Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego zwiazku 38 295 o charakterze antybio¬ tyku, nalezacego do grupy kwasowych eterów po- licyklicznych. Te klase zwiazków mozna scharak¬ teryzowac biologicznie ich wplywem na przenosze¬ nie kationów w mitochondriach. Ta rodzina anty¬ biotyków obejmuje monensyne, /J. Amer. Chem.Soc, 89:5737, 1967/, nigerycyne /Biochem. Biophys.Res. Comm., 33:20, 1908/, gryzoryksyne /J. Chem. iSoc. Chem. Commun., 1421 1970/, dianemycyne /J.Antibiotics, 22:161, 1969/, salinomycyne /J. Anti- biotics, 27:814, 1974/ X-537 A /J. Chem. Soc. Chem.Commun., 967, 19712/, X-206 /J. Chem. Soc. Chem.Commun., 927, 1971/ i A204 A /J. Amer. Chem.Soc, 95:3399, 1973/.Wymienione eterowe antybiotyki policykliczne wykazuja aktywnosc przeciwko bakteriom Gram- -dodatnim, grzybom i pierwotniakom. Wykazuja one potencjalna aktywnosc przeciwko kokcydiozie.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 839 557 opisano sposób lepszego wy¬ korzystania paszy przez zwierzeta przezuwajace i jednozoladkowe, które skarmiano wlóknista sub¬ stancja roslinna, podajac jednoczesnie monensyne, dianemycyne, nigerycyne lub inne eterowe anty¬ biotyki policykliczne.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia zwiazku 38 295 o charakterze antybiotyku o wzorze przedstawionym na rysunku.Antybiotyk wytwarza sie przez hodowanie Strep- tomyces hygroscopicus ATCC 31 050 w wodnym srodowisku, zawierajacym pozywke, w warunkach aerobowych w zanurzeniu. Antybiotyk i jego ka¬ tionowe sole sa potencjalnymi srodkami niszcza¬ cymi drobnoustroje, a takze sa efektywnymi srod¬ kami przeciw kokcydiozie i srodkami promotuja- cymi wzrost zwierzat.Mikroorganizm, stosowany do wytwarzania an¬ tybiotyku sposobem wedlug wynalazku, wyizolo¬ wano z próbki gleby, pochodzacej z Japonii. Ho¬ dowano go w wielu róznych srodowiskach, sto¬ sowanych do identyfikacji tego gatunku i stwier¬ dzono, ze jest on zupelnie podobny do Streptomy- ces hygroscopicus.Kulture Pfizer F. D. 23 604 porównywano z wielu róznych wzgledów w róznych srodowiskach z kul¬ tura Streptomyces hygroscopicus 48 248, otrzyma¬ na z holenderskiego zbioru szczepów muzealnych, Central bureau voor Schimmelcultures /CBS/. Po¬ równanie i identyfikacje wykonano w oparciu o pojecie gatunku, zgodnie z opisem w Applied Microbiology, 4:243—'250, 1956. Porównanie dwóch wymienionych kultur bylo nastepujace: Morfologia lancucha zarodnikowego — lancuchy kultury Pfizer F. D. 23 604 w postaci spiral o 6—10 zwojach lub mniej w róznych srodowiskach przy¬ pominaly lancuchy Streptomyces hygroscopicus CBS. Zarodniki Pfizer F. D. 23 604 badane za po¬ moca wybiórczej elektroskopii elektronowej wy¬ gladaly dokladnie tak samo, jak zarodniki szczepu 97 34197 341 3 CBS S. hygroscopicus* przedstawione w Applied Microbiology, 18:659—896, 1969, gdzie zarodniki o- pisano jako posiadajace pofaldowana powierzchnie zlozona z licznych wglebien, oddzielonych grzbie¬ tami substancji, stanowiacej scianki zarodnika.Barwione wycinki zarodników obu kultur wygla¬ daly identycznie.Barwa kolonii — grzybnia powietrzna miala bar¬ we szara w wiekszosci srodowisk, jecz dokladny odcien byl nieco rózny dla obu kultur. Pfizer F. D. 23 604 na sacharozowym agarze Czapka tworzyl gruby, nieregularnie pofaldowany szarawo-bialy -nalot,—pedGzas* / byl -plaski, -cienki i szary. Pfizer F. D. 23604 na \ agarze z maczka zoledzi po 4 tygodniach inkuba- l cji wytworzyl zólty nalot na uprzednio szarej * ^y^3P|io^ie1;rznej. Na agarze z ekstraktem droz- : dzewym- i slodowym Pfizer F. D. 23 604 dawal zól¬ te plamy nalotu na szarej substancji grzybni.Tworzenie melaminy — zadna z kultur nie two¬ rzyla melaniny na agarze peptonowo-zelazowym.Wykorzystanie wegla — /metoda Pfidhama i Gotlieba J. Bact., 56:107—114/, szczep Pfizer F. D. 23 604 wykorzystuje glukoze, L-arabinoze, dekstry¬ ne, D-fruktoze D/+/galaktoze, gliceryne, inozytol, inuline, laktoze, maltoze, D-mannitol, salicyne, ra- finoze, ramnoze, octan sodu, D-sorbitol, sorboze, skrobie, sacharoze, trehaloze i D-ksyloze, przy czym dulcitol nie byl wykorzystywany. Wyniki te sa zgodne z wynikami* opisanymi dla szczepu S. hy- groscopius w Applied Microbiology, 15:637—639, 1967 i dla szczepu CBS S. hygroscopicus wedlug Industrial Microbiology, 10:183—221, 1969, z tym wyjatkiem, ze szczep CBS nie wykorzystywal ino¬ zytolu.Wytwarzanie H2S — dla obu kultur uzyskano pozytywne wyniki na skosach agarowych z agaru peptonowozelazowego z pasmami octanu olowiu.Mleko — podobne wyniki uzyskano dla obu kul¬ tur—brak koagulacji, hydroliza pelna lub prawie pelna w ciagu 12 dni, brazowy, rozpuszczalny pig¬ ment.Zelatyna — obie kultury byly podobne we wzros¬ cie, barwie i umiarkowanej szybkosci uplynniania.Charakterystyka specjalna — szczep CBS S. hy¬ groscopicus daje czarne, higroskopijne powierzch¬ nie w ciagu 3 tygodni na agarze glukozowo-aspa- raginowym, agarze z maczki z zoledzi i agarze z ekstraktów drozdzowo-slodowych, natomiast szczep Pfizer F. D. 23 604 wykazuje czarne plamy jedy¬ nie na agarze z ekstraktów slodowo-drozdzowych.Dalsza inkubacja przez tydzien i magazynowanie kultur na szalkach Petriego w temperaturze 4— —10°C przez czwarty tydzien powoduje wzrost zaczerwienienia szczepu Pfizer F. D. 23 604. Na aga¬ rze z maczki z zoledzi, Czapek'a agarze sacharozo¬ wym i na agarze z ekstraktów slodowo-drozdzo- wych szczep Pfizer F. D. 23 604 daje zapach po¬ dobny do zapachu dzikiej cebuli lub czosnku z nieco ziemista wonia dodatkowa* natomiast szczep CBS S. hygroscopicus daje jedynie zapach zie¬ misty, przy czym o gatunku tym nigdzie nie do¬ niesiono, aby posiadal zapach dzikiej cebuli. Szczep Pfizer F. D. 23 604 gatunku S.hygroscopicus daje zwiazek 38 295, nowy eterowy antybiotyk policyk- liczny, natomiast szczep CBS gatunku S.hygrosco¬ picus nie daje go, jak równiez nie doniesiono o wytwarzaniu tego antybiotyku przez inne szczepy S.hygroscopicus.Omawiana kultura F. D. 23 604 zostala zmagazy¬ nowana w The American Type Culture Collection, Rockville, Md., i oznaczona w tym zbiorze jako ATCC 31 050.Hodowla Streptomyces hygroscopicus ATCC 31 050 najkorzystniej przebiega w srodowiskach wodnych, zawierajacych pozywke, w temperaturze 28—36°C, w zanurzeniu, w warunkach aerobowych z mieszaniem. Zawierajace pozywke srodowiska, uzyteczne do takich celów, obejmuja zródla przy¬ swajalnego wegla* takie jak cukry, skrobia i gli¬ ceryna, zródla organicznego azotu, takie jak ka¬ zeina, enzymatyczny wyciag kazeinowy, maczka sojowa, maczka z nasion bawelny, maczka z o- rzeszków ziemnych, gluten pszeniczny, maka so¬ jowa, maczka miesna i maczka rybna. Z powo¬ dzeniem mozna równiez wykorzystac zródla sub¬ stancji wzrostowych, takie jak ekstrakt z wyslod¬ ków i ekstrakt drozdzowy, jak równiez sole, ta¬ kie jak chlorek sodu i weglan wapnia oraz pier¬ wiastki sladowe, takie jak zelazo, magnez* cynk, kobalt i mangan. Jesli w czasie fermentacji poja¬ wia sie nadmiernie pienienie, wówczas w czasie fermentacji mozna do cieklego srodowiska dodac srodki przeciw pienieniu, takie jak oleje roslinne lub silikony. Szybkosc napowietrzania srodowiska w zbiorniku do hodowli w zanurzeniu wynosi ko¬ rzystnie 1/2—2 objetosci swiezego powietrza na objetosc bulionu na minute. Mieszanie mozna pro¬ wadzic za pomoca mieszadel typu, zwykle stoso¬ wanego w przemysle fermentacyjnym. W czasie przenoszenia organizmu i podczas jego wzrostu nalezy oczywiscie utrzymywac warunki aseptycz- ne.Szczepienie w celu wytworzenia antybiotyku mozna wykonac, stosujac nalot ze skosu kultury.Nalot ten mozna wykorzystac do zaszczepienia za¬ równo wstrzasanych kolb, jak i zbiorników szcze- piennych lub tez alternatywnie zbiorniki szcze- pienne mozna szczepic ze wstrzasanych kolb.Wzrost we wstrzasanych kolbach osiaga zwykle swe maksimum w ciagu 3 do 5 dni, podczas gdy zaszczepienie w zbiorniku szczepiennym w za¬ nurzeniu uzyskuje sie najkorzystniej w okresie 2 do 3 dni. Zasadnicza aktywnosc antybiotyczna u- zyskuje sie w koncowym etapie fermentacji w okresie 3 do 5 dni. Poziom antybiotyczny wynosi zwykle 50—500 mg/l.Proces wytwarzania antybiotyku dogodnie jest kontrolowac w czasie fermentacji za pomoca pró¬ by biologicznej bulionu przy zastosowaniu czulego szczepu Staphylococcus aureus lub Bacillus subtilis.Mozna tu stosowac standardowa metode próby na plytce, której strefa inhibicji wokól tarczy z pa¬ pieru filtracyjnego, nasyconego bulionem, stanowi miare mocy antybiotycznej. 60 Chromatografia cienkowarstwowa przy uzyciu zelu krzemionkowego jest uzyteczna metoda ana¬ lityczna do oznaczania antybiotyku, wytwarzanego w srodowisku fermentacyjnym i okreslenia skladu 65 surowych i oczyszczonych substancji, wyekstraho- 40 45 50 555 97 341 6 wanych z bulionów fermentacyjnych. Chromato- gramy cienkowarstwowe po rozwinieciu ich za pomoca octanu etylu spryskuje sie 3% roztworem waniliny w etanolowym roztworze kwasu siarko¬ wego /98,5—15% obj./obj./, a nastepnie ogrzewa do temperatury 60—80°C w ciagu kilku minut.Antybiotyk obserwuje sie wówczas jako jaskrawa, rózowo-czerwona plame na bialym tle.Antybiotyczny zwiazek 38 295 mozna wydzielic z wyklarowanego bulionu fermentacyjnego na dro¬ dze ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi, ta¬ kimi jak chloroform, octan etylu lub keton me- tylowoizobutylowy. Zasadnicza czesc antybiotyku zawarta jest w oddzielnej grzybni i mozna ja do¬ godnie ekstrahowac przez wytworzenie zawiesiny grzybni w rozpuszczalnym w wodzie rozpuszczal¬ niku, takim jak metanol.Korzystna metoda wydzielania i wyodrebniania antybiotycznego zwiazku 38 295 jest nastepujaca procedura: Nieprzesaczony bulion fermentacyjny ekstrahuje sie dwukrotnie 1/5—1/2 objetosci metyloizobutylo- ketonu. Ekstrakt w rozpuszczalniku zate,za sie pod obnizonym cisnieniem do oleistej pozostalosci, z której nastepnie wytwarza sie zawiesine w mie¬ szaninie chloroformu i heksanu /l:.l/ i wprowadza do kolumny, wypelnionej zelem krzemionkowym /najkorzystniej zloze zelu krzemionkowego 60, w którego górnej czesci znajduje sie warstwa zelu krzemionkowego PF254, oba zele firmy E. Merck, Darmstad, RFN/. Kolumne z zelem krzemionko¬ wym wymywa sie kolejno heksanem, mieszanina chloroformu i heksanu /1:1/ i chloroformem. Glów¬ na frakcje antybiotyku wymywa sie octanem ety¬ lu. Odciek zateza sie. pod zmniejszonym cisnie¬ niem, przenosi sie do acetonu i miesza przez okres —60 minut z weglem aktywnym /Darco G 60/.Wegiel aktywny usuwa sie na drodze filtracji, roztwór zateza sie do malej objetosci pod obnizo¬ nym cisnieniem i dodaje sie nieco wody po czym pH doprowadza sie za pomoca wodorotlenku sodu do wartosci 8,0—8,5. Nastepnie krystaliczna sub¬ stancje, oddziela sie na drodze filtracji, przemy¬ wa woda i suszy.Wyodrebniony w tym etapie antybiotyk jest mie¬ szanina soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295, u- tworzonych z jonów sodu i potasu, wystepujacych w bulionie fermentacyjnym oraz pochodzacych z doda¬ nego wodorotlenku sodowego. Chromatogramy cien¬ kowarstwowe tej substancji moga wykazywac sla¬ dowe ilosci co najmniej dwóch innych bardziej polarnych antybiotyków, które podobnie jak zwia¬ zek 38 295 daja charakterystyczna rózowo-czerwo¬ na plame po spryskaniu wanilina w etanolowym roztworze kwasu siarkowego.Zwiazek 38 295 mozna otrzymac jako pojedyncze indywiduum metoda chromatografii cienkowar¬ stwowej na zelu krzemionkowym PF254 przy uzy¬ ciu heksanu. Mieszanine soli sodowej i potasowej dodaje sie w postaci roztworu w chloroformie lub octanie etylu i kolumne pod cisnieniem 5,6 atm wymywa sie heksanem, zawierajacym wzrastaja¬ ca ilosc octanu etylu. Postep rozdzialu obserwuje sie metoda chromatografii cienkowarstwowej. Od¬ powiednie frakcje laczy sie, odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem i uzyskany antybiotyk krystalizuje z mieszaniny acetonu i wody.Zwiazek 38 295 w postaci wolnego kwasu moz¬ na otrzymac z mieszaniny soli sodowej i potaso- wej przez doprowadzenie pH w roztworze octanu etylu lub chloroformu do wartosci 4,5 za pomoca rozcienczonego kwasu fosforowego. Warstwe orga¬ niczna suszy sie bezwodnym siarczanem sodu, od¬ parowuje pod zmniejszonym cisnieniem, a pozosta¬ lo losc krystalizuje z mieszaniny chloroformu i hek¬ sanu.Sól sodowa zwiazku 38 295 mozna wytworzyc przez doprowadzenie pH roztworu wolnego kwasu w octanie etylu lub w chloroformie do wartosci 8,5 za pomoca roztworu wodorotlenku sodu /In/.Substancje krystalizuje sie z mieszaniny acetonu i wody. Krystaliczna sól potasowa otrzymuje sie analogicznie, stosujac wodorotlenek potasowy za¬ miast NaOH.Krystaliczna sól srebrowa mozna wytworzyc przez dodanie wodnego roztworu azotanu sodu do alkoholowego roztworu mieszaniny soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295. Innymi, dajacymi sie latwo wytworzyc zwiazkami sa sole miedzi* cynku, amonu, wapnia, magnezu i litu zwiazku 38 295.W przypadku zamierzonego stosowania otrzyma¬ nego produktu jako srodka zapobiegajacego i le¬ czacego kokcydioze u drobiu, caly bulion fermen¬ tacyjny, zawierajacy zwiazek 38 295, mozna wysu- szyc calkowicie /korzystnie metoda rozpylowego suszenia /i domieszac do pokarmu dla drobiu w ilosci, dajacej pozadany poziom mocy antybiotycznej Zwiazek 38 295 wykazuje dzialanie inhibitujace przeciwko wzrostowi licznych mikroorganizmów /tablica 1/. Testowe bakterie szczepi sie w szere¬ gu próbek, zawierajacych srodowisko z pozywka i rózne stezenia zwiazku 38 295 celem okreslenia minimalnego stezenia, wyrazonego w mikrogra- mach antybiotyku na mililitr, które inhibituje 40 wzrost organizmu w ciagu 24 godzin.Tablica 1 Organizm Staph. aureus 01A005 01A052 01A109 01A110 01A400 Strep. faecalis Strep. pyogenes Neisseria sicca Bacillus subtilis Lactobacillus casei var casei Lactobacillus catenaforme Clostridium innocuum Clostridium bifermentans Treponema hyodysenterif.e IZwiazek 138295 /mieszanina sól/ NaK ^78 0,78 0,78 0,39 0,39 0,20 <0,10 <0,10 <0,10 1,56 0*78 0,20 0,78 0,39 Zwiazek 33 295 /wolny kwas/ ^39 3,12 0,78 1,56 1,56 1,58 <0,10 <0,10 <0,10 —¦ —1 —{ — —97 341 Zwiazek 38 295 i jego sole wykazuja doskonala aktywnosc przeciwko zakazeniu kokcydioza u dro¬ biu. Przy zmieszaniu z pokarmem dla kurczat w ilosci 15—250 ppm zwiazki te sa efektywne w za¬ pobieganiu zakazeniu tymi organizmami.Dane, dotyczace efektywnosci zwiazku 38 295 i jego soli przeciwko zakazeniu kokcydioza u kur¬ czat, uzyskano w nastepujacy sposób. Grupy 3—5 sztuk 10 dniowych kogutków rasy bialej leghorn karmiono sruta, zawierajaca zwiazek 38 295 lub jedna z jego soli dokladnie wymieszanej z pokar¬ mem. Po 24 godzinach takiej diety kazde kurcze bylo szczepione doustnie za pomoca oocyst poszcze¬ gólnych gatunków badanych organizmów Einieria.Inne grupy kurczat karmionych pozbawiona anty¬ biotyków dieta srutowa byly zakazone w podobny sposób i sluzyly jako zakazone grupy kontrolne.Niezakazone i nieleczone kurczeta sluzyly jako nor- • walne grupy kontrolne. Wyniki leczenia oceniano po 5 dniach w przypadku E.acrevulina i po 6 dniach dla innych gatunków Eimeria.W tablicy 2 przedstawiono wyniki, uzyskane dla mieszaniny soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295.Tablica 2 Zakazenie gatunkiem Eimeria tonella Eimeria acervulina Eimeria necatrix Eimera | maxima Dawka /ppm/ ,250 J125 60 3,0 ;250 125 160 45 ¦ 250 J125 '60 ,250 1215 60 45 Sredni stopien * zakazenia 0,0 0,0 0,7 1.7 2,7 0,0 0,2 0,0 0,4 1,2 2,0 0,0 0,2 ^ 0,2 0,0 0,0 0,4 0,6 0,8 1,8 .Stosunek */ 0,0 0,0 0,211 0,54 0,86 0,0 0,1 0,0 0,2 0,6 1,6 0,0 0,13 0,13 0,0 0,0 i 0,25 0,33 0,44 0,68- */ Kryteria, stosowane do oceny aktywnosci prze¬ ciw kokcydiozie, polegaja na ocenie uszkodzen od 0 do 4 dla E.tenella /J. E. Lynch, Am. J.Vet. Res. 22:324—326, 1961/ i 0 do 3 dla innych gatunków /J. Johnson i W—H, Reid, Exp.Parasit./ 28:30—36, 1970/. W wyniku podzielenia oceny uszkodzen dla kazdej z leczonych grup przez ocene uszkodzen zakazonych zwierzat kon¬ trolnych uzyskuje sie staly stosunek.**/ Pierwsza liczba odnosi sie do uszkodzen jelit, a druga do uszkodzen katnicy. 40 45 50 55 Zakazenie gatunkiem Eimera brunetti Zakazenie mieszane /Coccivac D, Sterwine, Labora¬ tories, Opelika, Alabama./ Dawka /ppm/ 250 125 60 45 250 a'25 00 50 40 Sredni Stopien* zakazenia 0,4 0,4 0,8 1,2 1,6 1,6 0,0, 0,0 **/ 0,2, 0,4 0,2, 0,0 1,0, 0,6 1,2, 1,0 2,8, 2,0 Stosunek*/ o,o, 0,08, 0,08, 0,38, 0,48, 0,85, 0,22 0,44 0,22 0,53 0,88 0,88 0,0 0,18 0,0 0,21 0,35 0,71 Podobne wyniki uzyskac mozna z wolnym kwa¬ sem, sola sodowa, sola potasowa lub wysuszonym srodowiskiem fermentacyjnym, zawierajacym zwia¬ zek 38 295 w stosunku, dajacym pozadany poziom aktywnosci antybiotycznej.Promotowanie wzrostu przez zwiazek 38 295 wy¬ kazano w nastepujacych próbach z bydlem.Cieleta rasy Angus Heifer byly w sposób losowy umieszczane w przegrodach po 5 cielat w prze¬ grodzie i podawano im zwiazek 38 295 doustnie, przez wole, w wodzie pitnej itd. Zwiazek dawko¬ wano w oparciu o jego aktywnosc, podajac go w postaci kompozycji paszowej o duzej zawartosci substancji wlóknistych w ilosci 11—33 ppm. Zwia¬ zek 38 295 moze byc w róznych formach, takich jak wolny kwas, sól sodowa, sól potasowa, mie¬ szanina soli sodowej i potasowej lub suszony bulion fermentacyjny, wytworzony przez Streptomyces hygroscopicus ATCC 31 050.Pasze bez leków -i pasze, zawierajaca zwiazek 38 295, podawano badanym zwierzetom do syta.Pasza zawierala 12,5% protein i miala stosunek skladników tresciwych do skladników objetoscio¬ wych 75:25, przy czym zawierala kukurydze, macz¬ ke sojowa, maczke z lucerny, fosforan wapnia, melase,, witaminy i mineraly sladowe. Zwiazek 38 295 zawarty byl w premiksie wraz z mielona kukurydza, mineralami i witaminami.Karma podstawowa /l2,5% protein — 75:25 skladników tresciwych do objetosciowych/ Skladnik Procent Kukurydza mielona 55,6 Maczka sojowa, 48% protein 6,3 Maczka z lucerny, 17*/o protein 25,0 Suszona melasa*/ 10,0 Olej sojowy . 2,0 Fosforan dwuwapniowy /24°/o Ca, 18,5%P/ 0,4097 341 Sól z mineralami sladowymi **/ Premiks witaminowo-mineralny ***/ 0,50 0,20 */ Melasa z trzciny cukrowej na nosniku z ka¬ czanów kukurydzy: nie mniej niz 3% surowych protein, nie wiecej niz 15°/o materialu wlók¬ nistego* nie mniej niz 42% obojetnego cukru i maksimum -S°/o wody.**/ Nadajac nastepujace stezenie mineralów sla¬ dowych /ppm/ mangan-10, zelazo-8,25, miedz- -1,25, jod-0,025, kobalt-0,86, cynk-45.***/ Nadajac nastepujaca zawartosc witamin na 1 kg karmy: witamina A-3327 jedn, witamina D-444 jedn, witamina E-58 jedn.Premiks Skladnik Ilosc /1,8 kg/ Koncentrat witaminy A /30 000 jedn/g/ 0,1 kg Koncentrat witaminy D3/200 000 jedn/g/ 2,00 g Koncentrat witaminy E /278 000 jedn/kg/ 018 kg Tlenek cynku /79,4 Weglan kobaltowy /45°/o Co/ -1,70 g Sruta sojowa lub drobno mielone kaczany kukurydzy 1,47 kg Zwiazek 38295 40,0 g Premiks w ilosci 0,45 kg na 1 t paszy daje osta¬ tecznie stezenie zwiazku 38 295 równe 11 ppm.W tablicy 3 przedstawiono wyniki 28-dniowego testu w odniesieniu do trzech takich samych za¬ gród, z których kazda zawierala 5 cielat. Przybli¬ zona poczatkowa waga kazdego cielecia wynosila 180 kg.Zasadniczo takie same wyniki mozna uzyskac przy zastosowaniu czystego kwasu, soli sodowej, Przyklad I. Przygotowano sterylne wodne srodowisko o nastepujacym skladzie: Gramy/litr Glukoza 10,0 Rozpuszczalna skrobia 20,0 Ekstrakt drozdzowy 5,0 Enzymatyczny wyciag z kazeiny 5,0 Maczka mie,sna 5,0 CaC03 1,0 pH=7,0 Komórki nalotu plesniowego Streptomyces hy- groscopicus ATCC 31 050 przeniesiono do szeregu kolb o pojemnosci 300 ml, z których kazda za¬ wierala 50 ml sterylnego srodowiska. Kolby te wstrzasano na obrotowej wytrzasarce w ciagu 3 dni w temperaturze 28—30°C. Porcje po 5 ml ho¬ dowanego w ten sposób szczepu przeniesiono w warunkach aseptycznych do 300 ml kolb, zawiera¬ jacych 100 ml opisanego wyzej sterylnego srodo¬ wiska. Po wytrzasaniu przez 3—4 dni w tempera¬ turze -28—30°C wzrastajacy szczep przeniesiono do tanków fermentacyjnych o pojemnosci 4 1» za¬ wierajacych 2 1 sterylnego srodowiska o nastepu¬ jacym skladzie: Gramy/litr Glukoza Skrobia kukurydziana Maczka sojowa Ekstrakt z wyslodków gorzelnianych NaCl CaCOg pH=6,6 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 1,0 Tablica 3 Mieszanina soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295 Dawka Kontrolna zwiazek 38 2:95 | /li ppm/ 1 Zwiazek 33 295 /zwiazek 33 ppm/ iSDPW */ kg ; wskaznik 1,03 1,09 100,0 110,6 118,9 SDDP **/ kg 8,39 '8,08 ,58 wskaznik ,0,0 95,1 87,3 Pasza/Przyrost ***/ stosunek 6,95 ,94 ,1.-1 wskaznik 100,0 117,0 1136,0 */ Sredni dzienny przyrost wagi.**/ Srednia dzienna dawka pokarmu.***/ Ilosc paszy /kg/ na 1 kg przyrostu wagi. soli potasowej lub wysuszonego bulionu fermen¬ tacyjnego, zawierajacego zwiazek 38 295.Porównywalne wyniki mozna uzyskac dla innych zwierzat przezuwajacych, takich jak owce, lub zwierzat jednozoladkowych, takich jak konie, swi¬ nie lub króliki.Zwiazek 38 295 mozna podawac w paszy w wo¬ dzie pitnej lub w postaci premiksu, stosowanego do mieszania z pasza lub woda pitna. Ciekly pre¬ miks, zawierajacy antybiotyk w postaci koncen¬ tratu, przeznaczonego do dodawania do wody pit¬ nej, zwieksza wydajnoc paszowa zwierzat. Pre¬ miks taki mozna przygotowac w odpowiednim ste¬ zeniu przez rozpuszczenie zwiazku 38 295 w odpo¬ wiednim rozpuszczalniku, takim jak etanol lub gli¬ kol propylenowy. 50 55 60 Fermentacje prowadzono przez 90—120 godz. w temperaturze 28—30°C, mieszajac z . szybkoscia 1700 obr./min. i napowietrzajac z szybkoscia jed¬ nej objetosci powietrza na objetosc bulionu na mi¬ nute. Duze tanki fermentacyjne, zawierajace 300— —38 000 1 srodowiska, mozna szczepic przy uzyciu okolo 2% tego nalotu. Fermentacje prowadzi sie az do uzyskania mocy antybiotycznej co najmniej 50 mg/l /90—120 godz./. 100 1 calego nieprzefiltrowanego bulionu fermen¬ tacyjnego ekstrahowano dwukrotnie 1/5 objetosci ketonu metylowoizobutylowego. Oddzielony ek¬ strakt rozpuszczalnikowy zatezano pod zmniejszo¬ nym cisnieniem do oleistej pozostalosci /769 g/, która dyspergowano na zelu krzemionkowym przez dodanie pozostalosci rozpuszczonej w 2 1 chloro-97 341 li 12 formu na 1 kg zelu krzemionkowego PF254, a na¬ stepnie usunieto rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana pozostalosc wymieszano z 2 1 mieszaniny chloroformu z heksanem /1:1/ i dodano do zloza 300 g zelu krzemionkowego 60, na wierzchu którego znajdowala sie warstwa 300 g zelu krzemionkowego PF254.Zel krzemionkowy przemywano nastepnie sukce¬ sywnie 75 1 heksanu, 7,5 1 mieszaniny chlorofor¬ my z heksanem /1:1/ i 7,5 1 chloroformu. Antybio¬ tyk eluowano nastepnie 3,8 1 octanu etylu. Octan etylu usunieto pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc /38 g/ rozpuszczono w 400 ml acetonu.Roztwór acetonowy energicznie mieszano w tem¬ peraturze pokojowej przez okolo 45 min z 40 g wegla aktywnego /Darco G 60/. Calosc przesaczo¬ no, a nastepnie zatezono do objetosci okolo 200 ml i rozcienczono 100 ml wody. Zwiazek 38 295 wy¬ dziela sie w postaci soli sodowej i potasowej po doprowadzeniu pH roztworu do wartosci 8,5 za pomoca 1,0 n NaOH. Krystaliczna substancje /.13,8 g/ rozpuszczono w octanie etylu i poddano chro¬ matografii na kolumnie z zelem krzemionkowym PF254 przy uzyciu heksanu. Chromatogram rozwi¬ jano pod cisnieniem 5,6 atm za pomoca heksanu, zawierajacego stopniowo wzrastajaca ilosc octanu elylu. Postep rozdzialu kontrolowano metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej. Odpowiednie frakcje polaczono, odparowano pod zmniejszonym cisnie¬ niem, a czysty zwiazek krystalizowano z miesza¬ niny acetonu z woda.Czysta, krystaliczna mieszanina soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295 ma temperature topnie¬ nia 200°C i aktywnosc optyczna [a]D25=+36° przy stezeniu 1% w metanolu. Analiza elementarna pro¬ duktu po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnie¬ niem w ciagu nocy w temperaturze 70°C piecio¬ tlenkiem fosforu wykazala srednia zawartosc wegla 60,58% i wodoru 8,56%.Zwiazek jest rozpuszczalny w metanolu* etanolu, acetonie, chloroformie, chlorku metylenu, eterze etylowym, octanie etylu i ketonie metylowo-izo- butylowym, a czesciowo rozpuszczalny w heksanie i nierozpuszczalny w wodzie.Mieszanina soli sodowej i potasowej zwiazku 38 295 nie posiada charakterystycznego widma ab¬ orcyjnego w nadfioletowym zakresie promienie- wijpia. widmo w podczerwieni mieszaniny soli sodo¬ wej i potasowej zwiazku 38 295 przedstawiono na zalaczonym rysunku, fig. 1. Przy uzyciu plytki KBr stwierdzono obecnosc charakterystycznych pasm absorpcyjnych w podczerwieni przy nastepujacych dlugosciach fal, w mikronach: 2,92; 3,40; 6,27; 6,85; 7,22; 8,40; 9,00; 9,15; 9,25; 9,48; 9,98; 10,45; 10,68 i 11,45.Przyklad II. Powtórzono operacje z przy¬ kladu I, stosujac klarowny bulion fermentacyjny, zamiast calkowicie nieprzesaczanego bulionu fer¬ mentacyjnego.Przyklad III. Grzybnie oddzielona ze skla¬ rowanego bulionu fermentacyjnego z przykladu II rozrabiano wielokrotnie w metanolu, a ekstrakt metanolowy zatezano pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc przerabiano zgodnie z przykladem I.Przyklad IV. Powtórzono proces fermenta¬ cyjny z przykladu I, stosujac srodowisko fermen¬ tacyjne o nastepujacym skladzie: Gramy/litr Glukoza 20,0 Skrobia kukurydziana 10,0 Maka sojowa 10,0 Ekstrakty z wyslodków gorzelnianych 5,0 Fe2/S04/3 0,2 MnCl2 0,2 CaC03 1.0 NaCl 5,0 Oleinian metylu 2,0 Olej sojowy 2,0 pH=6,6—6,7 Na koniec procesu fermentacyjnego caly, nie- przesaczony bulion fermentacyjny wysuszono me¬ toda rozpylowa.Przyklad V. Mieszanine soli sodowej i po- tasowej zwiazku 38 295 rozpuszczono w octanie etylu i pH roztworu doprowadzono do wartosci 4,5 za pomoca rozcienczonego kwasu fosforowego.Warstwe rozpuszczalnikowa wysuszono bezwodnym siarczanem sodu, odparowano do sucha, a pozo- stalosc krystalizowano z mieszaniny chloroformu z heksanem, otrzymujac krystaliczny kwas o tem¬ peraturze topnienia 135—1380C i aktywnosci otycz- nej [a]25D=+ 38° przy stezeniu l°/o w roztworze metanolowym. Po wysuszeniu w ciagu nocy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 70°C pie¬ ciotlenkiem fosforu analiza elementarna zwiazku wykazala zawartosc 61,65% wegla, 8,94% wodoru i 29,41% tlenu /z róznicy bilansowej/. Zwiazek 38 295 w postaci wolnego kwasu nie posiada cha- rakterystycznego widma absorpcyjnego w nadfio¬ lecie.Widmo w podczerwieni zwiazku 38 295 w posta¬ ci wolnego kwasu przedstawiono na rysunku, fig. 2.Przy uzyciu plytki KBr stwierdzono obecnosc cha- 40 rakterystycznych pasm absorpcyjnych w podczer¬ wieni przy nastepujacych dlugosciach fal, w mi¬ kronach: 2,92; 3,43; 5,74; 6,85; 7,25; 8,28; 8,60; 8,80; 9,00; 9,18; 9,80; 10,10; 10,45; 10,68; 10,92; i 11,13.Rentgenowska analiza krystalicznej soli srebro- 45 wej zwiazku 38 295 pozwolila na ustalenie budowy zwiazku, która mozna przedstawic strukturalnym wzorem, przedstawionym na rysunku.Przyklad VI. Sól sodowa zwiazku 38 295 o- trzymano przez dodanie 1 n roztwór NaOH do 50 roztworu wolnego kwasu, otrzymanego w przykla¬ dzie V, w octanie etylu, az do osiagniecia war¬ tosci pH~8,5. Substancja wykrystalizowana z mie¬ szaniny acetonu z woda miala temperature top¬ nienia 197—198°C i aktywnosc optyczna [a]D25 = 55 = + 38° przy stezeniu 1,03% w roztworze metano¬ lowym. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnie¬ niem w ciagu nocy, w temperaturze 70°C, piecio¬ tlenkiem fosforu, sól sodowa zawierala 60,28% wegla i 8,76% wodoru.Widmo w podczerwieni soli sodowej zwiazku 38 295 przedstawiono na zalaczonym rysunku fig. 3.Przy uzyciu plytki KBr stwierdzono obecnosc cha¬ rakterystycznych pasm absorpcyjnych w podczer- 65 wieni przy nastepujacych dlugosciach fal, w mi- 6013 97 341 14 kronach: 2,94; 3,42; 6,27; 6,84; 7,20; 8,75; 9,00; 9,14; 9,30; 9,45; 10,45; 10,92; 11,15; i 1.1,47.Przyklad VII. Sól potasowa zwiazku 38 295 wytworzono metoda, opisana w przykladzie VI, sto¬ sujac wodorotlenek potasu zamiast wodorotlenku sodu. Substancja wykrystalizowana z mieszaniny acetonu z woda miala temperature topnienia 196— —198°C i aktywnosc optyczna [a]D25=38° przy ste¬ zeniu 1,02% w roztworze metanolowym. Po wy¬ suszeniu pod zmniejszonym cisnieniem w ciagu nocy, w temperaturze 70°C, pieciotlenkiem fosfo¬ ru, zwiazek zawieral 60,58% wegla i 8,0% wodoru.Widmo w podczerwieni soli potasowej zwiazku 33 295 przedstawiono- na zalaczonym rysunku, fig. 4. Przy uzyciu plytki KBr stwierdzono obecnosc charakterystycznych pasm absorpcyjnych w pod¬ czerwieni przy nastepujacych dlugosciach fal, w mikronach: 2,94; 3,42; 6,27; 6,84; 7,20; 8,75; 9,00; 9,14; 9,30; 9,45; 10,45; 10,92; lil,15; i 11,47.Przyklad VIII. Sól srebrowa zwiazku 38295 wytworzono przez dodanie wodnego roztworu azo¬ tanu srebra do etanolowego roztworu mieszaniny soli sodowej i potasowej, otrzymanych w przy¬ kladzie I. Wydzielone cialo stale krystalizowano z metanolu, otrzymujac produkt o temperaturze top¬ nienia 138—200°C i aktywnosci optycznej [a]D25= = +¦27°, przy stezeniu 0,982% w roztworze meta¬ nolowym. Sredni sklad próbki, wysuszonej w cia¬ gu nocy pod zmniejszonym cisnieniem, w tempe¬ raturze 70°C pieciotlenkiem^ fosforu, wynosil 55,95% wegla i 7,82—7,89% wodoru. Ciezar czasteczkowy krystalicznej soli srebrowej zwiazku 38 295, okres¬ lony z danych rentgenowskich wynosi 10'60±4. PL PL PL PL PL PL PL PL The subject of the invention is a method for producing a new antibiotic compound 38,295, belonging to the group of acidic polycyclic ethers. This class of compounds can be characterized biologically by their effect on the transfer of cations in mitochondria. This family of antibiotics includes monensin, (J. American Chem.Soc, 89:5737, 1967/, nigericine /Biochem. Biophys.Res. Comm., 33:20, 1908/, gryrixin /J. Chem. iSoc. Chem. Commun., 1421 1970/, dianemycyne /J. Antibiotics, 22:161, 1969/, salinomycin /J. Antibiotics, 27:814, 1974/ X-537 A /J. Chem. Soc. Chem. Commun., 967, 19712/, X-206 /J. Chem. Soc. Chem. Commun., 927, 1971/ and A204 A /J. Amer. Chem. Soc, 95:3399, 1973/. The above-mentioned polycyclic ether antibiotics are active against Gram-positive bacteria, fungi and protozoa. They exhibit potential activity against coccidiosis. United States Patent No. 3,839,557 describes a method for improving the utilization of feed by ruminant and monogastric animals fed with fibrous plant material while simultaneously administering monensin, dianemycin, nigericin or other polycyclic ether antibiotics. The invention relates to a method for producing the antibiotic compound 38,295 of the formula shown in the drawing. The antibiotic is produced by culturing Streptomyces hygroscopicus ATCC 31,050 in an aqueous medium containing a nutrient medium under aerobic conditions in submersion. The antibiotic and its cationic salts are potent antimicrobial agents and are also effective anticoccidial agents and animal growth promoters. The microorganism used to produce the antibiotic by the method of the invention was isolated from a soil sample from Japan. It was grown in many different media used for the identification of this species and was found to be quite similar to Streptomyces hygroscopicus. The Pfizer culture F. D. 23 604 was compared in many respects in different media with the culture Streptomyces hygroscopicus 48 248, obtained from the Dutch museum strain collection, Central bureau voor Schimmelcultures /CBS/. The comparison and identification were made on the basis of the species concept, as described in Applied Microbiology, 4:243-250, 1956. The comparison of the two cultures mentioned was as follows: Morphology of the spore chain — the chains of the Pfizer F. D. 23 604 culture, in the form of spirals with 6-10 turns or less in different environments, resembled the chains of Streptomyces hygroscopicus CBS. The spores of Pfizer F. D. 23 604 examined by selective electron electroscopy appeared exactly the same as the spores of strain 97 341 97 341 3 CBS S. hygroscopicus* presented in Applied Microbiology, 18:659—896, 1969, where the spores were described as having a corrugated surface composed of numerous depressions separated by ridges of substance constituting the spore walls. Stained sections of spores from both cultures appeared identical. Colony color—the aerial mycelium was gray in most environments, but the exact shade was slightly different for the two cultures. Pfizer F. D. 23604 on Czapka sucrose agar produced a thick, irregularly undulating grayish-white deposit, the shoot was flat, thin, and gray. Pfizer F. D. 23604 on acorn meal agar after 4 weeks of incubation produced a yellow deposit on previously gray agar. On agar with yeast extract and malt extract, Pfizer F. D. 23 604 gave yellow spots on the gray substance of the mycelium. Formation of melamine - none of the cultures formed melanin on peptone-iron agar. Use of carbon - /method of Pfidham and Gotlieb J. Bact., 56:107-114/, Pfizer F. D. 23 604 strain uses glucose, L-arabinose, dextrin, D-fructose, D/+/galactose, glycerin, inositol, inuline, lactose, maltose, D-mannitol, salicine, raffinose, rhamnose, sodium acetate, D-sorbitol, sorbose, starch, sucrose, trehalose and D-xylose, but dulcitol was not used. These results are consistent with those reported for the S. hygroscopicus strain in Applied Microbiology, 15:637-639, 1967, and for the CBS strain of S. hygroscopicus in Industrial Microbiology, 10:183-221, 1969, except that the CBS strain did not utilize inositol. H2S Production: Both cultures gave positive results on peptone-iron agar slants with lead acetate bands. Milk: Similar results were obtained for both cultures: no coagulation, complete or nearly complete hydrolysis within 12 days, brown soluble pigment. Gelatin: Both cultures were similar in growth, color, and moderate rate. liquefaction. Special characteristics — the CBS strain of S. hygroscopicus gives black, hygroscopic surfaces within 3 weeks on glucose-aspartate agar, acorn meal agar and malt yeast extract agar, while the Pfizer F. D. 23 604 strain shows black spots only on malt yeast extract agar. Further incubation for a week and storage of the cultures in Petri dishes at 4-10°C for the fourth week causes an increase in the redness of the Pfizer F. D. 23 604 strain. On acorn meal agar, Czapek's sucrose agar and malt yeast extract agar, the Pfizer F. D. 23 604 has an odour similar to that of wild onion or garlic with a slightly earthy additional odour*, while the CBS S. hygroscopicus strain has only an earthy odour, and this species has not been reported to have a wild onion odour. The Pfizer strain F. D. 23604 of S. hygroscopicus produces compound 38295, a new polycyclic ether antibiotic, whereas the CBS strain of S. hygroscopicus does not, and no other strains of S. hygroscopicus have been reported to produce this antibiotic. The culture of F. D. 23604 in question has been deposited at The American Type Culture Collection, Rockville, Md., and designated in that collection as ATCC 31050. Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 is grown most favorably in aqueous media containing a nutrient medium at a temperature of 28-36°C, in submerged conditions, under aerobic conditions with stirring. Nutrient-containing media useful for such purposes include sources of available carbon* such as sugars, starch, and glycerin; sources of organic nitrogen such as casein, enzymatic casein extract, soybean meal, cottonseed meal, peanut meal, wheat gluten, soy flour, meat meal, and fish meal. Growth factor sources such as pulp extract and yeast extract have also been used successfully, as have salts such as sodium chloride and calcium carbonate; and trace elements such as iron, magnesium, zinc, cobalt, and manganese. If excessive foaming occurs during fermentation, antifoaming agents such as vegetable oils or silicones can be added to the liquid medium during fermentation. The aeration rate in the submerged culture tank is preferably 1/2 to 2 volumes of fresh air per volume of broth per minute. Mixing can be accomplished using agitators of the type commonly used in the fermentation industry. Aseptic conditions must, of course, be maintained during transfer of the organism and during its growth. Inoculation to produce the antibiotic can be performed using a slant culture. This slant can be used to inoculate both shake flasks and inoculation tanks, or alternatively, inoculation tanks can be inoculated from shake flasks. Growth in shake flasks usually reaches its maximum within 3 to 5 days, while inoculation in a submerged inoculation tank is most preferably achieved within 2 to 3 days. Substantial antibiotic activity is achieved in the final stage of fermentation within 3 to 5 days. The antibiotic level is usually 50-500 mg/l. The antibiotic production process is conveniently monitored during fermentation by a broth bioassay using a sensitive strain of Staphylococcus aureus or Bacillus subtilis. This can be done by using a standard plate assay method, where the zone of inhibition around a filter paper disc impregnated with broth provides a measure of antibiotic potency. 60 Thin-layer chromatography using silica gel is a useful analytical method for determining the antibiotic produced in the fermentation medium and for determining the composition of crude and purified substances extracted from fermentation broths. Thin-layer chromatograms, after developing with ethyl acetate, are sprayed with a 3% solution of vanillin in ethanolic sulfuric acid (98.5-15% v/v) and then heated to 60-80°C for a few minutes. The antibiotic is then observed as a bright pink-red spot on a white background. Antibiotic compound 38,295 can be isolated from the clarified fermentation broth by extraction with organic solvents such as chloroform, ethyl acetate, or methyl isobutyl ketone. The bulk of the antibiotic is contained within the separate mycelium and can be conveniently extracted by suspending the mycelium in a water-soluble solvent such as methanol. A preferred method for isolating and isolating antibiotic compound 38,295 is as follows: The unfiltered fermentation broth is extracted twice with 1/5 to 1/2 volume of methyl isobutyl ketone. The solvent extract is concentrated under reduced pressure to an oily residue, which is then suspended in a mixture of chloroform and hexane (1:1) and introduced into a column packed with silica gel (preferably a bed of silica gel 60, the upper part of which contains a layer of PF254 silica gel, both from E. Merck, Darmstadt, Germany). The silica gel column is eluted successively with hexane, a mixture of chloroform and hexane (1:1), and chloroform. The main antibiotic fraction is eluted with ethyl acetate. The effluent is concentrated. under reduced pressure, transferred to acetone and stirred for 60 minutes with activated carbon (Darco G 60). The activated carbon is removed by filtration, the solution is concentrated to a small volume under reduced pressure, and some water is added, after which the pH is adjusted to 8.0-8.5 with sodium hydroxide. The crystalline substance is then separated by filtration, washed with water, and dried. The antibiotic isolated at this stage is a mixture of the sodium and potassium salts of compound 38295, formed from the sodium and potassium ions present in the fermentation broth and derived from the added sodium hydroxide. Thin-layer chromatograms of this substance may show trace amounts of at least two other more polar antibiotics, which, like compound 38295, produce a characteristic pink-red spot when sprayed with vanillin in ethanolic sulfuric acid. Compound 38295 can be obtained as a single entity by thin-layer chromatography on PF254 silica gel using hexane. The sodium and potassium salt mixture is added as a solution in chloroform or ethyl acetate, and the column is eluted at 5.6 atm with hexane containing increasing amounts of ethyl acetate. The progress of the separation is monitored by thin-layer chromatography. The appropriate fractions are combined, evaporated under reduced pressure and the resulting antibiotic is crystallized from a mixture of acetone and water. Compound 38,295 in the form of the free acid can be obtained from a mixture of the sodium and potassium salts by adjusting the pH in an ethyl acetate or chloroform solution to 4.5 with dilute phosphoric acid. The organic layer is dried over anhydrous sodium sulfate, evaporated under reduced pressure, and the residue is crystallized from a mixture of chloroform and hexane. The sodium salt of compound 38,295 can be prepared by adjusting the pH of a solution of the free acid in ethyl acetate or chloroform to 8.5 with sodium hydroxide solution (1N). The substance is crystallized from a mixture of acetone and water. The crystalline potassium salt is prepared analogously using potassium hydroxide instead of NaOH. The crystalline silver salt can be prepared by adding an aqueous solution of sodium nitrate to an alcoholic solution of a mixture of the sodium and potassium salts of compound 38295. Other compounds which can be readily prepared are the copper, zinc, ammonium, calcium, magnesium and lithium salts of compound 38295. In the event of the intended use of the obtained product as a preventive and curative agent for coccidiosis in poultry, the entire fermentation broth containing compound 38295 can be dried completely (preferably by spray drying) and mixed with poultry feed in an amount which gives the desired level of antibiotic potency. Compound 38295 has an inhibitory effect against the growth of coccidiosis in poultry. numerous microorganisms /Table 1/. The test bacteria are inoculated in a series of samples containing a nutrient medium and various concentrations of compound 38295 in order to determine the minimum concentration, expressed in micrograms of antibiotic per milliliter, which inhibits the growth of the organism within 24 hours. Table 1 Organism Staph. aureus 01A005 01A052 01A109 01A110 01A400 Strep. faecalis Strep. pyogenes Neisseria sicca Bacillus subtilis Lactobacillus casei var casei Lactobacillus catenaforme Clostridium innocuum Clostridium bifermentans Treponema hyodysenterif.e Compound 138295 /salt mixture/ NaK ^78 0.78 0.78 0.39 0.39 0.20 <0.10 <0.10 <0.10 1.56 0*78 0.20 0.78 0.39 Compound 33295 /free acid/ ^39 3.12 0.78 1.56 1.56 1.58 <0.10 <0.10 <0.10 —¦ —1 —{ — —97 341 Compound 38295 and its salts show excellent activity against coccidiosis infection in poultry. When mixed with chicken feed at 15-250 ppm, these compounds are effective in preventing infection with these organisms. Data on the effectiveness of compound 38295 and its salts against coccidiosis infection in chickens were obtained as follows. Groups of 3-5 10-day-old White Leghorn roosters were fed meal containing compound 38295 or one of its salts thoroughly mixed with the feed. After 24 hours of this diet, each chicken was orally vaccinated with oocysts of the individual Eimeria species tested. Other groups of chickens fed an antibiotic-free meal diet were infected in a similar manner and served as infected controls. Uninfected and untreated chickens served as normal controls. Treatment results were assessed after 5 days for E. acrevulina and after 6 days for the other Eimeria species. Table 2 presents the results obtained for the mixture of the sodium and potassium salts of compound 38295. Table 2 Infection with Eimeria tonella Eimeria acervulina Eimeria necatrix Eimera | maxima Dose /ppm/ ,250 J125 60 3,0 ;250 125 160 45 ¦ 250 J125 '60 ,250 1215 60 45 Average degree * of infection 0,0 0,0 0,7 1.7 2,7 0,0 0,2 0,0 0,4 1,2 2,0 0,0 0,2 ^ 0,2 0,0 0,0 0,4 0,6 0,8 1,8 . Ratio */ 0,0 0,0 0,211 0,54 0,86 0,0 0,1 0,0 0,2 0,6 1,6 0,0 0,13 0,13 0,0 0,0 i 0.25 0.33 0.44 0.68- */ The criteria used to evaluate anticoccidial activity are a lesion score of 0 to 4 for E. tenella (J. E. Lynch, Am. J. Vet. Res. 22:324—326, 1961) and 0 to 3 for other species (J. Johnson and W. H. Reid, Exp. Parasit. 28:30—36, 1970). Dividing the lesion score for each treated group by the lesion score for the infected control animals produces a constant ratio.**/ The first number refers to intestinal lesions and the second to caecal lesions. 40 45 50 55 Eimera brunetti infection Mixed infection /Coccivac D, Sterwine, Laboratories, Opelika, Alabama./ Dose (ppm) 250 125 60 45 250 a'25 00 50 40 Average Infection Rate* 0.4 0.4 0.8 1.2 1.6 1.6 0.0, 0.0 **/ 0.2, 0.4 0.2, 0.0 1.0, 0.6 1.2, 1.0 2.8, 2.0 Ratio*/ o,o, 0.08, 0.08, 0.38, 0.48, 0.85, 0.22 0.44 0.22 0.53 0.88 0.88 0.0 0.18 0.0 0.21 0.35 0.71 Similar results can be obtained with the free acid, sodium salt, potassium salt or dried fermentation medium containing compound 38295 in a ratio that gives the desired level of antibiotic activity. The growth promotion of compound 38295 was demonstrated in the following trials with cattle. Angus Heifer calves were randomly placed in stalls of 5 calves per stall and given compound 38295 orally, via the crop, in the drinking water, etc. The compound was dosed based on its activity, administered in the form of a high-fiber feed composition at a rate of 11-33 ppm. Compound 38295 may be in various forms, such as the free acid, sodium salt, potassium salt, a mixture of sodium and potassium salts, or dried fermentation broth produced by Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050. Unmedicated feeds and feeds containing compound 38295 were fed to the test animals on a full diet. The feed contained 12.5% protein and had a 75:25 nutrient to volume ratio and contained corn, soybean meal, alfalfa meal, calcium phosphate, molasses, vitamins, and trace minerals. Compound 38295 was contained in the premix together with ground corn, minerals and vitamins. Basic feed /12.5% protein — 75:25 nutrients by weight/ Ingredient Percentage Ground corn 55.6 Soybean meal, 48% protein 6.3 Alfalfa meal, 17% protein 25.0 Dried molasses*/ 10.0 Soybean oil. 2.0 Dicalcium phosphate (24% Ca, 18.5% P) 0.4097 341 Salt with trace minerals **/ Vitamin and mineral premix ***/ 0.50 0.20 */ Sugar cane molasses on a corncob carrier: not less than 3% crude protein, not more than 15% fibrous material*, not less than 42% neutral sugar and maximum -5% water.**/ Giving the following concentration of trace minerals /ppm: manganese-10, iron-8.25, copper-1.25, iodine-0.025, cobalt-0.86, zinc-45.***/ Giving the following vitamin content per 1 kg feed: vitamin A - 3327 units, vitamin D - 444 units, vitamin E - 58 units. Premix Ingredient Quantity /1.8 kg/ Vitamin A concentrate /30,000 units/g/ 0.1 kg Vitamin D3 concentrate /200,000 units/g/ 2.00 g Vitamin E concentrate /278,000 units/kg/ 0.18 kg Zinc oxide /79.4 Cobalt carbonate /45% Co/ -1.70 g Soybean meal or finely ground corncobs 1.47 kg Compound 38295 40.0 g The premix in the amount of 0.45 kg per 1 t of feed gives the final concentration of compound 38295 equal to 11 ppm. Table 3 presents the results. A 28-day test was performed on three identical pens, each containing five calves. The approximate initial weight of each calf was 180 kg. Essentially the same results can be obtained using pure acid, sodium salt, Example I. A sterile aqueous medium was prepared with the following composition: Grams/liter Glucose 10.0 Soluble starch 20.0 Yeast extract 5.0 Enzymatic extract of casein 5.0 Meat meal 5.0 CaCO3 1.0 pH=7.0 Cells of the mold Streptomyces hygroscopicus ATCC 31 050 were transferred to a series of 300 ml flasks, each containing 50 ml of sterile medium. These flasks were shaken on a rotary shaker for 3 days at 28-30° C. 5 ml portions of the strain thus cultivated were aseptically transferred to 300 ml flasks containing 100 ml of the sterile medium described above. After shaking for 3—4 days at -28—30°C, the growing strain was transferred to fermentation tanks with a capacity of 4 1⁄2 and containing 2 1⁄4 of a sterile medium with the following composition: Grams/liter Glucose Corn starch Soybean meal Distillery pulp extract NaCl CaCOg pH=6.6 .0 .0 .0 .0 .0 1.0 Table 3 Mixture of sodium and potassium salts of compound 38 295 Control Dose compound 38 2:95 | /li ppm/ 1 Compound 33 295 /compound 33 ppm/ iSDPW */ kg; index 1.03 1.09 100.0 110.6 118.9 SDDP **/ kg 8.39 '8.08 .58 index ,0.0 95.1 87.3 Feed/Growth ***/ ratio 6.95 .94 .1.-1 index 100.0 117.0 1136.0 */ Average daily weight gain.**/ Average daily food ration.***/ Amount of feed /kg/ per 1 kg of weight gain. potassium salt or dried fermentation broth containing compound 38295. Comparable results can be obtained for other ruminant animals, such as sheep, or monogastric animals, such as horses, pigs or rabbits. Compound 38295 can be administered in feed in the drinking water or as a premix to be mixed with feed or drinking water. A liquid premix containing the antibiotic in concentrated form, intended for addition to drinking water, increases the feed efficiency of the animals. This premix can be prepared to the appropriate concentration by dissolving compound 38295 in a suitable solvent, such as ethanol or propylene glycol. 50 55 60 Fermentation was carried out for 90-120 hours. at a temperature of 28-30°C, stirring at 1700 rpm and aerating at a rate of one volume of air per volume of broth per minute. Large fermentation tanks, containing 300-38,000 l of medium, can be inoculated using about 2% of this inoculum. Fermentation is continued until an antibiotic potency of at least 50 mg/l (90-120 hours) is achieved. 100 l of the entire unfiltered fermentation broth was extracted twice with 1/5 volume of methyl isobutyl ketone. The separated solvent extract was concentrated under reduced pressure to an oily residue (769 g) which was dispersed on silica gel by adding the residue dissolved in 2 l of chloro-97341 l of 12 formula per 1 kg of silica gel PF254, and then the solvent was removed under reduced pressure. The residue obtained was mixed with 2 liters of a chloroform-hexane (1:1) mixture and added to a bed of 300 g of silica gel 60, on top of which was a layer of 300 g of silica gel PF254. The silica gel was then washed successively with 75 liters of hexane, 7.5 liters of a chloroform-hexane (1:1) mixture and 7.5 liters of chloroform. The antibiotic was then eluted with 3.8 liters of ethyl acetate. The ethyl acetate was removed under reduced pressure, and the residue (38 g) was dissolved in 400 ml of acetone. The acetone solution was stirred vigorously at room temperature for about 45 minutes with 40 g of activated carbon (Darco G 60). The mixture was filtered, concentrated to about 200 ml and diluted with 100 ml of water. Compound 38,295 was isolated as the sodium and potassium salts after adjusting the pH of the solution to 8.5 with 1.0 N NaOH. The crystalline material (13.8 g) was dissolved in ethyl acetate and chromatographed on a PF254 silica gel column with hexane. The chromatogram was developed at 5.6 atm with hexane containing gradually increasing amounts of ethyl acetate. The progress of the separation was monitored by thin-layer chromatography. The appropriate fractions were combined, evaporated under reduced pressure, and the pure compound was crystallized from acetone/water. The pure, crystalline mixture of the sodium and potassium salts of compound 38,295 has a melting point of 200°C and an optical activity of [α]D25 = +36° at 1% concentration in methanol. Elemental analysis of the product after drying under reduced pressure overnight at 70°C with phosphorus pentoxide showed an average carbon content of 60.58% and hydrogen content of 8.56%. The compound is soluble in methanol, ethanol, acetone, chloroform, methylene chloride, diethyl ether, ethyl acetate and methyl isobutyl ketone, partially soluble in hexane and insoluble in water. The mixture of the sodium and potassium salts of compound 38,295 does not have a characteristic absorption spectrum in the ultraviolet range of radiation. The infrared spectrum of a mixture of the sodium and potassium salts of compound 38,295 is shown in the accompanying drawing, Fig. 1. Using a KBr plate, characteristic infrared absorption bands were observed at the following wavelengths, in microns: 2.92; 3.40; 6.27; 6.85; 7.22; 8.40; 9.00; 9.15; 9.25; 9.48; 9.98; 10.45; 10.68 and 11.45. Example II. The operations of Example I were repeated, using clear fermentation broth instead of completely unfiltered fermentation broth. Example III. The mycelium separated from the clarified fermentation broth from Example II was repeatedly dissolved in methanol, the methanol extract was concentrated under reduced pressure and the residue was processed according to Example I. Example IV. The fermentation process of Example I was repeated using a fermentation medium with the following composition: Grams/liter Glucose 20.0 Corn starch 10.0 Soy flour 10.0 Extracts from distillers' pulp 5.0 Fe2/SO4/3 0.2 MnCl2 0.2 CaCO3 1.0 NaCl 5.0 Methyl oleate 2.0 Soybean oil 2.0 pH=6.6-6.7 At the end of the fermentation process the entire, unfiltered fermentation broth was spray dried. Example V. A mixture of the sodium and potassium salts of compound 38,295 was dissolved in ethyl acetate and the pH of the solution was adjusted to 4.5 with dilute sodium hydroxide. The solvent layer was dried over anhydrous sodium sulfate, evaporated to dryness, and the residue was crystallized from a mixture of chloroform and hexane to give a crystalline acid with a melting point of 135-1380C and an otic activity of [α]25D = + 38° at a 1% concentration in methanolic solution. After drying overnight under reduced pressure at 70°C with phosphorus pentoxide, elemental analysis of the compound showed it to contain 61.65% carbon, 8.94% hydrogen, and 29.41% oxygen (by balance difference). Compound 38295 in the form of the free acid does not have a characteristic ultraviolet absorption spectrum. The infrared spectrum of compound 38295 in the form of the free acid is shown in Figure 2. Using a KBr plate, characteristic infrared absorption bands were observed at the following wavelengths, in microns: 2.92; 3.43; 5.74; 6.85; 7.25; 8.28; 8.60; 8.80; 9.00; 9.18; 9.80; 10.10; 10.45; 10.68; 10.92; and 11, 13. X-ray crystallographic analysis of the silver salt of compound 38,295 allowed the structure of the compound to be determined, which can be represented by the structural formula shown in the drawing. Example VI. The sodium salt of compound 38,295 was obtained by adding 1 N NaOH solution to a 50% solution of the free acid, obtained in Example V, in ethyl acetate until a pH of ~8.5 was reached. The substance crystallized from an acetone-water mixture had a melting point of 197-198°C and an optical activity of [α]D25 = 55 = + 38° at a concentration of 1.03% in methanol solution. After drying under vacuum overnight at 70°C with phosphorus pentoxide, the sodium salt contained 60.28% carbon and 8.76% hydrogen. The infrared spectrum of the sodium salt of compound 38,295 is shown in the accompanying Figure 3. Characteristic infrared absorption bands were observed on a KBr plate at the following wavelengths in microns: 2.94; 3.42; 6.27; 6.84; 7.20; 8.75; 9.00; 9.14; 9.30; 9.45; 10.45; 10.92; 11.15; and 1.1.47. Example VII. The potassium salt of compound 38,295 was prepared by the method described in Example VI, using potassium hydroxide instead of sodium hydroxide. The substance crystallized from acetone and water had a melting point of 196-198°C and an optical activity [α]D25=38° at a concentration of 1.02% in methanolic solution. After drying under vacuum overnight at 70°C with phosphorus pentoxide, the compound contained 60.58% carbon and 8.0% hydrogen. The infrared spectrum of the potassium salt of compound 33,295 is shown in the accompanying drawing, Figure 4. Using a KBr plate, characteristic infrared absorption bands were observed at the following wavelengths, in microns: 2.94; 3.42; 6.27; 6.84; 7.20; 8.75; 9.00; 9.14; 9.30; 9.45; 10.45; 10.92; 11.15; and 11.47. Example VIII. The silver salt of compound 38295 was prepared by adding an aqueous solution of silver nitrate to an ethanolic solution of the mixture of the sodium and potassium salts obtained in Example 1. The isolated solid was crystallized from methanol to give a product having a melting point of 138-200°C and an optical activity of [α]D25= = +¦27°, at a concentration of 0.982% in methanolic solution. The average composition of a sample dried overnight under vacuum at 70°C with phosphorus pentoxide was 55.95% carbon and 7.82-7.89% hydrogen. The molecular weight of the crystalline silver salt of compound 38295, determined from X-ray data, is 10'60±4. PL PL PL PL PL PL PL PL