PT100240A - Composicoes farmaceuticas compreendendo factor de crescimento transformante beta quimerico - Google Patents

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA 1. INTRODUÇÃO O presente invento refere-se a composições farmacêuticas compreendendo um novo factor de crescimento transformante, quimérico, beta denominado TGF-jSl/jS2 (ou TGF-5j3) para uso na inibição da proliferação de células endoteliais vasculares ou na indução da migração de células do músculo liso às sequências de nucleótidos e aos vectores de expressão que codificam o TGF-j81/j02 e aos processos de produção do TGF-/Jl/j82. O invento é exemplificado pela produção e secreção de TGF-/B1//J2 por células CHO transfectadas com vectores de expressão que codificam um gene de precursor TGF-/31/j82 quimérico. 0 produto de gene quimérico possui actividade biológica de TGF-jB. O invento refere-se ainda a composições farmacêuticas contendo um anticorpo antifactor de crescimento transformante quimérico /31//32 para uso na inibição válido na neovascularização de células microvasculares.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO 0 factor de crescimento transformante Beta (TGF-/3) é um membro de uma família recentemente descrita de polipéptidos que regulam a diferenciação e proliferação celular. Os outros membros desta família incluem a substância inibidora de Mullerian (Cate et al.. 1986, Cell. 45:685-698), as inibinas (Mason et al.. 1985, Nature. 318:659-663) e uma proteína prevista a partir de um transcrito do complexo de gene decapentaplégico de Drosophila (Padgett et al.. 1987, Nature. 325:81-84).

Foram identificados quatro tipos de TGF-/3 e designados por TGF-/31, TGF-02, TGF-/S1.2 e TGF-/33. O primeiro tipo descrito, TGF-/31, consiste em duas subunidades ligadas por dissulfureto idênticas tendo massas moleculares de 13 000 (Assoian et al. . 1983, J. Biol. Chem.. 258:7155-7160; Frolik et al. . 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80:3676-3680; Frolik et al.. 1984, J. Biol. Chem.. 260:10995-11000). Ele foi purificado a partir de várias fontes de tecidos incluindo a placenta (Frolik et al.. 73 766 5624-159-118

D / , -3- / u / / _ j :j{—.· <τβ~.ίί> 1983, Naturef 325:81-84), plaquetas sanguíneas (Childs et al.. 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 79:5312-5316; Assoian et al. . 1983, J. Biol. Chem. . 258:7155-7160), rim (Roberts et al.. 1983, Biochemistrv. 22:5692-5698) e osso desmineralizado (Seyedin et al.. 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82:119-123). Isolaram-se os clones de ADNc que codificam o TGF-/31 humano (Derynck et al. . 1985, Nature. 316:701-705), de ratinho fDervnck et al.. 1986, J. Biol. Chem.. 261:4377-4379) e de símio (Sharples et al.. 1987, DNA. 6:239-244). A análise da sequência de ADN destes clones indica que o TGF-/31 é sintetizado como um polipéptido precursor, grande, sendo o seu terminal carboxilo clivado para dar o monómero de TGF-/3 maduro. Verificou-se uma forte homologia de sequência ao longo da proteína precursora de TGF-/3 de todas as fontes anteriores.

Na presença de soro a 10% e factor de crescimento epidérmico, o TGF-/31 promove a ancoragem independente do crescimento de fibroblastos do rim de ratazana, normais, (Roberts et al.. 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 78:5339-5343; Roberts et al.. 1982, Nature. 295:417-419; Twardzik et al.. 1985, J. Cell. Biochem.. 28:289-297); na presença só de soro a 10%, ele é capaz de induzir a formação de colónias de fibroblastos AKR-2B (Tucker et al. . 1983, Câncer Res. . 43:1518-1586). 0 TGF-jSl também mostrou causar a diferenciação de células mesenquimais de músculo de feto de ratazana e produzir macromoléculas específicas da cartilagem (Seyedin et al.. 1986, J. Biol. Chem.. 261:5693-5695).

Em contraste com seu efeito na proliferação de células, o TGF-jSl purificado a partir de plaquetas humanas mostrou inibir o crescimento de certas células em cultura (Tucker et al.. 1984, Science. 226:705-707). O TGF-]Sl também mostrou inibir o crescimento de várias linhas celulares de cancro humano (Roberts et al.. 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82:119-123). Este efeito inibidor/estimulador do TGF-jSl pode depender de vários factores incluindo o tipo de células e o estado fisiológico das células (para revisão ver Sporn et al.. 1986, Science. 233:532-534). 73 766 5624-159-118 -4-

O TGF-j82, à semelhança do TGF-jSl, é um polipéptido de massa molecular 26 000 composto por duas subunidades de 13 000 daltons, Idênticas, que estão ligadas por dissulfureto (Cheifetz et al.. 1987, Cell. 48:409-415; Ikeda et al.. 1987, Biochemistrv 26:2406-2410) e foi também isolado a partir de osso desmineralizado de bovino (Seyedin et al.. 1987, J. Biol. Chem.. 262:1946-1949), plaquetas de porcino (Cheifetz et al.. 1987, 48:409-415), uma linha celular de adenocarcinoma prostático humano, PC-3 (Ikeda et al.. 1987, Biochemistrv. 26:2406-2410) e de uma linha celular de glioblastoma humano, (Wrann et al. . 1987, EMBO, 6:1633-1636). Isolaram-se os clones de ÀDNc que codificam o TGF-jSl humano e de símio (Madisen et al. . 1988, DNA. 7:1-8; Webb et al. . 1988, DNA. 7:493-497). 0 monómero de TGF-jB2 maduro é clivado a partir de um dos dois polipéptidos precursores, maiores, cujos (ARNm)s podem surgir através de corte diferencial (Webb et al.. 1988, DNA. 7:493-497). 0 TGF-jSl e o TGF-/32 partilham de 71% de identidade da sequência de aminoácidos nas suas regiões maduras, e de 41% de identidade nas suas estruturas precursoras. O TGF-/83, cuja sequência de aminoácidos foi muito recentemente deduzida a partir dos clones de ADNc, parece conter uma sequência de 112 aminoácidos no terminal-C com cerca de 80% de homologia aos monómeros maduros do TGF-jSl e TGF-j82 (Dijke et al.. 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4715-4719). 0 TGF-jSl°2 é uma forma heterodimérica que compreende uma subunidade j81 e uma subunidade j82 ligadas por ligações dissulfureto (Cheifetz et al.. 1987, Cell. 48:409-415). 2.1. PROCESSAMENTO INTRACELULAR DE TGF-fll A porção amino da região precursora do TGF-jSl de fontes humanas, de roedores e de simios mostrou um elevado grau de homologia (Derynck et al.. 1985, Nature. 316:701-705; Derynck et al.. 1986, J. Biol. Chem.. 261:4377-4379; Sharples et al.. 1987, DNA. 6:239-244), sugerindo que pode estar associada a esta parte da molécula tuna importante função biológica. Estudos recentes demonstrando que esta porção do precursor de TGF-jSl está glicosada e fosforilada apoiam este facto visto que se pode

73 766 5624-159-118 -5- considerar que uma célula não se vai dar ao trabalho de realizar estas modificações secundárias se não for para uma função específica (Brunner et al. . 1988, Mol. Cell . Biol. . 8:2229-2232). Estas modificações podem ser importantes para a dimerização do precursor ou para dirigir o seu movimento para fora da célula. Há provas que sugerem que a glicosação do precursor está envolvida no transporte do TGF-jSl maduro para fora da célula (Purchio et al.. 1988, J. Biol. Chem.. 263:14211-14215).

Foi descrita a existência do que se pode considerar complexos precursores intermediários envolvidos no processamento ou artefactos de expressão em células CHO que expressam o gene TGF-jSl de símio (Gentry et al. . 1988, Mol. Cell. Biol. . 8:4162-4168, imprensa; Gentry et al.. 1987, Mol. Cell. Biol.. 7:3418-3427). Estes estudos revelaram que o precursor de TGF-jSl sintetizado por células CHO transfectadas consiste em pro-TGF-jSl, TGF-jSl maduro e na região pro do precursor interligada por ligações dissulfureto. Tais complexos precursores ligados por dissulfureto podem ser também observados em formas latentes, isoladas, de TGF-jSl (Miyazano et al.. 1988, J. Cell. Biochem. SuopI.. 12(A):200; Wakefield et al.. 1987, J. Biol. Chem. SuppI.. 11(A):46).

Gentry et al. (Gentry et aí.. 1988, Mol. Cell. Biol.. 8:4162-4168) propuseram o esquema seguinte para o processamento do pre-pro-TGF-jSl em células CHO transf ectadas. (Os números das posições dos aminoácidos, referidos, são da sequência publicada do TGF-jSl de símio (Sharples et al. . 1987, DNA. 6:239-244)). De acordo com este esquema proposto, o primeiro passo envolve a clivagem do péptido de sinal na ligação peptídica Gly-29/Leu-30. Este passo de clivagem ocorre mais provavelmente co-traducionalmente durante o trânsito do precursor através da membrana do retículo endoplasmático rugoso (Blobel e Dobberstein, 1975, J. Cell. Biol.. 67:835-851; Walter et al.. 1984, Cell. 38:5-8). A seguir à clivagem do péptido de sinal, as unidades de glicosação do núcleo (Rothman et al.. 1978, Cell. 15:1447-1454) são adicionadas ao pro-TGF-jSl em cada um dos três 73 766 5624-159-118 6-

sítios de N-glicosilação previstos localizados em Asn-82, Asn-136 e Asn-176. 0 pro-TGF-/31 glicosado do núcleo é, depois processado sequencialmente durante o trânsito através do aparelho de Golgi para originar uma glicoproteína fosforilada contendo oligossacáridos sialados, complexos. Num passo durante a síntese ou trânsito, ocorre a clivagem proteolítica do resíduo dibásico e a isomerização do dissulfureto, libertando-se o TGF-jSl maduro.

Num outro estudo recente, identificou-se manose-6-fosfato no precursor de TGF-/31. A manose-6-fosfato, um análogo de açúcar fosforilado, parece desempenhar um papel fundamental no transporte dirigido e na permuta intercelular de enzimas lisossómicas (von Figura, 1986, Ann. Rev. Biochem.r 55:167-193). Os receptores específicos que reconhecem os resíduos manose-6-fosfato das enzimas lisossómicas foram identificados e são componentes essenciais do sistema de transporte. As proteínas lisossómicas segregadas contendo manose-6-fosfato foram identificadas no meio condicionado das células de cultura de tecidos (Gal e Gottesman, 1986, J. Biol. Chem. . 261:1760-1765; Capony et al.. 1981, J. Cell. Biol.. 104:253-262; Baumbach et al. . 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 81:2985-2989; Sahagian e Gottesman, 1982, J. Biol. Chem.. 257:11145-11150). É possível que os resíduos de manose-6-fosfato do precursor de TGF-j81 possam dirigir o pro-TGF-jSl para os lisossomas para processamento proteolítico, para dar o TGF-jSl maduro. Os resíduos de manose-6-fosfato podem actuar, alternativamente, de modo a dirigir o precursor de TGF-j01 clivado aos lisossomas para degradação.

3. SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento refere-se à produção de grandes quantidades de um novo TGF-/3, quimérico, denominado TGF-j31//32, por células hospedeiras eucariotas transfectadas com vectores de ADN recombinante contendo a sequência de codificação do precursor de TGF-j81/j32 controlada por elementos reguladores de expressão. 0 ADNc do TGF-/S1 de símio (Sharples et al., 1987, DNA, 6:239-244) foi modificado de modo a que os nucleótidos que 73 766 5624-159-118 7

codificam os resíduos de aminoácido números 9-13, 17, 19, 25 e 26 da sequência do TGF-jSl maduro fossem mudados para os nucleótidos que codificam os aminoácidos correspondentes da estrutura do TGF-/32 maduro. Manteve-se a utilização do codão de sxmio

Construiram-se vectores de expressão que codificam o precursor do TGF-/31/j02 quimérico sob o controlo regulador dos elementos reguladores da expressão do Vírus Símio 40 (SV 40) e utilizaram-se para transfectar células de ovário de Criceto Chinês (CHO). Foram obtidos transfectantes CHO que sintetizam e segregam níveis elevados do TGF-j3l/j32 maduro. A expressão do TGF-j31/j82 foi amplificada com metotrexato e os transfectantes amplificados segregaram tanto quanto 1 mg/1 de TGF-j0l/j82 maduro. A acidificação dos meios condicionados dos transfectantes de CHO resultou em níveis máximos de TGF-/31//32 bioactivo. Pensa-se que os níveis elevados de TGF-j31/j32 maduro segregados pelas células CHO transfectadas resultam de uma eficácia não normal no processamento proteolítico da proteína precursora quimérica. Tal eficácia de processamento aumentada pode, por seu lado, resultar de características estruturais afectadas pela combinação, dos requerentes, das sequências de aminoácidos do TGF-jSl e TGF-/32 no domínio amino-terminal da estrutura do TGF-jS maduro. 0 TGF-jSl/j32 quimérico do invento induz efeitos na proliferação de células endoteliais vasculares equivalentes aos induzidos pelo TGF-jSl (ver Secção 7., et sea.). O presente invento refere-se, assim, a composições farmacêuticas compreendendo um novo factor de crescimento transformante, quimérico, beta denominado TGF-/31/jS2 (ou TGF-5j3) para uso na inibição da proliferação de células endoteliais vasculares, na indução da migração de células do músculo liso. As composições farmacêuticas compreendendo anticorpo anti-TGF-j81/jS2 para uso na inibição da neovascularização de células microvasculares são também contempladas pelo invento. 73 766 5624-159-118 -8-

4. DESCRICÃO DAS FIGURAS FIG. 1. Sequência de nucleótidos e de aminoácidos, deduzida, da proteína híbrida do TGF-/31//32 codificada pelo plasmídeo de expressão p5/8/dhfr. FIG. 2. Bioactividade de meios condicionados de células 5/841,2.5. A bioactividade foi medida pela análise de inibição do crescimento de células epiteliais do pulmão de marta CCL-64. (A) Meio isento de soro condicionado por células 5/841,2.5 durante 24 horas foi dialisado contra ácido acético 0,2 M e analisado como descrito na Secção 6.1.3, infra. (B) Curva padrão de inibição do crescimento para TGF-/31. FIG. 3. Análise por imunotransferência de proteínas segregadas por células 5/841,2.5. As células 5/841,2.5 foram deixadas crescer até à confluência; os meios foram dialisados contra ácido acético 0,2 M e analisado por imunotransferência sob condições não redutoras (faixa 1) ou redutoras (faixa 2) com anti-TGF-/81369-381 como descrito na Secção 6.1.5., infra♦ FIG. 4. Efeito de vários TGF-/8 em células endoteliais vasculares. Culturas de células vasculares de cinco dias, bidimensionais, foram deixadas crescer em DME mais FCS a 10% (controlo) com adições de TGF-/81, TGF-/32, ambos a 0,5 ng/ml ou de TGF-5/8 a concentrações de 0,05, 0,5 ou 5,0 ng/ml. (A) BAEC; (B) BASMC; (C) RFC. Em todos os casos a molécula híbrida de TGF-5/8 mimetizou a isoforma de TGF-/81. FIG. 5. Efeito de vários TGF-/3 na migração de células vasculares. As células do músculo liso e do endotélio de aorta que migram foram tratadas com TGF-/31 e TGF-/32 a 0,5 ng/ml e TGF-5/8 a concentrações de 0,05, 0,5 ou 5,0 ng/ml. O TGF-5/8 mimetizou a resposta do TGF-/31 induzida em BASMC por aumento das velocidades migratórias, embora se tenha observado o efeito oposto quando se utilizaram células endoteliais de vasos grandes. 0 TGF-/82 não provocou nenhum efeito em qualquer tipo de células.

73 766 5624-159-118 FIG. 6. Resposta angiogénica induzida por vários TGF-/3. As culturas de RFC tridimensionais foram observadas com microscopia de interferência de Hoffman para analisar as respostas angiogénicas provocadas por TGF-/31, TGF-/32 e TGF-5/3. As culturas endoteliais de vasos pequenos 3-D, de quatro dias, foram criosseccionadas a 8 /um e fixadas com acetona. As culturas de controlo (A) foram desenvolvidas em DME mais FCS a 10%. As culturas tratadas incluem: (B) TGF-/31 (0,5 ng/ml); (C) TGF-/82 (0,5 ng/ml); e TGF-5/3 a (D) 0,05 ng/ml; (E) 0,5 ng/ml e (F) 5,0 ng/ml. O TGF-/31 origina estruturas tubulares com ramificações, complexas, ao passo que as culturas de controlo mostraram uma formação mínima de tubos. O TGF-5/3 a 0,05 ng/ml deu uma indicação de começo da neovascularização, ao passo que 0,5 ng/ml da molécula híbrida estimularam uma resposta angiogénica equivalente à isoforma de TGF-/31. A concentração mais elevada de TGF-5/3 parece causar uma ligeira diminuição na quantidade de estruturas com ramificações complexas, que foram mostradas antes da utilização do TGF-/31. O TGF-/32 necessita de um aumento de 10 vezes na concentração (5,0 ng/ml) de forma a igualar a neovascularização induzida por TGF-/31 e TGF-5/3 a 0,5 ng/ml. As setas indicam as formações tubulares por RFC. Ampliação = 100 X. 5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento refere-se ao TGF-/81//32, a sequências de nucleótidos que codificam TGF-/B1//32 e o precursor de TGF-/31//82, e à produção de TGF-/31//32 por processos de ADN recombinante. 0 TGF-/31//32, um novo factor de crescimento transformante beta, quimérico, é biologicamente activo na análise padrão utilizada para medir a bioactividade do TGF-/31 e é imunorreactivo com anticorpos específicos para TGF-/31. Uma quimera compreendendo estruturalmente uma combinação das sequências de aminoácidos de TGF-/31 e TGF-/32, o TGF-/31//32 do invento, possui provavelmente um novo conjunto de actividades biológicas, algumas das quais podem ser semelhantes ou quase idênticas às exibidas pelas suas moléculas progenitoras, enquanto que outras podem ser únicas para o TGF-/S1//02. Relativamente a essas bioactividades que são semelhantes ou quase idênticas às do TGF-/S1 ou TGF-/02, este novo factor pode proporcionar um meio mais eficaz para induzir

73 766 5624-159-118 respostas biológicas correspondentes e, por consequência, o seu uso pode ser uma alternativa desejável para TGF-jSl e TGF-02 em várias aplicações médicas previstas para os TGF-/J. Tais aplicações incluem mas não estão limitadas à indução ou aceleração da proliferação e diferenciação celular e, à inibição da divisão celular. Assim, o TGF-/Sl/jS2 pode ser usado, por exemplo, no tratamento do câncro e na promoção da cicatrização de feridas. O presente invento refere-se, assim, a composições farmacêuticas compreendendo factor de crescimento transformante, quimérico, TGF-j31/02 para uso na inibição da proliferação de células endoteliais vasculares ou na indução da migração de células do músculo liso. O invento refere-se também às composições farmacêuticas contendo anticorpo anti-TGF-j01//32 para uso na inibição da neovascularização de células microvasculares. 0 processo do invento pode ser dividido nos passos seguintes, sómente para o fim da descrição: (a) produção da sequência de codificação para o precursor do TGF-j81/j82? (b) construção de um vector de expressão que vai dirigir a expressão da sequência de codificação de TGF-/31//32; (c) transfecção de células hospedeiras apropriadas que são capazes de replicar, expressar o gene e processar o produto de gene para produzir a forma madura de TGF-/31//32 e/ou dos precursores de TGF-/31/j32; e (d) identificação e purificação dos precursores de TGF-/31/j32 e do TGF-j81/;82 biologicamente activo, maduro.

Uma vez identificado o transfectante que expressa níveis elevados de precursores de TGF-j81/j02 e/ou ΤΩΈ-β1/β2 maduro, a prática do processo do invento envolve a expansão desse clone e isolamento do produto de gene expresso. 0 processo do invento é aqui posto em evidência por meio de exemplos nos quais o ADNc do precursor do TGF-jSl de símio (Shar-ples et al.. 1987, DNA. 6:239-244) é modificado de modo a que os nucleótidos que codificam os resíduos de aminoácido números 9-13, 17, 19, 25 e 26 da sequência do TGF-jSl de símio, maduro, sejam mudados para nucleótidos que codificam os aminoácidos correspondentes na estrutura do TGF-j32 maduro, mantendo, no entanto, a utilização do codão de símio. A sequência que codifica o precursor do TGF-/31//32 quimérico, resultante, é então usada para construir vectores de expressão que são capazes de dirigir a síntese do produto de TGF-/31//32 maduro.

Os efeitos do TGF-jBl/j82 na proliferação, migração e angiogénese de células endoteliais vasculares foram examinados in vitro (secção 7., et seq.) e parecem quase paralelos aos induzidos por TGF-/J1 mas não pelo TGF-/32.

Os vários aspectos do processo do invento são descritos com mais detalhe nas subsecções seguintes e nos exemplos que se seguem.

5.1. PRODUÇÃO DA SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DO TGF-fll/fl2 QUIMÉRICO A sequência nucleotídica de codificação para o TGF-j31/|02 quimérico é apresentada na FIG. 1. Na prática do processo do invento, esta sequência nucleotídica ou o seu equivalente funcional podem ser usados para produzir as moléculas recombi-nantes que vão dirigir a expressão do produto de TGF-j8l/j82. Devido à degeneração das sequências nucleotídicas de codificação, podem ser usadas na prática do presente invento outras sequências de ADN, como mostrado na Fig. 1. Tais alterações da sequência nucleotídicas da FIG. 1 incluem delecções, adições ou substituições de resíduos de nucleótidos diferentes resultando numa sequência que codifica o mesmo ou um produto de gene funcionalmente equivalente. O produto de gene pode conter delecções, adições ou substituições de resíduos de aminoácidos numa sequência, o que resulta numa ligeira mudança produzindo-se assim um produto bioactivo. Tais substituições de aminoácidos podem ser realizadas com base na semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofolicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos carregados negativamente incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico; os aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina;

73 766 5624-159-118 -12- aminoácidos com grupos de cabeça dipolar não carregada ou grupos de cabeça não polar tendo valores de hidrofilicidade semelhantes incluem os seguintes: leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. A sequência de nucleótidos para o TGF-/B1 de símio pode ser obtida a partir de fontes celulares de símio (Sharples et al.. 1989, DNA. 6:239-244). A sequência de nucleótidos do TGF-J01//32 quimérico na FIG. 1 pode ser preparada por processos conhecidos na arte incluindo, mas não limitados ao uso de enzimas de restrição de ADN, oligonucleótidos sintéticos e ADN-ligases. Alternativamente, a sequência de codificação da FIG. 1 pode ser, sintetizada no todo ou em parte utilizando processos químicos bem conhecidos na arte.

Numa concretização específica do invento, a sequência de codificação para o TGF-/31 de símio foi obtida a partir de um clone de ADNc de comprimento total obtido a partir de uma linha celular de macaco verde Africano, BSC-40 (Sharples et al♦. 1987, supra). A sequência de codificação do TGF-j01/jS2 quimérico mostrada na FIG. 1 foi então derivada de ADNc do TGF-jSl de símio por remoção e substituição das sequências de codificação dos resíduos de aminoácido números 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 e 26 da molécula de TGF-/31 maduro pelas sequências de codificação dos resíduos de aminoácido números 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 e 26 da molécula do TGF-jS2 maduro (Madisen et al.. 1988, DNA. 7:1-8) utilizando-se técnicas de construção de genes.

5.2. CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO CONTENDO A SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DO TGF-fíl/fl2 QUIMÉRICO

De forma a expressar o TGF-/J1/JB2 maduro, biologicamente activo, deve-se escolher um sistema de expressão vector/hospedeiro que proporcione não só níveis elevados de transcrição e tradução, mas também o processamento correcto do produto de gene. Isto é especialmente importante quando se emprega a sequência de codificação completa do precursor do TGF-/?l/j32 quimérico nas estruturas de expressão porque, à 73 766 5624-159-118 -13-semelhança do TGF-jSl e do TGF-j32, pensa-se que o TGF-j31/j32 quimérico, maduro, é libertado a partir de uma molécula de precursor ou de um complexo de moléculas através de passos de processamento celular. Adicionalmente, pode ser desejável um sistema de expressão/célula hospedeira que proporcione a secreção do produto.

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Em particular, parece que o TGF-j31//S2 maduro é um homodímero, ligado por dissulfureto, de 112 aminoácidos por subunidade formado por passos de processamento celular que se pensa serem semelhantes aos que formam TGF-/31 e TGF-/32 maduro. O precursor do TGF-j31/j32 tem três sítios de N-glicosação potenciais no seu domínio pro (Sharples et al.. 1987, DNA. 6.:239-244). Estudos que envolvem o TGF-jSl determinaram que a N-glicosação e a fosforilação no domínio pró do TGF-jSl ocorrem em células CHO transfectadas, implicando um papel funcional importante para o precursor na síntese celular e na libertação ou secreção da molécula madura (Brunner et al.f 1988, Mol. Cell. Biol.. 8:2229-2232). A presença de manose-6-fosfato no precursor do TGF-jSl apoia também a hipótese de que o precursor tem actividade funcional independente (Purchio et al. . 1988, J. Biol. Chem.. 263:14211-14215). Visto que o precursor do TGF-jSl/j82 quimérico contém o domínio pro do TGF-jSl de símio, os requerentes pensam que é provável que o precursor do TGF-j31/j32 seja funcionalmente activo e importante para o processamento correcto da molécula do TGF-j8l/j82 maduro. Assim, a capacidade de uma célula hospedeira usada no sistema de expressão para expressar e processar correctamente o TGF-j81/j82 quimérico é importante para a produção de um produto bioactivo, maduro.

Numa concretização específica aqui descrita, o TGF-jSl/jS2 bioactivo, maduro é produzido com sucesso utilizando os elementos de controlo da expressão do vírus de símio 40 (SV 40) num sistema de células hospedeiras de Ovário de Criceto Chinês (CHO). Contudo, podem ser igualmente bem utilizada pelos peritos na arte, uma certa variedade de outros sistemas hospedeiro animal/vector de expressão (i.e., vectores que contêm os elementos necessários para dirigir a replicação, transcrição e

73 766 5624-159-118 -14-tradução da sequência de codificação do TGF-J31//32 numa célula hospedeira apropriada). Estes incluem, mas não estão limitados aos sistemas vector de expressão vírus/célula hospedeira de mamífero (por exemplo, citomegalovírus, vírus vacina, adenovírus e semelhantes); sistemas de vectores de expressão de vírus de insectos/células de insectos (por exemplo. baculovírus); ou sistemas de expressão de promotores não virais derivados dos genomas de células de mamífero (por exemplo. o promotor da metalotioneína de ratinho).

Os elementos de expressão destes vectores variam na sua força e especificidades. Pode-se utilizar qualquer um de um certo número de elementos de transcrição e tradução adequados, dependendo do sistema hospedeiro/vector utilizado. Por exemplo, aquando da clonagem em sistemas de células de mamíferos, podem ser usados promotores isolados do genoma das células de mamífero, fpor exemplo, o promotor da metalotioneína de ratinho) ou de vírus que se desenvolvem nestas células, (por exemplo, o promotor de 7,5k do vírus vacina). Os promotores produzidos por técnicas de ADN recombinante ou sintéticas podem também ser usados para proporcionar a transcrição das sequências inseridas.

Os sinais de iniciação específicos são também necessários para a tradução suficiente de sequências inseridas de codificação de proteínas. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e as sequências adjacentes. Por exemplo, nos casos onde só é inserida uma porção da sequência de codificação do TGF-j81/j82, devem-se fornecer os sinais de controlo da tradução, incluindo o codão de iniciação ATG. Além disso, o codão de iniciação deve estar em fase com a estrutura de leitura das sequências de codificação do TGF-/31//32 para assegurar a tradução de toda a inserção. Estes sinais de controlo da tradução exógenos e os codões de iniciação podem ter uma certa variedade de origens, naturais e sintéticas. A eficácia da expressão pode ser intensificada pela inclusão de sequências de atenuação da transcrição, elementos intensificadores e semelhantes.

Qualquer um dos processos previamente descritos para a

73 766 5624-159-118 -15-inserção de fragmentos de ADN num vector pode ser usado para construir vectores de expressão contendo a sequência de codificação do TGF-j31//32 e sinais de controlo da transcrição/tradução apropriados. Estes processos podem incluir técnicas de ADN recombinante in vitro. técnicas sintéticas e recombinações (recombinação genética) in vivo.

Nos casos em que é usado um adenovírus como vector de expressão, a sequência de codificação do TGF-/31/j32 pode ser ligada a um complexo de controlo da transcrição/tradução do adenovírus, por exemplo, o último promotor e a sequência de comando tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplor região EI ou E3) vai resultar num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar o TGF-/31/β2 em hospedeiros infectados. De modo semelhante, pode ser usado o promotor de 7,5k de vacina.

Um sistema de expressão alternativo que podia ser usado para expressar o TGF-j31/j82 é um sistema de insecto. Num tal sistema, o vírus da poliedrose nuclear de Autoarapha californica (AcNPV) é usado como vector para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera fruaiperda. A sequência de codificação do TGF-/31//32 pode ser clonada em regiões não essenciais (por exemplo, no gene da poliedrina) do vírus e colocada sob controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo, do promotor da poliedrina). A inserção com sucesso da sequência de codificação do TGF-/31//32 vai resultar na inactivação do gene da poliedrina e na produção de vírus recombinantes não obstruídos (i.e., vírus que carecem do revestimento proteináceo codificado pelo gene da poliedrina). Estes vírus recombinantes são então usados para infectar células de Spodoptera fruqiperda nas quais o gene inserido é expresso.

Adicionalmente, pode-se escolher uma estirpe de células hospedeiras que module a expressão das sequências inseridas ou modifique e processe o produto de gene da forma específica dese- 73 766 5624-159-118

-16- jada. A expressão de certos promotores pode ser aumentada na presença de certos indutores, (por exemplo, iões de zinco e cádmio para os promotores da metalotioneína). Por consequência, pode-se controlar a expressão do TGF-/31/j82 geneticamente elaborado. Isto é importante se o produto de proteína do gene estranho clonado for letal para as células hospedeiras. Além disso, as modificações pós-traducionais tal como a glicosação, e os acontecimentos de processamento tal como a clivagem proteolítica dos produtos de proteína, podem ser importantes para a funcionalidade da proteína. As células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-traducional e modificação de proteínas. As linhas celulares ou os sistemas hospedeiros, apropriados, podem ser escolhidos para assegurar a modificação e o processamento correctos da proteína estranha expressa.

Numa concretização específica do invento, é construído um vector de expressão contendo a sequência de codificação do TGF-/31//32 em tandem com o gene da di-hidrofolato-redutase (dhfr) de ratinho sob controlo das sequências reguladoras de SV40 e usado para transfectar células CHO deficientes em dhfr. Os transfectantes CHO que expressam o fenótipo de dhfr são isolados por propagação em meios selectivos. Para aumentar o nível de expressão de TGF-/31//32 os transfectantes podem ser expostos a quantidades crescentes de metotrexato de modo a isolar clones que transcrevem níveis ampliados de ARNm de TGF-J31//32. Os níveis de ARNm de TGF-/31//J2 podem ser analisados em várias fases da amplificação por hibridação em solução (Uhler et al. . 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:1300-1304).

5.3. IDENTIFICAÇÃO DOS TRANSFECTANTES QUE EXPRESSAM O TGF-fll/B2 QUIMÉRICO

As células hospedeiras que contêm a sequência de codificação do TGF-j31//32 e que expressam o produto maduro, biologicamente activo, podem ser identificadas, pelo menos, por quatro abordagens gerais: (a) hibridação de ADN-ADN? (b) presença ou ausência de funções de gene "marcador"; (c) avaliação do nível de transcrição medido pela expressão de

73 766 5624-159-118 -17-transcritos de ARNm do TGF-/S1//82 na célula hospedeira; e (d) detecção do produto de gene maduro medido por imunoensaio e, finalmente, pelas suas actividades biológicas.

Na primeira abordagem, a presença da sequência de codificação do TGF-j81/jB2 inserida no vector de expressão pode ser detectada por hibridação de ADN-ADN utilizando sondas que compreendem sequências de nucleótidos que são homólogas à sequência de codificação do TGF-/31//32 como substancialmente mostrado na FIG. 1, ou suas porções ou derivados.

Na segunda abordagem, o sistema vector de expressão recombinante/hospedeiro pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou ausência de certas funções de gene "marcador" (por exemplo, actividade de timidina-quinase, resistência a antibióticos, resistência ao metotrexato, transformação do fenótipo, formação de corpos de oclusão em baculovírus, etc.). Por exemplo, se a sequência de codificação do TGF-/?l/j02 for inserida numa sequência de gene marcador do vector, os recombinantes contendo a sequência de codificação do TGF-/31//32 podem ser identificados pela ausência da função do gene marcador. Alternativamente, pode-se colocar um gene marcador em tandem com a sequência do TGF-j01/j82 sob controlo do mesmo ou de promotores diferentes usados para controlar a expressão da sequência de codificação do TGF-j81/jS2. A expressão do marcador em resposta à indução ou selecção indica a expressão da sequência de codificação do TGF-/31/02.

Na terceira abordagem, a actividade transcricional para a região de codificação do TGF-jSl/jS2 pode ser avaliada por ensaios de hibridação. Por exemplo, o ARN poliadenilado pode ser isolado e analisado por transferência de Northern utilizando uma sonda homóloga à sequência de codificação do TGF-j91/jS2 ou a suas porções particulares. Os ácidos nucleicos totais da célula hospedeira podem ser, alternativamente, extraídos e ensaiados quanto à hibridação a tais sondas.

Na quarta abordagem, a expressão do produto de proteína 73 766 5624-159-118

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-2icat> -18-

maduro pode ser avaliada imunologicamente, por exemplo por transferência de Western, imunoensaios como imunotransferência, radio-imunoprecipitação, imunoensaios com enzima ligada e semelhantes. Contudo, o teste final do sucesso do sistema de expressão envolve a detecção do produto de gene TGF β1/β2 biologicamente activo. Quando a célula hospedeira segrega o produto de gene, os meios isentos de células obtidos a partir da célula hospedeira transfectante, cultivada, podem ser ensaiados quanto à actividade do TGF-/J1//32. Quando o produto de gene não é segregado, os lisados de células podem ser ensaiados quanto a essa actividade. Em qualquer caso, podem-se utilizar ensaios biológicos tal como o ensaio da inibição do crescimento, aqui descrito, ou semelhantes.

Uma vez identificado um clone que produz níveis elevados do TGF-j81/)82 maduro, o clone pode ser expandido e o TGF-jSl/j82 pode ser purificado utilizando-se técnicas bem conhecidas na arte. Tais processos incluem a purificação por imunoafinidade, processos cromatográficos que incluem a cromatografia líquida de elevada eficiência e semelhantes.

5.4. PROCESSO MELHORADO PARA A PRODUÇÃO DO TGF-gl/62 MADURO

Numa concretização específica do invento, o precursor do TGF-/31/j02 pode ser modificado por eliminação do aminoácido cisteína na posição 33 (CYS-33) da FIG. 1 e substituição deste por serina. Esta modificação pode ser introduzida ao nível do ADN utilizando mutagénese dirigida ao sítio. As células COS transfectadas com plasmídeos que codificam o gene do precursor do TGF-J01//82 assim modificado segregam finalmente entre três e cinco vezes mais TGF-01 maduro do que as células CHO que expressam o gene do precursor não modificado. Pensa-se que esta modificação impede a formação de certos complexos de precursor ligados por dissulfureto nas células COS transfectadas e, por consequência, permite a secreção de mais TGF-/3 maduro.

6. EXEMPLO: PRODUÇÃO DO TGF-fll/fl2 POR EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE OVÁRIO DE CRICETO CHINÊS

Construiu-se um plasmídeo recombinante que codifica o

73 766 5624-159-118 -19-precursor do TGF-/B1 no qual os aminoácidos 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 e 26 da sequência do TGF-/31 maduro foram substituídos pelos aminoácidos correspondentes da sequência do TGF-/32 maduro. Especificamente, o aminoácido 9 do TGF-jSl maduro (serina) foi substituído por arginina, o aminoácido número 10 (serina) foi substituído por asparagina, o aminoácido número 11 (treonina) foi substituído por valina, o aminoácido número 12 (ácido glutâmico) foi substituído por glutamina, o aminoácido número 13 (lisina) foi substituído por ácido aspártico, o aminoácido número 17 (valina) foi substituído por leucina, o aminoácido número 19 (glutamina) foi substituído por prolina, o aminoácido número 25 (arginina) foi substituído por lisina e o aminoácido número 26 (lisina) foi substituído por arginina. A estrutura foi usada para transfectar células CHO. Isolaram-se os transfectantes que produziram e segregaram um TGF-j01/02 quimérico, bioactivo, maduro.

6.1. MATERIAIS E PROCESSOS 6.1.1. TRANSFECCÕES DE ADN

Aproximadamente 24 horas a seguir à sementeira de 106 células CHO deficientes em dhfr em placas de 100 mm, as culturas foram transfectadas com 1 jiig de plasmídeo p5j3/dhfr linearizado com Ndel e 19 jug de ADN do timo de vitelo como veículo, como um precipitado de fosfato de cálcio, (Wigler, M., et al.. 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.. 76:1373-1376). Em resumo, adicio-naram-se 20 μg de plasmídeo mais ADN veículo a 1 ml de CaCl2 250 mM estéril. A solução de ADN (1 ml) foi adicionada gota-a-gota a uma porção de 1 ml de solução HEPES 2X (NaCl 280 mM, HEPES 50 mM, fosfato de sódio 1,5 mM, pH 7,1) com borbulhamento e a mistura foi deixada repousar em gelo durante 30 minutos. 0 precipitado foi então disperso gota-a-gota sobre as células contendo 10 ml de meio F12 (Gibco). Após incubação a 37°C durante 4 horas, o meio foi removido e substituído por 10 ml de meio F12 contendo 25% de glicerol, durante 90 segundos à temperatura ambiente. As células foram lavadas uma vez com 20 ml de meio F12 e incubadas em meio F12 não selectivo (20 ml) durante mais 48 horas. A selecção dos transfectantes que 73 766 5624-159-118 -20-

expressam dhfr foi realizada por substituição do meio por DMEM suplementado com 10% de FBS dialisado (Gibco) e 150 μg/ml de L-prolina. Observaram-se colónias após cultura das células durante 10-14 dias no meio de selecção.

6.1.2. SELECCÃO DAS CÉLULAS RESISTENTES AO METOTREXATO

As células amplificadas por di-hidrofolato-redutase (dhfr) foram derivadas dos transfectantes principais essencialmente como descrito (Gasser, C.S. e Schimke, R.T., 1986, J. Biol. Chem.. 261:6938-6946). Após expansão, foram semeadas 10^ células em placas de 100 mm e adaptadas a concentrações crescentes de metotrexato (100 nM; 500 nM? 2 500 nM? 10 000 nM? 20 000 nM). A concentração inicial de metotrexato foi de 100 nM. A placa contendo as colónias visíveis foi tripsinizada e adaptada à concentração de metotrexato durante, pelo menos, duas passagens adicionais de células a 1:5. As células (105) foram então semeadas em placas de 100 mm na concentração mais elevada, seguinte, de metotrexato. 0 disco contendo colónias visíveis foi de novo tripsinizado e adaptado no meio contendo metotrexato. As células foram congeladas em vários passos da amplificação em meios contendo 40% de FBS, 10% de dimetilsulfóxido e 50% de DMEM. O metotrexato não foi incluído nos meios de congelação.

6.1.3. ENSAIO DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO Células epiteliais dos pulmões de marta, Mv 1 Lu (Número de Acesso CCL-64, American Type Culture Collection), que são extremamente sensíveis ao TGF-/3 foram usadas no ensaio da inibição do crescimento. 0 ensaio foi realizado utilizando-se o análogo da timidina 5,-[125I]-iodo-2/-desoxi-uridina (125IdU), para avaliar a síntese de ADN. Uma unidade de actividade foi definida como a quantidade necessária para inibir 50% da incorporação de 125IdU comparada com células CCL-64 não tratadas. 0 soro isento de sobrenadantes foi recolhido durante uma recolha de 24 horas em culturas de células confluentes e extensivamente dialisado contra ácido acético 0,2 M, para ensaiar as células transfectadas quanto à secreção de TGF-01//S2 73 766 5624-159-118 21

activo. As amostras foram diluídas em meio de cultura completo estéril para ensaio.

6.1.4. SÍNTESE DE PÉPTIDOS E PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

Os péptidos foram sintetisados por técnicas em fase sólida num instrumento Beckman 990 e clivados da resina como previamente descrito (Gentry, L.E., et al.f 1983, J. Biol. Chem.. 258:11219-11228; Gentry, L.E. e Lawton, A., 1986, Virolo-cry. 152:421-431). A purificação foi realizada por cromatografia líquida de elevada eficiência, preparativa. A composição dos péptidos foi confirmada por análise de aminoácidos.

Os péptidos sintéticos foram conjugados com gama-globulina de bovino através do resíduo de cisteína. As reacções de acoplamento foram essencialmente realizadas como descrito (Gentry e Lawton, 1986, supra). As eficácias das conjugações dos péptidos variaram de 8 a 26 moléculas de péptido ligadas covalentemente por molécula de gama-globulina.

Sensibilizaram-se os coelhos brancos da Nova Zelândia em três a seis sítios por inoculações sub-cutâneas e intradérmicas combinadas com os conjugados de péptido (100 μg equivalentes de péptido) emulsionados em adjuvante completo de Freund. As inoculações de reforço foram administradas em intervalos de 2-3 semanas. Os sangramentos foram feitos 7-14 dias após os reforços.

Os anticorpos anti-péptido dirigidos para as sequências de péptidos na molécula de TGF-01 foram produzidos em coelhos utilizando-se péptidos sintéticos como imunogénios (Gentry et al.. 1987, Mol. Cell. Biol.. 7:3418-3427). Um dos anticorpos (anti-TGF-/31369-381) foi dirigido para os epítopos presentes na forma madura do factor de crescimento TGF-/3. Os outros dois anticorpos (anti-TGF-/Jl81_94 e anti-TGF-jSl225-236) são específicos do precursor e são dirigidos para as sequências de péptidos presentes apenas na molécula precursora de TGF-/31. 73 766 5624-159-118 -22-

6.1.5. IMUNOTRANSFERÊNCIA As proteínas foram fraccionadas em geles de SDS-poliacrilamida de gradiente 7,5%-17,5% e transferidas para nitrocelulose não modificada (0,45 μπι; Schleicher e Schuell) durante 1 hora a 24 volts a 4°C (Burnette, W.N., 1981, Anal. Biochem.. 112:195-203). 0 excesso de capacidade de ligação da nitrocelulose foi bloqueado por incubação com BLOTTO a 2,5% (Johnson, D.A., et al. . 1984, Gene Anal. Techn. . 1:3-8) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo NP-40 0,2%. 0 antissoro de coelho diluído a 1:75 em BLOTTO a 2,5% foi incubado com as folhas de nitrocelulose bloqueadas durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois de lavar o excesso de anticorpo em cinco lavagens de 5 minutos em BLOTTO a 2,5%, as folhas de nitrocelulose foram incubadas com Proteína A conjugada com fosfatase alcalina diluída a 1:500 em BLOTTO a 2,5%. A seguir a uma incubação de duas horas, as folhas de nitrocelulose foram lavadas 5 vezes em PBS ( lavagens de 5 minutos) contendo NP-40 a 0,2% e reveladas (Leary et al.. 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.. 80:4045-4049). 6.1.6. CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO QUE PROGRAMA A SÍNTESE DE TGF-fll/62 O plasmídeo que programa a síntese da proteína do TGF-/31//32 quimérico, p5/3/dhfr, foi construído como se segue. O pAc/BTGF-1, um vector de baculovírus derivado de pAc373 (Miyamoto et al.. 1985, Cell. Biol.. 5:2860-2865; Madisen et al. . 1987, Viroloqy. 158:248-250), que contém a sequência de codificação PstI-EcoRI de 1,4kb do TGF-01 (Sharples et al.. 1987, DNA. 6:239-244) clonada no sítio Pstl-EcoRl de pAc6ll (Miyamoto et al.. 1985, Cell. Biol.. 5:2860-2865; Madisen et al. . 1987, Viroloqy, 158:248-250), foi digerido com BamHI e EcoRI e isolou-se o fragmento de 375 pb da sequência de codificação do TGF-/J1 (Fragmento 1). O pSV2—jSTGF (Gentry et al. . 1987, Mol. Cell. Biol. . 7:3418-3427) foi digerido com Apal e EcoRI e isolou-se o fragmento de 3,5 kb (Fragmento 2).

Os oligonucleótidos sintéticos complementares tendo as sequências mostradas abaixo foram sintetizados num Applied Bio- -23- -23- 'jfâ. fZyMássisxs&Sí 73 766 5624-159-118 systems Oligonucleotide Synthesizer e purificados a partir de um gel de acrilamida. Adicionaram-se fosfatos com quinase T4 e foram desnaturadas/renaturadas quantidades equimolares dos oligonucleótidos submetidos a quinase. 0 ADN sintético de cadeia dupla, desnaturado/renaturado, foi então ligado aos fragmentos '1' e '2' acima descritos. A mistura de ligação foi utilizada para transformar E. coli e isolou-se 5/BpSV2 (Hpa~Eco+).

5' - CAA CAT CTG CAA AGC TCC CGG CAC CGC CGA GCC

CTG GAC ACC AAC TAC TGC TTC AGA AAT GTG CAG

GAT AAT TGC TGC CTA CGT CCG CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG AAA TG - 37

GAT CCA TTT CCA CCC TAG ATC CCT CTT GAA ATC AAT GTA AAG CGG ACG TAG GCA GCA ATT ATC CTG CAC ATT TCT GÃA GCA GTA GTT GGT GTC CAG GGC TÇÇ GCG GTG CCG GGA GCT TTG CAG ATG TTG GGC O 5/0pSV2(Hpa“Eco+) foi digerido com EcoRI. preenchido com enzima de Klenow, digerido com Hindlll e isolou-se o fragmento de 1,4 kb contendo a sequência de codificação do TGF-j31/j32 quimérico (Fragmento 3). 0 5jSpSV2 foi construído por ligação do Fragmento 3 em pSV2, neo que tinha sido previamente digerido com HindiII e Hpal para eliminar o gene neo. 0 5/3pSV2 foi digerido com EcoRI. preenchido com enzima de Klenow, digerido com Ndel e isolou-se o fragmento Ndel-EcoRl (rombo) de 2,6 kb, ligando-se este a pSV2/dhfr (Gentry et al.. 1987, Mol. Cell. Biol.. 7:3718-3727) que tinha sido digerido com Ndel e PvuII. A mistura de ligação foi utilizada para transformar E. coli e isolou-se p5)S/dhfr. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos deduzida da molécula do TGF-/31/j32 quimérico codificadas pelo p5/3/dhfr são mostradas na FIG. 1.

6.2. EXPRESSÃO DO TGF-/31/02 EM CÉLULAS CHO 0 p5j8/dhfr foi transfectado em células CHO e os clones simples foram amplificados com metotrexato como descrito na Secção 6.1., supra. Um desses clones amplificados, o

foi escolhido para posterior caracterização. 73 766 5624-159-118 CHO-5/341,2.5,

As células 0110-5)341,2.5 foram deixadas crescer até à confluência em 2,5 μΜ de metotrexato. O meio foi substituído com meio isento de soro e, após 24 h, recolhido e dialisado durante 48 horas contra ácido acético a 0,2 M. Os sobrenadantes condicionados, dialisados, foram ensaiados quanto à bioactividade por inibição da síntese do ADN das células CCL-64, como descrito na Secção 6.1.3., supra. As células CHO-5)341,2.5 segregam aproximadamente 1 mg/L de TGF-j3l/j82 quimérico bioactivo (FIG. 2).

As proteínas relacionadas com o TGF-jS segregadas por estas células foram analisadas por imunotransferência utilizando anticorpos antipéptido dirigidos contra o TGF-/81 maduro, como descrito na Secção 6.1.5., supra. A FIG. 3 mostra que as células CH0-5)341,2.5 segregam proteínas imunorreactivas que migram a 90 até 100 quilodaltons e a 24 quilodaltons quando analisadas por SDS-PAGE sob condições não redutoras (FIG. 3, faixa 1). A banda a 24 quilodaltons representa o dímero de TGF-j31/j32 maduro e a proteína de 90 a 100 quilodaltons representa provavelmente o TGF-j31//32 maduro ligado por dissulfureto às sequências precursoras (Gentry et al.. 1987, Mol. Cell. Biol. . 7:3418-3427).

Sob condições redutoras (FIG. 3, faixa 2), a maior parte das proteínas migra a 12 quilodaltons, representando o monómero de TGF-)31/)32 maduro. Observar que a falta de material imunorreactivo no intervalo de 45 a 55 quilodaltons, observado numa análise semelhante de proteínas recombinantes expressas em células CHO transfectadas com plasmídeos que codificam o gene do TGF-)31 de símio (Gentry et al. . 1987, Mol. Cell. Biol. f 7:3418-3427), sugere que o TGF-)31/j32 quimérico é processado proteoliticamente de modo mais eficaz que a sua molécula progenitora TGF-j31. Adicionalmente, as células CH0-5)S4l,2.5 segregam cerca de 2,5 vezes mais produto maduro, bioactivo, do que as células CHO que expressam TGF-j81 (Gentry et al.. 1987, supra). Embora a base destas observações sej a presentemente 73 766 5624-159-118 -25-

desconhecida, a estrutura secundária do precursor do TGF-/31//32 quimérico pode diferir significativamente da estrutura secundária do TGF-jSl, estrutura secundária essa que torna o TGF-j8l/j82 quimérico objecto acontecimentos de processamento molecular de diferente intensidade ou natureza. Por exemplo, o precursor do TGF-/31//32 pode ser um substrato mais favorável para os factores envolvidos no processamento do TGF-jS. Alternativamente, as características estruturais secundária do TGF-jB1/j82 podem-lhe permitir interagir com outros factores ou vias de processamento não tão acessíveis ao TGF-/31.

7. EXEMPLO: MODULAÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS ENDOTELIAIS VASCULARES PELO TGF-5A HÍBRIDO

Examinaram-se os efeitos biológicos induzidos pelo TGF-/31/j02 híbrido recombinante (TGF-5/3) na proliferação, migração e angiogénese de células endoteliais dos grandes vasos, células do músculo liso e células endoteliais microvasculares, utilizando-se três bioensaios distintos que indicaram previamente que as respostas diferenciais são induzidas pelo TGF-/S1 e pelo TGF-/32 (Merwin et al. , 1991, Am. J. Path. . 138(1):37-51).

7.1. MATERIAIS E PROCESSOS 7.1.1. CULTURA DE CÉLULAS

Desenvolveram-se células do músculo liso de aorta de bovino (BASMC) a partir de explantes de aorta de bovino em DME completo suplementado com FCS a 10%, como descrito em Kocher e Madri, 1989, In Vitro Cell. & Dev. Biol. . 25.:424-34. Após vários dias em cultura, as BASMC migraram para fora dos explantes médios. A seguir ao desenvolvimento de confluência, as células foram tripsinizadas, passadas e utilizadas nas análises de inibição do crescimento descritas, infra. Estas células do músculo liso a positivas a actina, formam o modelo típico de monte-e-vale de células de músculo liso cultivadas e foram utilizadas entre a passagem 2 e 5.

Isolaram-se células endoteliais dos capilares e

73 766 5624-159-118 -26-cultivaram-se a partir de almofadas de gordura epididimal de ratazana, como descrito em Madri e Williams, 1983.J. Cell. Biol.. 97.:153-65, e são a seguir denominadas "RFC". Células endoteliais da aorta de vitelo (BAEC) foram isoladas e cultivadas como descrito em Madri e Furthmayr, 1980, Hum. Path.f 11:353-66. As culturas de RFC tri-dimensionais eram compostas por colagénio da derme de vitelo solúvel em ácido de tipo I e preparadas utilizando-se o processo de Madri et al.. 1988, J. Cell Biol.. 106:1375-84. Foram também realizados estudos proliferativos, migratórios e angiogénicos utilizando-se as células endoteliais microvasculares do córtex adrenal de bovino, para visar a possibilidade de diferenças devidas ao uso de duas espécies; os resultados foram equivalentes aos obtidos com RFC. 7.1.2. FACTORES DO TGF-fl 0 TGF-jSl/02 híbrido recombinante foi produzido como descrito na Secção 6, et seq. supra. O TGF-/J1 e o TGF-/J2 foram preparados, respectivamente, como descrito em Assoian et al. r 1983, J. Biol. Chem.. 258:7155-60f e em Cheifetz et al.. 1987, Cell. 48.í 409-15, e foram obtidos junto dos Drs. A. Roberts e M. Sporn no Laboratõry of Chemoprevention, National Câncer Insti-tute, Bethesda, MD.

7.1.3. COMPONENTES DA MATRIZ

As placas e os balões de culturas de tecidos foram revestidos com colagénio de tipo I de bovino, purificado, (Madri e Furthmayr, 1980, Hum. Path.. 11:353-66) a uma concentração de 12,5 jxg/ml.

7.1.4. ENSAIO DE INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO

As placas revestidas com colagénio do tipo I foram lavadas em PBS antes da adição de suspensões de células (1,4 X 104 células/placa). Passadas 6 h, determinou-se o número "inicial” de células no substrato. Nesta altura, adicionou-se às culturas meio fresco com ou sem TGF-jS. O meio e os TGF-β foram substituídos uma vez mais no dia 3. 0 número de células foi determinado retirando as células das placas de cultura com trip-sina/EDTA e contando as amostras em quadruplicado utilizando um -27- 73 766 5624-159-118 contador Coulter (Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL). Foi então calculado o número médio de células por placa, para cada adição de TGF-j8.

7.1.5. ANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS O estímulo para migração de células foi realizado por libertação das culturas confluentes da inibição de contacto, utilizando-se um dispositivo "de barreira" de aço inoxidável como previamente descrito (Pratt et al.. 1984, Am. J. Path.. 117:349-54). Assim que ocorreu a confluência nas cavidades do centro das barreiras (±6 h), induziu-se a migração por remoção das barreiras e as células foram em seguida observadas a migrar para o exterior de uma forma radial. As culturas foram de novo alimentadas no dia 3 com meio de controlo ou meio suplementado com TGF-jS. Passados 6 dias, as culturas foram lavadas com PBS, fixadas com formalina tamponada neutra a 10% e coradas com hematoxilina de Harris. O aumento líquido na área coberta foi avaliado utilizando-se um projector de cabeça e as áreas foram calculadas utilizando-se uma tabela de gráficos computorizada e um "software" "MacMeasure" (Yale Shareware, Yale University, New Haven, CT).

7.2. RESULTADOS A maior parte dos relatórios publicados indicam que as isoformas de TGF-jSl e TGF-02 são equipotentes in vitro. Contudo, os relatórios recentes indicam que estas isoformas não são funcionalmente permutáveis, uma vez que originam efeitos não semelhantes e exibem diferentes localizações espaciais e temporais (ver, por exemplo, Ohto et al.. 1987, Nature. 329:539-41; Rosa et al.. 1988, Science. 239:783-85; e Danielpour et al. . 1989, J. Cell Phvsiol.. 138:79-86) . 0 TGF-jSl é visivelmente mais eficaz que o TGF-/32 na inibição da síntese do ADN em células endoteliais (Jennings, et al.. 1988, J. Cell. Phvsiol. . 137.:167-72).

Um relatório recente refere que as isoformas de TGF-jSl e TGF-J02 originam respostas diferenciais nos ensaios de proliferação que utilizam três tipos de células vasculares 73 766 5624-159-118 -28

.'liOEBiãa (Merwin et al. . 1991, Am. J. Path. , 118.(1):37-51). Por consequência, a investigação dos efeitos do TGF-5/3 nas células endoteliais pareceu ideal para determinar se o híbrido de TGF-/31/TGF-/32 (TGF-5/3) irá induzir respostas semelhantes ao TGF-/31 ou ao TGF-/32. Os resultados indicam que o TGF-5/3 mimetizou o TGF-/31 em todos os três ensaios de proliferação examinados, ao passo que o TGF-/32 apresentou propriedades únicas. 0 TGF-jSl e o TGF-5/3 inibiram a proliferação de BAEC em mais do que 70% (+/-1,5%) à concentração óptima de 0,5 ng/ml (FIG. 4A). Em contraste, o TGF-/32 só foi capaz de induzir a inibição em cerca de 20% (+/-2,5%). Aquando da utilização das BASMC, todos os três factores de crescimento exibiram actividades inibidoras semelhantes (FIG. 4B). As células endoteliais microvasculares tiveram o seu crescimento inibido em aproximada-mente 70% (+/- 4,0%) pelo TGF-/31 e pelo TGF-5/3 à concentração de 0,5 ng/ml (FIG. 4C). Contudo, a uma concentração equivalente, o TGF-/32 só foi capaz de causar uma inibição de 37% (+/- 8%); contudo, com um aumento de 10 vezes na concentração, o TGF-/32 foi capaz de induzir uma resposta semelhante. O TGF-5/3 híbrido exerceu, identicamente, uma resposta de migração de células equivalente à induzida pelo TGF-/31. Os resultados apresentados na FIG. 5 mostram que as BAEC são inibidas pelo TGF-5/3 e pelo TGF-/B1, ao passo que as BASMC sofrem uma estimulação do crescimento por ambos os factores. Em contraste, o TGF-/B2 não teve qualquer efeito na migração de qualquer tipo de células.

Os resultados anteriores podem ajudar a explicar a resposta vascular à lesão. Após desnudação (i.e. . a seguir à angioplastia) da barreira endotelial, as plaquetas aderem e agregam-se à matriz extracelular subendotelial recentemente exposta e libertam uma variedade de moléculas. Em relação a isto, um dos principais factores libertados pelas plaquetas é o TGF-/31. Com um aumento marcado na concentração local de TGF-/31, as células endoteliais podem ser inibidas de migrar para afectar 73 766 5624-159-118 -29-

uma rápida reendotelialização da lesão embora possa ser estimulada ao mesmo tempo a migração de células do músculo liso para um gradiente de factor aumentado, estabelecendo-se assim uma oportunidade ideal para perpetuar a expansão do compartimento médio da parede do vaso e a oclusão contínua do lúmen vascular.

Embora a angiogénese seja uma resposta importante e necessária durante a embriogénese e reparação dos tecidos, é um fenómeno indesejável no contexto do crescimento de tumores sólidos. Por consequência, a compreensão da intensificação da neovascularização é de interesse primordial. As RFCs foram desenvolvidas em culturas de colagénio tridimensionais durante 4 dias, na presença ou na ausência de isoformas de TGF-/J, para se investigar a resposta angiogénica induzida por TGF-jB em células endoteliais microvasculares. As três isoformas foram todas capazes de estimular as RFC a exibir uma resposta de neovascularização. Esta "activação" endotelial foi previamente definida por análise extensa por EM (Merwin et al. . 1990, J. Cell. Phvsiol.. 142;117-29) que revelou a formação de estruturas tubulares ramificadas, complexos de junção célula-célula, estimulação metabólica (número aumentado de ribossomas e RE absorvido), polaridade celular, deposição e organização de proteínas da matriz celular e formação do lúmen. A FIG. 6A mostra culturas de controlo sem factor de crescimento exógeno. As células permanecem independentes umas das outras e carecem de estruturas tubulares, ao passo gue o tratamento com TGF-/31 (FIG. 6B) revela formações semelhantes a tubo, complexas. 0 TGF-j32 (FIG. 6C) foi capaz de iniciar uma resposta angiogénica modesta. Contudo, como com os estudos de proliferação das RFC, foi necessário um aumento na concentração do TGF-/32 de 0,5 para 5,0 ng/ml para se estabelecer as estruturas tubulares complexas. O TGF-5jB mimetizou o TGF-/31, com início da formação de tubos com um mínimo de 0,05 ng/ml (FIG. 6D) e uma neovascularização óptima atingida a uma concentração de 0,5 ng/ml (FIG. 6E). Observou-se uma ligeira inibição da resposta angiogénica à maior concentração utilizada, 5,0 ng/ml

-30- 73 766 5624-159-118 (FIG. 6F).

Em resumo, o TGF-50 mimetiza o TGF-/31 na inibição da proliferação de culturas de células endoteliais dos micro e dos grandes vasos de monocamada, de baixa densidade, em aproximada-mente 70% e em aproximadamente 45% nas BÀSMC. Em contraste, uma concentração equivalente de TGF-/J2 não é eficaz nas BAEC e é equivalente nas BASMC. Além disso, é necessário um aumento de 10 vezes na concentração de TGF-JB2 para se originar uma resposta similar nas RFC. Aquando da utilização de uma cultura que começa com uma monocamada confluente, apertada, há diferenças na resposta induzida pelas isoformas. Em particular, o TGF-jSl e o TGF-/32 induzem níveis equivalentes de intensificação da migração das BASMC e de inibição da migração das BAEC, ao passo que o TGF-/J2 não influencia a migração de qualquer tipo de células. Finalmente, em células endoteliais microvasculares que respondem à lesão in vivo por neovascularização, os três TGF-jS foram capazes de estimular a angiogénese in vitro. Contudo, foi necessário um aumento de 10 vezes na concentração do TGF-/32 para se igualar o nível de resposta induzido pelos TGF-/31 e TGF-5jS. 8. DEPÓSITO DOS MICROORGANISMOS 0 transfectante seguinte foi depositado na American Type Culture Collection, Rockville, MD, e foi-lhe atribuído o número de acesso indicado.

Transfectante Plasmídeo Na de Acesso CHO-5J041,2.5 CL 5 p5j8/dhfr CRL 9959 0 presente invento não está limitado, em âmbito, pela linha celular depositada ou pelas concretizações aqui descritas que se destinam a ser ilustrações simples de um aspecto do invento e -todas as que são funcionalmente equivalentes estão no âmbito do invento. De facto, tornar-se-ão evidentes para aqueles peritos na arte, a partir da descrição anterior, várias modificações do invento, para além daquelas aqui mostradas e descritas. Tais modificações destinam-se a estar no âmbito das reivindicações 73 766 5624-159-118 m,.-

Cj-, y' -31-

apensas.

Deve-se compreender também que todos os números e tamanhos dos pares de bases e resíduos de aminoácido, dados para os nucleótidos e péptidos, são aproximados e utilizados com o fim de descrição.

Claims (7)

1. 5624-159-118 -32- REIVINDICACÕES

   1 - Composição farmacêutica compreendendo factor de crescimento transformante quimérico β1/β2 caracterizada por ser para uso na inibição da proliferação de células endoteliais vasculares.
2. 2 - Composição farmacêutica compreendendo factor de crescimento transformante quimérico β1/β2 caracterizada por ser para uso na indução da migração de células do músculo liso.
3. 3 - Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-factor de crescimento transformante quimérico β1/β2 caracterizada por ser para uso na inibição da neovascularização de células microvasculares.
4. 4 - Processo de produção de factor de crescimento transformante quimérico maduro TGF-50, caracterizado por se inserir numa célula de mamífero um vector de expressão codificando uma proteína precursora de TGF-5/3 compreendendo os aminoácidos l a 390, -261 AGGGGATCTGTGGCAGGTCGGAGA---AAGA-234 CTCC..C...CCA,,.A..CCCT.TTC... . Símio TC---CGTCTCCTGGTACCAGATCTCGCCCATCTAGGTTATTTCCGTGGGATACTGAGACACCCCCGGTCCAAGCCTCC -158 Humano C. ACC. AC. . T.............G ..................................................... Símio CCTCCACCACTGCGCCCTTCTCCCTGAGGA-CCTCAACTTTCCCTCGAGGCCCTCCTACCTTTTCCCGGGGGACCCCCA - 80 Humano ’ * ’ Símio GCCCCTGCAGGGGCGGGGCCTCCCCACCAAACTAGCCCTGTTCGCGCTCTCGGCAGTGCCGGGGGGCGCCGCCTCCCCC -1 Humano 10 20 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Leu Leu Vai 60 Símio ATG CCG CCC TCC GGG CTG CGG CTG CTG CCG CTG CTG CTA CCA CTG CTG TGG CTA CTG GTG Humano Gly Pr o 30 40 Símio Leu Thr Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu 120 Humano CTG ACG CCT AGC CGG CCG GCC GCA GGA CTA TCC ACC TGC AAG ACT ATC GAC ATG GAG CTG 50 60 Símio Vai Lys Arg Lys Arq Xle Glu Thr Ile Arg Gly Gin Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala 180 Humano GTG AAG CGG AAG CGC ATC GAG ACC ATC CGC GGC CAG ATC CTG TCC AAG CTG CGG CTC GCC 70 80 Símio Ser Pro Pro Ser Gin Gly Glu Vai Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Vai Leu Ala Leu 240 Humano AGC CCC CCG AGC CAG GGG GAG GTG CCG CCC GGC CCG CTG CCC GAG GCC GTG CTC GCC CTG 90 100 300 Símio Tvr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Vai Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu Fro Glu Pro Glu Humano TAC AAC AGC ACC CGC GAC CGG GTG GCC GGG GAG AGT GCG GAG CCG GAG CCC GAA CCG GAG

   73 766 5624-159-118 -33- 110 símio Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Vai Thr Arg Vai Leu Met Vai Glu Thr His Asn Glu Ile Hunano GCC GAC TAC TAC GCC AAG GAG GTC ACC CGC GTG CTA ATG GTG GAA ACC CAC AAC GAA ATC 360 130 140 Símio Humano Tyr Asp Lys Phe Lys Gin Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu TAT GAC AAG TTC AAG CAG AGC ACA CAC AGC ATA TAT ATG TTC TTC AAC ACA TCA GAG CTC ....................T....................................... 420 150 Slmio Humano Arg Arg Glu Ala Vai Pro Glu Pro Vai Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu --- Arg CGA GAA GCA GTA CCT GAA CCT GTG TTG CTC TCC CGG GCA GAG CTG CGT CTG CTG --- AGG ........G...........C.............................. 477 AGG J ) J 160 170 Slmio Hunano Slmio Humano Slmio slmio Símio Símio Humano Símio Humano Símio Símio Hunano Símio Humano Leu Lys Leu Lys Vai Glu Gin His Vai Glu Leu Tyr Gin Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp 537 CTC AAG TTA AAA GTG GAG CAG CAT GTG GAG CTG TAC CAG AAA TAC AGC AAC AAT TCC TGG 180 190 Asp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asn Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp 597 CGA TAC CTC AGC AAC CGG CTG CTG GCG CCC AGC AAC TCG CCG GAG TGG TTG TCT TTT GAT 200 210 Vai Thr Gly vai Vai Arg. Gin Trp Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu 657 GTC ACC GGA GTT GTG CGG CAG TGG TTG AGC CGC GGA GGG GAA ATT GAG GGC TTT CGC CTT 220 Arg 230 Ser Ala His Cys Ser Cys Asp Ser Lys Asp Asn Thr Leu Gin Vai Asp Ile Asn Gly Phe 717 AGC GCC CAC TGC TCC TGT GAC AGC AAA GAT AAC ACA CTG CAA GTG GAC ATC AAC GGG TTC .GG 240 250 Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu 777 ACT ACC GGC CGC CGA GGT GAC CTG GCC ACA ATT CAT GGC ATG AAC CGG CCT TTC CTG CTT 260 270 Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gin His Leu Gin Ser Ser Arg His Arq Arq Ala 837 CTC ATG GCC ACC CCA CTG GAG AGG GCC CAA CAT CTG CAA AGC TCC CGG CAC CGC CGA GCC 280 290 Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Vai Gin Asp Asn Cys Cys Leu Arg Pro Leu Tyr 897 CTG GAC ACC AAC TAC TGC TTC AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC TGC CTA CGT CCG CTT TAC . .C 300 310 Ile Asp Phe Lys Arq Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala 957 ATT GAC TTC AAG AGG GAC CTC GGC TGG AAG TGG ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC .. . . .T ... . .T 320 330 Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gin Tyr Ser Lys Vai 1017 AAC TTC TGC CTG GGG CCC TGT CCC TAC ATT TGG AGC CTG GAC ACG CAG TAC AGC AAG GTC 340 350 Leu Ala Leu Tyr Asn Gin His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Vai Pro Gin 1077 CTG GCC CTG TAC AAC CAG CAT AAC CCG GGC GCC TCG GCG GCG CCG TGC TGC GTG CCG CAG 360 370 Símio Humano Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Vai Tyr Tyr Vai Gly Arg Lys Pro Lys Vai Glu Gin Leu 1137 GCG CTG GAG CCA CTG CCC ATC GTG TAC TAC GTG GGC CGC AAG CCC AAG GTG GAG CAG CTG ...........G................................................ 390 390 Símio Humano Símio Humano Símio Humano Ser Asn Met Ile Vai Arg Ser Cys Lys Cys Ser TCC AAC ATG ATC GTG CGC TCC GTC AAA TGC AGC ..........................G...... TGA GGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCACCCCGGCAG 1204 .....T..................G......... GCCCGGCCCCGCCCCACCCCACCCCCGCTGTCTTGCCCTTGGGGGCTGTATTTAAGGACACCCGTGCCCCAAGCCCACC I283 AGG C A TGGGGCCCCATTAAAGA 1300 -34- 73 766 5624-159-118 ou codificando uma proteína precursora de TGF-5j0 compreendendo os aminoácidos 1 a 390, tal como se apresentou acima, com excepção do aminoácido 33 ser serina.
5. 5 - Molécula de ADN isolada que codifica uma proteína precursora de TGF-j81/j82, caracterizada por compreender os aminoácidos 1 a 390, tal como se apresentou na reivindicação 1, com excepção do aminoácido 33 ser serina.
6. 6 - Vector de expressão caracterizado por compreender a molécula de ADN da reivindicação 5.
7. 7 - Célula de mamífero transformada, caracterizada por conter o vector de expressão da reivindicação 6. Lisboa, 13l HARL i992 Por BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY =0 AGENTE 0FICIAL=