PL96694B1 - Sposob oczyszczania insuliny w postaci soli metalu alkalicznego lub soli amonowej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania insuliny w postaci soli metalu alkalicznego lub soli amonowej na drodze filtracji przez zel przy pH o wartosci 2,0—3,5w Od czasu odkrycia insuliny w roku 1921 jako skla¬ dnika trzustki, osiagnela ona ogromne znaczenie na swiecie w leczeniu cukrzycy. Poniewaz w celu wyizo¬ lowania insuliny z tkanek trzustki stosuje sie meto¬ dy ekstrakcyjne, równoczesnie z insulina usuwane sa znaczne ilosci protein, nie bedacych insulina.Zostaly podjete znaczne wysilki w kierunku roz¬ winiecia metod oczyszczania insuliny, tj. metod od¬ dzielenia insuliny od protein, nie bedacych insulina.Liczne z tych metod uzyskaly wazne znaczenie han¬ dlowe.Jedna z tych waznych z handlowego punktu wi¬ dzenia metod wywodzila sie z ogólnego stwierdzenia, ze proteina posiada minimum rozpuszczalnosci w punkcie izoelektrycznym, inne wspólczynniki pozo¬ stawaly bez zmiana Banting i inni w opisie patento¬ wym St. Zjedn. Amer. nr 1469 994 podali sposób oczyszczania, polegajacy na wytracaniu zawartych w wodnym wyciagu z trzustki protein, mie bedacych insulina, w ich punkcie izoelektrycznym. Izoelektry- czne wytracanie insuliny przy pH = 4—7 z wodnego ekstraktu trzustka zostalo opisane przez Waldena w opisne patentowym St. Zjedn. Amer. nr 1 520 673.W innej metodzie wczesniejszej wytracanie insu¬ liny bylo przeprowadzane przez dodanie odpowie¬ dniej ilosci nieorganicznej sold. Murlin w opisie pa- 2 tentowym St Zjedn. Amer. nr 1547 515 pierwszy opisal proces wysalania insuliny z rozpuszczalnika ekstrahujacego za pomoca chlorku sodowego. Inny proces wysalania zostal opisany przez Lautenschla- gera i innych w opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 2 449 076, polegajacy na wysalaniu insuliny z obo¬ jetnego ekstraktu przez dodanie chlorku sodowego, przesaczeniu, ponownym rozpuszczeniu pozostalosci i ponownym wysoleniu insuliny, lecz sola o nizszym stezemiu niz zastosowana w pierwszym etapie wysa¬ lania.Trzecia metoda handlowo wazna oczyszczania in¬ suliny polega na wytracaniu lub krystalizacji insu¬ liny z roztworu w postaci kompleksu z cynkiem. Na ogól, cynk insuline wytraca sie z buforowanego wo¬ dnego roztworu, zawierajacego jony cynku. Rózne bu¬ fory sa stosowane. Petersen np. wg opisu St. Zjedn.Amer. nr 2 626 228 stosuje kwas cytrynowy — cytry¬ nian. Niniejszy przemyslowy sposób oczyszczania in- suliny jest rozwinieciem wszystkich trzech powyz¬ szych metod. Poniewaz cynk insulina jest najwazniej¬ sza handlowa postacia insuliny, ostatni etap oczy¬ szczania insuliny jest zazwyczaj etapem krystalizacji cynku.' Jednakze proteiny nieinsulinowe, wsród których przewazaja proinsulina i proteiny promsulinopodo- bne zostaly uznane w ostatnich latach jako skladniki niepozadane handlowej cynk insuliny. Jakkolwiek skladniki te na ogól stanowia mniej niz okolo 8% wa- gowych handlowej cynk insuliny, niektóre z nich 96 69496 694 3 zostaly uznane za antygeny lub czynniki immunoge- niczne. Patnz np. Chance ii inni Science 161, 165 (1968); Stedner i limni, Diabetes, 18, 725 (1968); Bromier, Bio- Science, 20, 701 (1970); oraz Rubenstein i inni Am.Rer. Med. 22, 1, (1971).Tak wiec stalym problemem jest usuwanie protein ndedmsulinowycih z insuliny na skale przemyslowa.Okreslenie ,,insuflinia" sitosiowiaine w opisie dotyczy nie tylko insuliny jako takiej, ale równiez wszystkich protein insulino — podobnych, takich jak dezamido- insulina. Poniewaz insulina i proteiny insulino — po¬ dobne posiadaja podobna aktywnosc hypoglicemiczna, zazwyczaj nlie ma potrzeby oddzielania insuliny od wszystkich innych protein, zawartych w trzustce tj. normalnie nie jest wymagana insulina homogeniczna.Techniki oczyszczania substancjii biologicznych na skale laboratoryjna, takie jak elektroforeza i chro¬ matografia na jonach, sa znane w celu oddzielania skladników niedinsuUnowych od insuliny, bedacej skladnikiem preparatów handlowych insuliny (lub nawet surowej). Techniki te pozwalaja nawet rozlo¬ zyc skladnik insuliny w insuline jako taka i linsuline desamidowana. Jednakze takie procedury posiadaja watpliwa przydatnosc na duza iskale.Procesem bardziej nadajacym sie do zastosowania na duza skale jest chromatografia na zelu (synoni¬ mem jest gel exclusion chnomatography i gel per- meation chromatography). W metodach tych proteiny sa rozdzielane w kolumnie, wypelnionej zelem, który jest sieciowany w taki sposób, ze pory sa wytwa¬ rzane dla kazdego zelu oddzielnie. Pory te posiadaja okreslona, wymliierzalna objetosc, która jest wprost proporcjonalna do stopnia specznienia zelu i odwro¬ tnie proporcjonalna do stopnia usieciowania. Ponie¬ waz czasteczki mniejsze maja wiekszy dostep do tych por niz czasteczki wieksze, przesuwanie sie mniej¬ szych czasteczek przez kolumne jest hamowane w stosunku do wiekszych czasteczek, które maja tylko czesciowy lub zaden dostep do por.Filtracja na zelu stosowana byla dawniej przy oczyszczaniu insuliny. Przy wyosaibnianiu pojedyn¬ czej insuliny z trzustki kota otrzymuje sie surowa linsuline na drodze ekstrakcji kwas/alkohol, która na¬ stepnie traktuje sie alkaliami w celu usuniecia sub¬ stancji nieaktywnych, nastepnie zateza, poddaje izo- elektrycznemu wytracaniu i wreszcie wytracaniu przez wyisolenlie chlorkiem sodu. Surowa insuline wprowadza sie do kolumny, wypelnionej sieciowa- nym zelem dekstranowym i eluuje 1,0 n kwasem oc¬ towym [Davoren, Biochim, Biophys. Acta, 63, 150 (1962)].Przy wyosabnianiu insuliny z ryb, gruczoly homo¬ genizuje sie w wodzie, a proteiny wytraca roztwo¬ rem kwasu trójchlorooctowego, ekstrahuje roztwo¬ rem kwas/etanol, a ekstrakt traktuje chlorkiem me¬ tylenu w celu usuniecia lipidów. Pozostale ciala stale izoluje sde, przenosi do 5,0 m roztworu kwasu octo¬ wego, i przesacza przez kolumne, wypelniona sie- diowanym zelem dekstranowym, nastepnie eluuje 5,0 m kwasem octowym, [Humbel, Biochem, Biophys.Res. Commun., 12, 333 (1963)]. Podawano wydajnosc okolo 80%. Nalezy zauwazyc, ze Humbel stwierdzil, ze w celu dobrego oddzielenia insuliny od innych protein, warunki elucji powinny ulatwic dysocjacje czasteczek insuliny. Sugeruje on dalej, ze 1,0 n kwas 4 octowy nie jest odpowiednim razpuszczainiMem, po¬ niewaz wedlug YphanUils i Waingh [Biochim. Biophys.Acta, 26, 218 (1957)] insulina nie jest w tym przy¬ padku calkowicie zdysocjowana.Surowy ekstrakt trzustki wolowej zostal przesa¬ czony przez sieciowany zel dekstranowy przez Ep- steina i innych, Biochemistry, 2, 461, (1963). Rozpu¬ szczalnikiem eluujacym byl 0,2 m weglan amonu, rozpuszczalnikiem polecanym równiez przez Hum- io bela byl supra. Epstein i inni podawali wydajnosc okolo 60%.Insulina byla nawet izolowana z trzustki ludzkiej.Gruczoly byly najpierw homogenizowane i ekstra¬ howane. Frakcjonowanie siarczanem amonu usuwa- lo niektóre substancje nieaktywne. Nastepnie wytra¬ cano insuline, najpierw chlorkiem sodu, nastepnie stosujac wytracanie izoelektryczne. Otrzymana insu¬ line rozpuszczano w 0,5 n kwasie octowym i przesa¬ czano przez sieciowany zel dekstranowy. Przesaczo- na insuline przeprowadzano w cynk insuline [Jack¬ son li inni, Diabetes, 18, 206 (1969)]. Wydajnosc in¬ suliny po przesaczeniu przez zel wynosila okolo 60%.Wreszcie, saczenie przez zel i chromatografia jo^ nitowa zostaly polaczone przez Schlichthsulla i in- nych, jak podano w opisie patentowym Poludniowej Afryki nr 69/5280 (odpowiada opisowi patentowemu belgijskiemu nr 73l 257).W jedynym przykladzie dotyczacym saczenia przez zel (przyklad I) cynk insulina byla przepuszczana przez kolumne z siediiowanym zelem dekstranowym z wydajnoscia 80%. Rozpuszczalnikiem eluujacym byl 1,0 n kwas octowy. Nalezy podkreslic, ze Schlichth- sull i inni uznali za konieczne, po filtracji, wysala- nlie, wytracanie izoelektryczne i krystalizacje cynku w celu otrzymania cynk insuliny.Kazdy z uprzednich sposobów stosowania saczenia przez zel w celu oczyszczenia insuliny powodowal na ogól straty insuliny. Ponadto poprzednie meto¬ dy nie dawaly pewnosci1, ze w wyniku stosowania 4o saczenia przez zel otrzymuje sie tylko insuline (wla¬ cznie z proteinami iinsulinopodobnymi jak poda¬ no powyzej).Na ogól, w procesie wedlug wynalazku mozna za¬ stosowac kazdy odpowiednli peczniejacy w wodzie zel 45 do rozpuszczonych protein. Jednakze takie zele beda posiadaly w stanie suchym lub nie specznionym co najmniej okolo 4% wagowych wody, w przeliczeniu na suchy zel i srednice czasteczek beda mniejsze nliz okolo 100 mikronów. 50 Korzystnie, gdy zawartosc wody w zelach bedzie w granicach okolo 4—98%, a zwlaszcza 5—20%. Ko¬ rzystne, gdy srednice suchych czasteczek zelu sa mniejsze niz okolo 80 mikronów; szczególnie korzy¬ stny jest zakres srednic czasteczek od okolo 20 do 55 okolo 80 mli'kronów.Przykladami odpowiednich zeli miedzy innymi sa skrobia (wlacznie z kukurydziana), sieciowany galak- tomannan, sieciowany dekstran^agar lub agaroza, po- liacyloamidy, kopolimery acyloaimidiu z metyleno-bis- 60 akryloamidem, kopolimery metyleno-bis-akryloami- du z winylo-etylonkarbiitolem i z wiilnylo-pirolidonem i podobnymi. Najodpowiedniejszymi zelami sa sie- dibwane dekstrany, takie jak sephadex, produkowa¬ ny i sprzedawany przez Pharmaclila Fime Chemicals, 65 Inc. Piscataway, N.J., USA.96 694 Rodzaj stosowanych kolumn nie jest istotny. Wy¬ bór wysokosci, srednicy i ksztaltu zalezy od pozada¬ nych parametrów procesu. Oczywiscie ze wzrostem wysokosci kolumny maleje szybkosc przeplywu; stwierdzono niezaleznie od siebie, ze opór kolumny jest wprost proporcjonalny do jej wysokosci. Z tego powodu korzystny jest ksztalt kominowy kolumny, taM jak Pharmacia Sectional Oolumn KS — 370. Dla celów normalnej pirodiukcji sluzy bardzo dobrze ko¬ lumna, zlozona z 6 czesci.W przyblizeniu zadowalajace oczyszczenie insuliny mozna przeprowadzic w dumnie, wypelnionej okolo 4,5 g insuliny w postaci soli metalu alkalicznego lub soli amoniowej na litr objetoscti podloza. Takie wy¬ pelnienie jest najkorzystniejsze. Jednakze, na ogól wypelnienie kolumny moze wynosic 0,8—6,7 g na litr objetosci podloza, korzystnie 3,5—5,0 g na litr obje¬ tosci podloza. Naturalnie optymalne warunki moga byc ustalone z latwoscia dla kazdej kolumny.Zel mozna speczniac i wypelniac kolumne spe- cznionym zelem w dowolny znany sposób. Na ogól zel specznia sie w srodku eluujacym albo mozna go specznic w 30%-owym roztworze wodnym etanolu, zdekantowac i srodowisko speczniajace zastapic sro¬ dowiskiem eluujacymw Wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania insuliny w postaci soli metalu alkalicznego lub soli amonowej, polegajacego na specznianiu zelu, zawierajacego w stanie suchym co najmniej okolo 4% wagowych wo¬ dy, srednice czasteczek mniejsze niz okolo 100 mi¬ kronów, napelnieniu kolumny specznianym zelem, padaniu na kolumne wodnego roztworu insuliny w postaci, soli metalu alkalicznego lub soli amonowej o czystosci co najmniej okolo 80%, przy czym steze- nfiie insuliny lezy w granicach 1—8% wagowych na objetosc; calkowita ilosc insuliny jest wystarczajaca do wypelnienia kolumny w granicach od okolo 0,8 okolo 6,7 g na litr objetosci podloza, przy pH roz¬ tworu w granicach 2,0—3,5 i elucji insuliny z ko¬ lumny w temperaturze 5—30 UC wodnym roztworem eluanta o pH, utrzymanym w takich samych grani¬ cach jak roztwór insuliny.Rysunek przedstawia diagram elucji dla przykla¬ du I. Diagram przedstawia grafliloznie gestosc opty¬ czna przy 280 m/n pewnych frakcji roztworu insuliny podczas procesu chromatografii na zelu.Insuline w postaci roztworu soli metalu alkali¬ cznego lub soli amonowej mozna wytwarzac w do¬ wolny znany sposób. Np. mozna rozpuscic Itosuline w odpowiedniej ilosci srodka eluujacego lub mozna rozpuscic insuline w wodnym srodowisku, które jest nieco bardziej kwasne (jednakze w granicach pH srodka eluujacego) niz srodek eluujacy. Np. jesli sroóMem eluujacym jest 0,5 n kwas octowy o pH = «= 2,5, insuline mozna rozpuscic w wodnym srodo¬ wisku o pH okolo 2,3 to jest w 1,0 n kwasie octo¬ wym.Insulina w postaci soli metalu alkalicznego lub amonowej ma z natury rzeczy charakter zasadowy.W konsekwencji po rozpuszczeniu insuliny w obo¬ jetnym lub kwasnym srodowisku wodnym* pH otrzy¬ manego roztworu wzrasta. Tak wiec, jesM insuline rozpusci sie w 1,0 n kwasie octowym, pH otrzyma¬ nego wzrasta do okolo 2,7. Jednakze, w zaleznosci od 6 stezenia zastosowanej insuliny, roztwór insuliny mo¬ ze dochodzic do pH «= 3,2.Wzrost pH jest zjawiskiem normalnym i nlie stwa¬ rza problemów pod warunkiem, ze pH roztworu in- suliny nie przekroczy okolo 3,5. Insuline mozna ró¬ wniez rozpuscic w 0,5 n kwasie octowym i pH sko¬ rygowac na wartosc ponizej okolo 3,2 za pomoca rozcienczonego kwasu solnego.Na ogól, insuline w postaci soli metalu alkaliczne- go lub soli amonowej mozna wytwarzac w dowolny znany sposób. Jednakze korzystnie jest wytwarzac sposobem, opisanym w opisie patentowym St Zjedn.Amer. nr 3 719 655.Jak wykazano powyzej insulina powinna byc o czy¬ stosci co najmniej 80%. To jest, zawartosc insuliny wlacznie z piroteinami. insuliinopodobnymlil, wyka¬ zujacymi aktywnosc hypoglicemiczna, powinna wy¬ nosic co najmniej okolo 80% calkowitej zawartosci protein.Stezenie roztworu soli metalu alkalicznego lub amonowej insuliny wprowadzonego na kolumne po¬ winno wynosic, jak stwierdzono powyzej, 1—8% wa¬ gowych na objetosc. Korzystne stezenie 4—6%.Zadowalajace rezultaty otrzymuje sie, gdy sól me¬ talu alkalicznego lub sól amonowa insuliny rozpusci sie w mniejszej objetosci rozpuszczalnika niz obje¬ tosc stosowana przy rozdzielaniu, co zostalo omó¬ wione ponizej.W chromatografii, wspólczynnik podzialu Kd jest okreslony jako stosunek stezenia substancji rozpu¬ szczonej w fazie ruchomej do stezenia substancji roz¬ puszczonej w fazie stacjonarnej. W saczeniu przez zel faze ruchoma stanowi rozpuszczalntiik, poruszaja- cy sie w przestrzeni por pomiedzy czasteczkami ze¬ lu, a faze stacjonarna stanowi rozpuszczalnik, po¬ chloniety w czasteczkach zelu tj. zatrzymany w po¬ rach wewnatrz kazdej czasteczki zelu. Tak wiec wspólczynnik Kd dotyczy tej frakcji pochlonietego 40 rozpuszczalnika, która jest nasycona substancja roz¬ puszczona.W okreslenfilach Kd, objetosc eluanta, Ve, substan¬ cji rozpuszczonej moze byc wyrazona równaniem 45 Ve=V0-HK„-V1 gdzie: VQ oznacza objetosc por w kolumnie, V! oznacza objetosc pochlonietego rozpuszczalnika.Oznaczajac K,, równanie przyjmuje postac Jesli gestosc wody' przyjmie sie za jednosc, Vj •= 55 =a*Wr/ gdzie a oznacza ciezar suchego zelu, Wr zawartosc wody. W ten sposób i moze byc oznaczony doswiadczalnlie przez fachow¬ ców z tej dziedziny.Przyjmujac, ze roztwór zawiera dwie substancje rozpuszczone, objetosc elucji dla kazdej substancji 65 rozpuszczonej wyraza sie nastejmjaco;96 894 7 v;=vc+Kdv1 V,'-V0 + Kd'V, Objetosc rozdzielania, Vs, stanowi róznice pomie¬ dzy objetoscia elucji dwóch substancji rozpuszczo¬ nych. v.-v,'-v; V.-(Kd.,-Kd.)v, Z powyzszego wynika, ze stopien rozdzielenia dwóch (lub wiecej) substancji rozpuszczonych jest czesciowo zalezny od obciazenia kolumny.Kiedy ilosc substancji rozpuszczonych o nizszym ciezarze cza¬ steczkowym zbliza sie do granicy wolnych por, roz¬ dzial dwóch substancji rozpuszczonych z koniecznosci musi zmalec.W granicach dbciazen&a, okreslonych jako czesc niniejszego wynalazku, stopien rozdzialu moze sie zmieniac. W pewnych przypadkach, wyzsze obcia¬ zenie kolumny moze byc dopuszczone do zrównowa¬ zenia rozdzielania w stosunku do wydajnosci.Jak stwierdzono uprzednio srodek eluujacy moze posiadac pH w granicach 2,0 do 3,5. Na ogól srod¬ kiem eluujacym moze byc wodny roztwór dowolnego kwasu nieorganicznego lub organicznego, wobec któ¬ rego proteiny sa trwale.Przykladami takich kwasów sa: kwas chlorowodo¬ rowy, fosforowy, mrówkowy, octowy, propionowy, n-maslowy, izomaslowy, pentanokaiiboksylowy i po¬ dobne. Korzystne jest stosowanie kwasu octowego.Jesli stosuje sie kwas chlorowodorowy, nalezy do¬ dawac do srodka eluujacego srodek ochronny, taki jak fenol. Nalezy podkreslic, ze kwas octowy dziala jak srodek ochronny. Korzystnie stosuje sie pH okolo 2,5. W konsekwencji, iiajkorzystniejszy srodek elu¬ ujacy stanowi 0,5 n roztwór kwasu octowego.Jesli trzeba, srodek eluujacy moze zawierac sól nieorganiczna w ilosci do okolo 0,02 m na litr, taka jak chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek amonu i po¬ dobne. Korzystne stezenie wynosi 0,01 m, a korzy¬ stna sola jest chlorek sodu. Zastosowanie taMej soli jest korzystne w celu polepszenia zdolnosci rozdziel¬ czej i' zabezpieczenia substancji podstawowej przed zaabsorbowaniem przez zel.Elucje kolumny mozna przeprowadzic w grani¬ cach temperatur 5—30°C. Korzystnie w temperaturze otoczentia lub nizszej.Przebieg elucji mozna kontrolowac w jakikolwiek dogodny sposób. Jednakze szczególnie dogodna jest metoda pomiaru absorpcji kazdej frakcji przy 280 m/i. Frakcje te stanowiace oczyszczony skladnik in¬ suliny, laczy sie i zazwyczaj przeprowadza w cynk insuline.Jak zaznaczono powyzej, cynk insulina jest naj¬ wazniejsza postacia insuliny. W konsekwencji, otrzymana w procesie insuline w postaci soli metalu alkalicznego lub soli amonowej o wysokiej czystosci przeprowadza stfe w cynk insuline. Przemiane w cynk insuline przeprowadza sie korzystnie przy pH = 6,0 w obecnosci octanu amonu jako buforu. Nie ma potrzeby izolowania soli metalu alkalicznego lub amonowej insuliny ze srodowiska eluujacego lub za- tezania roztworu oczyszczonej insuliny przed krysta- 8 lizacja z cynkiem. Postepem w niniejszym procesie jest, ze roztwór izolowanej insuliny jest dostatecznie stezony i nie ma potrzeby stosowania wysalania lub izoelektrycznego wytracania, jakkolwiek, jesli trze- ba, mozna te procesy stosowac.W wyniku stosowania sposobu wedlug wynalazku otrzymuje sie cynk insuline o wiekszej czystosci Ta polepszona czystosc moze byc udowodniona róznymi metodami Cynk insuline mozna analizowac bezpo- srednio na obecnosc protein nieinsul±nowych, takich jak prodinsulina i glukagon.Obecnosc protein wielkoczasteczkowych, do których nalezy protaminaza^ proteolityczny enzym, moze byc oznaczona przez pomiar stabilnosci zawiesiny prota- la minowej w podwyzszonej temperaturze; jesli prota- minaza jest obecna, kompleks insuliny protaminowej bedzie dysocjowal z powodu rozkladu protaminy. Mo¬ ga byc mierzone fizyczne wlasnosci, takie jak rozpu¬ szczalnosc cynk iihsuliny w obojetnym pH i zabar- wiienie otrzymanego roztworu. Wreszcie, aktywnosc wlasciwa insuliny moze byc mierzona za pomoca prób bakteriologicznych i immunologicznych.Z powodu wyzszej czystosci cynk insulina, otrzy¬ mana sposobem wedlug wynalazku, jest pozadanym skladnikiem przy wytwarzaniu róznych postaci far¬ makologicznych insuliny, takich jak insulina zwykla, insulina izofanowa, protaminowa cytnk insulina, za¬ wiesina cynk insuliny, insulina globinowa i podobne.Nastepnie, bardziej czysta insulina umozliwia otrzy- manie obojetnej insuliny, która jest postacia bardziej trwala niz insulina w postaci kwasowej.Zanieczyszczenia, które poprzednio wystepowaly w cynk insulinie, czesto wytracaja sie czesciowo w obojetnym pH. Takie zanieczyszczenia zawieralyby czesto enzymy, powodujace rozklad insuliny, takie jak trypsyna i chymotrypsyna, które zmniejszaja ak¬ tywnosc preparatu insuliny. BamcMej czysta insulina umozliwia wytwarzanie preparatów insuliny o prze¬ dluzonym dzialaniu z wieprzy i1 wolów bez dodatko- 40 wego oczyszczania, wymaganego uprzednio. Wre¬ szcie, wytwarzanie insuliny izofanowej z bardziej czystej cynk insuliny wymaga mniejszej ilosci pro¬ taminy, poniewaz brak zanieczyszczen proteinami x kwasowymi umozliwia uzycie protaminy tylko w 45 iloscff, niezbednej do wytracenia insuliny.Sposób wedlug wynalazku moze ewentualnie byc polaczony z innymi sposobami oczyszczania, Np. roz¬ twór insuliny w postaci soli metalu alkalicznego lub amonowej mozna poddawac jednemu lub wiecej pro¬ so cesom saczenia przed procesem saczendia przez zel.Równiez insuline eluowana mozna poddawac jedne¬ mu lub wiecej procesom saczenia przed reakcja prze¬ miany w cynk insuline. i Przyklad I. Sieciowany zel dekstranowy o za- 55 wartosci wody 5% i wymiarach czasteczek 20—80 \i potraktowano 0,5 n kwasem octowym. Laboratoryj¬ na kolumne K 100/100 (Pharmacia Fine Chemicals Inc.) o przekroju 10 cm i wysokosci 100 cm napelnio¬ no specznianym zelem do objetosci podloza 7 litrów eo (glebokosc podloza 89 om). 17,5 g insuliny sodowej (z trzustki wolu), otrzymanej sposobem wg opisu patentowego St. Zjedn. Amer. nr 3 719 655, o akty¬ wnosci 23,8 je^nostek/mg i zawartosci proinsuliny 4,21% wagowych rozpuszczono w 400 ml 0,5 n kwasu 65 octowego. Roztwór insuliny wprowadzono do kolum-9 96 694 ny d eluowano 0,5 n kwasem octowym pod cisnie¬ niem 5 psig, uzyskujac szybkosc przeplywu 900 ml/godz. (liniowa szybkosc przeplywu 0,19 ml/cm2/ /mm). Nastepnie przeprowadzono elucje por o obje¬ tosci (1725 ml); Frakcje po 23,5 ml zostaly polaczone.Zawartosc protein zostala oznaczona za pomoca po¬ miaru absorpcji w ultrafiolecie przy 280 m^u. Ozna¬ czono równiez zawartosc cial stalych w mg/ml. Ze¬ brano 240 frakcji. Frakcje podzielono na 4 grupy, omówione ponizej w tablicy 1.Tablica 1 Gru¬ pa A B-1 B-2 C Obje¬ tosc w ml 1405 1193 978 1520 Frakcje —69 70—119 120—160 161—225 Sub¬ stan¬ cje stalea w% M 2,4 9,7 86,4 Wyniki identyfikacji Wielkocza^teczko- we proteiny i en¬ zymy Glówna proinsulina Proiinsulina i insulina posrednia Insulina | a % wszystkich eluowanych substancji stalych Do grupy C dodano 3,0 ml 20% roztworu chlorku cynku, a otrzymany roztwór rozcienczono do obje¬ tosci 3025 ml 0,5 n wodorotlenkiem amonu, pH kon¬ cowego roztworu skorygowano do wartosci 6,0 za po¬ moca rozcienczonego roztworu wodorotlenku amo¬ nu. Wytracona cynk insuline izolowano przez odwi¬ rowanie przemywano kolejno woda, alkoholem abso¬ lutnym, eterem i suszono pod próznia. Wydajnosc cynk insuliny wynosila 13,9 g; aktywnosc iinsuliny wynosila 25,6 jednostek/mg i zawartosc piroinsuliny 0,44%.Poniewaz zawartosc cial stalych grupy C stano¬ wila 86,4% calkowitej ilosci eluowanych dilal sta¬ lych, maximum wydajnosci cial stalych grupy C wy¬ nosila 86,4% 17,5 g lub 15,1 g; w rjrzeliiczeniu na jed¬ nostke podstawowa, maximum wydajnosci powinno wynosic okolo 360 000 jednostek. Takwiec wydajnosc cynk insuliny z grupy C odpowiada 91,9% w prze¬ laczeniu na ciezar produktu wyjsciowego i 98,9% w przeliczeniu na jednostke produktu wyjsciowego.W odniesieniu do produktu wyjsciowego ciezar wy¬ nosi 79,4% a % jednostek 85,4.Grupe B-2 wytraca sie za pomoca nadmiaru jonów cynku, jak opisano powyzej dla grupy C, rozpuszcza ponownie w 0,5 n kwasie octowym i przesacza na malej kolumnie. Insulinowy pik rekrystalizuje sie, jak opisano powyzej dla grupy C, wprowadzajac doda¬ tkowo 1,0 g cynk insuliny o aktywnosci 26,7 jedno¬ stek/mg. Tak wiec calkowita ilosc cynk iinsuliny, w przeliczeniu na produkt wyjsciowy, wynosila 85,1% w stosunku do ciezaru produktu wyjsciowego i 91,8% w stosunku do jednostek. 40 45 50 55 Lepsze zrozumienie procesu, opisanego w przykla¬ dzie I, bedzie mozliwe po omówieniu rysunku. Rysu¬ nek przedstawia diagram elucji dla przykladu I, tj. wykres zaleznosci gestosci optycznej przy 280 m^ ró¬ znych frakcji od ilosci' frakcji. Tak wiec diagram wykazuje zawartosc protein we frakcjach, zbiera¬ nych podczas procesu elucji. Podzial frakcji na gru¬ py, opisane w przykladnie I, jest uwidoczniony za pomoca wykreslonych prostopadlych linrii1. Z diagra¬ mu wynika jasno, ze produkt wyjsciowy stanowi na ogól insuline, a skladnik insuliny jest skutecznie od¬ dzielony od proinsuliiiny i podobnych protein.Przyklad II. Postepowano, jak w przykladzie I z wyjatkiem insuliny sodowej z wolu, która za¬ stapiono 30 g insuliny sodowej ze swin, loraz zwiek¬ szano ilosc 0,5 n kwasu octowego, w którym rozpu¬ szczono insuline, do 600 ml. Insulina sodowa ze swin wykazywala aktywnosc 23,3 jednostki/mg i zawar¬ tosc piroinsuliny 2,42% wagowych. Otrzymane wy¬ niki podano w tablicy 2. x Tablica 2 Grupa A B-1 B-2 C Objetosc w ml 1410 1200 820 1920 Frakcje —69 70—119 120—154 155—235 % cial stalych a 1,3 Xl 6,0 90,0 65 a % wszystkich eluowanych substancji stalych Z grupy C otrzymano 26,5 g cynk insuliny o akty¬ wnosci 25,3 jednostko/mg i zawartosci proinsuliny 0,57%. Takwiec wydajnosc cynk insuliny odpowiada 98,1% w stosunku do ciezaru surowca lub 95,9% jed¬ nostek.Cynk insuline, otrzymana z tej samej porcji trzu¬ stki w procesie, w którym krystalizacja alkaliczna ii chromatografia na zelu zostaly zastapione kon¬ wencjonalnym wytracaniem izoelektrycznym z wo¬ dnego i wodnoalkoholowego rozpuszczalnika, otrzy¬ mano z tymi samymi wydajinosciami na jednostke wagi trzustki. Jednakze aktywnosc wynosila 24,3 je¬ dnostka na mg, a zawartosc proinsuliiiny 3,18%. PL

Claims (8)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oczyszczania insuliny w postaci soli me¬ talu alkalicznego lub soli amonowej, znamienny tym, ze zel o wymiarach czasteczek mniejszych niz 100 mikronów i zawartosci wody w stanie suchym co najmniej okolo 4% wagowych poddaje sie specznia¬ niu i specznionym zelem wypelnia kolumne i na¬ stepnie wprowadza wodny roztwór insuliny w po¬ stano, soli metalu alkalicznego lub soli amonowej o czystosci co najmniej okolo 80%, przy czym. steze¬ nie insuliny wynosi 1—8% wagowych na objetosc, calkowita ilosc insuliny jest wystarczajaca do wy¬ pelnienia kolumny w granicach 0,8—6,7 gAitr obje¬ tosci zloza, przy czym pH roztworu wynosi 2,0—3,5, nastepnie eluuje sie insuline z kolumny w tempe¬ raturze 5—30°C wodnym roztworem eluanta o pH,96 694 11 lezacym, w tych samych granicach jak roztwór in¬ suliny.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zel o zawartosci wody od okolo 4 do oko¬ lo 98%. a.

3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze sto¬ suje sie zel o zawartosci wody 5—20%.

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze ja¬ ko zel stasuje sie sieciowany dettestnan. 12

5. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze stosuje sie zel o zawartosci wody okolo 5%.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zel o wielkosci czastek 20—80 miitaronów.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ko¬ lumne wypelnia sie w granicach 3,5—5,0 g na litr objetosci zloza.

8. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze ko¬ lumne wypelnia sie okolo 4,5 g ma litr objetosci zloza. 20 40 60 PZG Bydg., zam, 744/78, nakl. 100+20 Cena 45 zl PL