PT101813B - Utilizacao de fosfato de di-manosil-di-mio-inositol e de fosfato de 1,3-di-mio--inositol na termoestabilizacao, osmoproteccao e proteccao contra a desidratacao de componentes celulares e celulas - Google Patents

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DESCRIÇÃO
Utilização de fosfato de di-manosil-di-mzo-inositol e de fosfato de l,3'-di-m/o-inositol na termoestabilização, osmoprotecção e protecção contra a desidratação de componentes celulares e células
Vários solutos intracelulares de baixo peso molecular acumulam em níveis elevados em alguns microrganismos quando estes são sujeitos a condições ambientais extremas, nomeadamente de agressão osmótica. Estes solutos servem geralmente como osmólitos em organismos halotolerantes ou halofílicos (que toleram ou exigem meios com elevadas concentrações salinas, respectivamente), ou ainda como reservas de carbono e energia. Na célula, os osmólitos têm como função manter a pressão de turgescência e o volume celular, sem que a sua acumulação prejudique as estruturas e funcionamento celulares em condições de agressão osmótica. Praticamente todos os organismos halotolerantes ou halófilos até agora examinados acumulam ou iões inorgânicos (K*, Nia+, Cf) ou solutos orgânicos. Estes, também designados por solutos compatíveis, incluem açúcares, aminoácidos e substâncias derivadas de aminoácidos, polióis e oligopeptídeos [1].
Para além de serem compatíveis com a actividade celular normal, os osmólitos sintetizados em condições de agressão ambiental exercem um efeito estabilizador acentuado sobre as macromoléculas constituintes celulares, nomeadamente nas proteínas. Tem sido constatado que os solutos compatíveis têm um efeito positivo quer na estabilização térmica das proteínas, quer na sua estabilização na presença de agentes desnaturantes, como detergentes, solventes orgânicos ou agentes caotrópicos - ureia e cloreto de guanidina. Vários estudos têm incidido sobre o mecanismo molecular envolvido na estabilização da estrutura de proteínas por diferentes solutos de baixo peso molecular, nomeadamente osmólitos [2,3,41.
A adição de compostos de baixo pelo molecular a soluções contendo proteínas conduz a alterações das propriedades físicas da água, tendo como consequência um
aumento da sua tensão superficial e a exclusão desses compostos da proteína. Assim, a estrutura da água envolvida nas camadas de proteínas fica num estado de elevada organização, o que gera termodinamicamente desvaforável e que conduz à minimização da área de interface água-proteína. A área superficial das proteínas globulares é menor no estado nativo do que no desnaturado, deslocando-se o equilíbrio proteína nativa <=> desnaturada para a esquerda, do que resulta uma maior estabilização da estutura nativa. Esta maior estabilização das proteínas, induzida pela presença de compostos de baixo peso molecular em solução aquosa, permite que biocatalisadores funcionem e catalisem reacções específicas em condições extremas de temperatura, pressão, força iónica, pH ou na presença de solventes orgânicos e detergentes. Esta capacidade estabilizante dos compostos compatíveis reveste-se da maior importância visto que uma das prioridades da biotecnologia moderna passa pela obtenção de biocatalisadores estáveis ou de agentes que estabilizem os biocatalisadores contra a inactivação térmica e química.
E também de salientar que os solutos compatíveis contrariam os efeitos prejudiciais provocados pela desidratação em proteínas [5], membranas celulares [6] e células (7,8). Apesar da importância dos processos de secagem e congelação na conservação e armazenagem de amostras biológicas ocorrem sempre efeitos indesejáveis nestas operações, tais como a desnaturação de proteínas sensíveis ou o decréscimo na viabilidade de muitos tipos de células. A preservação de componentes celulares quando desidratados e/ou congelados tem grande importância em aplicações em medicina (conservação de tecidos e outros produtos de origem biológica), na indústria farmacêutica (microencapsulação de fármacos), cosmética (lipossomas), na indústria alimentar (conservação de alimentos) e em investigação científica (manutenção de colecções de culturas de microrganismos). Nos processos de desidratação de membranas celulares e células a remoção da água ligada aos grupos iónicos polares das bicamadas lipídicas, conduz a uma transição de fase dessas estruturas lipídicas. Após re-hidratação, as membranas secas sofrem uma transição de fase inversa, ocorrendo geralmente, defeitos que provocam rupturas em aleumas regiões das membranas. A proteccção exercida pelos solutos de baixo peso molecular nas membranas celulares e células relaciona-se com o tacto destes compostos substituírem a água (removida na secagem) entre as cabeças polares dos lípides, promovendo a manutenção da mesma fase lipídica. mesmo quando estas estruturas se
encontram desidratadas. Nos processos de desidratação de proteínas os compostos de baixo peso molecular exercem uma protecção através de um mecanismo de que resulta uma maior estabilização da estrutura nativa, análogo ao efeito de protecção exercido por solutos em proteínas, quando sujeitas a temperaturas elevadas ou à presença de agentes desnaturantes em solução aquosa. Assim, a integridade destas estruturas é mantida e a sua actividade normal recuperável numa maior extensão.
Foram identificados alguns solutos em bactérias e arquebacténas hipertermófilas (temperatura miníma de crescimento de 70°C) que revelaram exercer funções de termoproteccção. Esta conclusão baseia-se essencialmente no facto de estes solutos se acumularem preferencialmente durante o crescimento a temperaturas supra-óptimas. Estão nestas condições os solutos fosfato de 1 .F-di-wío-inositol em Pyrococcus furiosas e 2,3'-ciclo-difosfoglicerato em Metíianotliermus fervidas [9.10].
Os compostos, objecto da presente invenção, fosfato de di-manosil-di-mminositol e fosfato de l,3'-di-/?uo-inositol podem ser obtidos por fermentação de duas bactérias hipertermófilas e halófilas Thermotoga marítima e Thermotoga neapolitana, à temperatura de 88°C (sendo a temperatura óptima de 80cC), utilizando um meio de crescimento [11] que contém em 1 litro de água destilada: 5g de amido, 0,5g de KH2PO4, 20g de NaCl, 0,5g de extracto de levedura, 0,5g de cisteína-HCl, 2mg de NiCl2.6H2O, 2mg de biotina, 20mM de tiossulfato, 15 ml de uma solução de oligoelementos (que contém em 1 litro de água destilada: l,5g de ácido nitriloacético, 3g de MgSO4.2H2O, 0,5g MnSO4.2H2O, lg NaCl, O.lg de FeSO4.7H2O, 0,l8g de CoSO4.7H2O, O.lg de CaCl2.2H2O, 0.18g de ZnSO4.7H2O, O.Olg CuSO4.5H2O, 0,02g de KAI(SO4)2.12H2O. 0.01g de H-.BO3. O.Olg de Na2MoO4.2H2O, 0,025g de NiCl2.6H2O e 0,3g de Na2SeO3.5H2O). 250 ml de uma solução de água do mar (que contêm em l litro de água destilada: 27,7g de NaCl. 7c de MgSO4.2H2O, 5,5g de MgCl2.6H2O, O.65g de KC1, O.lg de NaBr (KBr). 30 mg de H3BO3, 15 mg de SrCl2.6H2O, 10 mg de ácido cítrico, 0,05 mg de Kl e 2,25 mc, de CaCl2.2H2O). O meio foi acertado com uma solução de H2SO4 a pH 6.5. A recuperação deste soluto é feita por extracçao das células a 100JC com uma mistura de etanokágua a 80% [9],
O facto dos solutos apresentados nesta invenção, fosfato de di-manosil-di-mioinositol e fosfato de 1,3'-di-wío-inositol, serem sintetizados por organismos
hipertemiófilos, e da sua concentração intracelular aumentar drasticamente a temperaturas de crescimento supraóptimas, toma estes novos solutos excelentes candidatos a acentes termoestabilizadores.
Os compostos da presente invenção podem ser utilizados na termostabilização de vários biocatalisadores com interesse industrial afectados por inactivação, diminuição de eficiência, a temperaturas de operação elevadas, tal como acontece na indústria dos detergentes, tratamento de pasta de papel, etapas nos processos de engenharia genética, etc,.
Os compostos da presente invenção podem ser utilizados como protectores de biocatalisadores na presença de agentes desnaturamos como solventes orgânicos, detergentes, agentes oxidantes ou agentes caotrópicos, tais corno ureia e cloreto de guanidina.
Estas utilizações podem ser confirmadas pela determinação de actividades enzimáticas de um determinado biocatalisador em função da temperatura e da concentração de agentes desnaturames, na presença e na ausência destes solutos.
Os compostos da presente invenção podem ser utilizados como protectores contra os efeitos negativos durante a secagem e/ou congelamento de componentes celulares (como proteínas e biomembranas), lipossomas, células ou mesmo tecidos.
Esta utilização pode ser confirmada adicionando estes solutos aos componentes celulares ou células ames do processo de secagem e/ou congelação. Após re-hidratação e/ou descongelamento, avalia-se o grau de manutenção da conformação molecular (quando se trata de biocatalisadores ou biomembranas) ou da viabilidade celular (quando se trata da conservação de células).
REFERÊNCIAS:
[1] Brown, A.D. (1990). Microbial WaterStress Physiology - Principies and Perspectives. John Wiley & Sons, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore.
[2] Arakawa, T. and S.N. Timasheff (1985). The stabilizadon of proteins by osmolytes. Biophys. J. , 47: 411-414.
[3] Arakawa, T. and S.N. Timasheff (1983). Preferential interactions of proteins with solvent components in aqueous amino acid solutions. Arch. Biochem. Biophys.. 224: 169-177.
[4] Arakawa, T. and S.N. Timasheff (19S2). The stabilizadon of protein structure by sugars. Biochem., 21: 6536-6544.
[5] Carpenter, J.F., Crowe, J.H. and T. Arakawa (1990). Comparision of solute-induced protein stabilizadon in aqueous solution and in the frozen and dried states. J. Dairy Sei., 73: 3627-3636.
[6] Rudolph, A.S., Crowe, J.H. and L.M. Crowe (1986). Effects of three stabilizing agents proline, betaine, and trehalose - on membrane phospholipids. Arch. Biochem. Biophys., 245: 134-143.
[7] Louis, P., Truper, H.G. and E.A. Galinski (1994). Survival of Escherichia coli during drying and storage in the presence of compauble solutes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41: 684-688.
[8] Leslie, S.B., Teter, S.A., Crowe, L.M. and J.H. Crowe (1994). Trehalose lowers membrane phase transitions in dry yeast cells. Biochm. Biophys. Acra. 1192: 7-13.
[9] Martins, L.O. and H Santos (1995) Accumulation of mannosylglycerate and di-mwinositol-phosphate by Pyrococcus furiosus in response to salinity and temperature. Appi. Environ. Microbiol. 61: 3299-3303.
[10] Hensel, R. and H. Konig (1988). Thermoadaptation of methanogenic bactéria by intracellular ion concentration. FEMS Microbiol. Lett.,49: 75-79.
[11] Huber, R, Langworthy, T.A., Konig, H., Thomm, M., Woese, C.R., Sleytr, U.B. and K.O. Stetter (1986). Thermotoga marítima sp. nov. represents a new genus of unique extremely thermophilic eubacteria growing up to 90 °C. Arch. Microbiol. 144: 324-333.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Processo novo que envolve a biossíntese de dois compostos novos de baixo pesomolecular, o fosfato de di-manosil-di-wío-inositol e o fosfato de l,3'-dw?uoinositol, pelas estirpes bacterianas Thermotoga marítima e Thermotoga neapolitana caracterizados como agentes termoestabilizadores sobre macromoléculas biológicas, uma vez que são produzidos por microrganismos hipertermófilos (Top[ de crescimento de 80°C) e são acumulados em concentrações crescentes a temperaturas de crescimento supra-óptimas.
    Processo novo de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo facto do fosfato de di-manosil-di-z/rio-inositol e do fosfato de 1,3’-di-/?7/o-inositol, quando adicionados a soluções contendo biocatalisadores permitirem a sua funcionalidade a temperaturas a que normalmente ocorreria a sua desnaturação e inoperacionalidade.
    Processo novo de acordo com a reinvindicação 2, caracterizado pelo facto do fosfato de di-manosil-di-wío-inositol e do fosfato de 1,3'-di-mzo-inositol quando adicionados a soluções contendo biocatalisadores permitirem a sua resistência a agentes desnaturantes como detergentes, solventes orgânicos, agentes oxidantes e outros.
    Processo novo de acordo com qualquer das reinvindicações anteriores caracterizado pelo facto dos dois novos compostos, o fosfato de di-manosil-di-w/o-inositol e o fosfato de 1,3'-di-/?n'o-inosito 1, poderem ser utilizados para a conservação por liofilização e conservação a temperaturas baixas de proteínas, membranas lipídicas e de linhas de células microbianas, vegetais e animais, bem como de órgãos perfundidos, promovendo a manutenção da conformação nativa destas estruturas, compatível com a sua posterior utilização.
    Processo novo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado pela utilização de fosfato de di-manosil-di-/77Ío-inositol e de fosfato de l,3'-di-m/oinositol na estabilização de lipossomas e outros sistemas de membranas usados para microencapsulação de fármacos e de outros compostos com aplicações nas indústrias farmacêutica, cosmética, de detergentes e outras.
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