PL80303B1 - - Google Patents

Description

Uprawniony z patentu: Merck and Co., Inc. Rahway (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania szczepionki przeciw grypie Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza- nia szczepionki przeciw grypie, zawierajacej anty¬ geny i substancje pomocnicza.Antygeny sa substancjami, tatóre stymuluja wy¬ twarzanie przeciwcial, te zas stanowia wazny ele¬ ment mechanizmu obronnego ciala przeciwko pro¬ cesom infekcyjnym i alergicznym. Ostrozne uzy¬ cie substancji antygenowych moze wywolac w zy¬ wym organizmie zjawisko jego uodpornienia i od¬ czulenia. W tym celu stosuje sie odpowiednie szczepionki, preparaty alergenowe i tym podobne.Czesto jednak napotyka sie w praktyce przy sto¬ sowaniu substancji antygenowych na trudnosci, uzyskujac tylko slabe lub zadowalajace wyniki wzbudzenia reakcji antygenowej. Trudnosci tych mozna uniknac stosujac substancje znane jako substancje pomocnicze, które /maja zdolnosc zwiek¬ szania efektu antygenowego. Wedlug wynalazku szczepionke wytwarza sie dodajac substancje, któ¬ re w polaczeniu z substancjami pomocniczymi jesz¬ cze bardziej poteguja ich dzialanie.Braun i Nakano w swej pracy opublikowanej w Science, 157 (1967), 819, opisali wyniki stosowa¬ nia pewnych polinukleotydów jako stymulatorów mechanizmu uodporniania. Zaobserwowali oni, ze pewne zwiazki kompleksowe polinukleotydów zwiekszaja poczatkowa szybkosc wzrostu liczby komórek sledziony produkujacych przeciwciala u myszy uodpornionych za pomoca czerwonych 10 20 25 cialek krwi owczej luib innych okreslonych anty¬ genów.Badania prowadzone nad opracowaniem nowych sposobów wytwarzania preparatu wedlug wyna¬ lazku, wykazaly, ze dodanie wysoko czasteczko¬ wego polinuikleotydu do wodnego roztworu szcze¬ pionki, albo nie daje efektu stymulujacego albo obniza wytwarzanie antycial.Braun i Nakano [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 119, 701—705 (1965)] opublikowali równiez wyniki badan, wykazujacych, ze oligodezoksyrybonukleo- tydy, o 2—5 jednostkach nukleotydów moga sty¬ mulowac wytwarzanie przeciwcial wobec antyge¬ nów w ciagu tylko okolo 48 godzin po podaniu i ze obecnosc wysokoczasteczkowych oligodezoksy- rybokleotydów moze kolidowac z aktywnoscia sty¬ mulujaca.Doswiadczenia prowadzone zgodnie z wynalaz¬ kiem wskazywaly, ze oligodezoksyirybonuMeotydy nie wzmagaja aktywnosci znanych srodków po¬ mocniczych. Z drugiej strony dodanie materialu polinukleotydowego w nowych preparatach typu szczepionek zwieksza wytwarzanie antycial do po¬ ziomu znacznie wyzszego od osiaganego przez sa¬ ma szczepionke z srodkiem pomocniczym, przy czym poziom antycial utrzymuje sie w ciagu dluz¬ szego okresu czasu, od poziomu uzyskiwanego przez znane typy szczepionek lub szczepionki z srod¬ kami dodatkowymi. 80 303s Wedlug wynalazku szczepionke przeciw grypie wytwarza sie nastepujaco: Do szczepionki zawierajacej antygen i srodek po¬ mocniczy w postaci emulsji dodaje sie w ilosci od 1 mikrograma do 10 miligramów material poli- nukleotydowy, taki jak homopolimer, wybrany z grupy skladajacej sie z pali I, pali C, poli A, poli U, poli X, poli G i poli DHU o ciezarze czasteczkowym 1X108—'1^5X106, podwójnie skre¬ conego kompleksu dwóch polimerów, kopolimeru przemiennego, takiego jak poli IC, poli AU, poli Al, poli IU, poli CU, poli AC, poli GU, poli AG o cie¬ zarze czasteczkowym 1X105 —1,5X108, wystepu¬ jacego w postaci naturalnej DS — RNA o cie¬ zarze czasteczkowym 1X105 — 1,5X106, hybrydu po¬ dwójnie skreconych polimerów, takich jak poli G:dc, poli dG:C, poli I:dc i poli dI:C, przy czym kazdy z homopolimerów poli dC, poli dG i poli dl ma ciezar czasteczkowy 1X105 —1,5X108 i che¬ micznie przemiennego homopolimeru, takiego jak poli Ni -metyloadenylan, poli ,,6-metyloadenylan", poli N7 -metyloinozynian, poli N7-metyloguanylan, poli 5-metylourydylan, poili 5-fluorourydylan, poli 5Jbromourydyilan, poli 5-jodourydylan, poli 5-bro- mocydytylan i poli S^odocytydylan.Kolejnosc laczenia z soba skladników szcze¬ pionki nie wplywa absolutnie na synergizm.W zwiazku z tym mozna równiez wedlug wyna¬ lazku najpierw polaczyc material polinukleotydo- wy z srodkiem pomocniczym, a nastepnie polaczyc z antygenem. Wyniki w obu przypadkach otrzy¬ muje sie analogiczne.Jako podwójnie skrecony kompleks dwóch po¬ limerów stosuje sie poli I:C lub A:U.Polaczenie materialu polinukleotydowego z srod¬ kiem pomocniczym daje w rezultacie wzmozona reakcje immunologiczna, podczas gdy reakcja anty- cial w stosunku do wodnego typu antycial jest hamowana przez rodzaj i ilosc poiinukleotydów.Tak wiec uzyskany poziom antycial jest wiekszy od otrzymywanego przez stymulujaca obecnosc samego materialu polinukleotydowego lub przez sam srodek pomocniczy.Stosowane wedlug wynalazku srodki pomocni¬ cze sa znanymi w immunologii dodatkami typu emulsyjnego. Takimi znanymi emulsjami sa emul¬ sje typu woda/olej roslinny, woda/olej mineralny i olej roslinny/woda. Wszystkie w zasadzie zna¬ ne oleje roslinne mozna stosowac do preparatów injekcyjnych zgodnie z Farmakopea St. Zjed-n. Am., a wiec takie jak, olej z orzechów ziemnych, olej kukurydziany, olej z oliwek, olej sezamowy, olej „chaulmoagra", olej z ziarn bawelny, olej z slod¬ kich migdalów, olej perski itd.Antygeny uzyteczne w sposobie wedlug wyna¬ lazku mozna stosowac z srodkiem pomocniczym emulsyjnym i moga byc w postaci antygenów czystych lub czesciowo oczyszczonych, pochodza¬ cych z organizmów bakterii, wirusów, bakterii ty¬ pu pleuropneumonia (PPLO), riketsja lub ich pro¬ duktów, lub antygen moze byc alergenem, takim jak pyl, zdenerwowanie lub w postaci trucizny lub jadu. We wszystkich przypadkach antygeny wystepujace w postaci, w której ich wlasciwosci toksyczne i zlosliwe sa zmniejszone lub rozlozone, 4 wprowadzone do organizmu zywego wzbudzaja aktywne uodpornienie przez wytworzenie sie anty¬ cial wobec tych mikroorganizmów w postaci eks¬ traktu lub produktów mikroorganizmów uzytych * w preparacie antygenowym, a w przypadku aler¬ genów powstaje zlagodzenie alergii. Antygeny sto¬ suje sie pojedynczo albo w polaczeniu, np. mozna stosowac antygeny wielu bakterii, wielu wirusów,, wielu raketsji, wielu trucizn bakteryjnych lub wi- 10 rusowych. Wiele alergenów lub polaczenia tych antygenów mozna wprowadzac do wodnej fazy srodka pomocniczego. Szczególnej wagi antygena¬ mi sa te, które pochodza z bakterii takich jak H. pertussis Leptospira pomona i icterohaemorrha- 15 ginae, S. typhosa, S. paratyphi A i B, C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, C. Feseri i innych bakterii zgorzeli gangrenowej, B. anthracis, P. pes- tis, P. multocida, V. chlorae itp. z wirusów, ta¬ kich jak poliovirus (typ wielokrotny), adenowirus ao (typy wielokrotne), wirus paradnfiluenzy (typy wie¬ lokrotne), wirus odry, swinki, wirus zespólni odde-* chowej, grypy (rózne typy), wirusa goraczki (SP4), wirusa zachodniej lub wschodniej encephalomycli- tis, Japanese B. encephalomyclitis, Rosyjska wdo- 25 senno-letnia encephalomyclitis, wirusa cholery u Swin, wirusa choroby Newcastle, wirusa zakaz¬ nej choroby wysypkowej u drobiu, u królików, wi¬ rusa nosówki kociej i psiej itp., z riketsji epide¬ micznego i endemicznego tyfusu i z grupy innych 30 wirusów powodujacych goraczke z jadów paja¬ ków i wezy lub innych znanych alergenów, np. z szmat, kurzu domowego, pylku kwiatowego, pyl¬ ku drwa itp.Materialem poMnukleotydowym stosowanym we¬ dlug wynalazku sa homopolimery, podwójnie skre¬ cane kompleksy homopolimerów, kopolimery prze¬ mienne, kopolimery o przypadkowym rozmieszcze¬ niu, podwójnie skrecone, wystepujace w stanie naturalnym kwasy rybonuikleinowe, hybrydowe podwójnie skrecone kompleksy homopolimerów i chemicznie przeksztalconych poiinukleotydów.Homopolimerami wystepujacymi w preparatach wedlug wynalazku sa polinukleotydy takie, jak kwas poliinozynowy (I), kwas policytydylowy (C), kwas poHiadenyiowy (A), kwas poliurydylowy (U), kwas poliksantylowy (X), kwas poltiguanylowy (G) i kwas polidehydrourydylowy (DHU). Zwiazki te sa dobrze znane w tej dziedzinie, latwo dostepne w handlu i wykazuja obszar ciezarów czasteczko¬ wych trudny do dokladnego okreslenia. Badania wykazuja, Sxv o wartosciach od okolo 3 do oko¬ lo 12, co wskazuje na ciezar czasteczkowy od w przyblizeniu 1X105 do 1,5X106. 55 Podwójnie skrecone kompleksowe homopolimery sa kompleksami utworzonymi z dwóch róznych homopolimerów, jako takie mozna wymienic poli I:C i poli A:U, jako kompleksy kwasu poliinozy- nowego (I) i kwasu policytydylowego (C) oraz 60 kompleksu kwasu poMadenylowego (A) i kwasu poliurydylowego (U). Wynalazek obejmuje wszyst¬ kie mozliwe lich kombinacje. Podwójnie skrecane kompleksy i ich wytwarzanie jest dobrze znane fachowcom. Zwykle stosowany sposób polega na 85 zmieszaniu dwóch wybranych homopolimerów w80 303 ilosciach równowaznikowych w solance buforowa¬ nej fosforaffiem, o wartosci p«Hiz = 7,0 {0,006 mola fosforanu sodowego i 0,015 mola chlorku sodu).Kompleks powstaje natychmiast po zmieszaniu, co wskazuje efekt hdpochromowy.Kopolimery przernleime stosowane w sposobie ^wedlug wynalazku, sa kopolimeraimi dwóch róznych nukleotydów, w których dwie zasady azotowe wy¬ stepuja w sposób regularnie przemienny, okresla sie je jako poli CU, poli IU, poli AC, pali GU, po¬ li AG, poda IC, poli AU, poli Al itd., co oznacza przemienne kopolimery C i U, I oraz U, A i C, G i U, A i G, I i C, A li U oraz A i I. Tego typu kopolimery sa równiez znane fachowcom w tej dziedzinie i mozna je wytworzyc przez dzialanie poliimeraza RNA. W tym przypadku ciezary cza¬ steczkowe homopolimeraw nde sa jednolite 1 wy- jiosza od 1X105 do 1,5X10*. Polimery te nasladuja dzialanie podwójnie skrecanych kompleksów ho- mopalianerów przez podwójne skrecanie poprzez wiazanie wodorowe dopelniajacych zasad.Wedlug wynalazku stosuje sie równiez wystepu¬ jacy w stanie naturalnym podwójnie skrecany kwas rybonukleinowy (Ds-RNA) o ciezarze cza¬ steczkowym od 1X105 do 1,5X;106. Jest to znany produkt, wytwarzany równiez w znany sposób.Hybrydowe podwójnie skrecane polimery sto¬ sowane wedlug wynalazku sa .podobne do kom¬ pleksowych homopolimerów wyzej opisanych, lecz róznia sie tym, ze jeden z homopolimerów jest polidezoksyrybonukleotydem adeniny (dA), tymi- ny (dT), cytozyny (dC), uracylu (dU), hypoksan- tyny (dl) lub guaniny (dG), o ciezarze czastecz¬ kowym o zakresie od 1X105 do 1,5Xi106. Te poli- dezolcsyryibonukleotydy sa znanymi zwiazkami i hybrydowe podwójnie skrecone polimery, takie jak poli G:dC, poli dG:C i poli dljC sa znanymi kompleksami i wytwarza sie je w sposób podob¬ ny do podwójnie skreconych kompleksowych po¬ limerów.Chemicznie przeksztalcone poilinukLeotydy stoso¬ wane w sposobie wedlug wynalazku sa znanymi zwiazkami, itakLmd jak poli N^metyloadenylan, po¬ li ,,6-nietyiloadenylaln", poli N^jmetyloinozynian, poli N7-metyloguanylan, poli 5-metylourydylan, po¬ li 5HfluoimirydyiLan, poili 5-bromouirydylan, poli 5- -jodourydylan, poli 5-bromocytydyilan i paM 5-jo- docytydylan.Wytwarzanie nowych szczepionek wedlug wyna¬ lazku polega na zmieszaniu trzech komponentów: srodka dodatkowego, wodnego antygenu i ma¬ terialu polimerycznego w odpowiednich ilosciach, w sposób konwencjonalny.Stezenie polimerów wynosi od mikrograma do ponizej poziomu, który wykazuje toksycznosc tkan¬ ki w organizmie ludzkim lub zwierzecym, to jest do okolo 10 mg/dawka. Dawka waha sie w za¬ leznosci od organizmu, od natury srodka dodat¬ kowego, wybranego pollinulkleoitydu i antygenu.Stezenie antygenu w kazdym poszczegóilinym pre¬ paracie, zawierajacym substancje pomocnicza, moz¬ na nastawic na poziomie równym preparatowi wo3- nemu, uzyskujac wzrost reakcji przeciwcial dzieki dzialaniu substancji pomocniczej, lub tez steze- 10 15 20 nie to mozna ograniczyc ójo poziomu nizszego niz w preparacie wodnym w celu zaoszczedzenia an¬ tygenu, zachowujac aktywnosc antygenowa porów¬ nywalna z aktywnoscia preparatu wodnego. Wsku- s tek tego widoczne korzysci wynikajace z dziala¬ nia substancji pomocniczej zostaja zaakcentowa¬ ne przez pózniejszy dodatek polinukleotydów.Braun i Nafoano (Science 157, 810 (1967) stwier¬ dzili, ze stosowanie polinukleotydów jest immu¬ nologicznie korzystne, gdyz przez ich polaczenie z antygenem uzyskuje sie wzrost szybkosci two¬ rzenia sie przeciwcial. Wazna ceche wynalazku stanowi (fakt, ze aktualna ilosc pobudzonych prze¬ ciwcial ulega synengistycznie zwiekszeniu, jesli po- linukleotydy polaczy sie z substancjami pomocni¬ czymi. Jak stwierdzono wyzej, nadzwyczaj maly dodatek wybranego polinukleotydu do szczepion¬ ki znanego typu, to jest sporzadzonej z antygenu i substancji pomocniczej, powoduje syinergistycz- nie wzrost reakcji przeciwcial. Ten styrnulacyjny efekt dzialania polinukleotydu mozna uzyskac, sto¬ sujac go w ilosci wynoszacej od ulamka mikro¬ grama do dziesieciu miligramów na aplikowana dawke jednostkowa. 25 W nizej podanych przykladach wystepuja jako antygeny wirusy grypy oznaczone odpowiednimi symbolami.Terminologia wirusów przez dluzszy czas byla so nieuporzadkowana. Wynikalo to z duzej dowol¬ nosci okreslen stosowanych przez róznych bada¬ czy wirusów. W wielu przypadkach uzywano do tego celu inicjalów iulb nazwisk pacjentów, w in¬ nych wskazywano miejsce wyizolowania wirusa 35 lub numer nadany w laboratorium. Prowadzilo to do licznych rozbieznosci. Andrewes, Bang i Bur- net uznali, ze wirusy grypy, swinki (mumsa), cho¬ roby Newcastle i pomoru ptasiego posiadaja do¬ stateczna ilosc wspólnych wlasciwosci, uzasadnia- 40 jacych ich zaklasyfikowanie do wspólnej grupy Myxovijrus. Grupa ta dzieli sie na dwie podgrupy, przy czym wirus grypy jest zaliczany do pierw¬ szej podgrupy. Klasyfikacja wirusów jest oparta na fizyko-chemicznych wlasciwosciach skladnika 45 rybonuiMeoproteinowego wirusa. Identyfikacja wi¬ rusa grypy uzalezniona jest od stwierdzenia, czy jego antygen S, wystepujacy w zainfekowanej tkance, odpowiada klasycznym typom. Poniewaz antygenu S nigdy nie spotyka sie w tkance nie- 50 zainfekowanej wirusem grypy, jego obecnosc w serum jest uwazana za absolutny dowód uprzed¬ niej infekcji wirusem grypy. Antygen S jest bar¬ dzo trwaly i latwy do wykrycia. Jego wlasciwosci stanowia doskonala podstawe do podzialu na 3 ty- 55 py A, B i C. Te trzy typy dziela sie dalej na pod- typy zgodnie z wlasciwosciami serologicznymi kom¬ pleksu antygenu V, który jest 'zwiazany z zewnetrz¬ nym skladnikiem czastki wirusa. Te dane dopro¬ wadzily do przyjecia nowego systemu okreslania 60 wirusów. W tym ukladzie na pierwszym miejscu wskazuje sie typ serologiczny (np. A), oparty na wlasciwosciach skladnika rybonukleoproteinowego (antygenu S) po czym kolejno wymienia naturalne¬ go gospodarza (ludzie, zwierzeta, ptactwo), seroio- 65 giczny podtyp (antygen V), miejsce wyizolowania,1 cumer seryjny wyizolowanego szczepu oraz rok Je¬ go wyizolowania. Tak wiec nip. pierwotny szczep WS bedzie okreslany Jafco A/human O/London/i/ 33, a pierwotny szczep azjatycki — A/human 2/Sin- gapore/1/57.System ten nie jest doskonaly. Miejsce wyizolo¬ wania wirusa bywa przez róznych badaczy poda¬ wane dowolnie jako kraj lub miasta. Numer se¬ ryjny jest prawie zawsze dla wiekszosci celów zbedny i zwykle jest opuszczany. Naturalnego go¬ spodarza tez zwykle pomija sie, jesM infekcje wy¬ stepuja wylacznie wsród ludzi, np. w przypadku wirusa grypy.Na tych zasadach oparta jest terminologia sto¬ sowanych w nizej podanych przykladach wirusów Jako antygenów.Nizej podane przyklady wyjasniaja blizej wyna¬ lazek.Przyklad L Srodek pomocniczy 05 przygo¬ towano przez zmieszanie 86% objetosciowych oczyszczonego oleju arachidowego, 10% objetoscio¬ wych jednoolelnianu mannitu (Ariacel A) i 4% ob¬ jetosciowych jednostearynian glinu. Wodna szcze¬ pionke wirusa grypy, zawierajaca 4800 CCA (aglu¬ tynacja komórek kurczecia) na 1 tml antygenów wirusa grypy Aj (Japonia) 170/62, 800 CCA/ml; A, (Taiwan) 1/64, 800 CCA jednostek (ml; A/PR) 8/34, 1600 CCA jednostek/ml; i B (Mass) 3,66, 1008 CCA jedftostek/ml lub 1200 CCA jednostek antygenu wirusa grypy na 1 ml. Otworzono emul¬ sje wodna W oleju zawierajaca koncowe stezenie antygenu 600 CCA jednostek/0,5 ml lub 150 CCA jednostek/0,5 ml.Sporzadzono równiez anitygenowo porównywal¬ na szczepionke wodna.Kazda ze szczepionek stosowano z podfinukleoty- dem (pali- I:C lub poli A:U), jak wskazuja tabli¬ ce la—Id, lub bez polinukleotydu. Gdy polinufcleo- tydy byly dodane, stezenie ich wynosilo 260 mg/ /dawka.Preparaty te wstrzykiwano domiesniowo swin¬ kom morskim w dawce jednorazowej 600 CCA jednostek (tablica la) lub dwukrotnie w odstepie miesiaca (tablica Ib), lub w dawce jednorazowej 150 CCA jednostek (tablica Ic), lub dwukrotnie w odstepie miesiaca (tablica Id).Wszystkim zwierzetom pobrano krew bezposred¬ nio pnzed szczepieniem oraz w odstepach miesiecz¬ nych przez nieograniczony okres czasu.Surowiec poddawano badaniom serologicznym na zawartosc przeciwcial metoda inhibicji procesu aglutynacji czerwonych cialek krwi (metoda HI).Wyniki przedstawiono w tablicach la—Id. Wska¬ zuja one na to, ze polinukleotydy nie zwiekszaja dzialania antygenowego szczepionki grypy typu wodnego, jesli sie ja aplikuje tyttko w jednej daw¬ ce, natomiast zauwaza sie pewien wzrost po szcze¬ pieniu dwukrotnym. Z drugiej strony szczepionka z substancja pomocnicza 65 bez dodatku polinu- kleotydów i zastosowana w jednej lub dwóch dawkach podwyzsza antygenowosc i pobudza wy¬ twarzanie przeciwcial do poziomu o wiele wyz¬ szego, niz uzyskiwany po zastosowaniu szczepion¬ ki typu wodnego. Dodatek poMnukleotydów do S szczepionki zawierajacej substancje pomocnicza 65 jeszcze bardziej wzmaga dzialanie tej substancji pomocniczej. Wszystkie typy wirusa grypy uzyte w róznych preparatach, zachowywaly sie podobnie. 8 Z tablic Ic i Id ^wi4ocanym jest, ie wjpcow;aoeer nie poli A:U do szczepionki calkowicie hamuje re¬ akcje antycial wobec wszystkich czterech antyge¬ nów wirusa grypy po jednym lub dwóch szcze¬ pieniach. Z drugiej strony dodanie poli I:C do 10 szczepionki ani nie hamuje ani nie pobudza reakcji antycial w porównaniu do reakcji antycial w przy¬ padku samej szczepionki. Aktywnosc srodka do¬ datkowego 65 jest jasno wykazana jako dalsze zwiekszenie reakcji antycial przez dodanie poli- 15 nukLeotydów.P r z y k l a d U. Srodek pomocniczy 65 szcze¬ pionki zawierajacy lub bez poli I:C (240 mg/daw¬ ka) lub szczepionki typu grypy sporzadzono, jak w przykladzie I, tak ze zawieral 600 CCA jed¬ nostek antygenu wirusa grypy i zaszczepione; do¬ miesniowo afrykanskie malpy zielone. Zwierzetom badano krew bezposrednio przed szczepieniem i w miesiac po szczepieniu. Serum badano serologicznie na HI reakcje antycial. Wyniki sa podane w tabli¬ cy li,'z której widocznym jest, ze szczepionka z substancja pomocnicza odznaczala sie wspoma¬ gajacym dzialaniem antygenów grypy bez dodatku kompleksu polinukleotydowego w stosunku do sa¬ mej szczepionki. Efekt ten znacznie zwiekszylo dodanie do szczepionki poli I:C, przy czyim wszyst¬ kie szczepy wirusa grypy zachowywaly sie po¬ dobnie.Przyklad III. Oczyszczona trójskladnikowa J5 szczepionke grypy (B) Mass, A2 (Japan) 170 i A* (Taiwan) zemulgowano niepelnym srodkiem pomoc¬ niczym Freuda, zawierajacym lulb bez poli I:C i wy¬ tworzono szczepionke z lub bez poli I :C. Swinki morskie zaszczepiono domiesniowo raz lub dwu- krotnie dawka o zawartosci 600 CCA jednostek wi¬ rusa i 263 pg poli I :C, zwierzetom badano krew bezposrednio przed szczepieniem i kazdego miesia¬ ca po szczepieniu. Serum badano serologicznie me¬ toda HI. 45 Wyniki podane w tablicy III, wykazuja bardzo efektywna aktywnosc niepelnego srodka pomocni¬ czego Freuda. Zwiekszony efekt jest oczywisty.Znowu nie bylo zwiekszenia antygenowego w przy¬ padku szczepionki z dodatkiem poli I:C. so Przyklad IV. Postepowano jak w przykla¬ dzie III, z tym, ze srodek pomocniczy Freuda (emulsja woda/olej mineralny) zastapiono emulsja oleju roslinnego w wodzie, skladajaca sie z 9 czesci oczyszczonego oleju z orzechów ziemnych, 5B 0,4 czesci Ariacel A i 0,6 czesci Tween 60 zemul- gowanych taka sama objetoscia wodnej szczepionki.WyniM podane w tablicy W wskazuja na bardzo nieznaczny efekt srodka pomocniczego typu emulsji olej/woda w stosunku do wodnej szczepionki z obu 60 szczepami A2 wirusa grypy lecz bez szczepu B.Jednakze dodanie poli I:C do emulsji olej/woda wykazalo zasadnicza aktywnosc srodka pomocni* czego wobec wszystkich antygenów.Przyklad V. Trójskladnikowa szczepionke tt wirusa grypy (Ai/Japan) 170, A^/Taiwan i B(Mass)80 303 10 typu wodnego, z alunem jako srodkiem pomoc¬ niczym lub szczepionke z srodkiem pomocniczym -65, przy róznych kombinacjach i róznych koncen¬ tracjach, poll I, poli C i poH I:C, szczepiono do¬ miesniowo swinki morskie (1© zwierzat w grupie) dawka 600 OOA jednostek. Zwierzetom badano krew bezposrednio przed szczepieniem i w miesiac potem, serologicznie metoda SHI. Wlasciwosci daw¬ ki i wyniki miana antycial HI podano w tabli¬ cy V.Tablica ta wskazuje, ze 260 mg poli I calkowicie hamuje aktywnosc anitygenna wirusów A i B ty¬ pu grypy stosowanych w wodnym preparacie.Podwójna redukcja poli I, zasadniczo eliminuje -dzialanie hamujace. Nie wystepowala ani aktyw¬ nosc hamujaca ani pobudzajaca, wywolywana przez poli C lub polaczone poli 1:0* przy zastoso¬ waniu z szczepionka typu wodnego. Nieco inna sytuacje stwierdzono przy stosowaniu szczepionki z alunem. Wystapil wówczas wzrost aktywnosci antygenicznej szczepionki z alunem jako srodkiem pomocniczym bez polinukleotydu, w stosunku do szczepionki typu wodnego. Dodanie poli I, poli C lub poli I:C ani nie zahamowalo ani nie zwiekszy¬ lo aktywnosci alunu jako srodka pomocniczego z kazdym z posród szczepów wirusa grypy. Aktyw¬ nosc antygenna szczepionki z srodkiem pomocni¬ czym 65 bez polinukleotydu byla wieksza niz szcze¬ pionki wodnej lub szczepionki z alunem.Nie zaobserwowano znaczniejszego wzrostu zwiekszenia dzialania antygenowego z jakimkol¬ wiek szczepem wirusa grypy przez dodanie sa¬ mego poli I lub poli C. Dodanie kompleksu poli I:C znacznie zwiekszylo aktywnosc antygenowo, pobudzajaca wytwarzanie antydal do poziomu da¬ leko wyzszego od osiaganego za pomoca szczepion¬ ki typu wodnego lub szczepionek z alunem jako srodkiem pomocniczym.Przyklad VI. Siedmioskladnikowa szczepion¬ ke dróg oddechowych zawierajaca wirus grypy B (Maas) 100 CCA (daiwka), wirus grypy A2 (Tai- wan) 100 CCA (dawka) wirus parainffluency typu 1/2 X 1010 czastek (dawka) wirus paragrypy typu 2/2 X 1010 czastek (dawka), wirus/paragrypy typu 3/2 X 1010 czastek (dawka) wirus syncytialowy dróg oddechowych /2 X 1010 czastek (dawka) i My- *coplasma pneumoniae (Eaton PPLO, 35 \ig, DNA) + (daiwka) wyttworzono jako szczepionke z srod¬ kiem pomocniczym 65, o zawartosci 260 jig (daw¬ ka) poli I:C i bez poli I.C Szczepionke szczepiono domiesniowo swinki morskie (6 zwierzat w gru¬ pie). Zwierzetom badano krew w dniu zerowym i nastepnie co miesiac. Serum badano serologicznie na antyciala w sposób wskazany w taW&y VL v Wyniki podano w tablicy VI wskazywaly, ze dp- danie poH I:C zwiekszalo aktywnosc srodka po- b mocniezego ze wszystkimi komponentami Bzcze- pionikL :"'A. ..:•¦; -;-¦ <,.r.Przyklad VII. Postepujac na og# w sposób opisany w przykladzie I, rózne polaczenia trój¬ skladnikowej wodnej szczepionki wirusa grypy io /Aa (Japan) 170, At (Taiwan i B/Mass), lub szcze¬ pionke z srodkiem pomocniczym 65 bez lub z poli I.C w róznych stezeniach zaszczepiano domiesnio¬ wo swinkom morskim (12 zwierzat w grupie). Pró¬ by na zahamowanie hemoaglutynacji antycial prze- is prowadzano na surowicy krwi pobranej przed roz¬ poczeciem badan i w 1 miesiac pózniej: charak¬ ter dawki i wyniki prób serologicznych podano w tablicy VII, z której widocznym jest, ze doda¬ nie ilosci tak malej jak 2,6 \xg poli I:C na dawke 20 znacznie zwiekszalo aktywnosc szczepionki wiru¬ sa grypy iypii A, nawet wtedy gdy stosowano ja w stezeniu tak malym, jak 10 CCA jednostek.Szczep B wirusa grypy nie dawal takiej reakcji w tych samych warunkach. Stosowanie tak ma- 25 lych ilosci jak 2,6 fig poli I:C znacznie zwieksza aktywnosc obu szczepów A-B wirusa grypy, gdy uzywa ich sie w tak malym stezeniu jak 5 CCA jednostek na dawke. Zaobserwowano, ze nieznacz¬ na korzysc daje zwiekszenie stezenia poli I:C so z szczepem typu B wirusa grypy, która nie wy¬ stepuje przy uzyciu szczepu typu A.Szereg przeprowadzonych badan dotyczacych przypadków, w których zastapiono wirusy i My- coplasma pneumoniae stosowane w przykladach 35 I—VII innymi znanymi antygenami ludzkimi i zwierzecymi, w celu wytworzenia szczepionek do stosowania ludziom i zwierzetom, zawieraja¬ cym dodatkowo oprócz antygenu i srodka po¬ mocniczego poliniuMeotyd lub kompleks poUnuMeo- 40 tydowy, dal wyniki pozytywne.Podobnie inne przyklady dotyczace przypadków, w których kompleksy homopolimerów i homopo- limery z przykladów I—VIII zastapiono równo¬ waznikowymi ilosciami funkcjonalnie równowaz- 45 nikowych przemiennych kopolimerów, kopolime¬ rów o przypadkowym rozmieszczeniu, podwójnie skreconych wystepujacych w stanie naturalnym kwasów rybonukleinowych, hybrydowych podwój¬ nie skreconych kompleksów homopolimerów i che- 50" mdcznie przemienionych polinukleotydów swiad¬ cza korzystnie o szczepionkach, otrzymywanych sposobem wedlug wynalazku.Tablica la Reakcje przeciwcial swinek morskich na 1 zastrzyk 600 jednostek CCA szczepionki wirusa grypy uzytej w róznych zestawieniach 1 A Preparat szczepionki wirusa grypy ] Wodny Srednia geometryczna HI miana przeciwcial w poszczególnych miesiacach A/PR/S 0 1* 1 69 2 64 3 9 4 11 A2/Jap/170 0 1 1 8 2 6 3 9 4 8 |Cd. tablicy la 80 303 Wodny + podi A:U Wodny + poili IjC 1 Srodek pomocniczy 65 Srodek ponwcniczy 65 + pwli A:U Srodek ipomooniezy 65 + poli I:C Wodny Wodny + poli A:U Wodny + poM I:C Srodek pomocniczy 65 Srodek piomocniczy 65 + poli A:U Srodek pomocniczy 65 + poli I:C 80 69 548 546 832 40 30 208 320 416 20 14 69 128 223 17 9 32 64 137 A2/Taiwan 0 1 5 5 8 80 137 631 2 2 4 1 91 274 274 3 3 15 5 97 194 223 4 5 6 6 56 128 194 1 1 1 1 1 5 15 181 256 631 8 2 111 274 274 20 13 91 158 223 11 [ 6 49 I 128 [ 194 B/Mass 0 1 5 8 7 91 137 776 2 1 1 23 34 111 239 3 2 3 1 5 97 223 4 1 | 2 | 2 l 20 69 1 194 *) Wszystkie miana wyrazono jako odwrotnosc rozcienczenia surowicy.Tablica Ib Reakcje przeciwcial u swinek morskich po 2 zastrzykach po 600 jednostek CCA miesiecznie tej samej szczepionki wirusa grypy uzytej w róznych zestawieniach Preparat szczepionki winusa grypy Wodny Wodny + poli A:U Wodny + poli I:C Srodek pomocniczy 65 Srodek pomocniczy 65 + poli A:U Srodek pomocniczy 65 + poli I:C.Wodny Wodny + poli A:U Wodny + poli IaC Srodek pomocniczy 65 Srodek pomocniczy 65 + poli A:U Srodek pomocniczy 65 + poli I:C Srednia geometryczna HI miana przeciwcial w poszczególnych miesiacach I A/PR/8 0 1 56 60 52 446 640 640 2 64 137 160 388 416 724 3 12 28 45 137 223 362 4 9 18 28 56 181 239 A2/Taiwan 0 1 7 1 7 119 181 320 2 11 40 69 208 320 548 3 11 28 60 223 548 416 4 9 24 49 111 223 320 A2/Jap/170 0 1 14 1 12 239 223 512 2 34 51 239 320 320 640 3 34 28 104 223 388 478 B/Mass 0 1 10 7 11 104 274 274 2 23 52 45 160 548 274 3 8 39 34 223 274 416 4 | 17 f 34 69 160 194 [ 362 | 4 5 16 28 [ 111 181 239 Tablica Ic Reakcja przeciwcial u swinek marskich na 1 zastrzyk 150 jednostek CCA szczepionki wirusa grypy uzytej w róznych zestawieniach Preparat szczepionki wisrusa grypy Wodny Srednia geometryczna HI miana przeciwcial w poszczegól- [ nych miesiacach A/PR/8 0 1 1 64 2 45 3 8 4 6 A2/Jap/170 0 1 1 7 2 10 3 11 4 980 303 •c.d. itatalilcy Je 1 Wodny + poli A:U I Wodny + poili I:C Srodek pomocniczy 65 Srodek pomocniczy 65 + poli A:U Srodek pomocniczy 65 + poli I:C Wodny Wodny + poli A:U Wodny + poli I:C Srodek pomocniczy 65 Srodek pomocniczy 65 + poli A:U Srodek pomocniczy 65 + poli I:C 1 1 1 1 1 1 40 478 388 546 1 34 181 223 362 1 1 5 26 79 128 1 1 6 28 ' 40 119 A2/Taiwan 0 1 1 1 1 1 1 1 7 1 4 45 160 320 2 3 1 2 56 80 274 3 6 1 6 56 64 194 4 10 1 3 40 56 160 1 1 1 1 1 1 12 97 256 540 1 .2 181 80 388 1 13 64 80 131 1 7 1 40 56 137 B/Mass 0 1 8 1 6 40 64 223 2 1 1 1 24 223 128 3 2 1 3 20 64 111 4 I 2 1 2 28 28 60 Tablica II Reakcja przeciwcial u malp na jednorazowe szczepienie 600 CCA szczepionki wodnej wirusa grypy lub preparatem z srodkiem pomocniczym 65 z lub bez polinukleotydów Preparat szczepionki wirusa grypy wodny srodek pomoc¬ niczy 65 1 srodek pomoc¬ niczy 65+poli I:C wodny srodek pomoc¬ niczy 65 srodek pomoc¬ niczy 65+poli I:C Srednia geometryczna HI miana przeciwcial w poszczególnych miesiacach 0 1* 1 1 1 12 160 557 A2/Jap/170 2 1 80 735 3 1 86 243 4 1 26 137 5 1 12 80 6 1 7 60 A/PR/8 0 1 1 1 . 1 10 243 557 2 2 92 965 3 3 70 422 4 1 30 208 5 1 12 119 6 3 17 104 1 0 1 1 1 A2/Taiwan 1 4 16 557 2 2 70 485 3 2 70 279 4 1 26 137 5 1 9 80 6 1 ¦ 9 69 B/Mass 0 1 1 1 1 3 211 640 2 1 121 965 3 1 92 485 4 1 26 208 5 1 18 160 6 1 30 137 +/ — Odwrotnosc rozcienczenia poczatkowego surowicy W/O — emulsja woda/olej Tablica III Reakcje przeciwcial u swinek morskich po jednorazo wym zastrzyku 600 CCA jednostek szczepionki wirusa grypy, uzytej w róznych zestawieniach Preparat szczepionki wirusa grypy 1 Wodny j Wodny + poli I:C Srednia geometryczna HI miana przeciwcial w poszczególnych miesiacach A2/Jap./170 0 1* 1 1 9 11 2 6 8 4 6 9 A2/Taiwan 0 1 1 1 28 42 2 20 30 4 20 32 B/Mass 0 1 1 1 6 6 2 7 3 4 7 580 303 c. d. tablicy III 1096 766 1436 3072 1096 2510 1 1 776 1260 1434 4303 \ 19« 2510 •) W/O = emulsja woda/olej **) Olej mineralny = niepelna emulsja typu Freuda +) Odwrotnosc rozcienczenia poczatkowego surowicy Tablica IV Reakcje przeciwcial u swinek morskich po jednorazowym zastrzyku 600 CCA jednostek szczepionki wirusa grypy, uzyttej w róznych zestawieniach Preparat szczepionki wirusa grypy Wodmy Wodny + .poli I:C Olej z orzechów ciemnych (O/W)*) Olej z orzechów ziemnych (O/W)*) poli I3C Srednia geometryczna HI miana przeciwcial w poszczególnych miesiacach A2/Japan/170 0 1* 1 1 1 1 9 11 39 40 2 6 8 24 49 4 6 9 17 39 A2/Taiwan 0 1 1 1 1 1 28 42 79 128 B/Mass 1 i 2 4 0 20 30 40 97 20 32 40 60 1 1 1 1 1 6 6 2 24 2 7 3 6 20 4 7 5 6 20 *) O/W = emulsja olej/woda Tablica V Reakcja przeciwcial u swinek morskich na szczepionke o 600 CCA jednostkach wirusa grypy stosowana w róznych zestawieniach z lub bez polinukleotydów Szczepionka wirusa grypy 1 Wodna Alun*) Stezenie poli- nukleotydów mcg/ poli I 2 260 130 — — — — 260 130 — — — — poli C 3 — — 260 130 — — — — 260 130 — — poli I:C 4 — — — — 260 — — — — — 260 — Srednia geometryczna HI miana przeciwcial w poszczególnych miesiacach A2/Jap./170 0 5 1 6 1 18 7 21 8 23 60 73 37 45 64 28 2 7 1 12 14 23 30 12 45 45 30 45 42 34 3 8 1 5 12 16 11 4 32 42 26 34 34 32 4 9 1 3 11 8 17 4 30 40 24 37 45 24 A2/Taiwan 0 10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 8 10 7 1 6 34 37 32 37 34 26 2 12 1 1 6 12 12 4 20 23 14 37 24 21 3 13 1 2 3 5 3 1 11 20 17 24 15 26 4 14 1 2 2 3 7 3 9 21 8 23 15 18 B/Mass 0 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 16 1 1 1 1 1 2 28 39 37 26 14 24 2 17 1 1 1 1 1 1 33 43 53 61 25 12 3 18 1 1 1 2 3 2 2S 32 24 30 11 30 4 19 1 1 1 2 2 1 18 30 16 30 14 34 Olej iriinerafliny **) KW/O)*) Olej irmineratLny + pofci I;C (W/O) 548 388 1096 2355 1024 174180 303 c. d. tablicy VII I 1 1 Srodek pomocniczy 65 1 bez poli I:C 1 Srodek pomocniczy 65 z 260 mcg poli I:C Srodek pomocniczy 65 z 26 mcg poli I:C 1 Srodek pomocniczy 65 z 2,6 mcg poli I:C 1 2 500 100 50 10 0 500 100 50 10 0 500 100 50 10 0 500 100 50 10 0 3 4 - 91 128 80 69 1 446 274 320 388 1 388 512 274 256 1 362 111 256 320 1 |- 5 | 6 | 7 i 8 | 194 137 137 39 1 274 274 194 137 1 256 274 362 362 1 256 194 137 128 1 34 20 [ 23 17 1 97 39 49 23 1 56 49 56 24 1 28 10 17 3 1 Zarówno z podanych przykladów jak i danych zamieszczonych w tablicach, opartych na przepro¬ wadzonych badaniach wynika wyzszosc szczepion¬ ki przeciw grypie otrzymywanej sposobem we¬ dlug wynalazku, nad znanymi dotad szczepion¬ kami. PL PL PL PL

Claims (6)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciw gry¬ pie skladajacej sie z antygenu i srodka pomocni¬ czego w postaci emulsji, znamienny tym, ze do szczepionki dodaje sie w ilosci od 1 mikrograma do 10 miligramów material polinukleotydowy, taki jak homopolimer wybrany z grupy skladajacej sie z poli I, poli C, poli A, poli U, poli X, poli G i poli DHU o ciezarze czasteczkowym 1X105 — — 1,5X106, podwójnie skreconego kompleksu dwóch polimerów, kopolimeru przemiennego, takiego jak poli IC, poli AU, poli Al, poli IU, poli CU, poli AC, poli GU, poli AG o ciezarze czasteczkowym od 1X105 do 1,5 X106, wystepujacego w postaci na¬ turalnej DS-RNA o ciezarze czasteczkowym od 1X105 do 1,5 X108, hybrydu podwójnie skreconych polimerów, taki jak poli G:dc, poli dG:C, poli I:dC i poli dI:C, przy czym kazdy z homopolimerów 40 45 50 55 poli dC, poli DG i poli Dl ma ciezar czasteczkowy od 1X105 do 1,5 X106 i chemicznie przemiennego homopolimeru, takiego jak poli Ni-metyloadenylan, poli „6-metyloadenylan", poli N7-metyloinozynian, poli N7-metyloguanylan, poli 5-metylourydylan, po¬ li 5-fluorourydylan, poli 5-bromourydylan, poli 5- -jodourydylan, poli 5-bromocytydylan i poli-5-jo- docytydylan.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako podwójnie skrecony kompleks dwóch poli¬ merów stosuje sie poli I:C lub poli A:U.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze srodek pomocniczy stosuje sie w postaci emulsji typu woda/olej.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie antygen pochodzacy z wirusa grypy.

5. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze stosuje sie srodek pomocniczy w postaci emulsji typu woda/olej roslinny.

6. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie podwójnie skrecony kompleks homopo¬ limerów w ilosci od mikrograma do okolo 10 mili¬ gramów, taki jak poli I:C i poli A:U przy czym ciezar czasteczkowy kazdego z homopolimerów wy¬ nosi od 1X105 do 1,5 X106. LDA — Zaklad 2 — Typo, zam. 590/75 — 100 egz. Cena 10 zl PL PL PL PL