PT1003785E - Métodos para o isolamento de proteinas inibidoras da proteinase a partir de tubérculos de batata - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "MÉTODOS PARA 0 ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS INIBIDORAS DA PROTEINASE A PARTIR DE TUBÉRCULOS DE BATATA"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção está, na generalidade, direccionada para métodos de isolamento de proteínas inibidoras da proteinase a partir de tecidos de plantas, mais particularmente, para o isolamento de proteínas inibidoras da proteinase estáveis ao calor a partir de tubérculos de batata.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os tubérculos de plantas Solanaceous, tais como da batata, são uma fonte abundante de uma grande variedade de classes de proteínas inibidoras de proteinase. Muitas destas proteínas inibem a actividade de proteinases digestivas, tais como a tripsina e a quimotripsina, que ocorrem naturalmente quer em insectos quer em mamíferos. Através da perturbação do processo digestivo natural, os inibidores da proteinase formam parte das defesas naturais da planta contra o forrageio por herbívoros. Pelas mesmas razões, os inibidores de proteinase têm uma aplicação no controlo de pragas industriais, no controlo de insectos tais como as formigas-de-fogo.

Adicionalmente, estes inibidores, que também inibem as proteinases digestivas humanas, têm um valor na indústria farmacêutica para o controlo da obesidade e diabetes.

Os tubérculos de batata têm sido a maior fonte para o estudo e preparação dos inibidores da proteinase. Diversos inibidores de proteinase presentes nos tubérculos da batata 1 são da variedade estável ao calor. Entre estes, estão dois inibidores de proteinase do tipo Kunitz com uma subunidade Mr de cerca de 20 e 20.5 kD que inibem quer a tripsina quer a quimotripsina (Walsh and Twichell, Plant Physiol. 97: 15-18, 1991) . A proteína menor é um inibidor potente da quimotripsina e um fraco inibidor da tripsina. A proteína maior é um inibidor potente da tripsina. Outros inibidores de proteinase estáveis ao calor incluem um com uma subunidade Mr de cerca de 9.5 kD (o designado inibidor da proteinase I) que é um forte inibidor da quimotripsina (Melville and Ryan, J. Biol. Chem. 247:3445-3453, 1972) e outro com uma subunidade Mr de cerca de 10.5 kD (o designado inibidor da proteinase II) que é um forte inibidor da quimotripsina e tripsina (Bryant, Green and Ryan, Biochemistry 15: 3418-3424, 1976).

Os métodos anteriores para a preparação destes inibidores de proteinase estáveis ao calor têm numerosos passos incorporados, incluindo: extracção, na presença de ditionato, calor, precipitação com sulfato de amónio e cromatografia (Walsh and Twichell, Plant Physiol. 97:15-18,1991: Melville and Ryan, J. Biol. Chem. 247:3445-3453, 1972; Bryant, Green and Ryan, Biochemistry 15: 3418-3424, 1976; Ryan and Kassell, Methods in Enz. XIX: 883-889, 1970; Pearce and Ryan, Anal. Biochem. 130: 223-225, 1983). Infelizmente, estes métodos são incómodos, fastidiosos, morosos, caros e produzem rendimentos relativamente baixos de inibidores da proteinase estáveis ao calor. Um dos maiores problemas é que os extractos iniciais formam um homogenato pastoso com características de fluxo fracas que resulta em dificuldades nos passos de processamento subsequentes, especialmente a filtração, a precipitação com sulfato de amónio e ressolubilização. Por vezes a consistência pastosa requer o uso de filtração pressurizada durante os passos subsequentes, especialmente em extracções de larga escala (Ryan and Kassell, 1970). Além disso, a consistência 2 pastosa reduz o rendimento por causa da dificuldade na recuperação completa do material a partir da pasta. Estes métodos anteriores também têm desvantagens porque requerem pessoal especializado para executar e, geralmente, demoram vários dias para completar.

Deste modo, existe uma necessidade na arte de um método para isolar inibidores de proteinase a partir de tecidos de plantas, especialmente tubérculos de batata, que acabe com o problema do extracto pastoso, elimine a necessidade da precipitação com sulfato de amónio, seja rápido, não dispendioso, simples de realizar e fácil de atingir em qualquer escala desde a de laboratório até à de um processo industrial em larga escala. A presente invenção preenche estas necessidades e fornece ainda outras vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Resumidamente, esta invenção, tal como definida nas reivindicações, está relacionada com métodos simples e rápidos de isolamento de proteínas inibidoras da proteinase estáveis ao calor a partir de tecidos de plantas, contendo as mesmas, particularmente tubérculos de batata. 0 método compreende três passos. Primeiro, as proteínas a partir dos tubérculos de batata são extraídas numa forma solúvel num meio de extracção aquoso/álcool tal como ácido fórmico diluído e 20% de etanol. Uma presença de etanol no meio de extracção converte o homogenato pastoso num extracto alcoólico macio fluido que é fácil de ser manipulado e particularmente fácil de filtrar. Segundo, o álcool é aquecido a uma primeira temperatura e depois arrefecido a uma segunda temperatura. O aquecimento na presença de álcool desnatura a maior parte das proteínas indesejadas no extracto de álcool e arrefecimentos subsequentes levam à formação de uma fase precipitada constituída por debris e uma fase solúvel que contém as 3 ao calor. proteínas inibidoras de proteinase estáveis Terceiro, as proteínas inibidoras de proteinase estáveis ao calor são precipitadas a partir da fase solúvel por diálise contra um meio de diálise adequado, tal como ácido fórmico diluído ou água seguida por ácido fórmico diluído. As proteínas precipitadas podem ser uma proteína inibidora única - inibidor da proteinase II, ou uma mistura de inibidor da proteinase II e dois inibidores da proteinase de Kunitz (um mais activo contra tripsina e outro mais activo contra quimotripsina). As proteínas inibidoras de proteinase precipitadas estão livres do meio das outras proteínas e de outros constituintes originalmente presentes no tubérculo.

Se as proteínas precipitadas constituem o inibidor único ou a mistura de inibidores é determinado por uma modificação única. Esta modificação está relacionada com a temperatura de aquecimento seleccionada para o passo de desnaturação. 0 inibidor único pode ser obtido até um aquecimento de 70°C, arrefecimento de 50°C seguido por diálise contra ácido fórmico a 0.22%. A mistura inibidora pode ser obtida por aquecimento a 50°C, arrefecimento à temperatura ambiente seguido por diálise contra água, onde a água de diálise é ainda seguida pela adição de ácido fórmico a 0.88%.

Excluindo o tempo de diálise, o método completo pode ser realizado em menos de uma hora, comparado com os dias que são necessários pelos métodos anteriores. O método é simples, pode ser realizado por técnicos não especializados e é fácil de realizar em qualquer escala. Isto evita o uso de sulfato de amónio e passos de cromatografia dispendiosos e mesmo o etanol pode ser recuperado o que reduz ainda mais os custos do processo do método. O método pode ter um rendimento de 300 mg de proteínas inibidores da proteinase substancialmente puras a partir de 453.6 g (1 libra) de batatas o que é largamente superior aos 150 mg de rendimento de proteínas menos puras a 4 partir de 4.54 kg (100 libras) de batatas usando os métodos anteriores.

Estes e outros aspectos da invenção são evidentes com referência à descrição detalhada e desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é a análise por HPLC de um extracto aquoso/álcool tratado com calor representativo preparado de acordo com esta invenção antes da diálise. A Figura 2 é a análise por HPLC de uma primeira mistura da proteína inibidora da proteinase, pós-diálise, preparada de acordo com esta invenção. A Figura 3 ilustra a análise por electroforese em gel de uma primeira mistura da proteína inibidora da proteinase preparada de acordo com esta invenção • A Figura 4 ilustra a actividade do inibidor de proteinase duma primeira mistura da proteína inibidora da proteinase preparada de acordo com esta invenção • A Figura 5 ilustra a actividade do inibidor de proteinase duma segunda mistura da proteína inibidora da proteinase preparada de acordo com esta invenção. A Figura 6 é a análise por HPLC de uma segunda mistura da proteína inibidora da proteinase preparada de acordo com esta invenção. A Figura 7 ilustra a análise por electroforese em gel de uma segunda mistura da proteína inibidora da proteinase preparada de acordo com esta invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como mencionado acima, a presente invenção está direccionada para o isolamento de uma ou mais proteínas inibidoras da proteinase estáveis ao calor a partir de um tecido de plantas que contenha as mesmas. Os tubérculos de 5 batata são um dos tecidos de planta particularmente bem estudados que são conhecidos por conterem, abundantemente, várias classes de inibidores da proteinase estáveis ao calor. Assim, numa modalidade desta invenção, é revelado um método para o isolamento de proteínas inibidoras da proteinase estáveis ao calor a partir de tubérculos de batata. Será também evidente para os especialistas na arte que este método pode ser adaptado à extracção de outros inibidores de proteinase a partir de outros tecidos de plantas, fornecendo os inibidores que são estáveis ao calor e solúveis numa solução que compreende álcool e água. Em adição aos tubérculos de batata, os tecidos representativos podem incluir, mas não se limitam a, tubérculos de batatas-doces ou mandioca, folhas e frutos de batatas, tomates e legumes, sementes de todas as espécies de plantas, bem como organismos geneticamente modificados que expressem genes de inibidores da proteinase.

Na prática desta invenção, o método para preparar proteínas inibidoras da proteinase a partir de tecidos de plantas inclui três passos.

No primeiro passo, as proteínas são extraídas a partir de tecido num meio de extracção água/álcool para obter um extracto alcoólico. A "extracção" significa romper a estrutura celular do tecido da planta de modo a libertar e solubilizar os conteúdos celulares para o meio de extracção. 0 passo inicial da extracção é normalmente conhecido na arte como "homogeneização", que pode compreender um processo disruptivo mecânico tal como esmagamento, moagem, mistura, sonicação ou outra técnica. Na presente invenção o meio de extracção é compreendido por uma solução com uma porção aquosa e uma porção de álcool. A porção aquosa, idealmente, deve ser seleccionada para ser uma que irá, preferivelmente, solubilizar os inibidores de proteinase enquanto promove, simultaneamente, a precipitação de proteínas indesejadas e 6 outras macromoléculas libertadas a partir do tecido. As soluções ácidas e soluções com grande teor de sal (superior a 0.3 M) , têm uma tendência para precipitar muitas macromoléculas, tais como proteínas e ácidos nucleicos, ao passo que vários inibidores da proteinase são solúveis nas mesmas. Assim, uma modalidade desta invenção usa uma porção aquosa que compreende ácido fórmico diluído e elevado teor em sal. O álcool também tem uma tendência para precipitar macromoléculas e esta invenção revela que alguns inibidores da proteinase permanecem solúveis em solução com álcool. O meio de extracção também inclui uma porção de álcool. O álcool pode ser adicionado à porção aquosa do meio de extracção durante ou após a homogeneização do tecido da planta sem alterar, substancialmente, os resultados. Nas modalidades aqui reveladas, o álcool é adicionado à solução aquosa durante o processo de homogeneização. 0 etanol é usado a cerca de 20% v/v nas modalidades preferidas aqui descritas. No entanto, outros álcoois podem servir de substitutos, incluindo, mas não se limitando a, metanol, propanol ou fenol bem como outros compostos orgânicos miscíveis em água. Os substitutos de álcoois podem ser avaliados por extracção do tecido da planta usando meios que compreendem uma variedade de álcoois numa variedade de concentrações. Após a centrifugação dos debris, o doseamento dos níveis de proteína e as actividades específicas do inibidor da proteinase no sobrenadante determina um tipo de álcool e concentração em que se obtém a actividade específica mais elevada. O homogenato inicial pode ser preparado numa solução de ácido fórmico diluído e sal. Por exemplo, os tubérculos de batata podem ser homogeneizados numa misturadora num meio com uma concentração final de cerca de 0.2% de ácido fórmico e NaCl 0.3 Μ. O etanol é adicionado durante o processo de 7 homogeneização. A adição de etanol deste modo é particularmente útil para extractos preparados a partir de tubérculos de batata porque o etanol modifica a consistência do homogenato a partir duma pasta de amido pegajosa para um extracto alcoólico macio fluido. Isto facilita as manipulações subsequentes do extracto de álcool, tal como a remoção de debris grosseiros. Nas modalidades aqui descritas, os debris são removidos por compressão do extracto de álcool através dum pano para coalhos. Outros modos para se conseguir a remoção dos debris inclui, mas não se limita a, centrifugação, filtração através de materiais naturais tais como terras de diatomáceas, filtração através de filtros sintéticos, extrusão através de redes de malha e outras técnicas.

No segundo passo, o extracto de álcool é aquecido até uma primeira temperatura e depois arrefecido até uma segunda temperatura. Isto provoca a desnaturação e precipitação de muitas proteínas indesejadas presentes no extracto que formam uma fase precipitada insolúvel e uma fase solúvel. A desnaturação é um processo que causa a disrupção das estruturas secundárias e terciárias das proteínas causando o seu desenrolamento ou então a perda das suas características nativas. A desnaturação pode ser irreversível se depois as proteínas não conseguirem readquirir as suas características nativas. 0 álcool promove a desnaturação de muitas proteínas, especialmente na presença do calor. Após o arrefecimento, as proteínas desnaturadas são susceptíveis de se agregarem para formar precipitados insolúveis. Na prática desta invenção, vários inibidores de proteinase não são desnaturados irreversivelmente e permanecem solúveis quando são aquecidos e arrefecidos na presença de álcool, enquanto a maior parte das outras proteínas precipitam. Em particular, as modalidades aqui descritas mostram que vários inibidores de proteinase a partir de tubérculo de batata permanecem activos e solúveis 8 num extracto de álcool com 20% de etanol que foram aquecidos até uma primeira temperatura e arrefecidos até uma segunda temperatura.

Geralmente, o extracto de álcool deve ser aquecido até uma primeira temperatura que é suficiente para desnaturar as proteínas indesejadas, mas não suficientemente quente para desnaturar irreversivelmente os inibidores da proteinase. O extracto deve então ser arrefecido até uma segunda temperatura baixa o suficiente para facilitar a agregação de um precipitado. Após o arrefecimento, vai-se desenvolver uma fase precipitada insolúvel com as proteínas desnaturadas e outros debris. A fase de precipitado pode ser separada da fase que permanece solúvel por centrifugação, filtração ou outro método equivalente para obter uma fase solúvel límpida. A fase solúvel contém a proteína inibidora da proteinase. A selecção da primeira e segunda temperaturas do passo de aquecimento podem ser determinantes do tipo de inibidor obtido porque inibidores da proteinase diferentes têm propriedades de desnaturação e/ou precipitação diferentes. Numa modalidade que usa extractos de álcool de tubérculos de batata, a primeira temperatura é 7 0°C e a segunda temperatura é 50°C. Obtém-se, assim uma preparação com inibidor da proteinase II. Numa outra modalidade que usa o mesmo extracto de álcool de tubérculos de batata, a primeira temperatura é 50°C e a segunda temperatura é à temperatura ambiente. Obtém-se assim uma mistura com três inibidores diferentes - inibidor da proteinase II e dois inibidores de proteinase de Kunitz, um mais activo contra a tripsina e o outro mais activo contra a quimotripsina. O método permite a selecção da primeira e da segunda temperaturas para o passo de aquecimento para serem modificadas conforme for necessário para obter os melhores rendimentos de tipos particulares de proteínas inibidoras da proteinase e para variedades particulares de tecidos de 9 plantas. Por exemplo, dentro de uma modalidade, os extractos de álcool a partir de um tecido duma planta particular podem ser tratados para uma série de primeira e segunda temperaturas diferentes. Após a centrifugação dos debris, o doseamento dos níveis de proteína e as actividades específicas do inibidor da proteinase no sobrenadante determina o tratamento de aquecimento em que se obtém a actividade específica mais elevada. 0 álcool pode ser recuperado da fase solúvel após o tratamento de aquecimento do extracto de álcool. Numa modalidade, o etanol pode ser recuperado por evaporação na segunda temperatura à qual o extracto de álcool já foi arrefecido. Numa outra modalidade, o álcool não precisa ser recuperado. Em qualquer caso, no método, a presença ou ausência do álcool não irá afectar os passos subsequentes.

No terceiro passo do método, os inibidores de proteinase são recuperados a partir da fase solúvel por precipitação através de diálise contra um meio que irá promover a precipitação dos inibidores, preferivelmente, uma solução de diálise ácida que empregue um ácido prótico, tal como um ácido orgânico e mais preferivelmente ácido fórmico. A diálise promove não apenas a precipitação para recuperar as proteínas mas também elimina as proteínas menores e outras moléculas transportadas através dos passos anteriores. A selecção do meio de diálise é, em parte, determinada pelos inibidores da proteinase a serem isolados. Numa modalidade, o ácido fórmico diluído em cerca de 0.22% é usado para recuperar o inibidor da proteinase II a partir de tubérculos de batata. Noutra modalidade, é preferida água da distribuição para recuperar uma mistura de três inibidores da proteinase a partir de tubérculos de batata. Quando a água de distribuição é usada como meio de diálise as proteínas podem ser precipitadas através da adição subsequente de ácido fórmico a cerca de 10 0.88%. Em qualquer caso, a diálise faz-se através duma membrana com corte de peso molecular de 12000 - 14000 Daltons. À medida que o sal, álcool residual e outras moléculas pequenas presentes no extracto solúvel são removidos, vai formar-se um precipitado branco que conterá os inibidores da proteinase. Numa modalidade à escala laboratorial, 12 a 24 horas de diálise são suficientes para a formação completa do precipitado. No entanto, pode-se substituir por outros métodos de diálise, troca de solutos, ou precipitação que podem dar um melhor rendimento ou uma recuperação mais rápida dos inibidores da proteinase.

As proteínas precipitadas podem ser recuperadas por filtração, centrifugação ou outros métodos. As proteínas precipitadas contêm uma mistura de proteínas inibidoras da proteinase numa variedade de graus de pureza. Uma ou mais proteínas inibidoras da proteinase podem constituir >90% da proteína total do precipitado. Este precipitado pode ser considerado uma mistura substancialmente pura de proteínas inibidoras da proteinase. O precipitado pode ser dissolvido num solvente adequado para uma utilização pretendida ou formulação subsequente dos inibidores da proteinase. Nas modalidades aqui apresentadas, os precipitados são dissolvidos em bicarbonato de amónio 0.1 Μ o qual é adequado para a solubilização e liofilização subsequente - um método conhecido para armazenamento estável dos inibidor da proteinase. A metodologia geral aqui descrita é adequada para a preparação duma variedade de proteínas inibidoras de proteinase estáveis ao calor, fornecidas a partir duma variedade de tecidos de plantas, em que os inibidores são resistentes à desnaturação irreversível na presença de álcool e calor. Este método permite obter misturas de proteínas inibidoras de proteinase com vários graus de pureza que dependem, sobretudo, do tecido específico usado, os inibidores 11 da proteinase presentes e nos álcoois particulares, temperaturas e meio de diálise empregues para o método. Quando optimizado para um dado tecido, podem ser obtidos rendimentos elevados de composições substancialmente puras de inibidores da proteinase como pode ser visto nos exemplos para inibidores da proteinase de tubérculos de batata descritos abaixo. Agora são apresentados os exemplos como forma de ilustração e não constituem uma limitação.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

PREPARAÇÃO DE INIBIDOR DA PROTEINASE II DE BATATA

Foram homogeneizadas 453.6 g (1 libra) de batatas Russet Burbank numa misturadora na presença de 100 ml de ácido fórmico 0.88% e NaCl 1.5 M durante 2 minutos. Durante a mistura, foram adicionados lentamente ao homogenato 125 ml de etanol 95% para se obter a concentração final de etanol de cerca de 20%. Isto modifica o homogenato de uma pasta para uma mistura liquida o que facilita a filtração. Os debris grosseiros insolúveis foram removidos por compressão do liquido através de 8 camadas de pano para coalhos. O filtrado liquido foi recolhido como o extracto de álcool. O extracto de álcool foi transferido para um balão de evaporação e aquecido com agitação por imersão do balão num banho de água em ebulição até a temperatura ter alcançado 70°C. Neste ponto, o balão foi conectado no encaixe do evaporador com uma temperatura de banho de 50°C. O evaporador foi usado para recuperar o etanol, no entanto, não é necessário remover o etanol para continuar com o método. O liquido resultante foi centrifugado a 4000 x g para remover o amido em excesso e a fase precipitada insolúvel que se formou, 12 o sobrenadante límpido, que representa a fase solúvel, foi recolhido. A fase solúvel foi colocada numa banda de diálise de corte de peso molecular de 12000 - 14000 e dialisada contra 10 litros de ácido fórmico a 0.22% durante pelo menos 12 horas com várias trocas de solução de ácido fórmico; Nesta altura formou-se um precipitado branco no saco. O precipitado era inibidor da proteinase II puro que foi recuperado por centrifugação a 4000 x g durante 5 minutos. O precipitado foi dissolvido em bicarbonato de amónio 0.1 M e liofilizado. O rendimento foi de aproximadamente 57 mg de inibidor por 453.6 g (1 libra) de batatas. Podem ser conseguidos melhores rendimentos começando com batatas recentemente colhidas ou variedades de batata com níveis elevados de inibidor da proteinase II.

As Figuras 1 e 2 mostram análises de HPLC dos materiais recuperados a partir deste procedimento. As duas figuras mostram a absorvância espectrofotométrica a 280 nm de materiais eluídos a partir de uma coluna C18 semipreparativa (Vy-dac, Catalog #218TP510, 5, 10 x 250 mm) que foi

desenvolvida a 2 ml/min durante mais de 45 minutos com um gradiente linear desde 20% do solvente A (ácido trifluoroacético a 0.1%) até 50% do solvente B (trifluoroacético a 0.1%/acetonitrilo). A Figura 1 mostra o material solúvel presente na fase solúvel límpida recuperada após a desnaturação por calor do extracto de álcool no passo 2 antes da diálise. A Figura 2 mostra o material presente no precipitado formado após a diálise no passo 3. O precipitado foi dissolvido no solvente A para análise. A Figura 3 mostra uma análise de electroforese em gel do material no pico #1 a partir da análise de HPLC da Figura 2. A Linha 1 é uma amostra do homogenato inicial de batata antes da adição de etanol. As Linhas 2, 3, e 4 são amostras da fracção 13 dianteira, média e traseira, respectivamente, do pico #1. 0 pico 1 foi ainda sujeito a análise imunológica que identificou o material como sendo o inibidor da proteinase II de batata. A Figura 4 mostra a actividade do inibidor da proteinase II do pico #1 a partir da Figura 2. 0 material mostrou-se como sendo um forte inibidor quer de tripsina (T) quer de quimotripsina (C) . Para a inibição de tripsina: 4.0 μρ de material inibiram 2 μg de tripsina. Para a inibição de quimotripsina: 1.4 μρ inibiram 1.5 μρ de quimotripsina. Esta actividade, do inibidor duplamente aquecido, é caracteristica do inibidor da proteinase II. EXEMPLO 2

PREPARAÇÃO DUMA MISTURA DE INIBIDORES DA PROTEINASE DE BATATA A PARTIR DE BATATAS

Um extracto de álcool foi preparado como descrito acima no Exemplo 1. O extracto de álcool foi aquecido com agitação com imersão do balão num banho de água em ebulição até a temperatura alcançar 50°C. Nesse ponto o balão foi imerso num banho de água corrente frio de modo a que a temperatura reduza até à temperatura ambiente. O líquido resultante foi centrifugado a 4000 x g para remover o amido em excesso e a fase precipitada insolúvel, o sobrenadante límpido, que representa a fase solúvel, foi recolhido. A fase solúvel foi colocada numa banda de diálise com corte de peso molecular de 12000 - 14000 e dialisado contra água de distribuição corrente durante 24 horas. Após este tempo ou a solução no saco foi ajustada para ácido fórmico a 0.88% ou, alternativamente, a solução de diálise foi ajustada para ácido fórmico a 0.88% e a diálise continuou durante mais 4 horas. Nesta altura formou-se um precipitado branco no saco. O precipitado continha uma mistura de inibidor de proteinase 14 II e dois inibidores da proteinase da família Kunitz como mostrado nas Figuras 5 e 6 abaixo. 0 precipitado foi recuperado, dissolvido e liofilizado como no Exemplo 1. 0 rendimento foi aproximadamente 300 mg de inibidores por 453.6 g (1 libra) de batatas. Novamente, podem ser possíveis melhores rendimentos começando com batatas recentemente colhidas ou variedades de batata com níveis elevados de inibidor da proteinase II. A Figura 5 mostra a actividade do inibidor da proteinase da mistura precipitada recuperada. Descobriu-se que o material inibe fortemente a tripsina (T) e a quimotripsina (C) . Para a inibição de tripsina: 3.2 μρ de material inibiram 2.0 μρ de tripsina. Para a inibição de quimotripsina: 2.2 μρ inibiram 1.5 μρ de quimotripsina. A Figura 6 mostra a análise por HPLC do material final precipitado recuperado a partir deste procedimento. As condições foram as mesmas das descritas na Figura 2. Os três picos identificados foram sujeitos a análise de electroforese em gel como mostrada na Figura 7. As Linhas 1, 2, e 3 são os materiais dos picos #1, # 2 e #3, respectivamente, da Figura 6. Tal como anteriormente, a análise imunológica identificou o material no pico #1 como sendo o inibidor da proteinase II de batata. Os materiais dos picos 2 e 3 foram sujeitos a análise para sequência de aminoácidos. A análise identificou o pico 2 como um inibidor da família Kunitz com uma forte actividade inibitória para a quimotripsina e um fraco inibidor da tripsina. O pico 3 foi identificado como um inibidor da família Kunitz com uma forte actividade inibitória para a tripsina.

Lisboa, 18 de Dezembro de 2006 15

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES 1- Um método para obter uma proteína inibidora da proteinase estável ao calor a partir de tubérculos de batata, tubérculos de batatas-doces ou mandioca, folhas e frutos de batatas, tomates e legumes, sementes de todas as espécies de plantas, ou organismos geneticamente modificados que expressam genes inibidores da proteinase, caracterizado por compreender os passo de: extrair a proteína inibidora da proteinase a partir de tecidos num solvente aquoso/álcool para formar um extracto de álcool com uma proteína inibidora da proteinase solubilizada; aquecer o extracto de álcool até uma primeira temperatura seguindo-se o arrefecimento até uma segunda temperatura para formar uma fase precipitada insolúvel e uma fase solúvel; e precipitar a proteína inibidora da proteinase a partir da fase solúvel por diálise contra uma solução de diálise acídica. 2- 0 método, de acordo com a reivindicação N° .1, caracterizado por os tecidos serem tubérculos de batata. 3- 0 método, de acordo com a reivindicação N°. 1, caracterizado por a proteína inibidora da proteinase ser o inibidor da proteinase II de batata. 4- 0 método, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por a proteína inibidora da proteinase ser uma mistura do inibidor da proteinase II de batata, um inibidor de quimotripsina/tripsina da família Kunitz com uma actividade inibitória para a quimotripsina dominante e um inibidor de quimotripsina/tripsina da família Kunitz com uma actividade inibitória para a tripsina dominante. 1 5- 0 método, de acordo com a reivindicação N° .1, caracterizado por o solvente aquoso/álcool ser constituído por uma concentração final de cerca de 0.2% de ácido fórmico, NaCl a cerca de 0.3 M e cerca de 20% etanol; a primeira temperatura ser cerca de 70°C ou acima; a segunda temperatura ser cerca de 50°C ou abaixo; e a solução aquosa de diálise conter cerca de 0.22% de ácido fórmico.
2. 6- O método, de acordo com a reivindicação N° .1, caracterizado por o solvente aquoso/álcool compreender cerca de 0.2% de ácido fórmico, NaCl a cerca de 0.3 M e cerca de 20% de etanol; a primeira temperatura ser cerca de 50°C; a segunda temperatura ser cerca de 27°C ou abaixo; e a solução aquosa de diálise ser inicialmente compreendida por água; e em que após um período de diálise contra água, pelo menos uma das fases solúveis ou a solução aquosa de diálise, ser ajustada para compreender cerca de 0.88% de ácido fórmico.
3. 7- Um método para obter a proteína inibidora da proteinase estável ao calor a partir de tubérculos de batata que contêm as mesmas, caracterizado por compreender os passos de: extrair os tubérculos de batata por homogeneização dos tubérculos de batata num meio que compreende cerca de 0.2% de ácido fórmico e NaCl aproximadamente a 0.3 M para formar o extracto em bruto; adicionar cerca de um volume de etanol para quatro volumes de extracto em bruto para formar um extracto de álcool; filtrar o extracto de álcool para formar um extracto filtrado; aquecer o extracto filtrado até uma primeira temperatura de 50°C ou superior depois arrefecer até uma segunda temperatura de 50 °C ou abaixo, para formar um extracto tratado por calor contendo uma fase de precipitado insolúvel e uma fase solúvel; 2 separar a fase de precipitado insolúvel da fase solúvel por, pelo menos uma de, filtração do extracto tratado por calor através de um filtro poroso, ou centrifugação do extracto tratado por calor a cerca de 4000 x g durante cerca de 5 minutos, para formar uma fase solúvel clarificada; remover as impurezas da fase solúvel clarificada por diálise usando uma membrana de diálise com um corte de peso molecular de aproximadamente 12000 daltons, contra um meio de diálise que compreende ou água da distribuição ou cerca de 0.2% ácido fórmico, para formar um extracto dialisado; precipitar as proteínas inibidoras da proteinase a partir do extracto dialisado por, pelo menos um de; incluindo cerca de 0.22% de ácido fórmico no meio de diálise, ou adicionar ácido fórmico a cerca de 0.88%, para formar uma mistura de precipitação; recuperar as proteínas inibidoras da proteinase precipitadas por, pelo menos um de, filtração da mistura de precipitação através dum filtro poroso, ou centrifugação da mistura de precipitação a cerca de 4000 x g durante cerca de 5 minutos, para obter uma mistura da proteína inibidora da proteinase. Lisboa, 18 de Dezembro de 2006 3