROBIOTIC MICROORGANISMS IN BREAD SOURDOUGHS.
EP4673528A1 (en) A new bacterial strain weissella cibaria, a composition comprising it, a pharmaceutical composition for use, a dietary supplement, a probiotic preparation, a bacterial starter culture for making bread, sourdough, bread, a method for the production of bread, a method for microbiological production of dextran, a bacterial preparation and applications using this strain
Lata et al. Probiotic characterization of Saccharomyces cerevisiae Y196 and Y197 isolated from rice chhang-a fermented beverage of Lahaul Spiti
Peng et al. Complete genome analysis of Lactiplantibacillus plantarum VHProbi P06, a novel probiotic that resists Streptococcus pneumoniae in the upper respiratory tract
Hossain et al. Antipathogenic action and antibiotic sensitivity pattern of the “Borhani”-associated lactic acid bacterium Weissella confusa LAB-11
KR102668292B1 (ko) 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 atg-v5 균주 또는 이를 포함하는 면역증강용 조성물
KR101789155B1 (ko) 발효시 높은 생균수를 갖는 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 발효 식품 제조 방법
Angelov et al. On the Molecular Selection of Exopolysaccharide-Producing Lactic Acid Bacteria from Indigenous Fermented Plant-Based Foods and Further Fine Chemical Characterization. Foods. 2023; 12 (18)
Huligere Sujay S. Huligere, VB Chandana Kumari, Taha Alqadi 2, Saurabh Kumar 3, Charley A. Cull 4, Raghavendra G. Amachawadi 5* and Ramith Ramu
Nuñez et al. Novel Probiotic for Peppers Fermentation with Safe and Health-Promoting Potential
CA3046705C (en) Novel probiotics bifidobacteria strains
FASHOGBON et al. ENHANCEMENT OF SOURDOUGH BREAD USING PROBIOTIC LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM CORN STEEP LIQUOR
SULIMAN CHARACTERIZATION OF EXOPOLYSACCHARIDES FROM PROBIOTIC Lactobacillus STRAINS ISOLATED FROM TRADITIONAL MALAYSIAN FOODS
Avci et al. Determination of fundamental probiotic properties of Lactobacillus strains isolated from Turkish local yogurt