Pierwszenstwo: Opublikowano: 30.IX.1967 (P 122 810) 15.VIII.1971 62547 KI. 6 b, 16/02 MKP C 12 d, 1/06 UKlt CZYTELNIA Urzedu Patentowego j Twórca wynalazku: Romuald Bogoczek Wlasciciel patentu: Politechnika Slaska im. W. Pstrowskiego (Katedra Chemii i Technologii Organicznej), Gliwice (Polska) Fermentacyjny sposób wytwarzania kwasu 2-keto-L-gulonowego Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia kwasu 2-keto-L-gulonowego na drodze fermen¬ tacji roztworów sorbitolu.Z opisu patentowego brytyjskiego nr 994.119 znany jest fermentacyjny sposób otrzymywania tego kwasu z sorbitolu. Sposób ten polega na dlu¬ gotrwalym, periodycznym fermentowaniu rozcien¬ czonych roztworów sorbitolu z pomoca bakterii ro¬ dzaju Acetobacter i Pseudomonas, z dodatkiem weglanu wapnia i skladników odzywczych dla bak¬ terii. Po 7—10 dniach trwania fermentacji, tj. po jej zakonczeniu filtruje sie brzeczke, a nastepnie przepuszcza przez kolumny kationitowa i amonito¬ wa. W tej ostatniej sorbuje sie kwas 2-keto-L-gulo- nowy a wyciek z niej ulega odrzuceniu jako bez¬ wartosciowy. Zaabsorbowany produkt wypiera sie ze zloza amonitowego z pomoca roztworu zasady uzyskujac w ten sposób roztwór soli kwasu 2-keto- -L-gulonowego.Znany jest tez sposób otrzymywania czystego kwasu 2-keto-L-gulonowego z jego soli, na drodze przepuszczania roztworów tej soli przez zloze zywi¬ cy kationitowej.Znany fermentacyjny sposób wytwarzania kwasu 2-keto-L-gulonowego cechuje dlugotrwalosc i pra¬ cochlonnosc, jak równiez dosc niska wydajnosc ma¬ terialowa. Ponadto istnieje koniecznosc ponowne¬ go zaszczepiania kazdej nowej szarzy kultura bak¬ terii fermentacyjnych. 20 Wiele z wymienionych wad i niedogodnosci tego sposobu mozna byloby pokonac, gdyby proces pro¬ wadzono w sposób ciagly. Dotychczas jednak nie¬ znany jest ciagly proces wytwarzania kwasu 2- -keto-L-gulonowego z sorbitolu na drodze fermen¬ tacyjnej, tj. biochemicznej.Znany jest natomiast z opisu patentowego nr 56722 ciagly sposób otrzymywania kwasu 2-keto- -L-gulonowego na drodze czysto chemicznej to jest nie fermentacyjnej, przy czym wychodzi sie z in¬ nego surowca organicznego, a mianowicie z L-sor- bozy. Znane jest tez w zwiazku z tym z tego same¬ go opisu patentowego, urzadzenie sluzace do prze¬ prowadzenia takiego ciaglego sposobu. Urzadzenie to sklada sie z reaktora, filtra, kolumny kationito¬ wej, kolumny anionitowej, zbiorników podawczych i odbiorczych, z pompy obiegowej oraz ze zbiorni¬ ka przygotowawczego.W niniejszym opracowaniu udalo sie stworzyc ciagly sposób wytwarzania kwasu 2-keto-L-gulono¬ wego na drodze fermentacyjnej, gdzie surowcem organicznym jest sorbitol. Wynalazek powstal przez polaczenie znanego, fermentacyjnego periodycznego sposobu wytwarzania ze znanym lecz zmienionym nieco urzadzeniem sluzacym do ciaglego wytwa¬ rzania tego kwasu na drodze chemicznej, lecz u in¬ nych surowców. Ze sposobu bedacego przedmiotem opisu patentowego nr 56722 przyjeto równiez ogól¬ na koncepcje procesu polegajaca na nawracaniu 62 5473 do srodowiska reakcyjnego roztworu, z którego usunieto produkt reakcji.Jednakze wprowadzono tu pewne zmiany, gdyz jak sie okazalo, roztwory poreakcyjne, które prze¬ szly przez uklad kolumn jonitowych po ponownym wprowadzeniu do kadzi fermentacyjnej, zatruwaly mikroorganizmy, zatrzymujac fermentacje nieraz równiez zmienialy jej kierunek. Te istotna prze- , szkode udalo sie usunac dopiero po zainstalowaniu sterylizatora pomiedzy zbiornik przygotowawczy w kadz fermentacyjna, i przez dokladne wysterylizo- wanie wszystkich roztworów obiegowych. Ten zmieniony schemat aparaturowy przedstawiono na rysunku. Zostanie on omówiony w przykladzie.Postep techniczny jaki wnosi sposób wedlug wy¬ nalazku w stosunku do znanego sposobu fermenta¬ cyjnego polega na tym, ze nowy proces jest ciagly, charakteryzuje sie znacznie wieksza szybkoscia wy¬ twarzania produktu i przebiegu samej reakcji bio¬ chemicznej, co stanowi efekt nieoczekiwany. W stosunku do znanego ciaglego sposobu wytwarzania kwasu 2-keto-L-gulonowego na drodze chemicz¬ nej postep polega na tym, ze w charakterze glów¬ nego surowca stosuje sie sorbitol, a wiec surowiec wymagajacy krótszej obróbki chemicznej niz L-sorboza.Sposób wedlug wynalazku polega na ciaglej, lecz stale tylko czesciowej fermentacji roztworu sorbi- tolu, wywolanej dzialaniem bakterii rodzaju Aceto- bacter lub Pseudomonas na podlozu odzywczym, zawierajacym weglan wapnia. Ciaglosc procesu jest wywolana ciaglym odprowadzaniem czesci brzecz¬ ki z kadzi fermentacyjnej do kolumn jonitowych gdzie sorpcji ulega produkt reakcji, 'i ciaglym po¬ wrotem tego roztworu do tejze kadzi, po uprzednim uzupelnieniu w nim surowców i wysterylizowaniu.Czesciowosc fermentacji polega na tym, ze koncen¬ tracja jonu 2-keto-L-gulonianowego w brzeczce fermentacyjnej wynosi tylko niewielka czesc kon¬ centracji sorbitolu, a mianowicie stezenie sorbitolu wynosi 1,0—15% wagowych a stezenie 2-keto-L- -gulonianu wapniowego wynosi 0,01—1,0% wago¬ wych.Kolumny jonitowe stosuje sie dwojakiego rodza¬ ju. Najpierw roztwór przeplywa przez kolumne ka- tionitowa, gdzie jony metaliczne w roztworze zo¬ staja wymienione na jony wodorowe. Nastepnie roztwór przeplywa przez kolumne anionitowa, gdzie sorpcji ulega kwas 2-keto-L-gulonowy, a roztwór nieprzereagowanego sorbitolu przeplywa bez zmian.Kwas 2-keto-L-gulonowy otrzymuje sie przez wy¬ parcie ze zloza amonitowego za pomoca elektrolitu.Zloza zywiczne regeneruje sie w znany sposób, a mianowicie kationit przez przemycie kwasem mi¬ neralnym, anionit przez przemycie roztworami wo¬ dorotlenków zasadowych. Sposób postepowania wedlug wynalazku, przedstawiony zostal na rysun¬ ku.Istota wynalazku oparta jest na spostrzezeniu, ze szybkosc powstawania kwasu 2-keto-L-gulonowego jest zróznicowana w czasie trwania fermentacji.Poczatkowo istnieje pewien-okres inicjacji procesu w którym narastanie koncentracji produktu jest bardzo powolne. Dopiero przy poziomie okolo 0,1 g 30 62 547 4 2-keto-L-gulonianu wapniowego w litrze nastepuje bardzo szybki przyrost koncentracji produktu w brzeczce fermentacyjnej, po czym koncentracja ta zbliza sie asymptotycznie do wielkosci maksymal- 5 nej. Dalszym spostrzezeniem na którym oparto wy¬ nalazek jest fakt, ze mozliwa jest zupelna sorpcja nawet drobnych ilosci kwasu 2-keto-L-gulonowego z brzeczki fermentacyjnej zawierajacej znaczne ilosci innych substancji, poprzez ciagle cykliczne io przeprowadzenie roztworu przez kolumny jonitowe.Dlatego wedlug wynalazku, gdy stezenie kwasu 2-keto-L-gulonowego w brzeczce wynosi tylko nie¬ wielka czesc maksymalnie mozliwej koncentracji korzystnie od okolo 0,1—10 g w litrze, zaczyna sie 15 z niej w sposób ciagly odprowadzac roztwór do ko¬ lumn jonitowych, a jednoczesnie doprowadza sie do kadzi swiezy roztwór sorbitolu z pozywka dla bakterii jak równiez weglan wapnia.W ten sposób przywraca sie i zachowuje w kadzi 20 pierwotne warunki koncentracyjne, to jest kilka do kilkanascie procent wagowych sorbitolu i okolo 0,01—1% wagowych 2-keto-L-gulonianu-wapniowe- go. W ten sposób zachowuje sie wysoka predkosc tworzenia sie 2-keto-L-gulonianu-wapniowego, 25 przy czym brzeczka znajdujaca sie w kadzi wyma¬ ga tylko jednokrotnego zaszczepienia bakteriami na dlugi okres pracy. Celem zapewnienia nalezytej czystosci kultury bakteryjnej w srodowisku fer¬ mentacyjnym, odkaza sie roztwory. przed ich po¬ wrotem do kadzi. Odkazanie odbywa sie znany¬ mi sposobami czy to przez zagotowanie, pasteryzo¬ wanie czy tez napromieniowanie.Wymienione kolumny jonitowe sa wypelnione dwoma rodzajami jonitów. Pierwsze kolumny za¬ wieraja kationit w formie wodorowej celem za¬ miany w brzeczce jonów wapnia i innych kationów metali na jon wodorowy. Nastepne kolumny wy¬ pelnione sa anionitami bedacymi w formie wodo- 40 rotlenowej. Maja one na celu zatrzymanie kwasów zawartych w brzeczce.Sposób wytwarzania kwasu 2-keto-L-gulonowego wedlug wynalazku przedstawia nastepujacy szcze¬ gólowy przyklad, w którym procenty oznaczaja pro- 45 centy wagowe.Przyklad. W przedstawionej na rysunku kadzi fermentacyjnej 1 oraz w zbiornikach przygoto¬ wawczych 11 umieszcza sie roztwór wodny sorbi¬ tolu o stezeniu 5%. Do kadzi dodaje sie poza tym 50 w charakterze pozywki dla bakterii jeden procent glikozy oraz w przyblizeniu tyle samo 3%-owego ekstratu drozdzowego. Nastepnie dodaje sie wegla¬ nu wapnia w ilosci równej w przyblizeniu XU czesci sorbitolu celem zachowania wartosci pH roztworu 55 fermentacyjnego na poziomie okolo 5,6. Do kadzi do¬ daje sie równiez bakterie rodzaju Pseudomonas, po czym, utrzymujac temperature w kadzi na pozio¬ mie okolo 29°C, miesza sie zawartosc i napowiet¬ rza energicznie za pomoca belkotki. Sorbitol utle- 60 nia sie do kwasu 2-keto-L-gulonowego, który ule¬ gajac zobojetnieniu weglanem wapniowym, prze¬ chodzi w 2-keto-L-gulonian-wapniowy. Gdy kon¬ centracja tegoz zwiazku w brzeczce wyniesie okolo 1 g w litrze, zaczyna sie równomiernie i ciagle od- 65 prowadzac roztwór fermentacyjny przewodem nav?\i ,k ki : m:hm 62547 6 filtr 2, a jednoczesnie zaczyna sie ciagle doprowa¬ dzac do kadzi 1 swiezo przygotowany roztwór ze zbiornika przygotowawczego 11 poprzez steryliza¬ tor 3.W kadzi fermentacyjnej utrzymuje sie w ten spo¬ sób stala koncentracje 2-keto-L-gulonianu-wapnia na poziomie okolo 1 g w litrze. Wartosc pH roz¬ tworu utrzymuje sie na poziomie 5—6 poprzez okre¬ sowe dodawanie do kadzi weglanu wapnia. Tym¬ czasem roztwór fermentacyjny przechodzac przez filtr 2 dodaje isie do kolumn kationitowyeh 4, gdzie zawarte w nim kationy wapniowe zostaja wymie¬ nione na wodorowe po czym roztwór przedostaje sie przez odbieralnik 5 do kolumn amonitowych • w których zostaje zatrzymany glównie kwas 2- -keto-L-gulonowy, a brzeczka zawierajaca inne substancje przechodzi do odbieralników 7, z któ¬ rych pompa 9 podaje ja do zbiorników przygoto¬ wawczych 11, do których dodaje sie sorbitol w ilos¬ ci ekwiwalentnej do ilosci usunietego z brzeczki kwasu 2-keto-L-gulonowego, pozywki dla bakterii wywaru drozdzowego i glikozy, równiez w ilosci takiej aby 'Uzupelnic ubytki w brzeczce do pozio¬ mu pierwotnego.Roztwór ze zbiorników 11 doplywa ciagle do ka¬ dzi fermentacyjnej poprzez sterylizator i podgrze¬ wacz 3, do której dodaje sie stopniowo weglan wapniowy, celem utrzymywania wartosci pH = 5,6, jak równiez utrzymuje sie temperature okolo 29°C.Co pewien czas bada sie brzeczke w kadzi pod wzgledem skladu mikrobiologicznego i cheimicz- nego, aby zawczasu spostrzec falszywy bieg pro¬ cesu zapoczatkowany przypadkowym skazeniem. W takim przypadku nalezy zmienic kadz. Przy do¬ kladnym przestrzeganiu warunków sterylizacji zda¬ rza sie to bardzo rzadko.Gdy kolumna kationitowa ulegnie po pewnym czasie dezaktywacji, uaktywnia sie ja przez prze¬ mycie 3% kwasem solnym, przy czym wyciek od¬ rzuca sie.Gdy natomiast dezaktywacji ulegnie kolumna amonitowa to jest, gdy ulegnie ona wysyceniu kwa¬ sem 2-keto-LHgulonowyim, to roztwór pofermenta¬ cyjny przelacza sie do innej kolumny amonitowej, 5 a kwas 2-keto-L-gulonowy wypiera sie okresowo z kolumny amonitowej 6 za pomca kwasu solnego o stezeniu 3% doplywajacego z dozownika 12, uzy¬ skujac w odbieralniku 8 wodny roztwór kwasu 2-keto-L-gulonowego o stezeniu okolo 10%. Kolum¬ ne amonitowa przemywa sie nastepnie roztworem wodorotlenku anionu, celem jej uaktywnienia, aby byla przygotowana do przyjecia nastepnej ilosci produktu, n Otrzymany wodny roztwór kwasu 2-keto-Li-gulo- nowego nadaje sie dobrze do bezposredniej syntezy witaminy C. PL PL