Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia pochodnych interferonowych, a cecha tego spo¬ sobu jest to, ze koncowa jednostke galaktozy w asialointerferonach odszczepia sie enzymatycznie za pomoca okreslonej galaktozy.Proces ten prowadzi sie w znany sposób, stoso¬ wany do odszczepiania koncowych jednostek ga¬ laktozy w glikoproteinach, stosujac znane p-galak- tozydazy, w tym równiez pochodzenia bakteryjne¬ go lub zwierzecego, np. z Dipplococcus pneumoniae (DPG) [R.C. Hughes i R.W. Jeanloz, Biochem.3, 1535 (1964)]^ z Concanavalia ensiformis (CEG) [Y.T.Li i S.C.Li. Methods in Enzymology 28, 102 93 32793 327 \ &5rr4^,iwYpizJi)i i w przypadku ANf ! 4'5—M^ Przebieg ¦fprflnu, który trale (1972)], z Phaseus vulgaris (PVG) [K.M.L. Agranal i C.P. Bahl, Methods in Enzymology 28, 720 (1972)] z Aspergillus niger (ANG) [O.P. Bahl i K.M.L.Agronal, Methods in Enzymology 28, 728 (1972)] i z Clostridium perfringens (CPG) [E.J. McGuire i in., Methods in Enzymology 28, 755, (1972)].Proces prowadzi sie w znanych warunkach, za¬ leznych w duzej mierze od uzytego enzymu. Tak np. o ile ogólnie stosuje sie wartosc pH 3,5—6,5, to jezeli jako enzym stosuje sie DPG, bedacy najko¬ rzystniejszym, wartosc pH wynosi 6,3—6,5 i uzys¬ kuje sie ja za pomoca fosforanu jako substancji buforowej WN*p*«3jpadku CEG wartosc pH wynosi *=, ^ * j.nvj:A^dku pvG odpowiednio 3,5—4,8, 3,8—4,6, a w przypadku CPG odszczepiania reszt galaktozy pomoca trytowanego asialointer- uje sie p-galaktozydaza, dializu¬ je i hydrolizuje po czym trytowana galaktoze mo¬ zna wykrywac w produkcie hydrolizy.Otrzymane pochodne interferonu mozna zatezac i oczyszczac w znany sposób, np. na drodze ultra- wirowania, elektroogniskowania lub chromatografii.Asialointerferony bedace interferonami, w któ¬ rych koncowe reszty sialowe zostaly uwolnione cal¬ kowicie lub czesciowo, stosowane jako produkty wyjsciowe w sposobie wedlug wynalazku, sa albo znane [K. Schonne i in. Symp. Series Immunobiol.Standard 14, 61 (1969)] lub moga byc wytwarzane w znany sposób, stosowany do usuwania koncowych reszt kwasu sialowego z glikoprotein. Mozna je wytwarzac droga lagodnej, kwasnej hydrolizy in¬ terferonów, np. rozcienczonym kwasem siarkowym w temperaturze podwyzszonej, na przyklad przez dlugotrwala inkubacje przy wartosci pH = 2 na zimno, na przyklad w temperaturze 4°C w ciagu tygodnia.Moga tez byc wytwarzane przez traktowanie in¬ terferonów neuraminidaza pochodzenia bakteryjne¬ go lub zwierzecego, np. otrzymana z Vibrio chole- rae, Clostridium perfringens lub Diplococcus pneu- moniae [R. Drzenieck, Current Topics in Microbio- logy and Immunology 59, 35 (1972)] lub z serca szczura. Warunki hodowli sa zwykle i zaleza od rodzaju uzytej neuraminidazy. Na przyklad, w przypadku neuraminidazy z V. cholerae wartosc pH 5,5 wydaje sie najkorzystniejsza, przy czym jako substancje buforowa stosuje sie np. octan, a w przypadku neuraminidazy z D. Pneumoniae korzystna jest wartosc pH 6,5.W razie potrzeby mozna w celu uzyskania lep¬ szej desialilacji stosowac oba wyzej opisane spo¬ soby.Otrzymane asialointerferony mozna wyodrebniac i oczyszczac w znany sposób.Oczyszczanie preparatów interferonów, stosowa¬ nych do wytwarzania asialointerferonów, polega na chromatografowaniu preparatu na unierucho¬ mionej aglutyninie i nastepnie desorbowaniu in¬ terferonu ze zwiazana aglutynina, asialointerfero- nu lub zmodyfikowanego interferonu. Ten proces chromatograficznego oczyszczania mozna prowa¬ dzic w zwykly sposób. Tak np. ligand aglutynino- wy korzystnie unieruchamia sie w zasadniczo obo¬ jetnym, stalym nosniku. Dobór tego nosnika zale¬ zy w pewnej mierne od uzytej aglutyniny, ale ko¬ rzystnie jako nosnik stosuje sie agaroze,..aktywo¬ wana w znany sposób i kowalencyjnie zwiazana z aglutynina (P. Cuatrocasas i in., Biochemistry 11, 2291 — 2299). Interferony zostaja specyficznie za- adsprbowane do aglutyniny poprzez swój skladnik weglowodanowy, podczas gdy zanieczyszczenia przechodza po wiekszej czesci. Zaadsorbowany in¬ terferon eluuje sie nastepnie odpowiednim eluen- io tern.Jako aglutyniny stosuje sie w tym celu agluty¬ niny, które mozna stosowac do oczyszczania gliko¬ protein, np. fitohemaglutyniny z Lens culinaris, Triticum vulgaris, Lotus tetragonolobus, Micinus comunis, a zwlaszcza z Phaseus vulgaris. Eluent do desorpcji zwiazanego interferonu zalezy od rodza¬ ju uzytej aglutyniny, ale ogólnie nadaja sie do te¬ go celu cukry proste, oligosacharydy lub polisacha¬ rydy, albo glikoproteiny, korzystnie gliko-proteina lub jej fragment otrzymany z ludzkich erytrocy¬ tów [S. Kornfeldt i in., Proc. Mat. Acad. Sci. (USA) 63, 1439—1446]. Desorpcje interferonu mozna spo¬ wodowac równiez przez zmiane pH do wartosci 2,0.Interferony stosowane jako produkty wyjsciowe sa opisane w literaturze i moga byc wytwarzane pod wplywem induktorów, takich jak wirusy RNS i DNS, a takze pod wplywem induktorów niewiru- sowych, takich jak naturalne lub syntetyczne dwu¬ pasmowe RNS z komórkami in vivo i in vitro.Jako specyficzne interferony wymienia sie indu¬ kowane rozmaitymi induktorami interferony króli¬ ka, kury, malp, cielat, swini, myszy, kaczki lub tez czlowieka.Interferony zmodyfikowane sposobem wedlug wynalazku maja wlasciwosci przeciwwirusowe po¬ dobne do wlasciwosci interferonów nie poddawa¬ nych modyfikowaniu, ale ich okres polowicznego rozkladu jest dluzszy. W szczególnosci sa one sku¬ teczne przeciwko wirusowi Herpes Simplex, jak to 40 wykazaly badania przeprowadzone na bialych kró¬ likach z Nowej Zelandii o masie ciala 1,0 — 2,0 kgr którytn wstrzykiwano wirus Herpes Simplex o stezeniu 10* jednostek. Po uplywie 3 — 6 dni od zabiegu u wszystkich królików wystepowal paraliz 45 postepowy, a u 2/3 zwierzat wystepowalo zapalenie mózgu ze zwyklymi objawami smiertelnymi. Kró¬ likom tym wstrzykiwano 106 jednostek preparatu interferonu w postaci jednorazowej dawki lub w 4 dawkach co 6 godzin, poczawszy od wystapienia 50 zakazenia i obserwowano wyniki.Interferony zmodyfikowane sposobem wedlug wynalazku sa przeto wskazane jako srodki przeciw¬ wirusowe, zwlaszcza zapobiegawcze. Korzystna dawka dzienna wynosi od 5,lfl« do 200,10« jednostek, 55 stosowana w postaci dawek podzielonych 2 — 4 razy dziennie. Zmodyfikowane interferony mozna korzystnie mieszac z obojetnymi, cieklymi rozcien¬ czalnikami i stosowac pozajelitowo w postaci wy¬ jalowionych roztworów lub zawiesin do wstrzyki- 60 wania.Podane nizej przyklady ilustruja wynalazek.W przykladach jest mowa o izoelektrycznym ogniskowaniu. Zabieg ten prowadzi sie w ukladzie LKB Uniphor Columm Electrophoresis, o objetosci 65 220 ml, stosujac jako nosnik amfolinowy amfote-93 327 6 lointerferon oznaczony symbolem [8H] jest bardzo silnie adsorbowany na tej lektynie sprzezonej z aga- roza.Stosowano w sumie 10000 jednostek interferonu o aktywnosci 120000 dpm [8H]. Okolo 50% radio¬ aktywnosci nie zostaje zaadsorbowane, a dalsze % mozna eluowac za pomoca 0,1 m galaktozy, ale material ten nie wykazywal aktywnosci biolo¬ gicznej. Calkowita desorpcje osiaga sie stosujac io fragment glikoproteiny z ludzkich erytrocytów. Ten fragment otrzymuje sie z blony ludzkich erytrocy¬ tów po dzialaniu trypsyna wedlug metody opisanej przez S. Kornfelda i in., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 63, 1439—1446. Po dodaniu tego fragmentu glikopro- teiny do srodka eluujacego, otrzymuje sie ostre maksimum (rysunek). Calkowita pozostala radio¬ aktywnosc zostaje wyeluowana, to znaczy, ze inter¬ feron ulega desorpcji w wyraznie ograniczonym zakresie.Przyklad III. Odszczepianie galaktozy w po¬ lozeniu koncowym.Roztwór 40 ml interferonu króliczego zawieraja¬ cy 5.106 jednostek interferonu w 0,05 m roztworze buforowym octanu sodowego o wartosci pH 5,5, 3*15 m NaCl i 20 milimoli Ca Cl2, traktuje sie je¬ dna miedzynarodowa jednostka neuraminidazy po¬ chodzenia bakteryjnego lub zwierzecego. Po uply¬ wie 4 godzin dializuje sie material 0,1 n kwasem octowym i nastepnie woda. W cieczy nad osadem znajduje sie asialointerferon. Jezeli taki preparat poddaje sie izoelektrycznemu ogniskowaniu, to oka¬ zuje sie, ze jak to juz wczesniej opisano (K. Schon- ne i in., Symp. Series Immunobiol. Standard, 14, 61—68), zanikla róznorodnosc ladunku i utworzyl sie jednorodny produkt o p I 6,3. 107 jednostek asialointerferonu króliczego w 0,01 m roztworze buforowym fosforanu sodowego, wartosc pH 6,5, poddaje sie hodowli z 1000 jednos¬ tek p-galaktozydazy z Diplococcus pneumoniae 40 [R.C. Hughes i R.W. Jeanloz. Biochem. 3, 1535 (1964)] w ciagu 3 godzin, po czym dializuje sie 0,1 m kwasem octowym i oddziela osad przez od¬ wirowanie. Ciecz znad osadu zawiera agalaktointer- feron. Fakt pdszczepienia galaktozy mozna po- 45 twierdzic za pomoca asialointerferonu znaczonego trytem. Gdy produkt ten, traktuje sie 0-galaktozy- daza, wyczerpujaco dializuje i nastepnie poddaje kwasnej hydrolizie, wówczas w produkcie hydroli¬ zy nie mozna wykryc galaktozy znaczonej trytem. ryczne elektrolity o wartosci pH 3 — 10. Izoelek- tryczne ogniskowanie prowadzi, sie wedlug pod¬ recznych instrukcji LKB. Wszystkie zabiegi pro¬ wadzi sie w temperaturze 2°C. Po uplywie 36 go¬ dzin zbiera sie frakcje po 5 ml i niezwlocznie re¬ jestruje wartosc pH.Przyklad I. Wytwarzanie interferonu.Interferon wytwarza sie w pierwotnych komór¬ kach nerek królika metoda Tan i in., Proc. Nat.Acad. Sci. 67, 464—471, stosujac nastepujaca mo¬ dyfikacje. Pojedyncze warstwy hoduje _ sie z 200 \ig/ml poly(l) poly(C) w ciagu 1 godziny w temperaturze 37°C. Po usunieciu induktora komór¬ ki plucze sie dwukrotnie buforowanym roztworem solanki Hanksa i dodkje 10 jig/ml cykloheksimidu w minimalnym, zasadniczym czynniku Eagle'a za¬ wierajacym 2% plodowej surowicy cielecej. Kul¬ tury hoduje sie w ciagu 3 1/2 godzin w tempera¬ turze 37°C, po czym dodaje 3 ng/ml aktynomycyny D i prowadzi dalej hodowle w ciagu 1/2 godziny.Nastepnie usuwa sie antymetabolity, komórki prze¬ mywa pieciokrotnie roztworem Hanksa i przykry¬ wa swiezym czynnikiem bez surowicy. Po uply¬ wie 8 — 10 godzin zbiera sie ciecze znad osadu, odwirowuje i przechowuje do dalszego uzytku w temperaturze — 70PC. litrów tej cieczy steza sie dwustokrotnie na drodze ultrafiltracji przez przepony Diaflo PM-10 (Amicon), dializuje rozcienczonym kwasem octo¬ wym (wartosc pH 3,0) i odwirowuje w celu usunie¬ cia wytraconych protein.Do badania interferonu stosuje sie próbke plyt¬ kowej redukcji na pierwotnych komórkach nerek królika. Pojedyncze warstwy komórek w szalkach Petriego o 6 cm srednicy traktuje sie w ciagu okolo 18 godzin 2 ml roztworów interferonu i na¬ stepnie dziala 50 — 80 jednostkami wirusa Vesicu- lar stomatitis tworzacymi plytki. Miana okresla sie jako rozcienczenie interferonu powodujace zmniej¬ szenie plytek o 50%. Do kazdego szeregu prób sto¬ suje sie wzorzec miedzynarodowy i wszystkie wy¬ niki koryguje sie do tego wzorca i wyraza w je¬ dnostkach miedzynarodowych na 2 ml.Przyklad II. Proces oczyszczania.Stosowana w procesie fitoaglutynine z Phaseolus vulgaris, to jest baktofitohernaglutynine, oczyszcza sie w sposób opisany przez T. Webera i in., Scand.J. Hamat. 4, 77 — 80. Skladnik erytroaglutynujacy odsacza sie jako zel na Sephadex G-150 i nastepnie sprzega z estrem N-hydroksyimidu kwasu burszty¬ nowego acylowanej kwasem bursztynowym amino- alkiloagarozy (P. Guatrocacas i in., Biochemistry 11, 2291 — 2299). Aglutynina ta wykazuje specy¬ ficzna reakcje z sekwencja oligosacharydowa ga- laktoza - N-acetyloglikozamina - mannoza, wy¬ stepujaca jako charakterystyczna cecha struktural¬ na u wielu glikoprotein. Jak widac z rysunku, asia- - _ -A rf • y y ^ l / / / / s s 7 / / / / / s [ o 00 o i o to o 00 frakcja 3H dpm x10^ OZGraf. Zam. 1163 (105+25 egz.) Cena 10 zl PL PL PL PL PL PL PL