PT1018559E

PT1018559E - Enzimas fosfodiesterases

Info

Publication number: PT1018559E
Application number: PT99308902T
Authority: PT
Inventors: Mark Fidock
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-11-09
Publication date: 2007-11-07
Also published as: US20040137508A1; DE69936973T2; DE69936973D1; EP1018559A1; ATE371740T1; US7091024B2; EP1018559B8; EP1018559B1; DK1018559T3; CY1106978T1; ES2291010T3

Description

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DESCRIÇÃO "ENZIMAS FOSFODIESTERASES"

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a uma enzima. A presente invenção também diz respeito a uma sequência nucleotidica que a codifica.

Em particular, a presente invenção diz respeito a novas sequências de ácidos nucleicos que codificam novas enzimas fosfodiesterases. A presente invenção também diz respeito à utilização das novas sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos para o diagnóstico e o tratamento de doenças. A presente invenção diz ainda respeito à utilização das novas sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos para avaliar e/ou pesquisar agentes que possam modular a actividade das fosfodiesterases. A presente invenção também diz respeito a células hospedeiras geneticamente modificadas que compreendem ou expressam as novas sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos para avaliar e/ou pesquisar agentes que possam modular a actividade das fosfodiesterases.

TÉCNICA ANTERIOR

Os nucleótidos cíclicos, tais como cAMP e cGMP, são segundos mensageiros intracelulares importantes. As fosfodiesterases dos nucleótidos cíclicos - conhecidas pela designação de PDE - são uma família de enzimas que catalisam a degradação de nucleótidos cíclicos e que, por 2 tal motivo, são um dos componentes celulares que regulam a concentração de nucleótidos cíclicos.

Nos últimos anos foram definidas pelo menos dez enzimas PDE, bem como muitos subtipos de tais enzimas, com base na afinidade para determinado substrato e nos requisitos de co-factores (Beavo JA e Reifsnyder DH, 'Trends Pharmacol. Sei.' 11:150 [1990]; Beavo J, em: 'Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action.', Beavo J e Housley MD (Eds.). Wiley:Chichester, págs. 3-15 [1990]).

Como exemplos de subfamílias refere-se: PDEl (às vezes escrito PDEI), dependentes de Ca2+/calmodulina; PDE2 (às vezes escrito PDEII), estimuladas por cGMP; PDE3 (às vezes escrito PDEIII), inibidas por cGMP, hidrólise de cAMP; PDE4 (às vezes escrito PDEIV), específicas de cAMP, sensíveis a rolipram; PDE5 (às vezes escrito PDEV), específicas de cGMP; PDE6 (às vezes escrito PDEVI), fotorreceptoras, específicas de cGMP; PDE7 (às vezes escrito PDEVII), específicas de cAMP, insensíveis a rolipram; PDE8 (às vezes escrito PDEVIII), específicas de cAMP, insensíveis a IBMX; PDE9 (às vezes escrito PDEIX), específicas de cGMP, insensíveis a IBMX; PDE10 (às vezes escrito PDEX), substrato duplo, sensíveis a IBMX.

As PDE contêm um domínio catalítico conservado no terminal C com -270 aminoácidos (Charbonneau et al.r 1986, PNAS, 83(24):9308-12) e um domínio no terminal N implicado na regulação da actividade catalítica por meio de co-factores de ligação e na especificação da localização subcelular (Juilfs et al., (1999), 'Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol.' 135:67-104). 3

Cada família de PDE pode conter duas ou mais isoformas (isto é, pode haver duas ou mais isoenzimas PDE). A título exemplificativo, sabe-se que a PDE IV de mamíferos, que é homóloga do gene de Drosophila Dunce (Chen CN et al., yProc. Nat. Acad. Sei. (USA)', 83:9313 [1986]), possui quatro isoformas no rato (Swinnen JV et al., 'Proc. Nat. Acad. Sei. (USA)', 86:5325 [1989]). Também se sabe que as PDE humanas ocorrem em isoformas e têm variantes reagrupadas. Por exemplo, em 1990, foi descrita a clonagem de uma isoforma humana de PDEIV a partir de monócitos (Livi GP et al., 'Mol. Cell. Bio.', 10:2678 [1990]). Ainda a título exemplificativo, também foi efectuada, por outros investigadores, a clonagem independente de três variantes de corte e colagem (em inglês, "splicing") das PDEIV, as quais são actualmente designadas por hPDElV-Bl, hPDElV-B2 e hPDEIV-B3.

Também é possível encontrar informações sobre fosfodiesterases de nucleótidos cíclicos nos documentos US-A-5932423 e US-A-5932465. O documento WO-A-97/35989 descreve outras fosfodiesterases de nucleótidos cíclicos - nomeadamente CN PCDE8. De acordo com o documento WO-A-97/35989, a CN PCDE8 tem duas isozimas - designadas por CN PCDE8A e CN PCDE8B. Na especialidade, às vezes, o termo "isozima" é utilizado com o mesmo significado de "isoforma".

Também é possível encontrar informações sobre fosfodiesterases de nucleótidos cíclicos humanos e sobre a codificação de polinucleótidos

De acordo com o documento WO-A-97/35989, foram já identificados muitos inibidores de diferentes PDE, tendo alguns sido submetidos a avaliação clinica. Por exemplo, 4 estão a ser desenvolvidos inibidores de PDEIII como agentes antitrombóticos, como agentes anti-hipertensivos e como agentes cardiotónicos úteis para o tratamento de apoplexia cardíaca congestiva. 0 rolipram, que é um inibidor de PDEIV, tem vindo a ser utilizado para o tratamento da depressão e há outros inibidores de PDEIV que estão a ser avaliados como agentes anti-inflamatórios. Também foi já demonstrado que o rolipram inibe o TNF-α induzido por lipopolissacáridos (LPS), sobre o qual se sabe que potência a replicação do HIV-1 in vitro. Sendo assim, o rolipram pode inibir a replicação do HIV-1 (Angel et al., 1995, AIDS, 9:1137-44). Além disso, com base na sua aptidão para suprimir a produção dos TNF α e β e de interferão γ, foi já demonstrado que o rolipram é eficaz para o tratamento de encefalomielite, no modelo animal experimental de esclerose múltipla (Sommer et al.,, 1995, yNat. Med.', 1:244-248) e que também pode ser eficaz para o tratamento da discinésia tardia (Sasaki et al., 1995, 'Eur. J. Phamacol.', 282:71-76) .

De acordo com o documento WO-A-97/35989, também existem inibidores das PDE não específicos, tais como a teofilina, utilizada para o tratamento da asma brônquica e de outras doenças respiratórias, e a pentoxifilina, utilizada para o tratamento de claudicação intermitente e doença vascular periférica induzida pela diabetes. No tratamento de doenças respiratórias, admite-se que a teofilina actua sobre a função dos músculos lisos das vias aéreas respiratórias e que também possui actividades anti-inf lamatória e imunomoduladora (Banner et al., 1995, 'Respir. J.' 8:996-1000), admitindo-se que actua através da inibição da hidrólise tanto de cAMP como de cGMP das CN PDE 5 (Banner et al., 1995, 'Monaldi Arch. Chest. Dis.' 50:286- 292) . A pentoxifilina, sobre a qual também se sabe que bloqueia a produção de TNF-α, pode inibir a replicação de HIV-1 (Angel et ai., supra). É possível aceder a uma listagem de inibidores de CN PDE em Beavo, 1995, supra.

Foi sugerido que os inibidores selectivos de PDE, para além das suas isozimas e dos seus subtipos, poderão dar origem a terapias mais eficazes com menos efeitos secundários. Por exemplo, veja-se Wieshaar RE et al., ('J. Med. Chem.', 28:537 [1985]), Giembycz MA ('Biochem.

Pharm.', 43:2041 [1992]) e Lowe JA e Cheng JB ('Drugs of the Future', 17:799-807 [1992]).

Assim, para algumas aplicações, é desejável a inibição selectiva de um determinado tipo individual de PDE. Assim sendo, a clonagem e a expressão de uma nova PDE seriam uma ajuda importante para a descoberta de inibidores selectivos.

ASPECTOS ABREVIADOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Nas reivindicações e na memória descritiva subsequentes serão apresentados os aspectos da presente invenção.

Resumidamente, de acordo com alguns dos seus aspectos, a presente invenção diz respeito a: 1. novos aminoácidos, 2. novas sequências nucleotídicas, 3. ensaios em que tais novas sequências são utilizadas, 4. compostos/composições identificados utilizando tais ensaios, 6 5. sistemas de expressão que compreendem ou expressam tais novas sequências, 6. métodos de tratamento com base em tais novas sequências, 7. composições farmacêuticas à base de tais novas sequências. Há outros aspectos respeitantes à sequência de aminoácidos da presente invenção e/ou à sequência nucleotídica da presente invenção, incluindo: um arquétipo que compreende ou é capaz de expressar as sequências da presente invenção; um vector que compreende ou é capaz de expressar as sequências da presente invenção; um plasmideo que compreende ou é capaz de expressar as sequências da presente invenção; um tecido que compreende ou é capaz de expressar as sequências da presente invenção; um órgão que compreende ou é capaz de expressar as sequências da presente invenção; um hospedeiro transformado que compreende ou é capaz de expressar as sequências da presente invenção e um organismo transformado que compreende ou é capaz de expressar as sequências da presente invenção. A presente invenção também abrange os métodos para a sua expressão, tais como a expressão num microrganismo, incluindo os métodos para a sua transferência.

Por razões de facilidade de referência, os aspectos da presente invenção irão ser descritos em secções com os títulos adequados correspondentes. No entanto, as informações constantes sob a epígrafe de cada secção não estão necessariamente limitadas a cada secção particular.

Na memória descritiva subsequente, as expressões "sequência nucleotídica da presente invenção" e "sequência 7 de aminoácidos da presente invenção" designam, respectivamente, qualquer uma ou várias das sequências nucleotidicas aqui apresentadas ou descritas e a qualquer uma ou várias das sequências de aminoácidos aqui apresentadas ou descritas. De igual modo, tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de aminoácidos" designa sequências peptídicas ou proteicas, podendo também designar as suas porções. Além disso, a expressão "sequência de aminoácidos da presente invenção" é sinónima da expressão "sequência polipeptidica da presente invenção". Além do mais, a expressão "sequência nucleotidica da presente invenção" é sinónima da expressão "sequência polinucleotidica da presente invenção".

ASPECTOS PORMENORIZADOS DA PRESENTE INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma enzima PDE XIV que possui a sequência de aminoácidos ilustrada por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 ou pelo menos com uma identidade de 95%.

De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um gene de PDE XIV que possui uma sequência nucleotidica ilustrada por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 ou pelo menos com uma identidade de 95%.

De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um vector que compreende o gene de PDE XIV de acordo com o segundo aspecto da presente invenção.

De acordo com um quarto aspecto, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira isolada que foi incorporada no gene de PDE XIV de acordo com o segundo e o terceiro aspectos da presente invenção.

De acordo com um quinto aspecto, a presente invenção proporciona um método de ensaio que consiste em fazer contactar um agente com a enzima PDE XIV de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou com o gene de PDE XIV de acordo com o segundo aspecto da invenção, com o vector de acordo com o terceiro aspecto da invenção ou com a célula hospedeira de acordo com o quarto aspecto da invenção e em medir a actividade ou a expressão de PDE_XIV, em que a existência de uma diferença entre a) a actividade ou expressão da enzima PDE_XIV na ausência do agente e b) a actividade ou expressão da enzima PDE_XIV na presença do agente indica que o agente pode afectar a actividade ou a expressão da enzima PDE_XIV.

De preferência, o ensaio consiste em pesquisar agentes úteis para o tratamento de distúrbios existentes em um ou vários dos locais seguintes: putâmen, núcleo caudado cerebral, lobo occipital cerebral, coração, ovário, glândula pituitária, rim, fígado, intestino delgado, timo, músculo esquelético, regiões leucocitárias, gânglios da raiz dorsal, útero, cóclea, intestino delgado (duodeno), astrocitoma e apêndice.

De acordo com um sexto aspecto, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira de acordo com o quarto aspecto, em que a célula hospedeira se encontra depositada sob o número NCIMB 40995, NCIMB 40996 ou NCIMB 41027 de admissão.

De acordo com um sétimo aspecto, a presente invenção proporciona uma sequência nucleotídica que codifica uma PDE, em que a sequência nucleotídica pode ser obtida a partir de NCIMB 40995, NCIMB 40996 OU NCIMB 41027. 9

De acordo com um oitavo aspecto, a presente invenção proporciona uma PDE, em que a PDE pode ser expressa a partir de uma sequência nucleotidica que pode ser obtida a partir de NCIMB 40995, NCIMB 40996 ou NCIMB 41027.

Serão agora apresentados outros aspectos da presente invenção.

Uma sequência nucleotidica isolada ou uma sequência proteica isolada de acordo com a presente invenção.

Uma sequência nucleotidica praticamente pura ou uma sequência proteica praticamente pura de acordo com a presente invenção.

Um método de ensaio para identificar um agente que pode afectar o padrão de expressão da sequência nucleotidica da presente invenção ou a actividade do produto da sua expressão, consistindo o método de ensaio em: expor a sequência nucleotidica da presente invenção ou o seu produto de expressão ("EP") a um agente e determinar se o agente modula (ou seja, se afecta o padrão de expressão ou a actividade) da sequência nucleotidica da presente invenção ou seu produto de expressão.

PDE_XIV

Tal como descrito antes, a presente invenção diz respeito a uma nova enzima PDE - que recebeu a designação de PDE_XIV - e a uma sequência nucleotidica que a codifica. A presente invenção também diz respeito à utilização das novas sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos para o diagnóstico e para o tratamento de doenças. A presente invenção também diz respeito à utilização das novas sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos para avaliar e/ou pesquisar agentes que podem modular a 10 actividade de fosfodiesterase. A presente invenção diz ainda respeito a células hospedeiras modificadas geneticamente que compreendem ou exprimem as novas sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos para assim avaliar e/ou pesquisar agentes que podem modular a actividade de fosfodiesterase.

Tal como aqui utilizado, o termo "PDE_XIV" designa uma nova família de PDE que não tinham sido caracterizadas até ao momento presente. A título exemplificativo, foi identificada uma PDE_XIV humana (às vezes designada por hspde_xiv). Também foi identificada uma sequência de murganho - que recebeu a designação de PDE_XIV (às vezes designada por MMPDE_XIV).

Por razões de conveniência, salvo quando especificado de outro modo, quando a referência a uma PDE_XIV irá abranger a HSPDE_XIV e/ou MMPDE_XIV.

Admite-se que a PDE_XIV se encontra presente em diversas fontes, sendo possível obtê-la a partir das mesmas. A título exemplificativo, a PDE_XIV está presente em um ou vários dos locais seguintes: putâmen, núcleo caudado cerebral, lobo occipital cerebral, coração, ovário, glândula pituitária, rim, fígado, intestino delgado, timo, músculo esquelético, regiões leucocitárias, gânglios da raiz dorsal, útero, cóclea, intestino delgado (duodeno), astrocitoma e apêndice.

Também se admite que a PDE_XIV se encontra presente em várias outras fontes, tais como, por exemplo, ratos, bovinos, ovinos, suínos e equinos.

De preferência, a presente invenção abrange a PDE_XIV de mamíferos, que inclui, mas sem que isso constitua 11 qualquer limitação, qualquer uma das fontes referidas antes.

Mais preferencialmente, a presente invenção abrange a PDE_XIV humana. A PDE_XIV pode ser idêntica à forma que ocorre naturalmente; no entanto, de acordo com este aspecto, de preferência a pde_xiv possui a sequência de aminoácidos não original (isto é, que não se encontra presente no seu ambiente natural) ou é uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado. Além disso, ou em alternativa, a pde_xiv é a pde_xiv isolada e/ou a pde_xiv purificada. A PDE_XIV pode ser obtida ou produzida a partir de qualquer fonte adequada, natural ou não, ou então pode ser sintética, semi-sintética ou recombinante. A sequência de codificação da PDE_xiv pode ser idêntica à da forma que ocorre naturalmente; no entanto, de acordo com este aspecto, de preferência a sequência de codificação da PDE_XIV é a sequência nucleotidica não original (isto é, que não se encontra presente no seu ambiente natural) ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado. Além disso, ou em alternativa, a sequência de codificação da PDE_XIV é uma sequência de codificação de PDE_XIV isolada e/ou uma sequência de codificação PDE_XIV purificada. A sequência de codificação de PDE_XIV pode ser obtida ou produzida a partir de qualquer fonte adequada, natural ou não, ou então pode ser sintética, semi-sintética ou recombinante. A PDE_XIV e/ou as suas sequências de codificação e/ou uma sequência capaz de a hibridar é/são útil(eis) para testar a selectividade dos fármacos elegíveis para as diferentes PDE. 12

Admite-se que a PDE_XIV seja capaz de catalisar a conversão de cAMP em AMP.

Os aspectos preferidos da presente invenção compreendem uma enzima PDE_XIV recombinante e uma sequência nucleotidica recombinante que codifica uma enzima PDE_XIV.

De preferência, a enzima PDE_XIV recombinante e/ou a sequência nucleotidica recombinante da presente invenção são respectivamente uma enzima PDE_XIV recombinante de mamífero e/ou uma sequência nucleotidica recombinante de mamífero.

De preferência, a enzima pde_xiv recombinante e/ou a sequência nucleotidica recombinante da presente invenção são, respectivamente, uma enzima PDE_XIV recombinante humana e/ou uma sequência nucleotidica recombinante humana. É possível utilizar a sequência nucleotidica que codifica a PDE_XIV ou a própria enzima PDE_XIV ou ambas para a pesquisa de agentes que possam afectar a actividade da PDE_XIV. Em particular, é possível utilizar a sequência nucleotidica que codifica a PDE_XIV ou a própria PDE_XIV para a pesquisa de agentes que possam inibir a actividade de PDE_XIV. Além disso, é possível utilizar a sequência nucleotidica que codifica a PDE_XIV ou a própria PDE_XIV para a pesquisa de agentes que possam afectar selectivamente a actividade da PDE_XIV, por exemplo, inibir selectivamente a actividade de PDE_XIV.

Além do mais, também é possível utilizar a sequência nucleotidica que codifica a PDE_XIV, ou uma sua sequência complementar, em ensaios para se detectar a presença de sequências codificadoras de PDE_XIV em células humanas. Tais ensaios poderiam fornecer informações sobre a 13 distribuição da enzima nos tecidos e sobre a sua relevância biológica em determinados estados patológicos. A presente invenção também abrange os anticorpos para a PDE_XIV (incluindo um seu derivado, fragmento, homólogo ou variante). É possível utilizar os anticorpos para PDE_XIV em ensaios para se detectar a presença de PDE_XIV em células humanas. Tais ensaios poderiam fornecer informações sobre a distribuição da enzima nos tecidos e sobre a sua relevância biológica em determinados estados patológicos.

Em particular, é possível utilizar qualquer uma ou várias das isozimas de PDE_XIV, das sequências nucleotídicas que as codificam, das sequências nucleotídicas que lhes são complementares e dos anticorpos encaminhados para as mesmas em ensaios para pesquisar agentes que afectem selectivamente uma das isozimas. Tais ensaios poderiam fornecer informações sobre a distribuição de cada uma das isozimas nos tecidos e sobre a relevância biológica de cada uma das isozimas em determinados estados patológicos. Tais ensaios também permitiriam aos investigadores testar e identificar agentes úteis para afectar a expressão ou a actividade de PDE_XIV, por exemplo, num determinado tecido ou num determinado estado patológico.

POLIPEPTIDO DA PRESENTE INVENÇÃO 0 termo "polipeptido" - que é utilizado de um modo permutável com o termo "proteína" - designa moléculas polipeptídicas de cadeia simples, bem como complexos de múltiplos polipeptidos em que os polipeptidos constituintes 14 individuais se encontram ligados por meios covalentes ou não covalentes.

De preferência, o polipeptido da presente invenção é um polipeptido de cadeia simples.

Os polipeptidos da presente invenção podem existir numa forma praticamente isolada. Faz-se observar que o polipeptido pode ser misturado com veículos ou diluentes que não irão interferir com a finalidade do polipeptido, o qual continuará a ser considerado praticamente isolado. 0 polipeptido da presente invenção também pode assumir uma forma praticamente purificada, caso este em que se considerará, geralmente, o polipeptido numa preparação em que mais de 90%, v.g., 95%, 98% ou 99%, do polipeptido na preparação é um polipeptido da presente invenção. Os polipeptidos da presente invenção podem ser modificados, por exemplo, por adição de resíduos de histidina para uma melhor purificação ou por adição de uma sequência de sinal para favorecer a sua secreção a partir de uma célula, conforme a seguir se descreverá.

Os polipeptidos da presente invenção podem ser produzidos por métodos sintéticos (v.g., conforme descrito por Geysen et al., 1996) ou por métodos recombinantes, tal como a seguir se descreverá.

De acordo com uma variante preferida, a sequência de aminoácidos per si, a presente invenção não abrange a PDE_XIV original de acordo com a presente invenção quando se encontra no seu ambiente natural, quando tenha sido expressa pela sua sequência de codificação original que também se encontra no seu ambiente natural e quando tal sequência nucleotídica está a ser regulada pelo seu promotor original que também se encontra no seu ambiente 15 natural. Por razões de facilidade de referência, esta variante preferida recebeu a designação de "sequência de aminoácidos não original". 0 termo "variante", "homólogo" ou "fragmento", utilizado a propósito da sequência de aminoácidos da enzima da presente invenção, compreende qualquer substituição, variação, modificação, suprimento, supressão ou adição de um (ou vários) aminoácidos da sequência, desde que a enzima resultante tenha actividade de PDE_XIV e de preferência seja pelo menos tão activa, sob o ponto de vista biológico, como a enzima apresentada na listagem de sequências anexa. Em particular, o termo "homólogo" abrange a homologia em termos de estrutura e/ou função. No que concerne à homologia das sequências, existe uma homologia pelo menos de 95% e mais preferencialmente pelo menos de 98% em relação a qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa.

De uma forma tipica, os tipos de substituições de aminoácidos que podem ser efectuadas deverão manter a hidrofobicidade/hidrofilicidade da sequência de aminoácidos. É possível efectuar substituições de aminoácidos, por exemplo, entre 1, 2 ou 3 e 10, 20 ou 30 substituições, desde que a sequência modificada mantenha a aptidão para actuar como uma enzima PDE de acordo com a presente invenção. As substituições de aminoácidos podem incluir a utilização de análogos que não ocorrem naturalmente, por exemplo, para aumentar a semi-vida no plasma sanguíneo. A sequência de aminoácidos da presente invenção pode ser produzida por expressão de uma sequência nucleotídica que a codifique, num sistema de expressão adequado. 16

Além disso, ou em alternativa, seria possível produzir a própria proteína utilizando método químicos para sintetizar uma sequência de aminoácidos de PDE, integral ou parcialmente. Por exemplo, é possível sintetizar péptidos por meio de técnicas em fase sólida, clivá-los a partir da resina e purificá-los por cromatografia preparativa em líquido de elevado rendimento (v.g., Creighton (1983) 'Proteins Structures And Molecular Principies', WH Freeman and Co., Nova Iorque, NY) . A constituição dos péptidos sintéticos pode ser confirmada por análise ou sequenciação dos aminoácidos (v.g., o procedimento de degradação à Edman). É possível realizar a síntese directa de péptidos, recorrendo para tal a diversas técnicas em fase sólida (Roberge JY et al. (1995) 'Science', 269:202-204), e é possível efectuar a síntese automatizada, utilizando, por exemplo, o sintetizador peptídico 'ABI 43 1 A' (Perkin Elmer) em conformidade com as instruções fornecidas pelo fabricante. Além disso, é possível alterar a sequência de aminoácidos da PDE, ou qualquer parte sua, durante a síntese directa e/ou combiná-la, utilizando métodos químicos, com uma sequência proveniente de outras subunidades, ou qualquer parte sua, para se produzir um polipeptido variante.

De acordo com outra variante da invenção, é possível ligar uma sequência natural, modificada ou recombinante de PDE a uma sequência heteróloga para codificar uma proteína de fusão. Por exemplo, para se efectuar a pesquisa em bancos de péptidos por inibidores da actividade de PDE, pode ser útil codificar uma proteína de PDE quimérica que expresse um epítopo heterólogo que é reconhecido por um 17 anticorpo disponível nos circuitos comerciais. Também é possível manipular uma proteína de fusão para que passe a conter um local de clivagem localizado entre uma sequência de PDE e a sequência proteica heteróloga, de tal forma que a PDE possa ser separada do radical heterólogo e purificada. A PDE também pode ser expressa sob a forma de uma proteína recombinante, com um ou vários domínios polipeptídicos suplementares para facilitar a purificação da proteína. Tais domínios facilitadores da purificação compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, péptidos queladores de metais, tais como blocos de histidina-triptofano que permitem a purificação sobre metais imobilizados (Porath J (1992), 'Protein Expr. Purif.', 3-26328 1), domínios de proteína A que permitem a purificação sobre imunoglobulina imobilizada e o domínio utilizado nos sistemas de purificação por amplificação/afinidade FLAGS (Immunex Corp, Seattle, WA). A inclusão de uma sequência ligadora clivável, tal como Factor XA ou enterocinase (Invitrogen, San Diego, CA), entre o domínio de purificação e a PDE é útil para facilitar a purificação. De acordo com um aspecto preferido, a enzima é expressa com um identificador de epítopo FLAG para assim facilitar o isolamento e a purificação da enzima expressa.

As sequências de aminoácidos específicas da PDE_XIV estão ilustradas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5. No entanto, a presente invenção abrange as sequências de aminoácidos que codificam outros membros da família pde_xiv, compreendendo isso as sequências de aminoácidos com uma identidade pelo menos de 60% (mais 18 preferencialmente, pelo menos de 75%) em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos.

Os polipeptidos da presente invenção também compreendem os fragmentos da sequência de aminoácidos apresentada e suas variantes. Os fragmentos adequados terão um tamanho correspondente pelo menos a 5 aminoácidos, v.g.r pelo menos 10, 12, 15 ou 20 aminoácidos.

Os polipeptidos da presente invenção também podem ser modificados para conterem uma ou várias (v.g., pelo menos 2, 3, 5 ou 10) substituições, supressões ou inserções, incluindo substituições conservadas. Mais adiante, descrever-se-ão tais aspectos numa outra secção.

SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DA PRESENTE INVENÇÃO A expressão "sequência nucleotídica", tal como aqui utilizada, designa uma sequência oligonucleotídica ou uma sequência polinucleotidica e suas variantes e seus homólogos, fragmentos e derivados (tais como, as suas porções) . A sequência nucleotídica pode ser ADN ou ARN, que pode ser de origem genómica, sintética ou recombinante e pode ser de cadeia dupla ou simples, representando a cadeia de sentido codificador ou a cadeia anti-sentido.

De preferência, a expressão "sequência nucleotídica" designa o ADN.

Mais preferencialmente, a expressão "sequência nucleotídica" designa ADN preparado por meio de técnicas de ADN recombinante (isto é, ADN recombinante).

De acordo com uma variante preferida, a sequência nucleotídica per si da presente invenção não abrange a sequência nucleotídica codificadora original de acordo com a presente invenção no seu ambiente natural, quando está 19 sob a regulação do seu promotor original que também se encontra no seu ambiente natural. Por razões de simplicidade de referência, a presente variante preferida recebeu a designação de "sequência nucleotídica não original".

As sequências nucleotídicas da presente invenção podem conter nucleótidos sintéticos ou modificados. Há inúmeros tipos diferentes de modificação de oligonucleótidos que são conhecidos na especialidade, , Como exemplos refere-se as estruturas principais de fosfonato de metilo e fosforotioato e a adição de cadeias de acridina ou polilisina às extremidades 3' e/ou 5' da moléculas. Para os objectivos da presente invenção, faz-se observar que as sequências nucleotídicas aqui descritas podem ser modificadas por qualquer método conhecido na especialidade. Tais modificações podem ser efectuadas para melhorar a actividade in vivo ou o periodo de vida das sequências nucleotídicas da presente invenção. A presente invenção também abrange as sequências nucleotídicas que são complementares das sequências aqui apresentadas, ou qualquer seu derivado, fragmento ou derivado. No caso de a sequência ser complementar de um seu fragmento, então é possível utilizar tal sequência como uma sonda para identificar sequências codificadoras semelhantes noutros organismos, etc.. A presente invenção também abrange as sequências nucleotídicas que são capazes de hibridar com as sequências aqui apresentadas ou qualquer seu derivado, fragmento ou derivado. A presente invenção também abrange as sequências nucleotídicas que são capazes de hibridar com as sequências 20 que são complementares das sequências aqui apresentadas, ou qualquer seu derivado, fragmento ou derivado. O termo "variante" também abrange as sequências que são complementares das sequências que são capazes de hibridar com as sequências nucleotidicas aqui apresentadas.

De preferência, o termo "variante" abrange as sequências que são complementares de sequências que são capazes de hibridar em condições rigorosas (v.g., 55°C e SSC 0,2x {SSC lx = NaCl 0,15 M, citrato de Na3 0,015, pH 7,0}) com as sequências nucleotidicas aqui apresentadas.

Mais preferencialmente, o termo "variante" abrange sequências que são complementares de sequências que são capazes de hibridar em condições rigorosas (v.g., 65°C e SSC 0,lx {SSC lx = NaCl 0,15 M, citrato de Na3 0,015, pH 7,0}) com as sequências nucleotidicas aqui apresentadas. A presente invenção também diz respeito a sequências nucleotidicas que podem hibridar com as sequências nucleotidicas da presente invenção (incluindo as sequências complementares das que aqui são apresentadas). A presente invenção também diz respeito a sequências nucleotidicas que são complementares de sequências que podem hibridar com as sequências nucleotidicas da presente invenção (incluindo as sequências complementares das que aqui são apresentadas).

Também estão abrangidas no âmbito da presente invenção as sequências polinucleotidicas que são capazes de hibridar com as sequências nucleotidicas aqui apresentadas, em condições de rigor intermédio a máximo.

De acordo com um aspecto preferido, a presente invenção abrange as sequências nucleotidicas que podem hibridar com a sequência nucleotidica da presente invenção, 21 ou o seu complemento, em condições rigorosas {v.g., 55°C e SSC 0,2x).

De acordo com um aspecto mais preferido, a presente invenção abrange as sequências nucleotidicas que podem hibridar com a sequência nucleotidica da presente invenção, ou o seu complemento, em condições muito rigorosas {v.g., 65°C e SSC 0,lx).

Em alternativa, os ácidos nucleicos exemplificativos podem ser caracterizados como sendo aquelas sequências nucleotidicas que codificam uma proteína PDE_XIV e hibridam com uma ou várias das sequências de adn ilustradas na listagem de sequências anexa. São preferidas as sequências que codificam as PDE_XIV que hibridam, em condições de grande rigor, com qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa ou com o seu complemento.

De uma forma vantajosa, a invenção proporciona sequências de ácidos nucleicos que são capazes de hibridar, em condições rigorosas, com um fragmento de qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa ou com o seu complemento. De preferência, o comprimento do fragmento está compreendido entre 15 e 50 bases. Vantajosamente, possui cerca de 25 bases de comprimento. O termo "variante", "homólogo" ou "fragmento", utilizado a propósito da sequência nucleotidica que codifica a enzima preferida da presente invenção, compreende qualquer substituição, variação, modificação, suprimento, supressão ou adição de um (ou vários) ácidos nucleicos da sequência, desde que a sequência nucleotidica resultante codifique ou seja capaz de codificar uma enzima que possua actividade de PDE_Xiv e de preferência que seja pelo menos tão activa, sob o ponto de vista biológico, como 22 a enzima codifica por qualquer uma das sequências apresentada na listagem de sequências anexa. Em particular, o termo "homólogo" abrange a homologia em termos de estrutura e/ou função, desde que a sequência nucleotidica resultante codifique ou seja capaz de codificar uma enzima que possua actividade de PDE_XIV. No que concerne à homologia das sequências, de preferência, existe uma homologia pelo menos de 75%, mais preferencialmente pelo menos de 85% e ainda mais preferencialmente pelo menos de 90% em relação a uma sequência nucleotidica que codifique a sequência de aminoácidos ilustrada sob a designação de fórmula I. Mais preferencialmente, existe uma homologia pelo menos de 95% e mais preferencialmente pelo menos de 98% em relação a uma sequência nucleotidica que codifique a sequência de aminoácidos ilustrada sob a designação de fórmula I. No que concerne à homologia das sequências, de preferência, existe uma homologia pelo menos de 75%, mais preferencialmente pelo menos de 85% e ainda mais preferencialmente pelo menos de 90% em relação a qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa. Mais preferencialmente, existe uma homologia pelo menos de 95% e mais preferencialmente pelo menos de 98% em relação a qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa.

Conforme indicado, a presente invenção diz respeito a uma sequência de ADN (de preferência, uma sequência de ADNc) que codifica as PDE_XIV. Em particular, a presente invenção diz respeito a sequências de ADNc que codificam as PDE_XIV. A presente invenção também diz respeito a segmentos de ADN que compreendem a sequência de ADN de qualquer uma das 23 sequências ilustrada na listagem de sequências anexa ou variações alélicas de tais sequências. A presente invenção também diz respeito a polipeptidos produzidos por expressão numa célula hospedeira na qual se incorporou as sequências de ADN anteriores ou suas variações alélicas. A presente invenção também diz respeito a ADN que compreende a sequência de ADN de qualquer uma das sequências ilustrada na listagem de sequências anexa ou uma sua variação alélica. A presente invenção também diz respeito a ADN não natural que compreende a sequência de ADN de qualquer uma das sequências ilustrada na listagem de sequências anexa ou uma sua variação alélica.

De acordo com um seu aspecto bastante preferido, a presente invenção diz respeito a ADN recombinante que compreende a sequência de ADN de qualquer uma das sequências ilustrada na listagem de sequências anexa ou uma sua variação alélica.

Os polinucleótidos da presente invenção incluem as sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipeptidos da presente invenção. Faz-se observar que há um conjunto de polinucleótidos diferentes que codificam uma determinada sequência de aminoácidos, em consequência da degenerescência do código genético.

Conhecendo as sequências de aminoácidos aqui apresentadas, é possivel conceber as sequências de ácidos nucleicos de comprimento parcial e de comprimento total, tais como ADNc e/ou clones genómicos que codificam os polipeptidos da presente invenção. Por exemplo, os polinucleótidos da presente invenção podem ser obtidos por 24 PCR degenerativa, na qual serão utilizados iniciadores concebidos para visar as sequências que codificam as sequências de aminoácidos aqui apresentadas. De uma forma tipica, os iniciadores irão conter múltiplas posições degeneradas. No entanto, para minimizar a degenerescência, seleccionar-se-ão sequências que codifiquem regiões das sequências de aminoácidos aqui apresentadas que contenham aminoácidos, tais como metionina, que são codificados apenas por um tripleto. Além disso, as sequências serão escolhidas tomando em consideração a utilização de codões no organismo, cujo ácido nucleico é utilizado como ADN matricial para o procedimento de PCR. A PCR será realizada em condições de rigor inferiores às utilizadas para a clonagem de sequências com iniciadores de sequência simples (não degenerados) a partir de sequências conhecidas.

As sequências de ácidos nucleicos, obtidas por PCR, que codificam fragmentos polipeptidicos da presente invenção podem então ser utilizadas para se obter sequências maiores, recorrendo para tal a técnicas de hibridação para pesquisa em bancos. Por exemplo, é possível marcar um clone de PCR com átomos radioactivos e utilizá-lo para pesquisar um banco genómico ou de ADNc de outras espécies, de preferência outras espécies de mamíferos. Tipicamente, as condições de hibridação irão ser condições de rigor médio a elevado (por exemplo, cloreto de sódio 0,03 M e citrato de sódio 0,03 M, a uma temperatura compreendida entre cerca de 50°C e cerca de 60°C) .

Também é possível utilizar sondas de ácido nucleico degeneradas, que codificam total ou parcialmente a sequência de aminoácidos, para pesquisar em bancos genómicos e/ou de ADNc de outras espécies, de preferência 25 outras espécies de mamíferos. No entanto, inicialmente é preferível utilizar técnicas de PCR para se obter uma única sequência utilizável noutros procedimentos de pesquisa.

De acordo com a presente invenção, é possível utilizar as sequências polinucleotídicas de PDE_XIV que codificam PDE_XIV, os fragmentos do polipeptido, suas proteínas de fusão ou seus equivalentes funcionais, para gerar moléculas de ADN recombinante que comandam a expressão de PDE_XIV em células hospedeiras adequadas. Devido à degenerescência inerente do código genético, é possível utilizar outras sequências de ADN que codificam praticamente a mesma sequência de aminoácidos, ou uma sequência de aminoácidos funcionalmente equivalente, para a clonagem e a expressão de PDE_XIV. Os especialistas na matéria compreenderão que pode ser vantajoso produzir sequências nucleotídicas codificadoras de PDE que possuam codões que não ocorrem naturalmente. Os codões preferidos por um determinado hospedeiro procariótico ou eucariótico (Murray E et al. (1989), 'Nuc. Acids Res.', 17:477-508) podem ser seleccionados, por exemplo, de tal forma que aumentem a taxa de expressão de PDE_XIV ou produzam transcritos de ARN recombinante com propriedades desejáveis, tais como um período de semi-vida mais longo do que o dos transcritos produzidos a partir de uma sequência que ocorre naturalmente.

As sequências polinucleotídicas da presente invenção, obtidas por meio das técnicas descritas antes, podem ser utilizadas para se obter mais sequências e variantes homólogas, recorrendo para tal às técnicas descritas antes. Também podem ser modificadas para utilização na expressão dos polipeptidos da presente invenção em diversos sistemas 26 de células hospedeiras, por exemplo, para optimizar as preferências em termos de codões para uma determinada célula hospedeira em que as sequências polinucleotídicas estão a ser expressas. Pode ser desejável efectuar outras alterações nas sequências, para se introduzir locais de reconhecimento de enzimas de restrição ou para se modificar a propriedade ou a função dos polipeptidos codificados pelos polinucleótidos.

As sequências polinucleotídicas de PDE_XIV alteradas, que podem ser utilizadas de acordo com a invenção, compreendem supressões, inserções ou substituições de diferentes resíduos nucleotídicos, dando origem a um polinucleótido que codifica a mesma PDE ou uma PDE funcionalmente equivalente. A proteína também pode ter supressões, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e dão origem a uma PDE funcionalmente equivalente. É possível efectuar substituições deliberadas de aminoácidos com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos, desde que se mantenha a actividade biológica da PDE. Por exemplo, como aminoácidos de carga negativa refere-se o ácido aspártico e o ácido glutâmico; como aminoácidos de carga positiva refere-se a lisina e a arginina e como aminoácidos com grupos polares não carregados com valores de hidrofilicidade semelhantes refere-se leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina. A presente invenção abrange no seu âmbito os alelos de PDE. Tal como aqui utilizado, o termo "alelo" ou "sequência 27 alélica" designa uma forma alternativa de PDE. Os alelos resultam de uma mutação, isto é, de uma alteração na sequência de ácidos nucleicos, e produzem geralmente ARNm alterados ou polipeptidos cuja estrutura ou função pode ou não estar alterada. Um determinado gene pode não possuir nenhuma forma alélica ou pode possuir uma ou várias formas alélicas. De um modo geral, as alterações mutacionais comuns que dão origem a alelos estão associadas a supressões, adições ou substituições de aminoácidos. Cada um de tais tipos de alterações pode ocorrer por si só ou em combinação e uma ou mais vezes numa determinada sequência. 0 termo "alelo" também designa polimorfismos genéticos, tais como SNP (polimorfismos nucleotidicos simples).

As sequências nucleotidicas da presente invenção podem ser manipuladas com o intuito de se alterar a sequência codificadora de uma PDE por diversos motivos, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, alterações que modificam a clonagem, o processamento e/ou a expressão do produto génico. Por exemplo, é possível introduzir mutações por meio de técnicas bem conhecidas na especialidade, v.g., mutagénese dirigida ao local, para se inserir novos locais de restrição, para se alterar os padrões de glicosilação ou para alterar a preferência em termos de codões. É possível utilizar os polinucleótidos da presente invenção para produzir um iniciador, v.g., um iniciador de PCR, um iniciador para uma reacção de amplificação alternativa ou uma sonda, v.g., marcada com um identificador por meios convencionais, utilizando identificadores radioactivos ou não radioactivos, ou é 28 possível clonar os polinucleótidos dentro de vectores. Tais iniciadores, sondas e outros fragmentos possuem um tamanho correspondente pelo menos a 15 e de preferência pelo menos 20, por exemplo, pelo menos a 25, 30 ou 40, e também são abrangidos na definição da expressão "polinucleótidos da presente invenção", tal como aqui utilizada.

Os polinucleótidos ou iniciadores da presente invenção podem suportar um identificador. Como identificadores adequados refere-se os radioisótopos, tais como 32P ou 35S, marcadores enzimáticos ou outros marcadores proteicos, tais como biotina. Tais identificadores podem ser adicionados a polinucleótidos ou iniciadores da presente invenção e podem ser detectados por meio de técnicas conhecidas per si.

Os polinucleótidos, tais como um polinucleótido de ADN, e os iniciadores de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por via recombinante, sintética ou por quaisquer outros métodos que os especialistas na matéria tenham disponíveis. Também podem ser clonados por técnicas convencionais.

De um modo geral, os iniciadores serão produzidos por métodos de síntese que compreendem a preparação progressiva da sequência de ácidos nucleicos desejada, nucleótido a nucleótido. Já se encontram disponíveis na especialidade as técnicas automatizadas para tal fim.

De um modo geral, os polinucleótidos mais compridos serão produzidos por métodos recombinantes, por exemplo, utilizando técnicas de clonagem por PCR (reacção em cadeia com polimerase). Tais técnicas compreendem a preparação de um par de iniciadores (v.g., com cerca de 15 a 30 nucleótidos) para uma região da sequência nucleotídica que se pretende clonar, fazer contactar os iniciadores com ARNm 29 ou ADNc proveniente de uma célula fúngica, vegetal ou procariótica, efectuar uma reacção em cadeia com polimerase em condições que favorecem a amplificação da região desejada, isolar o fragmento amplificado (v.g., por purificação da mistura de reacção sobre um gel de agarose) e recuperar o ADN amplificado. Os iniciadores podem ser concebidos de modo a conterem locais de reconhecimento de enzimas de restrição adequados, de tal forma que o ADN amplificado possa ser clonado num vector de clonagem adequado.

As moléculas de ADN podem ser modificadas para se aumentar a estabilidade intracelular e o periodo de semi-vida. Como modificações que é possivel efectuar refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a adição de sequências de flanqueamento das extremidades 5' e/ou 3' da molécula ou a utilização de fosforotioato ou 2'-0-metilo em vez de ligações fosfodiesterase dentro da estrutura da moléculas.

Conforme se referiu antes, a presente invenção também diz respeito a sequências nucleotidicas que são capazes de hibridar com a totalidade ou com parte de qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa, ou uma sua variação alélica. Tais sequências nucleotidicas podem ser utilizadas em técnicas anti-sentido para modificar a expressão de PDE_XIV. Em alternativa, tais sequências (ou suas porções) podem ser utilizadas como uma sonda ou para amplificar tal sequência, total ou parcialmente, quando é utilizada como iniciador para a reacção em cadeia com polimerase.

Para além das sequências de ADN recombinantes, as sequências genómicas também são úteis no contexto da 30 descoberta de fármacos. Pode ser útil inibir a transcrição de ARNm de uma isoforma particular, em vez de inibir a sua proteína traduzida. Isto também pode ser aplicável à PDE_XIV, no caso de existirem variantes por corte e colagem e de as variantes por corte e colagem diferentes poderem ser transcritas a partir de promotores diferentes. Há um precedente estabelecido pelos múltiplos promotores que comandam a transcrição de uma 3'-fosfodiesterase de 2',3'-nucleótido cíclico de cérebro de murganho (Kurihara T. et al., 'Biochem. Biophys. Res. Comm.', 170:1074 [1990]). A invenção também é útil devido ao facto de as sequências de ADN, depois de conhecidas, proporcionarem as informações necessárias para conceber ensaios para detectar especificamente isoenzimas ou variantes de corte e colagem. Os pares de iniciadores de PCR específicos para isozimas constituem apenas um dos exemplos de um ensaio que depende totalmente do conhecimento da sequência de ADN específica da isozima ou variante de corte e colagem. Um tal ensaio permite detectar o ARNm para a isozima e assim determinar a distribuição tecidual e a relevância biológica de cada isozima num determinado estado patológico. Também permite identificar linhagens celulares que podem exprimir naturalmente apenas uma isozima - uma descoberta que pode tornar desnecessária a expressão de genes recombinantes. No caso de se conseguir demonstrar que há isozimas de PDE_XIV específicas associadas a um determinado estado patológico, então a invenção seria útil para conceber ensaios de diagnóstico para detectar a presente de ARNm da isozima. A existência de um nível anormal de sequências nucleotídicas que codificam uma PDE_XIV numa amostra 31 biológica pode reflectir uma aberração cromossómica, tal como uma supressão ou mutação num ácido nucleico. Em consequência, as sequências nucleotidicas que codificam uma PDE_XIV proporcionam a base para se obter sondas que podem ser utilizadas em diagnóstico para detectar aberrações cromossómicas, tais como supressões, mutações ou translocações cromossómicas no gene que codifica a PDE. A expressão de genes de PDE_XIV pode estar alterada em tais estados patológicos ou pode existir uma aberração cromossómica na região do gene que codifica uma PDE_XIV.

De acordo com uma variante alternativa da invenção, a sequência codificadora de PDE poderia ser sintetizada, total ou parcialmente, utilizando métodos químicos bem conhecidos na especialidade (veja-se Caruthers MH et al. (1980), 'Nuc. Acids Res. Symp. Ser.', 215-23, Horn T et al. (1980) 'Nuc. Acids Res. Symp. Ser.', 225-232).

OCORRE NATURALMENTE

Tal como aqui utilizada, a expressão "ocorre naturalmente" designa uma PDE_XIV com uma sequência de aminoácidos que existe na natureza.

ISOLADA/PURIFIÇADA

Tal como aqui utilizados, os termos "isolada" e "purificada" designam moléculas, quer sequências de ácidos nucleicos quer sequências de aminoácidos, que são removidas do seu ambiente natural e isoladas ou separadas pelo menos a partir de outro componente ao qual estão naturalmente associadas. 32

BIOLOGICAMENTE ACTIVA

Tal como aqui utilizada, a expressão "biologicamente activa" designa uma PDE_XIV de acordo com a presente invenção - tal como uma PDE_XIV recombinante - que possui uma função estrutural semelhante (mas não necessariamente do mesmo grau) e/ou uma função reguladora semelhante (mas não necessariamente do mesmo grau) e/ou uma função bioquímica semelhante (mas não necessariamente do mesmo grau) e/ou uma actividade imunológica semelhante (mas não necessariamente do mesmo grau) à da PDE_XIV que ocorre naturalmente. Especificamente, uma pde_xiv da presente invenção possui aptidão para hidrolisar um nucleótido cíclico, o que constitui uma das actividades características d enzima PDE da presente invenção.

ACTIVIDADE IMUNOLÓGICA

Tal como aqui utilizada, a expressão "actividade imunológica" é definida como sendo a aptidão de uma PDE_XIV natural, recombinante ou sintética, ou um seu oligopeptido, para induzir uma resposta imunitária específica em animais ou células adequados e para se ligar a anticorpos específicos.

DERIVADO 0 termo "derivado", tal como aqui utilizado em relação à sequência de aminoácidos, compreende a modificação química de uma PDE_XIV. A substituição de um átomo de hidrogénio por um grupo alquilo, acilo ou amino é bem ilustrativa de tais modificações. 33

SUPRESSÃO

Tal como aqui utilizado, o termo "supressão" é definido como sendo uma alteração numa sequência nucleotidica ou de aminoácidos, da qual se encontram ausentes um ou vários nucleótidos ou resíduos de aminoácidos, respectivamente.

INSERÇÃO/ADIÇÃO

Tal como aqui utilizado, o termo "inserção" ou "adição" designa uma alteração numa sequência nucleotidica ou de aminoácidos da qual tenha resultado a adição de um ou vários nucleótidos ou resíduos de aminoácidos, respectivamente, em comparação com a PDE que ocorre naturalmente.

SUBSTITUIÇÃO

Tal como aqui utilizado, o termo "substituição" é definido como sendo a substituição de um ou vários nucleótidos ou aminoácidos respectivamente por nucleótidos ou aminoácidos diferentes.

HOMÓLOGO 0 termo "homólogo", utilizado a propósito da sequência nucleotidica da presente invenção e da sequência de aminoácidos da presente invenção, pode ser sinónimo de variações alélicas das sequências.

Em particular, é possível estabelecer uma equivalência entre o termo "homologia", tal como aqui utilizado, e o termo "identidade". No caso presente, a homologia sequencial, no que concerne à sequência nucleotidica da presente invenção e à sequência de aminoácidos da presente 34 invenção, pode ser determinada por simples comparação "à vista" (isto é, uma comparação estrita) de qualquer uma ou várias das sequências com outra sequência para se verificar se essa outra sequência possui uma identidade pelo menos de 75% em relação à(s) sequência(s). Também é possível determinar a homologia sequencial relativa (isto é, identidade entre sequências) por meio de programas informáticos comercialmente disponíveis que conseguem calcular a homologia percentual (%) entre duas ou mais sequências. Como exemplo tipico de um tal programa informático refere-se o "CLUSTAL". É possivel calcular a homologia percentual (%) ao longo de sequências contíguas, isto é, alinhando uma sequência com outra sequência e comparando directamente cada aminoácido de uma sequência com o aminoácido correspondente da outra sequência, residuo a resíduo. Esta operação é designada por alinhamento "sem lacunas". Tipicamente, tais alinhamentos sem lacunas são efectuados apenas ao longo de um número relativamente pequeno de resíduos (por exemplo, menos de 50 aminoácidos contíguos).

Embora tal método seja muito simples e consistente, não leva em consideração o facto de uma simples inserção ou supressão num par de sequências idênticas, por exemplo, poder provocar o desalinhamento dos resíduos se aminoácidos subsequentes, daí podendo resultar uma grande redução da homologia percentual (%) quando se efectua um alinhamento global. Em consequência, a maior parte dos métodos de comparação de sequências são concebidos para produzirem alinhamentos óptimos que levem em consideração as possíveis inserções e supressões, sem penalizar indevidamente a classificação geral da homologia. Este objectivo é atingido 35 por inserção de "lacunas" no alinhamento de sequências, para assim tentar maximizar a homologia local.

No entanto, em tais métodos mais complexos são atribuídas "penalizações de lacuna" a cada lacuna que ocorre no alinhamento, de tal forma que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, há um alinhamento de sequências com o menor número possível de lacunas reflectindo um maior grau de afinidade entre as duas sequências comparadas - que irá atingir uma classificação melhor do que aquele em que existem muitas lacunas. Tipicamente, são utilizados custos de lacunas afins" para cobrar um custo relativamente elevado pela existência de uma lacuna e uma penalização mais pequena por cada resíduo subsequente na lacuna. Este é o sistema de classificação de lacunas utilizado mais vulgarmente. Evidentemente, as elevadas penalizações por lacunas irão produzir alinhamentos optimizados com poucas lacunas. A maior parte dos programas de alinhamento permitem modificar as penalizações por lacunas. No entanto, é preferível aplicar os valores originais (por defeito) quando se utiliza tais programas informáticos para a comparação de sequências. Por exemplo, quando se utiliza o programa 'GCG Wisconsin Bestfit' (ver infra), a penalização por lacuna que vem por defeito para as sequências de aminoácidos é de -12 para uma lacuna e -4 para cada prolongamento.

Sendo assim, para o cálculo da homologia percentual (%) máxima, é necessário, em primeiro lugar, a produção de um alinhamento óptimo, tomando em consideração as penalizações por lacuna. 0 produto 'GCG Wisconsin Bestfit' (Universidade de Wisconsin, E.U.A.; Devereux et al1984, 'Nucleic Acids Research', 12:387) é um programa informático 36 adequado para efectuar um alinhamento desse tipo. Como exemplos de outros programas informáticos com os quais se pode efectuar comparações de sequências refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, o produto 'BLAST' (veja-se Ausubel et ai., 1999 ibid - capitulo 18), 'FASTA' (Atschul et al., 1990, ' J. Mol. Biol. ', 403-410) e o conjunto de ferramentas de comparação 'GENEWORKS'. Os produtos 'BLAST' e 'FASTA' estão disponíveis para pesquisa em diferido e em linha (veja-se Ausubel et ai., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). No entanto, para algumas aplicações, é preferível utilizar o programa 'GCG Bestfit'.

Embora a homologia percentual (%) final possa ser medida em termos de identidade, há casos em que o próprio processo de alinhamento, tipicamente, não se baseia na comparação "tudo ou nada" de pares. Em vez disso, utiliza-se geralmente uma matriz de classificação de semelhanças relativas para se atribuir classificações a cada comparação entre pares com base na semelhança química ou na distância evolutiva. Como exemplo de uma tal matriz normalmente utilizada refere-se a matriz 'BLOSUM62' - a matriz por defeito do conjunto 'BLAST' de programas. De um modo geral, nos programas 'GCG Wisconsin' são utilizados os valores públicos por defeito ou um quadro de comparação de símbolos personalizado, caso seja fornecido (para mais pormenores, veja-se o manual do utilizador). É preferível utilizar os valores públicos por defeito para o produto GCG ou, no caso de outro programa, a matriz por defeito, tal como a 'BLOSUM62'.

Depois de o programa informático ter realizado um alinhamento óptimo, é possível calcular a homologia percentual (%) e de preferência a identidade percentual (%) 37 entre sequências. Tipicamente, o programa informático efectua tal operação, enquanto parte constituinte da comparação de sequências, e gera um resultado numérico.

Conforme indicado, para algumas aplicações, é possivel determinar a homologia (ou identidade) entre sequências recorrendo a qualquer algoritmo de homologia adequado e utilizando, por exemplo, parâmetros por defeito. De um modo vantajoso, utiliza-se o algoritmo 'BLAST', com os parâmetros fixados nos valores por defeito. 0 algoritmo 'BLAST' encontra-se descrito minuciosamente em http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html. Os parâmetros de pesquisa são definidos a seguir, utilizando-se vantajosamente os parâmetros definidos por defeito.

De uma forma vantajosa, a expressão "homologia substancial", quando determinada por 'BLAST', designa as sequências com uma correspondência traduzida num valor 'EXPECT' pelo menos de cerca de 7, de preferência pelo menos de cerca de 9 e mais preferencialmente 10 ou superior. Normalmente, o limiar por defeito para o valor 'EXPECT' na pesquisa por 'BLAST' é de 10. O 'BLAST' (ferramenta de pesquisa por alinhamento local básico, em inglês "Basic Local Alignment Search Tool") é o algoritmo de pesquisa heurística utilizado nos programas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx; tais programas atribuem significância às suas conclusões utilizando para tal os métodos estatísticos de Karlin e Altschul (veja-se http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html) com alguns aperfeiçoamentos. Os programas 'BLAST' foram feitos à medida para a pesquisa de semelhanças entre sequências. Por exemplo, com o intuito de identificar homólogos de uma 38 sequência em questão. De um modo geral, os programas não são úteis para pesquisa por motivos. Para uma descrição das questões básicas da pesquisa de semelhanças em bases de dados de sequências veja-se Altschul et al. (1994), 'Nature Genetics', 6:119-129.

Os cinco programas 'BLAST', que se encontram disponíveis em http://www.ncbi.nlm.nih.gov, executam as tarefas seguintes: o blastp efectua a comparação de uma sequência de aminoácidos em questão com uma base de dados de sequências proteicas; o blastn efectua a comparação de uma sequência nucleotidica em questão com uma base de dados de sequências nucleotidicas; o blastx efectua a comparação dos produtos da tradução conceptual em seis quadros de uma sequência nucleotidica em questão (as duas cadeias) com uma base de dados de sequências proteicas; o tblastn efectua a comparação de uma sequência proteica em questão com uma base de dados de sequências nucleotidicas traduzida dinamicamente nos seis quadros de leitura (as duas cadeias); o tblastx efectua a comparação das traduções em seis quadros de uma sequência nucleotidica em questão com as traduções em seis quadros de uma base de dados de sequências nucleotidicas.

No 'BLAST' são utilizados os parâmetros de pesquisa seguintes: 'HISTOGRAM' (HISTOGRAMA) - Exibe um histograma de classificações para cada pesquisa; o valor por defeito é 'sim'. (Veja-se o parâmetro H no manual de 'BLAST'). 39 'DESCRIPTIONS' (DESCRIÇÕES) - Limita ao número especificado o número de descrições curtas de sequências correspondentes encontradas; o limite por defeito é de 100 descrições. (Veja-se o parâmetro V na página do manual). Veja-se também os parâmetros 'EXPECT' e 'CUTOFF'. 'ALIGNMENTS' (ALINHAMENTOS) - Restringe as sequências das bases de dados ao número especificado para o qual se obtêm pares de segmentos de classificação elevada (HSP); por defeito, o limite é 50. No caso de haver outras sequências da base de dados que satisfaçam o limiar da significância estatística para declaração (veja-se 'EXPECT' e 'CUTOFF', infra), então apenas serão declaradas as correspondências às quais se atribua a maior significância estatística. (Veja-se o parâmetro B no manual de 'BLAST'). 'EXPECT' (PREVISÃO) - O limiar de significância estatística para declaração de correspondências em relação às sequências da base de dados; o valor por defeito é 10, prevendo-se que se consiga encontrar 10 correspondências por mera sorte, de acordo com o modelo estocástico de Karlin e Altschul (1990) . No caso de a significância estatística atribuída a uma correspondência ser superior ao limiar de 'EXPECT', então a correspondência não será declarada. Os limiares mais baixos de 'EXPECT' são mais rigorosos e por tal motivo são declarados menos correspondências por sorte. São aceites valores fraccionais. (Veja-se o parâmetro E no manual de 'BLAST'). 'CUTOFF' (VALORES CRÍTICOS) - Valores críticos de classificação para declarar pares de segmentos de classificação elevada. O valor por defeito é calculado a partir do valor de 'EXPECT' (veja-se supra). São declarados HSP para uma sequência da base de dados apenas se a 40 significância estatística que lhes é atribuída for pelo menos tão elevada quanto a que poderia ser atribuída a um HSP por si só com uma classificação igual ao valor de 'CUTOFF'. Os valores mais elevados de 'CUTOFF' são mais rigorosos e por tal motivo são declarados menos correspondências por sorte. (Veja-se o parâmetro S no manual de 'BLAST') . De uma forma típica, os limiares de significância podem ser geridos de um modo mais intuitivo utilizando 'EXPECT'. 'MATRIX' (MATRIZ) - Especifica uma matriz de classificação alternativa para 'blastp', 'BLASTX', 'TBLASTN' e 'TBLASTX'. A matriz por defeito é 'BLOSUM62' (Henikoff & Henikoff, 1992) . Como escolhas alternativas válidas refere-se: 'PAM40', 'PAM120', 'PAM250' e 'IDENTITY'. Não existem matrizes de classificação alternativas para o 'BLASTN'; a especificação da directiva 'MATRIX' em pedidos do 'BLASTN' devolve uma resposta de erro. 'STRAND' (CADEIA) - Limita uma pesquisa do 'TBLASTN' apenas à cadeia do topo ou do fundo das sequências da base de dados ou limita uma pesquisa do 'BLASTN', 'BLASTX' ou 'TBLASTX' apenas aos quadros de leitura da cadeia do topo ou do fundo da sequência em questão. 'FILTER' (FILTRO) - Dissimula segmentos da sequência em questão que têm uma complexidade constitucional diminuta, conforme determinado pelo programa 'SEG' de Wootton & Federhen (1993), 'Computers and Chemistry', 17:149-163, ou segmentos constituídos por repetições internas de periodicidade curta, conforme determinado pelo programa 'XNU' de Claverie & States (1993), 'Computers and Chemistry', 17:191-201, ou, no caso do 'BLASTN', pelo 41 programa 'DUST' de Tatusov e Lipman (veja-se http://www.ncbi.nlm.nih.gov). A filtração pode eliminar declarações estatisticamente significativas, mas biologicamente desinteressantes do campo de resultados (v.g., resultados positivos em relação a regiões vulgares acídicas, básicas ou ricas em prolina), deixando as regiões mais interessantes, sob o ponto de vista biológico, da sequência em questão disponíveis para comparação específica com sequências de bases de dados.

Uma sequência de complexidade diminuta, encontrada por um programa de filtração, é substituída pela letra "N" na sequência nucleotídica (v.g., "NNNNNNNNNNNNN") e a letra "X" nas sequências proteicas (v.g.,, "XXXXXXXXX"). A filtração é aplicada somente à sequência em questão (ou aos produtos da sua tradução) e não às sequências da base de dados. Por defeito, o filtro do 'BLASTN' é o 'DUST' e para outros programas é o ySEG'. Não é invulgar que os filtros 'SEG', 'XNU' ou ambos não tenham nada a dissimular quando são aplicados a sequências em 'SWISS-PROT', de modo que não se deve esperar que a filtração produza sempre um efeito. Além disso, em alguns casos, as sequências são dissimuladas na sua totalidade, indicando isso que a significância estatística de quaisquer correspondências declaradas, em relação à sequência em questão não filtrada, deve ser suspeita. 'NCBI-gi' - Faz com que os identificadores 'NCBI gi' sejam exibidos nos resultados, para além do número de acesso e/ou nome do local.

Mais preferencialmente, as comparações de sequências são efectuadas utilizando o algoritmo simples de pesquisa 'BLAST' disponível em http://wwxv.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. 42

No caso de serem utilizadas Penalizações por Lacuna durante a determinação da identidade de sequências, então utiliza-se preferencialmente os parâmetros seguintes: PARA BLAST ABERTURA DE LACUNA 0 PROLONGAMENTO DE LACUNA 0 PARA CLUSTAL ADN PROTEÍNA TAMANHO DE PALAVRA 2 1 K triplo PENALIZAÇÃO POR LACUNA 10 10 PROLONGAMENTO DE LACUNA 0,1 I-1 o

Como exemplos de outros métodos computorizados para a determinação da identidade e da semelhança entre duas sequências refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, o conjunto de programas 'GCG' (Devereux et al., 1984, 'Nucleic Acids Research', 12:387) e FASTA (Atschul et al., 1990, 'J. Molec. Biol.' 403-410).

VARIANTES E DERIVADOS DE POLIPEPTIDOS O termo "variante" ou "derivado", utilizado a propósito das sequências de aminoácidos da presente invenção, designa qualquer substituição, variação, modificação, suprimento, supressão ou adição de um (ou vários) aminoácidos da sequência, desde que a sequência de aminoácidos resultante tenha actividade de PDE e de preferência seja pelo menos tão activa como qualquer um dos polipeptidos apresentado na listagem de sequências anexa. 43

As sequências da presente invenção podem ser modificadas para utilização na presente invenção. De uma forma típica, são feitas modificações que mantenham a actividade de PDE da sequência. É possível efectuar substituições de aminoácidos, por exemplo, entre 1, 2 ou 3 e 10, 20 ou 30 substituições, desde que a sequência modificada mantenha a actividade de PDE. As substituições de aminoácidos podem incluir a utilização de análogos que não ocorrem naturalmente, por exemplo, para aumentar o período de semi-vida no plasma sanguíneo de um polipeptido administrado para fins terapêuticos. É possível efectuar substituições conservativas, por exemplo, de acordo com o quadro seguinte. É possível fazer substituições entre os aminoácidos que se encontram no mesmo bloco na segunda coluna e preferencialmente na mesma linha na terceira coluna.

ALIFÁTICOS Não polares GAP ILV Polares - sem carga C S T M NQ Polares - com carga D E KR AROMÁTICOS H F W Y

Conforme indicado antes, as proteínas da invenção são preparadas, tipicamente, por métodos recombinantes, por exemplo, conforme aqui descrito, e/ou por métodos de síntese, utilizando técnicas bem conhecidas pelos especialistas na matéria, tais como a síntese em fase sólida. As variantes e os derivados de tais sequências 44 incluem as proteínas de fusão, em que as proteínas de fusão compreendem pelo menos a sequência de aminoácidos da presente invenção ligada (directa ou indirectamente) a outra sequência de aminoácidos. Tipicamente, essas outras sequências de aminoácidos - as quais são, às vezes, designadas por compares de proteínas de fusão - irão conferir uma funcionalidade vantajosa, por exemplo, ajudar a extrair e purificar a sequência de aminoácidos da presente invenção. Como exemplos de compares de proteínas de fusão refere-se a glutationa-S-transferase (GST), His 6x, GAL4 (domínios de ligação do adn e/ou domínios de activação transcricional) e β-galactosidase. Também pode ser conveniente incluir um local de clivagem proteolítica entre o cômpar de proteína de fusão e a sequência proteica da presente invenção, para assim permitir a remoção deste último. De preferência, o cômpar de proteína de fusão não irá obstruir a função da proteína da presente invenção.

VARIANTES E DERIVADOS DE POLINUCLEOTIDOS 0 termo "variante" ou "derivado", utilizado a propósito da sequência nucleotídica da presente invenção, designa qualquer substituição, variação, modificação, suprimento, supressão ou adição de um (ou vários) ácidos nucleicos da sequência, desde que a sequência nucleotídica resultante codifique um polipeptido que tenha actividade de pde e de preferência tenha pelo menos a mesma actividade das sequências apresentadas na listagem de sequências anexa.

Conforme indicado antes, no que concerne à homologia entre sequências, de preferência existe uma homologia pelo menos de 75%, mais preferencialmente pelo menos de 85% e 45 ainda mais preferencialmente pelo menos de 90% em relação às sequências aqui ilustradas na listagem de sequências. De uma forma mais preferencial, existe uma homologia pelo menos de 95% e mais preferencialmente pelo menos de 98%. É possível efectuar comparações de homologia entre nucleótidos, conforme descrito antes. Para algumas aplicações, o programa de comparação de sequências preferido é o programa 'GCG Wisconsin Bestfit' descrito antes. Por defeito, o valor das correspondências da matriz de classificação é de 10 para cada nucleótido idêntico e de -9 para cada falha de correspondência. A penalização por defeito para a criação de lacunas é de -50 e a penalização por defeito para o prolongamento de lacunas é de -3 por cada nucleótido.

Tal como aqui utilizados, os termos "variante", "homólogo", "fragmento" e "derivado" abrangem as variações alélicas das sequências. O termo "variante" também abrange as sequências que são complementares das sequências que são capazes de hibridar com as sequências nucleotídicas aqui apresentadas.

HIBRIDAÇÃO O termo "hibridação", tal como aqui utilizado, designa "o processo através do qual uma cadeia de ácido nucleico se liga a uma cadeia complementar por emparelhamento de bases" (Coombs J. (1994), 'Dictionary of Biotechnology', Stockton Press, Nova Iorque, NY), bem como o processo de amplificação tal como tem lugar nas técnicas de reacção em cadeia com polimerase, conforme descrito por Dieffenbach CW e GS Dveksler (1995, 'PCR Primer, a Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Press, Plainview NY). 46

As condições de hibridação são determinadas com base na temperatura de fusão (Tm) do complexo de ligação de ácidos nucleicos, conforme descrito por Berger e Kimmel (1987, 'Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology', Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), e conferem um "rigor" definido, conforme adiante se explica.

Quando se fala em rigor da hibridação pretende-se designar as condições sob as quais os híbridos de poli(ácidos nucleicos) são estáveis. Tais condições são evidentes para os especialistas na matéria. Tal como é do conhecimento dos especialistas na matéria, a estabilidade dos híbridos reflecte-se na sua temperatura de fusão (Tm), a qual diminui aproximadamente 1°C a 1,5°C por cada 1% de redução da homologia das sequências. De um modo geral, a estabilidade de um híbrido é uma função da concentração de iões de sódio e da temperatura. Tipicamente, a reacção de hibridação é efectuada em condições de rigor elevado, seguindo-se operações de lavagem de rigor variável.

Tal como aqui utilizada, a expressão "rigor elevado" designa as condições que permitem a hibridação apenas das sequências de ácidos nucleicos que formam híbridos estáveis em Na+ 1 M a uma temperatura entre 65°C e 68°C.

De uma forma típica, o rigor máximo ocorre a uma Tm de cerca de -5°C (5°C inferior à Tm da sonda).

As condições de rigor elevado correspondem a uma temperatura entre cerca de 5°C e 10°C abaixo da Tm da sonda. É possível obter condições de rigor elevado, por exemplo, efectuando a hibridação numa solução aquosa que contenha SSC 6x, meio de Denhardt 5x, SDS a 1% (dodecil-sulfato de sódio), pirofosfato de Na+ 0,1 e ADN de esperma de salmão desnaturado à razão de 0,1 mg/mL, enquanto 47 competidor não específico. Após a hibridação, é possível efectuar uma lavagem de rigor elevado em vários passos, com uma lavagem final (cerca de 30 minutos) à temperatura de hibridação em SSC 0,2 - 0,lx, SDS a 0,1%.

De uma forma típica, as condições de rigor moderado ou intermédio ocorrem a uma temperatura entre cerca de 10°C e 20°C abaixo da Tm da sonda.

Tipicamente, as condições de rigor reduzido ocorrem a uma temperatura entre cerca de 20°C e 25°C abaixo da Tm da sonda.

Tal como será do conhecimento dos especialistas na matéria, é possível recorrer a uma hibridação em condições de rigor máximo para identificar ou detectar sequências polinucleotídicas, ao passo que é possível recorrer a uma hibridação em condições de rigor intermédio (ou reduzido) para identificar ou detectar sequências polinucleotídicas semelhantes ou afins.

As condições de rigor moderado correspondem a condições equivalentes às da hibridação efectuada na solução anteriormente descrita, mas a uma temperatura compreendida entre cerca de 60°C e 62°C. Em tal caso, a lavagem final é efectuada à temperatura de hibridação, em SSC lx, SDS a 0,1%.

As condições de rigor reduzido correspondem a condições equivalentes às da hibridação efectuada na solução anteriormente descrita, mas a uma temperatura compreendida entre cerca de 50°C e 52°C. Em tal caso, a lavagem final é efectuada à temperatura de hibridação, em SSC 2x, SDS a 0,1%.

Para algumas aplicações, pode ser útil utilizar condições de rigor reduzido a médio para identificar 48 sequências codificadoras de enzimas semelhantes provenientes de organismos diferentes.

Faz-se observar que é possível adaptar e duplicar tais condições, recorrendo para tal a uma grande variedade de tampões, v.g., tampões à base de formamida, e temperaturas. A solução de Denhardt e o SSC, bem como outros tampões de hibridação adequados, são bem conhecidos pelos especialistas na matéria (veja-se, v.g., Sambrook, et al., eds. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, ou Ausubel, et al., eds. (1990) 'Current Protocols in Molecular Biology', John Wiley & Sons, Inc.). As condições de hibridação óptimas terão de ser determinadas empiricamente, já que o comprimento e o teor em GC da sonda também aí desempenham uma função.

De um modo geral, os polinucleótidos da invenção que são capazes de hibridar selectivamente com as sequências nucleotídicas aqui apresentadas, ou seu complemento, serão homólogos pelo menos em 70%, de preferência pelo menos em 80 ou 90% e mais preferencialmente pelo menos em 95% ou 98% às correspondentes sequências nucleotídicas aqui apresentadas, ao longo de uma região pelo menos de 20, de preferência pelo menos de 25 ou 30, por exemplo, pelo menos de 40, 60 ou 100 ou mais nucleótidos contíguos.

A expressão "selectivamente hibridáveis" significa que o polinucleótido, utilizado como sonda, é utilizado em condições nas quais se concluiu que um polinucleótido alvo da presente invenção híbrida com a sonda a um nível significativamente superior ao espontâneo. A hibridação espontânea pode ocorrer devido à presença dos outros polinucleótidos, por exemplo, no banco de ADNc ou de ADN 49

genómico sob pesquisa. Em tal caso, o nível espontâneo implica um nível de sinal, gerado por interacção entre a sonda e um membro de ADN não específico do banco, que é 10 vezes e de preferência 110 vezes menos intenso do que a interacção específica observada com o ADN alvo. A intensidade da interacção pode ser medida, por exemplo, por radiomarcação da sonda, v.g., com 32P.

De acordo com um aspecto preferido, a presente invenção abrange as sequências nucleotídicas que podem hibridar com qualquer uma ou várias das sequências nucleotídicas da presente invenção em condições rigorosas (v.g., 60°C e SSX 0,2x {SSX lx = NaCl 0,15 M, citrato de Na3 0,015 M, pH 7,0) .

De acordo com um aspecto mais preferido, a presente invenção abrange as sequências nucleotídicas que podem hibridar com qualquer uma ou várias das sequências nucleotídicas da presente invenção em condições de rigor elevado (v.g., 65°C e SSX 0,lx {SSX lx = NaCl 0,15 M, citrato de Na3 0,015 M, pH 7,0).

No caso de o polinucleótido da presente invenção ser de cadeia dupla, a presente invenção abrange as duas cadeias da hélice dupla, quer individualmente quer em combinação. No caso de o polinucleótido ser de cadeia simples, faz-se observar que a presente invenção também abrange, no seu âmbito, a sequência complementar de tal polinucleótido.

Os polinucleótidos que não são 100% homólogos das sequências da presente invenção, mas que estão abrangidos no âmbito da invenção, podem ser obtidos de diversas formas. É possível obter outras variantes das sequências aqui descritas, por exemplo, por pesquisa com sondas de 50 bancos de ADN provenientes de um conjunto de indivíduos, por exemplo, indivíduos de populações diferentes. Além disso, também é possível obter outros homólogos virais/bacterianos ou celulares, em particular homólogos celulares existentes em células de mamíferos (v.g., células de ratos, murganhos, bovinos e primatas), e geralmente tais homólogos e seus fragmentos irão ser capazes de hibridar selectivamente com as sequências aqui apresentadas na listagem de sequências. Tais sequências podem ser obtidas por pesquisa com sondas de bancos de ADNc ou bancos de ADN genómico preparados a partir de outras espécies de animais, pesquisando tais bancos com sondas que compreendem a totalidade ou parte de qualquer uma das sequências apresentadas na listagem de sequências anexa, sob condições de rigor médio a elevado. O mesmo se aplica à obtenção de homólogos de espécies e variantes alélicas do polipeptido ou das sequências nucleotídicas da invenção.

Também é possível obter variantes e homólogos de estirpe/espécie por PCR degenerada, na qual se utilizará iniciadores concebidos para visar sequências dentro das variantes e dos homólogos que codificam sequências de aminoácidos conservadas dentro das sequências da presente invenção. As sequências conservadas podem ser previstas, por exemplo, por alinhamento das sequências de aminoácidos de diversos variantes/homólogos. Os alinhamentos de sequências podem ser realizados utilizando programas informáticos conhecidos na especialidade. Por exemplo, utiliza-se bastante o programa 'GCG Wisconsin PileUp'.

Os iniciadores utilizados na PCR degenerada irão conter uma ou várias posições degeneradas e serão utilizados em condições de rigor inferior às utilizadas 51 para clonar sequências com iniciadores de sequência única a partir de sequências conhecidas.

Em alternativa, tais polinucleótidos podem ser obtidos por mutagénese dirigida ao local de sequências caracterizadas. Este método pode ser útil, por exemplo, no caso de ser necessário submeter as sequências a alterações silenciosas dos codões para assim optimizar as preferências de codões para uma determinada célula hospedeira na qual as sequências polinucleotidicas são expressas. Pode ser desejável efectuar outras alterações nas sequências para se introduzir locais de reconhecimento de enzimas de restrição ou para alterar a propriedades ou a função dos polipeptidos codificados pelos polinucleótidos.

Os polinucleótidos da invenção podem ser utilizados para produzir um iniciador, v.g., um iniciador de PCR, um iniciador para uma reacção de amplificação alternativa ou uma sonda, v.g., marcada com um identificador por métodos convencionais, utilizando marcadores radioactivos ou não radioactivos, ou então os polinucleótidos podem ser clonados dentro de vectores. Tais iniciadores, sondas e outros fragmentos irão possuir um tamanho correspondente pelo menos a 15, de preferência pelo menos a 20, por exemplo, pelo menos 25, 30 ou 40, nucleótidos e também estão abrangidos pelo significado do termo "polinucleótidos da presente invenção", tal como aqui utilizado.

Os polinucleótidos, tais como os polinucleótidos de ADN, e as sondas de acordo com a invenção podem ser produzidos por métodos recombinantes, de síntese ou por quaisquer métodos ao alcance dos especialistas na matéria. Também podem ser clonados por técnicas convencionais. 52

De um modo geral, os polinucleótidos mais compridos serão produzidos por métodos recombinantes, por exemplo, utilizando técnicas de clonagem por PCR (reacção em cadeia com polimerase). Tais técnicas compreendem a preparação de um par de iniciadores {v.g., com cerca de 15 a 30 nucleótidos) que flanqueiam uma região da sequência de encaminhamento para lípidos que se pretende clonar, fazer contactar os iniciadores com ARNm ou ADNc proveniente de uma célula animal ou humana, efectuar uma reacção em cadeia com polimerase em condições que favorecem a amplificação da região desejada, isolar o fragmento amplificado (v.g., por purificação da mistura de reacção sobre um gel de agarose) e recuperar o ADN amplificado. Os iniciadores podem ser concebidos de modo a conterem locais de reconhecimento de enzimas de restrição adequados, de tal forma que o ADN amplificado possa ser clonado num vector de clonagem adequado.

SEQUÊNCIAS REGULATÓRIAS

De preferência, o polinucleótido da presente invenção está funcionalmente ligado a uma sequência regulatória que é capaz de comandar a expressão da sequência codificadora, por exemplo, pela célula hospedeira seleccionada. A título exemplificativo, a presente invenção abrange um vector que compreende o polinucleótido da presente invenção 53 funcionalmente ligado a uma tal sequência regulatória, isto é, em que o vector é um vector de expressão. A expressão "funcionalmente ligado" designa uma justaposição, em que os componentes descritos estão relacionados de uma forma tal que lhes permite funcionar do modo pretendido. Uma sequência regulatória que esteja "funcionalmente ligada" a uma sequência codificadora está ligada de tal forma que a expressão da sequência codificadora ocorre em condições compatíveis com as sequências de controlo. A expressão "sequências regulatórias" abrange os promotores e intensificadores e outros sinais de regulação da expressão. 0 termo "promotor" é aqui utilizado no sentido normalmente utilizado na especialidade, v.g., um local de ligação de polimerase de ARN.

Também é possível conseguir uma expressão aperfeiçoada do polinucleótido de acordo com a presente invenção através da selecção de regiões regulatórias heterólogas, v.g., regiões promotoras, regiões líder secretoras e regiões finalizadoras, as quais servem para aumentar a expressão e também, se desejado, os níveis de secreção da proteína relevante a partir do hospedeiro de expressão escolhido e/ou para proporcionar a regulação induzível da expressão do polipeptido da presente invenção.

De preferência, a sequência nucleotídica da presente invenção pode ser funcionalmente ligada pelo menos a um promotor.

Para além do promotor original do gene que codifica o polipeptido da presente invenção, é possível utilizar outros promotores para comandarem a expressão do 54 polipeptido da presente invenção. 0 promotor pode ser seleccionado quanto à sua eficácia para comandar a expressão do polipeptido da presente invenção no hospedeiro de expressão desejado.

De acordo com outra variante, é possivel escolher um promotor constitutivo para comandar a expressão do polipeptido desejado da presente invenção. Um tal arquétipo de expressão pode proporcionar vantagens suplementares, uma vez que contorna a necessidade de criar os hospedeiros de expressão em cultura num meio que contenha um substrato indutor.

Como exemplos de promotores induziveis e/ou constitutivos fortes, que são preferíveis para utilização em hospedeiros fúngicos de expressão, refere-se os que podem ser obtidos a partir dos genes de fungos para promotores de xilanase (xlnA), fitase, ATP-sintetase, subunidade 9 (oliC), triose-fosfato-isomerase (tpi), desidrogenase alcoólica (AdhA), α-amilase (amy), amiloglicosidase (AG - do gene glaA), acetamidase (amdS) e gliceraldeído-3-fosfto-desidrogenase (gpd).

Como exemplos de promotores fortes de leveduras refere-se os que se podem obter a partir dos genes para desidrogenase alcoólica, lactase, 3-fosfoglicerato-cinase e triosefosfato-isomerase.

Como exemplos de promotores bacterianos fortes refere-se os promotores de c-amilase e SP02, bem como os promotores dos genes de proteases extracelulares.

Também é possivel utilizar promotores híbridos para melhorar a regulação induzivel do arquétipo de expressão.

Além disso, o promotor pode ainda possuir caracteristicas que lhe permitam garantir ou aumentar a 55 expressão num hospedeiro adequado. Por exemplo, as características podem ser regiões conservadas, tais como uma caixa de Pribnow ou uma caixa TATA. 0 promotor pode mesmo conter outras sequências para afectar (por exemplo, para manter, aumentar, reduzir) os níveis de expressão da sequência nucleotídica da presente invenção. Por exemplo, como outras sequências adequadas refere-se o intrão Shl ou um intrão de ADH. Há outras sequências que incluem elementos induzíveis - tais como elementos induzíveis por temperatura, agentes químicos, luz ou stress. De igual modo, também podem estar presentes elementos adequados para reforçar a transcrição ou a tradução. Como exemplo de um destes últimos elementos refere-se a sequência de sinal de 5' de TMV (veja-se Sleat, 'Gene', 217 [1987] 217-225, e Dawson, 'Plant Mol. Biol.', 23 [1993] 97).

SECREÇÃO

Frequentemente, é desejável que o polipeptido da presente invenção seja segregado a partir do hospedeiro de expressão para o meio de cultura, meio este a partir do qual é possível recuperar mais facilmente o polipeptido da presente invenção. De acordo com a presente invenção, a sequência líder de secreção pode ser seleccionada com base no hospedeiro de expressão desejado. Também é possível utilizar sequências de sinal híbridas no contexto da presente invenção.

Como exemplos típicos de sequências líder de secreção refere-se as provenientes do gene de amiloglicosidase (AG) fúngico (glaA - ambas as versões de 18 e 24 aminoácidos, v.g., proveniente de Aspergillus), o gene do factor α 56 (leveduras, v.g., Saccharomyces e Kluyveromyces) ou o gene de α-amilase (Bacillus).

ARQUÉTIPOS 0 termo "arquétipo" - que é um sinónimo dos termos "conjugado", "cassete" e "híbrido" - abrange a sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção ligada, directa ou indirectamente, a um promotor. Como exemplo de uma ligação indirecta é possível inserir um grupo separador adequado, tal como uma sequência de intrão, tal como o intrão Shl ou o intrão ADH, entre o promotor e a sequência nucleotídica da presente invenção. 0 mesmo se aplica ao termo "fundido" utilizado na presente invenção, o qual abrange a ligação directa ou indirecta. Em cada um dos casos, os termos não abrangem a combinação natural da sequência nucleotídica que codifica a proteína normalmente associada ao promotor génico de tipo natural, quando ambas se encontram no seu ambiente natural. 0 arquétipo pode mesmo conter ou exprimir um marcador que permite seleccionar o arquétipo genético, por exemplo, numa bactéria, de preferência do género Bacillus, tal como Bacillus subtilis, ou em plantas para as quais tenha sido transferido. É possível utilizar diversos marcadores existentes, tais como, por exemplo, os que codificam a manose-6-fosfato-isomerase (especialmente no caso das plantas), ou aqueles marcadores que proporcionam resistência aos antibióticos - v.g., resistência a G418, higromicina, bleomicina, canamicina e gentamicina.

De preferência, o arquétipo da presente invenção compreende pelo menos a sequência nucleotídica da presente invenção funcionalmente ligada a um promotor. 57

VECTORES O termo "vector" abrange os vectores de expressão, os vectores de transformação e os vectores pendulares. 0 termo "vector de expressão" designa um arquétipo com aptidão para expressão in vivo ou in vitro. 0 termo "vector de transformação" designa um arquétipo que pode ser transferido de uma entidade para outra entidade pertencente à mesma espécie ou a uma espécie diferente. No caso de se poder transferir o arquétipo entre duas espécies diferentes, por exemplo, entre um plasmideo de E. coli e uma bactéria, tal como uma bactéria do género Bacillus, então, por vezes, o vector de transformação recebe designação de "vector pendular". Pode mesmo tratar-se de um arquétipo que pode ser transferido de um plasmideo de E. coli para uma Agrobacterium e depois para uma planta.

Os vectores da presente invenção podem ser transformados dentro de uma célula hospedeira adequada, conforme adiante se descreve, para assim proporcionar a expressão de um polipeptido da presente invenção. Assim, de acordo com outro dos seus aspectos, a invenção proporciona um processo para a preparação de polipeptidos de acordo com a presente invenção, o qual consiste em criar em cultura uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vector de expressão, conforme descrito antes, em condições tais que o vector proporcione a expressão de uma sequência codificadora que codifica os polipeptidos, e em recuperar depois os polipeptidos expressos.

Por exemplo, os vectores podem ser plasmídeos, virus ou bacteriófagos que possuam uma origem de replicação, 58 facultativamente um promotor da expressão do referido polinucleótido e facultativamente um regulador do promotor.

Os vectores da presente invenção podem conter um ou vários genes marcadores seleccionáveis. Os sistemas de selecção mais adequados para microrganismos industriais são aqueles que são constituídos pelo conjunto de marcadores seleccionáveis que não exigem uma mutação no organismo hospedeiro. Como exemplos de marcadores seleccionáveis fúngicos refere-se os genes para acetamidase {amdS), ATP-sintetase, subunidade 9 (oliC), orotidina-5'-fosfato-descarboxilase (pvrA), fleomicina e resistência a benomilo (benA) . Como exemplos de marcadores seleccionáveis não fúngicos refere-se o gene bacteriano de resistência a G418 (este também pode ser utilizado em leveduras, mas não em fungos filamentosos), o gene da resistência à ampicilina (E. coli), o gene da resistência à neomicina (Bacillus) e o gene uidA de E. coli, que codifica a β-glicuronidase (GUS).

Os vectores podem ser utilizados in vitro, por exemplo, para a produção de ARN, ou podem ser utilizados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira.

Assim, é possível incorporar polinucleótidos da presente invenção num vector recombinante (tipicamente, um vector replicável), por exemplo, um vector de clonagem ou expressão. 0 vector pode ser utilizado para replicar o ácido nucleico numa célula hospedeira compatível. Assim, de acordo com uma outra variante, a invenção proporciona um método para a preparação de polinucleótidos da presente invenção, o qual consiste em introduzir um polinucleótido da presente invenção num vector replicável, introduzir o vector numa célula hospedeira compatível e deixar a célula hospedeira crescer em condições que favorece, a replicação 59 do vector. É possível recuperar o vector a partir da célula hospedeira. Seguidamente, descrever-se-ão células hospedeiras adequadas a propósito dos vectores de expressão. A presente invenção também diz respeito à utilização de células hospedeiras manipuladas geneticamente que expressam uma PDE_xiv, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, em métodos de pesquisa para a identificação de inibidores e antagonistas da PDE_XIV que modulem a actividade de fosfodiesterase e consequentemente modulem os níveis de nucleótidos cíclicos. Tais células hospedeiras manipuladas geneticamente poderiam ser utilizadas para pesquisas de bancos de péptidos ou moléculas orgânicas capazes de modular a actividade de PDE_xiv. Os antagonistas e inibidores de pde_xiv, tais como anticorpos, péptidos e moléculas orgânicas pequenas, irão constituir a base de composições farmacêuticas para o tratamento de doenças associadas, por exemplo, às PDE_XIV. Tais inibidores ou antagonistas podem ser administrados, por si sós ou em combinação com outros fármacos, para o tratamento de tais doenças. A presente invenção também diz respeito a vectores de expressão e a células hospedeiras que compreendem sequências polinucleotídicas que codificam as PDE_XIV, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, para a produção in vivo ou in vitro de proteína de PDE_XIV ou para a pesquisa de agentes que possam afectar a expressão ou actividade de PDE_XIV. 60

TECIDO O termo "tecido", tal como aqui utilizado, abrange os tecidos em si e os órgãos.

CÉLULAS HOSPEDEIRAS A expressão "célula hospedeira" - utilizada a propósito da presente invenção - designa qualquer célula que possa compreender a sequência nucleotidica que codifica a proteína recombinante de acordo com a presente invenção e/ou produtos obtidos a partir da mesma, em que, no caso de haver um promotor presente na célula hospedeira, então poderá permitir a expressão da sequência nucleotidica de acordo com a presente invenção.

Sendo assim, de acordo com outra das suas variantes, a presente invenção proporciona células hospedeiras transformadas ou transfectadas com um polinucleótido da presente invenção. De preferência, tal polinucleótido é transportado num vector para a replicação e a expressão dos referidos polinucleótidos. As células serão seleccionadas de tal forma que sejam compatíveis com o referido vector e podem ser, por exemplo, células procarióticas (por exemplo, bacterianas), fúngicas, de leveduras ou vegetais. A bactéria gram-negativa E. coli é frequentemente utilizada como hospedeiro para a expressão de genes heterólogos. No entanto, há uma tendência de acumulação de grandes quantidades de proteína heteróloga dentro da célula. Às vezes, torna-se difícil efectuar a purificação subsequente da proteína desejada a partir do agregado de proteínas intracelulares de E. coli.

Ao contrário do que sucede com a E. coli, as bactérias pertencentes ao género Bacillus são muito adequadas como 61 hospedeiros heterólogos devido à sua aptidão para segregar proteínas para o meio de cultura. Como exemplos de outras bactérias adequadas como hospedeiros refere-se as pertencentes aos géneros Streptomyces e Pseudomonas.

Consoante a natureza do polinucleótido que codifica o polipeptido da presente invenção e/ou do desejo de processamento suplementar da proteína expressa, pode ser preferível utilizar hospedeiros eucarióticos, tais como leveduras ou outros fungos. De um modo geral, as células de levedura são preferíveis, comparativamente com as células de fungos, visto que são mais facilmente manipuláveis. No entanto, há algumas proteínas cuja secreção é fraca a partir da célula de levedura ou, em alguns casos, não são processadas convenientemente (v.g., hiperglicosilação na levedura). Em tais casos, dever-se-á seleccionar um organismo hospedeiro fúngico diferente.

Como exemplos de hospedeiros de expressão adequados, dentro do âmbito da presente invenção, refere-se os fungos, tais como os da espécie Aspergillus (tais como os que se encontram descritos nos documentos EP-A-0 184438 e EP-A-0284603) e da espécie Trichoderma·, as bactérias, tais como as da espécie Bacillus (tais como as que se encontram descritos nos documentos EP-A-0134048 e EP-A-0253455), da espécie Streptomyces e da espécie Pseudomonas, e leveduras, tais como as da espécie Kluyveromyces (tais como as que se encontram descritos nos documentos EP-A-0096430 e EP-A-0301670) e da espécie Saccharomyces. A título exemplificativo, é possível seleccionar hospedeiros de expressão típicos entre o conjunto constituído por Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, 62

Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus lichenformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis e Saccharomyces cerevisiae. A utilização de células hospedeiras adequadas - tais como células hospedeiras de leveduras, fúngicas e vegetais - pode dar origem a modificações pós-traducionais (v.g., miristoilação, glicosilação, truncamento, lapidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina), tal como pode ser necessário conferir uma actividade biológica óptima aos produtos de expressão recombinante da presente invenção.

ORGANISMO 0 termo "organismo", utilizado a propósito da presente invenção, designa qualquer organismo que possa compreender a sequência nucleotidica que codifica a proteína recombinante de acordo com a presente invenção e/ou os produtos obtidos a partir da mesma, em que, no caso de haver um promotor presente no organismo, então poderá permitir a expressão da sequência nucleotidica de acordo com a presente invenção. Como exemplos de organismos é possível referir um fungo, uma levedura ou uma planta. A expressão "organismo transgénico", utilizada a propósito da presente invenção, designa qualquer organismo que compreende a sequência nucleotidica que codifica a proteína recombinante de acordo com a presente invenção e/ou os produtos obtidos a partir da mesma, em que, no caso de haver um promotor presente no organismo, então poderá permitir a expressão da sequência nucleotidica de acordo 63 com a presente invenção. De preferência, a sequência nucleotídica é incorporada no genoma do organismo. A expressão "organismo transgénico" não abrange a sequência codificadora nucleotídica original de acordo com a presente invenção, no seu ambiente natural, quando se encontra sob a regulação do seu promotor original que também se encontra no seu ambiente natural. Além disso, a presente invenção não abrange a proteína original de acordo com a presente invenção quando esta se encontra no seu ambiente natural e quando é expressa pela sua sequência codificadora nucleotídica original que também se encontra no seu ambiente natural e quando tal sequência nucleotídica se encontra sob a regulação do seu promotor original que também se encontra no seu ambiente natural.

Sendo assim, o organismo transgénico da presente invenção inclui um organismo que compreende qualquer uma das sequências nucleotídicas que codificam a sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, ou suas combinações, arquétipos de acordo com a presente invenção (incluindo as suas combinações), vectores de acordo com a presente invenção, plasmídeos de acordo com a presente invenção, células de acordo com a presente invenção, tecidos de acordo com a presente invenção ou os seus produtos A célula ou o organismo transformado poderia preparar quantidades aceitáveis do composto desejável, o qual poderia ser facilmente recuperado a partir da célula ou do organismo. A presente invenção também abrange os organismos que tenham sido modificados no sentido de expressarem níveis elevados da enzima. 64 MODELOS DE ANIMAIS ATENUADOS OU INOPERACIONALIZADOS ('KNOCK-OUT') A presente invenção também diz respeito a organismos que tenham sido modificados de tal forma que a actividade enzimática tenha sido atenuada ou mesmo eliminada. Como exemplo de uma variante deste tipo refere-se um rato ou murganho inoperacionalizado ('knock-out'), em que a sequência codificadora natural foi removida e substituída, por exemplo, por um gene repórter - tal como β-gal. Em alternativa, o promotor pode ser silenciado para que não ocorra nenhuma expressão génica. Estes tipos de organismos podem ser preparados por meio de técnicas convencionais.

TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS/ORGANISMOS HOSPEDEIROS

Conforme indicado antes, o organismo hospedeiro pode ser um organismo procariótico ou eucariótico. Como exemplos de hospedeiros procarióticos adequados refere-se E. coli e Bacillus subtilis. A transformação de hospedeiros procarióticos está bem documentada na especialidade; veja-se, por exemplo, Sambrook et al. ('Molecular Cloning: A Laboratory Manual', 2a edição, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) e Ausubel et al. ('Current Protocols in Molecular Biology' (1995), John Wiley & Sons, Inc.).

No caso de se utilizar um hospedeiro procariótico, então poderá ser necessário modificar convenientemente a sequência nucleotídica antes da transformação, por exemplo, por remoção de intrões.

De acordo com outra variante, o organismo transgénico pode ser uma levedura. As leveduras também têm sido amplamente utilizadas como veículos para a expressão de 65 genes heterólogos. A espécie Saccharomyces cerevisiae tem uma longa história de utilização industrial, incluindo a sua utilização para a expressão de genes heterólogos. A expressão de genes heterólogos em Saccharomyces cerevisiae foi descrita por Goodey et al. (1987, 'Yeast Biotechnology', D.R. Berry et al.f eds., págs. 401-429, Allen and Unwin, London) e por King et al, , (1989, 'Molecular and Cell Biology of Yeasts', E.F. Walton e G.T. Yarronton, eds., págs. 107-133, Blackie, Glasgow). Há várias razões pelas quais a Saccharomyces cerevisiae é bastante adequada para a expressão de genes heterólogos. Em primeiro lugar, não é patogénica para os seres humanos e é incapaz de produzir determinadas endotoxinas. Em segundo lugar, tem um longo historial de utilização em segurança, depois de séculos de exploração comercial para vários fins. Isto resultou numa grande aceitação pública. Em terceiro lugar, a intensa utilização comercial e pesquisa devotada ao organismo resultou numa grande riqueza de conhecimentos sobre a genética, a fisiologia e também as caracteristicas da fermentação em grande escala de Saccharomyces cerevisiae. B. Hinchcliffe e E. Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H. Rose e J. Stuart Harrison, eds., 2a edição, Academic Press Ltd.) descreveram os princípios da expressão de genes heterólogos em Saccharomyces cerevisiae e a secreção de produtos génicos. Há diversos tipos de vectores de levedura disponíveis, incluindo vectores integrativos, os quais exigem a recombinação com o genoma do seu hospedeiro para fins de manutenção, e vectores plasmídicos de replicação autónoma. 66

Para se preparar os arquétipos de expressão de Saccharomyces transgénica, prepara-se arquétipos de expressão inserindo a sequência nucleotidica da presente invenção num arquétipo concebido para expressão em levedura. Foram desenvolvidos diversos tipos de arquétipos utilizáveis para expressão heteróloga. Os arquétipos contêm um promotor activo na levedura que se funde com a sequência nucleotidica da presente invenção; normalmente, utiliza-se um promotor de origem em leveduras, tal como o promotor GALl. Vulgarmente, utiliza-se uma sequência de sinal com origem em leveduras, tal como a sequência que codifica o péptido de sinal SUC2. No fim do sistema de expressão existe um finalizador activo em leveduras.

Para a transformação de leveduras, foram desenvolvidos diversos protocolos de transformação. Por exemplo, é possivel preparar um organismo Saccharomyces transgénico de acordo com a presente invenção de acordo com os ensinamentos de Hinnen et al. (1978, 'Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA', 75, 1929); Beggs, J.D. (1978, 'Nature', Londres, 275, 104) e Ito, H. et al. (1983, 'J. Bacteriology', 153, 163-168).

As células de levedura transformadas são seleccionadas utilizando diversos marcadores selectivos. Entre os marcadores utilizados para a transformação há alguns marcadores auxotróficos, tais como LEU2, HIS4 e TRPl, e marcadores dominantes da resistência a antibióticos, tais como marcadores de antibióticos aminoglicosídicos, v.g., G418.

Como exemplo de um outro organismo hospedeiro refere-se uma planta. O principio básico para a produção de plantas modificadas geneticamente consiste em inserir 67 informações genéticas no genoma da planta de tal forma que se consiga manter estável o material genético inserido.

Existem diversas técnicas para inserir as informações genéticas, consistindo as duas técnicas principais na introdução directa da informação genética e na introdução da informação genérica utilizando um sistema de vectores. Nos artigos de Potrykus ('Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.' [1991] 42:205-225) e Christou ('Agro-Food-Industry Hi-Tech', Março/Abril de 1994, 17-27) é possivel encontrar uma descrição das técnicas gerais. O documento EP-A-0449375 fornece mais informações sobre a transformação de plantas.

Assim, a presente invenção também proporciona um método para transformar uma célula hospedeira com uma sequência nucleotídica, ilustrada como qualquer uma das sequências apresentadas na listagem de sequências anexa, ou um seu derivado, homólogo, variante ou fragmento. É possivel criar em cultura células hospedeiras transformadas com uma sequência codificadora nucleotídica de PDE, em condições adequadas para a expressão e a recuperação da proteína codificada a partir da cultura celular. A proteína produzida por uma célula recombinante pode ser segregada ou pode ficar contida a nível intracelular, dependendo isso da sequência e/ou do vector utilizado. Conforme será do conhecimento dos especialistas na matéria, é possível conceber vectores de expressão, que contenham sequências codificadoras de PDE, com sequências de sinal que comandam a secreção de sequências codificadoras de PDE através de uma membrana particular das células procarióticas ou eucarióticas. Há outras construções nas quais se pode juntar uma sequência 68 codificadora de PDE a uma sequência nucleotidica que codifica um domínio polipeptidico, o que irá facilitar a purificação de proteínas solúveis (Kroll D.J. et al. (1993) 'DNA Cell Biol.', 12:441-53, veja-se também a descrição anterior de vectores que contêm proteínas de fusão).

PODUÇÃO DO POLIPEPTIDO

De acordo com a presente invenção, é possivel produzir o polipeptido da presente invenção através da cultura, por exemplo, de hospedeiros de expressão microbianos que tenham sido transformados com um ou vários polinucleótidos da presente invenção, num meio de fermentação nutriente convencional. A escolha do meio adequado pode basear-se na selecção de hospedeiros de expressão e/ou nas necessidades regulatórias do arquétipo de expressão. Tais meios são bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Se desejado, o meio pode conter componentes suplementares que fortaleçam os hospedeiros de expressão transformados em relação a microrganismos potencialmente contaminantes.

Assim, a presente invenção também proporciona um método para a produção de um polipeptido que possua actividade de PDE_XIV, em que tal método compreende os passos que consistem em a) transformar uma célula hospedeira com uma sequência nucleotidica ilustrada sob a forma de qualquer uma das sequências apresentadas na listagem de sequências anexa, ou um seu derivado, homólogo, variante ou fragmento, e b) tratar em cultura a célula hospedeira transformada, em condições de cultura adequadas para a expressão do referido polipeptido. A presente invenção também proporciona um método para a produção de um polipeptido que possua actividade de 69 PDE_XIV, em que tal método compreende os passos que consistem em a) tratar em cultura uma célula hospedeira que tenha sido transformada com uma sequência nucleotídica ilustrada sob a forma de qualquer uma das sequências apresentadas na listagem de sequências anexa, ou um seu derivado, homólogo, variante ou fragmento, em condições adequadas para a expressão do referido polipeptido, e b) recuperar o referido polipeptido a partir da cultura de células hospedeiras. A presente invenção também proporciona um método para a produção de um polipeptido que possua actividade de PDE_XIV, em que tal método compreende os passos que consistem em a) transformar uma célula hospedeira com uma sequência nucleotídica ilustrada sob a forma de qualquer uma das sequências apresentadas na listagem de sequências anexa, ou um seu derivado, homólogo, variante ou fragmento, b) tratar em cultura a referida célula hospedeira transformada, em condições adequadas para a expressão do referido polipeptido, e c) recuperar o referido polipeptido a partir da cultura de células hospedeiras.

RIBOZIMAS

As ribozimas são moléculas de ARN enzimático capazes de catalisar a clivagem especifica do ARN. 0 mecanismo de acção das ribozimas implica a hibridação especifica de sequências da molécula de ribozima com o ARN alvo complementar, seguindo-se uma clivagem endonucleolitica. A invenção também abrange no seu âmbito as moléculas de ribozimas manipuladas, com motivos de tipo martelo, que catalisam de um modo específico e eficaz a clivagem endonucleolitica das sequências de ARN das PDE. 70

Os locais de clivagem específicos de ribozimas dentro de qualquer alvo de ARN potencial são identificados, inicialmente, por varrimento da molécula alvo em busca de locais de clivagem de ribozimas que incluem as sequências seguintes: GUA, GUU e GUC. Após a identificação, é possível avaliar sequências curtas de ARN, com 15 a 20 ribonucleótidos correspondentes à região do gene alvo que contém o local de clivagem, quanto às suas características estruturais secundárias que podem fazer com que a sequência oligonucleotídica fique inoperacional. Também é possível avaliar se os alvos elegíveis são adequados, recorrendo para tal a testes de acessibilidade à hibridação com oligonucleótidos complementares, utilizando ensaios de protecção com ribonucleases. É possível preparar as moléculas de ARN e ADN anti-sentido, bem como as ribozimas da presente invenção por qualquer método conhecido na especialidade para a síntese de moléculas de ARN. Tais técnicas incluem a síntese química de oligonucleótidos, tais como a síntese química com fosforamidite em fase sólida. Em alternativa, as moléculas de ARN podem ser geradas por transcrição in vitro ou in vivo de sequências de ADN que codificam a molécula de ARN anti-sentido. Tais sequências de ADN podem ser incorporadas numa grande variedade de vectores com promotores de polimerases de ARN adequados, tais como T7 ou SP6. Em alternativa, os arquétipos de ADNc anti-sentido que sintetizam ARN anti-sentido, de um modo constitutivo ou induzível, podem ser introduzidos em linhagens celulares, células ou tecidos. 71

DETECÇÃO A presença da sequência codificadora polinucleotidica de PDE pode ser detectada por hibridação ou amplificação de tipo ADN-ADN ou ADN-ARN, utilizando sondas, porções ou fragmentos da sequência apresentada sob a forma de uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa. Os ensaios baseados na amplificação de ácidos nucleicos implicam a utilização de oligonucleótidos ou oligómeros com base na sequência codificadora de PDE para detectar transformantes que contenham ADN ou ARN de PDE. Tal como aqui utilizado, o termo "oligonucleótidos" ou "oligómeros" pode designar uma sequência de ácidos nucleicos que possua pelo menos cerca de 10 nucleótidos e no máximo cerca de 60 nucleótidos, de preferência entre cerca de 15 e 30 nucleótidos e mais preferencialmente entre cerca de 20 e 25 nucleótidos, a qual pode ser utilizada como sonda ou amplimero. De preferência, os oligonucleótidos são provenientes da região 3' da sequência nucleotidica ilustrada sob a forma de qualquer uma das sequências apresentadas na listagem de sequências anexa. São conhecidos na especialidade diversos protocolos para detectar e medir a expressão de polipeptidos de PDE, por exemplo, utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para a proteína. Como exemplos refere-se o ensaio de imunossorção ligada a enzimas (ELISA), o radioimunoensaio (RIA) e a selecção de células activadas por fluorescência (FACS). É preferível utilizar um imunoensaio em dois locais, de base monoclonal, utilizando anticorpos monoclonais reactivos a dois epítopos não interferentes nos polipeptidos de PDE, mas também é possível utilizar um ensaio de ligação competitiva. Estes e 72 outros ensaios foram descritos, entre outros, por Hampton R. et al. (1990, 'Serological Methods, A Laboratory Manual', APS Press, St. Paul MN) e Maddox D.E. et al. (1983, 'J. Exp. Med.', 15, 8:121 1). Há inúmeros marcadores e técnicas de conjugação que são do conhecimento dos especialistas na matéria e podem ser utilizados em vários ensaios de ácidos nucleicos e aminoácidos. Os métodos para produzir uma hibridação marcada ou sondas de PCR para detectar sequências polinucleotidicas de PDE incluem a oligomarcação, a tradução por entalhes, marcação das extremidades ou amplificação por PCR utilizando um nucleótido marcado. Em alternativa, é possível efectuar a clonagem da sequência codificadora de PDE, ou qualquer sua porção, dentro de um vector para a produção de uma sonda de ARNm. Tais vectores são conhecidos na especialidade, encontram-se disponíveis nos circuitos comerciais e podem ser utilizados para a síntese de sondas de ARN in vitro por meio da adição de uma polimerase de ARN adequada, tal como T7, T3 ou SP6, e nucleótidos marcados. Há diversas empresas, tais como 'Pharmacia Biotech' (Piscataway, NJ), 'Promega' (Madison, WI) e 'US Biochemical Corp.' (Cleveland, OH) que fornecem estojos comerciais e protocolos para estes procedimentos. Como moléculas repórter ou marcadores adequados refere-se radionuclidos, enzimas, agentes fluorescente, quimioluminescentes ou cromogénicos e ainda substrato, co-factores, inibidores, partículas magnéticas e semelhantes. A utilização de tais marcadores encontra-se descrita nas patentes de invenção US-A-3817837, US-A-3850752, US-A-3939350, US-A-3996345, US-A-4277437, US-A-4275149 e US-A-4366241. De igual modo, é 73 possível produzir imunoglobulinas recombinantes conforme se descreve no documento US-A-4816567.

Como métodos suplementares para quantificar a expressão de uma determinada molécula refere-se a radiomarcação (Melby P.C. et al. 1993, 'J. Immunol. Methods', 159:235-44) ou nucleótidos biotinilados (Duplaa C. et al. 1993, 'Anal. Biochem.', 229-36), co-amplificação de um ácido nucleico de controlo e curvas padrão sobre as quais se faz a interpolação dos resultados experimentais. É possível acelerar a quantificação de ensaios múltiplos efectuando o ensaio num formato ELISA, em que o oligómero relevante é apresentado em várias diluições e há uma resposta espectrofotométrica ou calorimétrica que proporciona uma quantificação rápida.

Embora a presença/ausência de expressão do gene marcador sugira que o gene relevante também se encontra presente, dever-se-á confirmar a sua presença e a sua expressão. Por exemplo, no caso de se inserir a sequência codificadora de PDE dentro de uma sequência de gene marcador, então as células recombinantes que contêm regiões codificadoras de PDE podem ser identificadas pela ausência de função do gene marcador. Em alternativa, é possível colocar um gene marcador em tandem com uma sequência codificadora de PDE, sob regulação de um único promotor. A expressão do gene marcador em resposta à indução ou selecção também indica, normalmente, a expressão de PDE.

Em alternativa, as células hospedeiras que contêm a sequência codificadora para PDE e expressam regiões codificadoras de PDE podem ser identificadas por diversos procedimentos conhecidos pelos especialistas na matéria. Tais procedimentos incluem, mas sem que isso constitua 74 qualquer limitação, técnicas de hibridação de tipo ADN- ADN ou ADN-ARN e técnicas de bioensaio ou imunoensaio de proteínas que compreendem tecnologias baseadas em membranas, soluções ou segmentos, para a detecção e/ou quantificação do ácido nucleico ou da proteína.

ANTICORPOS A sequência de aminoácidos da presente invenção também pode ser utilizada para gerar anticorpos, por exemplo, recorrendo a técnicas convencionais, contra a sequência de aminoácidos. É possível utilizar procedimentos bem conhecidos na especialidade para a produção de anticorpos para os polipeptidos de PDE XIV. Tais anticorpos compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos, de cadeia simples, fragmentos Fab e fragmentos produzidos por um banco de expressão de Fab. Para fins de diagnóstico e terapêuticos são particularmente preferíveis os anticorpos neutralizadores, isto é, aqueles que inibem a actividade biológica de polipeptidos de PDE.

Para a produção de anticorpos, é possível imunizar diversos hospedeiros, tais como cabras, coelhos, ratos, murganhos, etc., por injecção com o inibidor ou uma sua porção ou variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado ou oligopeptido que retenha péptido imunogénicas. Consoante a espécie do hospedeiro, assim é possível utilizar vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica. Como exemplos de tais adjuvantes refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, solução de Freund, geles minerais, tais como hidróxido de alumínio, e 75 substâncias tensioactivas, tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianina de diodora apertura e dinitrofenol. 0 BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e a Corynebacterium parvum constituem adjuvantes para seres humanos potencialmente úteis que podem ser utilizados. É mesmo possivel preparar anticorpos monoclonais para a sequência de aminoácidos utilizando qualquer técnica que favoreça a produção de moléculas de anticorpos por linhaqens celulares continuas em cultura. Tais técnicas compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a técnica do hibridoma, originalmente descrita por Koehler e Milstein (1975, 'Nature', 256:495-497), a técnica do hibridoma de células B humanas (Kosbor et al. (1983) 'Immunol. Today', 4:72; Cote et al. (1983), 'Proc. Natl. Acad. Sei.', 80:2026-2030) e a técnica do hibridoma de EBV (Cole et al. (1985), 'Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy', Alan R. Liss Inc., págs. 77-96). Além disso, também é possivel utilizar as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos", a montagem de genes de anticorpos de murganho para genes de anticorpos humanos para assim se obter uma molécula com a especificidade antigénica e a actividade biológica adequadas (Morrison et al. (1984) 'Proc. Natl. Acad. Sei.', 81:6851-6855; Neuberger et al. (1984), 'Nature', 312:604-608; Takeda et al. (1985), 'Nature', 314:452-454). Em alternativa, é possivel adaptar as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (US-A-4946779) à produção de anticorpos de cadeia simples específicos do inibidor.

Também é possível produzir anticorpos induzindo a produção in vivo na população de linfócitos ou por pesquisa 76 de bancos de imunoglobulinas recombinantes ou painéis de reagentes de ligação altamente específicos, conforme descrito por Orlandi et al. (1989, 'Proc. Natl. Acad. Sei.', 86:3833-3837) e Winter G. e Milstein C. (1991; 'Nature', 349:293-299).

Também é possível gerar fragmentos de anticorpos que contêm locais de ligação específicos para PDE_XIV. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão com pepsina da moléculas de anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados por redução das pontes dissulfureto dos fragmentos F(ab')2· Em alternativa, é possível construir bancos de expressão de Fab para permitir uma identificação rápida e fácil de fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade desejada (Huse W.D. et al. (1989), 'Science', 256:1275-128 1). Há uma técnica alternativa que implica a pesquisa de bancos de exibição de bacteriófagos, em que, por exemplo, os bacteriófagos exprimem fragmentos scFv sobre a superfície do seu revestimento, com uma grande variedade de regiões determinantes da complementaridade (CDR). Esta técnica é bem conhecida na especialidade.

Os anticorpos específicos de PDE_XIV são úteis para o diagnóstico de estados patológicos e doenças associadas à expressão do polipeptido de PDE_XIV. São conhecidos na especialidade diversos protocolos para ensaios de ligação competitiva ou imunorradiométricos, utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidades bem determinadas. Tipicamente, tais imunoensaios implicam a formação de complexos entre polipeptidos de PDE_XIV e o seu anticorpo específico (ou molécula semelhante de ligação a 77 PDE_XIV) e a medição da formação de complexos. É preferível utilizar um imunoensaio em dois locais, de base monoclonal, utilizando anticorpos monoclonais reactivos a dois epítopos não interferentes numa proteína PDE_ XIV específica, mas também é possível utilizar um ensaio de ligação competitiva. Estes ensaios foram descritos por Maddox d.e. et al. (1983, 'J. Exp. Med.', 158:121 1).

Os anticorpos anti-PDE_XIV são úteis para o diagnóstico de inflamação, estados patológicos associados à proliferação de células hematopoiéticas e infecção com HIV ou outros distúrbios ou doenças caracterizados pela expressão anormal de uma PDE_XIV. Os ensaios de diagnóstico para uma PDE_XIV incluem métodos em que se utiliza o anticorpo e um identificador para se detectar um polipeptido PDE_XIV em fluidos, células, tecidos ou secções ou extractos de tais tecidos do corpo humano. Os polipeptidos e os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados com ou sem modificações. Frequentemente, os polipeptidos e os anticorpos são marcados por ligação, de um modo covalente ou não covalente, a uma molécula repórter. Há uma grande variedade de moléculas repórteres conhecidas pelos especialistas na matéria.

Os anticorpos podem ser utilizados em métodos para a detecção de polipeptidos da invenção presentes em amostras biológicas, utilizando para tal um método que consiste em: (a) obter um anticorpo da invenção; (b) incubar uma amostra biológica com o referido anticorpo em condições que permitam a formação de um complexo anticorpo-antigénio e (c) determinar se o complexo anticorpo-antigénio, que compreende o referido anticorpo, se formou. 78

Em função das circunstâncias, as amostras adequadas podem incluir extractos de tecidos, tais como cérebro, mama, ovário, pulmão, cólon, pâncreas, testículos, figado, músculo e ósseo ou provenientes de excrescências neoplásicas de tais tecidos.

Os anticorpos da invenção podem ser ligados a um suporte sólido e/ou embalados em estojos num recipiente adequado, conjuntamente com reagentes adequados, contraprovas, instruções e semelhantes.

ENSAIOS/MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO A presente invenção também diz respeito a um método de ensaio para detectar a presença de PDE_XIV em células (tais como células humanas), o qual consiste em: (a) efectuar uma reacção em cadeia com transcriptase-polimerase inversa sobre ARN (tal como ARN total) proveniente de tais células, utilizando um par de iniciadores para a reacção em cadeia com polimerase que são específicos para PDE_XIV, conforme determinado a partir da sequência de ADN de qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa ou uma sua variante alélica, e (b) testar o aparecimento de um fragmento de PCR (reacção em cadeia com polimerase) adequadamente dimensionada, por exemplo, por electroforese em gel de agarose.

Presente invenção também diz respeito a um método para identificar agentes (tais como compostos, outras substâncias ou composições que os contenham) que afectam (por exemplo, inibem ou de qualquer outro modo modificam) a actividade de PDE_XIV e/ou a sua expressão, consistindo tal método em fazer contactar PDE_xiv, ou a sequência 79 nucleotídica que a codifica, com o agente e em medir depois a actividade de PDE_XIV e/ou a sua expressão. A presente invenção diz ainda respeito a um método para identificar agentes (tais como compostos, outras substâncias ou composições que os contenham) que afectam selectivamente (por exemplo, inibem ou de qualquer outro modo modificam) a actividade de pde_xiv e/ou a sua expressão, consistindo tal método em fazer contactar PDE_XIV, ou a sequência nucleotídica que a codifica, com o agente e em medir depois a actividade de PDE_XIV e/ou a sua expressão. A presente invenção também diz respeito a um método para identificar agentes (tais como compostos, outras substâncias ou composições que os contenham) que afectam selectivamente (por exemplo, inibem ou de qualquer outro modo modificam) a actividade de PDE_XIVA1 ou PDE_XIVA2 ou PDE_XIVA3 ou PDE_XIVA4 e/ou a sua expressão, consistindo tal método em fazer contactar a PDE_XIV relevante, ou a sequência nucleotídica que a codifica, com o agente e em medir depois a actividade da PDE_XIV relevante e/ou a sua expressão. A presente invenção também diz respeito a um método para identificar agentes (tais como compostos, outras substâncias ou composições que os contenham) que afectam (por exemplo, inibem ou de qualquer outro modo modificam) a actividade de PDE_XIV e/ou a sua expressão, consistindo tal método em medir a actividade de PDE_XIV e/ou a sua expressão, na presença do agente ou depois da adição do agente: (a) numa linhagem celular na qual se tenha incorporado adn recombinante que compreende a sequência de ADN de qualquer uma das sequências ilustradas na listagem 80 de sequências anexa, ou uma sua variação alélica, ou (b) uma população celular ou linhagem celular que expressa selectivamente, de um modo natural, a PDE_XIV. De preferência, a actividade de PDE_XIV é determinada pelo método de ensaio descrito antes. A presente invenção também diz respeito a um método para identificar agentes (tais como compostos, outras substâncias ou composições que os contenham) que afectam selectivamente (por exemplo, inibem ou de qualquer outro modo modificam) a actividade de PDE_XIV e/ou a sua expressão, consistindo tal método em medir a actividade de PDE_XIV e/ou a sua expressão, na presença do agente ou depois da adição do agente: (a) numa linhagem celular na qual se tenha incorporado ADN recombinante que compreende a sequência de ADN de qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa, ou uma sua variação alélica, ou (b) uma população celular ou linhagem celular que expressa selectivamente, de um modo natural, a PDE_XIV. De preferência, a actividade de PDE_XIV é determinada pelo método de ensaio descrito antes. A presente invenção também diz respeito a um método para identificar agentes (tais como compostos, outras substâncias ou composições que os contenham) que afectam selectivamente (por exemplo, inibem ou de qualquer outro modo modificam) a actividade de PDE_XIVA1 ou PDE_XIVA2 ou PDE_XIVA3 ou PDE_XIVA4 e/ou a sua expressão, consistindo tal método em medir a actividade da PDE_XIV respectiva e/ou a sua expressão, na presença do agente ou depois da adição do agente: (a) numa linhagem celular na qual se tenha incorporado ADN recombinante que compreende a respectiva sequência de ADN de qualquer uma das sequências ilustradas 81 na listagem de sequências anexa, ou uma sua variação alélica, ou (b) uma população celular ou linhagem celular que expressa selectivamente, de um modo natural, a PDE_XIV respectiva. De preferência, a actividade da PDE_XIV é determinada pelo método de ensaio descrito antes. A presente invenção também proporciona um método para a pesquisa de um agente para a modulação (de preferência, para a modulação especifica) da actividade de PDE_XIV (ou um seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou da expressão da sequência nucleotidica que a codifica (incluindo um seu derivado, homólogo, variante ou fragmento), em que o método compreende os passos que consistem em: a) obter um agente elegível; b) combinar PDE_XIV (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou a sequência nucleotidica que a codifica (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) com o agente elegível durante um período suficiente para permitir a modulação em condições adequadas e c) detectar a modulação da PDE_XIV (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou da sequência nucleotidica que a codifica (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) pelo agente elegível, para assim determinar se o agente elegível modula a actividade de PDE_XIV (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou a expressão da sequência nucleotidica que a codifica (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento). A presente invenção também proporciona um método para a pesquisa de um agente com afinidade de ligação específica com a PDE_XIV (ou um seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou com a sequência nucleotidica que a codifica (incluindo um seu derivado, homólogo, variante ou 82 fragmento), em que o método compreende os passos que consistem em: obter um agente elegível; b) combinar PDE_XIV (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou a sequência nucleotídica que a codifica (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) com o agente elegível durante um período suficiente para permitir a ligação em condições adequadas e c) detectar a ligação do agente elegível à PDE_XIV (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou à sequência nucleotídica que a codifica (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento), para assim determinar se o agente elegível se liga à PDE_XIV (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou à sequência nucleotídica que a codifica (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento), A presente invenção proporciona ainda um método para identificar um agente que é capaz de modular a PDE_XIV, em que tal método compreende os passos que consistem em: a) fazer contactar o agente com PDE_XIV (ou um seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou com a sequência nucleotídica que a codifica (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento), b) manter a mistura do passo a) a incubar com um nucleótido cíclico, em condições adequadas para a hidrólise do nucleótido cíclico, c) medir a quantidade de hidrólise de nucleótido cíclico e d) comparar a quantidade de hidrólise de nucleótido cíclico do passo c) com a quantidade de hidrólise de nucleótido cíclico obtida por incubação da PDE_XIV (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) ou da sequência nucleotídica que a codifica (ou seu derivado, homólogo, variante ou fragmento) na ausência do composto, determinando-se assim se o agente 83 afecta (por exemplo, estimula ou inibe) a hidrólise de nucleótidos cíclicos.

Assim, de acordo com determinadas variantes da presente invenção, é possível utilizar a PDE_XIV, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, e/ou uma linhagem celular que exprime a PDE_XIV, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, para a pesquisa de anticorpos, péptidos ou outro agente, tal como moléculas orgânicas ou inorgânicas, que actuam como moduladores da actividade de fosfodiesterase ou da sua expressão, para assim se identificar um agente terapêutico capaz de modular os níveis de nucleótidos cíclicos. Por exemplo, é possível utilizar anticorpos anti-PDE_XIV, capazes de neutralizar a actividade de PDE_XIV, para inibir a hidrólise com pde_XIV de nucleótidos cíclicos, aumentando assim os niveis dos mesmos. Em alternativa, a pesquisa em bancos de péptidos ou bancos orgânicos executada por técnicas de química combinatória com PDE_XIV expressa de um modo recombinante, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, ou com linhagens celulares que expressam PDE_XIV, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, pode ser útil para identificar agentes terapêuticos que funcionam por modulação da hidrólise com PDE_XIV de nucleótidos ciclicos. É possivel pesquisar compostos sintéticos, produtos naturais e outras fontes de materiais potencialmente activos sob o ponto de vista biológico, recorrendo para tal a inúmeras técnicas rotineiras para os especialistas na matéria. Por exemplo, as sequências nucleotidicas que codificam a região do terminal N da PDE_xiv podem ser expressas numa linhagem celular que pode ser utilizada para a pesquisa de 84 moduladores alostéricos, quer agonistas quer antagonistas da actividade de PDE_XIV. Em alternativa, as sequências nucleotidicas que codificam o domínio catalítico conservado de PDE_XIV podem ser expressas em linhagens celulares e utilizadas para a pesquisa de inibidores da hidrólise de nucleótidos cíclicos. A aptidão de um agente de teste para interferir com a actividade de PDE_XIV ou com a hidrólise de nucleótidos cíclicos pode ser determinada por meio da medição dos níveis de PDE. _X IV ou de nucleótidos cíclicos (conforme descrito por Smith et al. 1993. 'Appl. Biochem. Biotechnol r • f 41:189 -218). Também se encontram comercialmente disponíveis estojos de imunoensaio para a medição de cAMP e cGMP (v.g., Amersham International, Arlington Heights, il e DuPont, Boston, MA) . A actividade de PDE_XIV também pode ser monitorizada por medição de outras respostas, tais como a fosforilação ou a desfosforilação de outras proteínas, utilizando para tal técnicas convencionais desenvolvidas para esse fim.

Em consequência, a presente invenção proporciona um método para identificar um composto que é capaz de modular a actividade de fosfodiesterase de nucleótidos cíclicos de uma PDE_XIV, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, o qual compreende os passos que consistem em: a) fazer contactar o composto com uma PDE_XIV, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado; b) manter a mistura do passo a) a incubar com um nucleótido cíclico, em condições adequadas para a hidrólise do nucleótido cíclico; c) medir a quantidade de hidrólise de nucleótido cíclico e d) comparar a quantidade de hidrólise de nucleótido cíclico do passo c) com a 85 quantidade de hidrólise de nucleótido cíclico obtida por incubação da PDE_XIV, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, na ausência do composto, determinando-se assim se o composto estimula ou inibe a hidrólise de nucleótidos cíclicos. De acordo com uma variante do método, o fragmento pode ser proveniente de uma região do terminal N da pde_xiv e proporciona um método para identificar moduladores alostéricos da PDE_XIV. De acordo com outra variante da presente invenção, o fragmento pode ser proveniente da região do terminal carboxi da PDE_XIV e proporciona um método para identificar inibidores da hidrólise de nucleótidos cíclicos. É possível utilizar um polipeptido de PDE_XIV, os seus fragmentos imunogénicos ou seus oligopeptidos para a pesquisa de compostos terapêuticos em qualquer uma de diversas técnicas de pesquisa de fármacos. 0 polipeptido utilizado em tal teste pode estar livre em solução, fixo num suporte sólido, suportado numa superfície celular ou localizado ao nível intracelular. É possível medir a supressão de actividade ou a formação de complexos de ligação entre um polipeptido de PDE_XIV e o agente que se pretende testar.

Assim sendo, a presente invenção proporciona um método para a pesquisa de um ou vários compostos para a modulação (de preferência, modulação específica, tal como a afinidade de ligação específica) da PDE_XIV ou da sua expressão, ou de uma sua porção ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, o qual consiste em obter um ou vários compostos, combinar uma PDE_XIV ou uma sequência nucleotídica que a codifica, ou uma sua porção ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, com o 86 composto ou cada um dos vários compostos, durante um período suficiente para permitir a modulação em condições adequadas, e detectar a ligação de uma PDE_XIV, ou uma sua porção ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, a cada um dos vários compostos, identificando assim um ou vários compostos que modulam a PDE_XIV ou uma sequência nucleotídica que a codifica. Em tal ensaio, os vários compostos podem ser produzidos por meio de técnicas químicas combinatórias conhecidas pelos especialistas na matéria. Há uma outra técnica para pesquisa de fármacos que proporciona uma pesquisa de elevado rendimento de compostos com uma afinidade de ligação adequada para os polipeptidos PDE_XIV e que se baseia no método descrito minuciosamente por Geysen no pedido de patente de invenção europeia n° 84/03564, publicado a 13 de Setembro de 1984. Resumidamente, efectua-se a síntese de um grande número de pequenos compostos de ensaio peptídicos diferentes sobre um substrato sólido, tal como pinos de plástico ou uma outra superfície. Faz-se reagir os compostos de ensaio peptídicos com fragmentos de PDE_XIV e lava-se. Depois detecta-se uma PDE_XIV ligada, por exemplo, adaptando convenientemente métodos bem conhecidos na especialidade. Também é possível revestir directamente sobre placas uma PDE_XIV purificada, para utilização nas técnicas de pesquisa de fármacos supramencionadas. Em alternativa, é possível utilizar anticorpos não neutralizadores para capturar o péptido e imobilizá-lo sobre um suporte sólido. A presente invenção também contempla a utilização de ensaios competitivos de pesquisa de fármacos, em que os anticorpos neutralizadores capazes de se ligar a uma 87 PDE_XIV competem especificamente com um composto de ensaio pela ligação a uma PDE_XIV. Desta forma, é possível utilizar os anticorpos para detectar a presença de qualquer péptido que partilhe um ou vários determinantes antigénicos com uma PDE_XIV. 0 método de ensaio da presente invenção pode ser uma análise de elevada produtividade (HTS). A este respeito, é possível adaptar os conhecimentos descritos no documento WO 84/03 564 à PDE da presente invenção.

Os conhecimentos descritos no documento US-A-5738985 podem ser adaptados ao método de ensaio da presente invenção. A presente invenção também proporciona um ou vários agentes identificados pelos métodos de ensaio e pelos métodos de identificação da presente invenção. O agente da presente invenção pode ser, por exemplo, um composto orgânico ou um composto inorgânico. O agente pode ser, por exemplo, uma sequência nucleotídica que seja anti-sentido em relação a todas ou a parte das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa. A invenção proporciona ainda um agente da presente invenção (ou mesmo um seu sal farmaceuticamente aceitável ou um seu solvato farmaceuticamente aceitável), ou uma composição farmacêutica que contenha qualquer uma das substâncias supramencionadas, para utilização como medicamento. A presente invenção também proporciona a utilização de um agente para afectar a actividade de PDE_XIV (por exemplo, inibir, modular ou actuar como agonista) em qualquer um ou vários dos órgãos seguintes: putâmen, núcleo caudado cerebral, lobo occipital cerebral, coração, ovário, 88 glândula pituitária, rim, fígado, intestino delgado, timo, músculo esquelético, regiões leucocitárias, gânglios da raiz dorsal, útero, cóclea, intestino delgado (duodeno), astrocitoma e apêndice.

DIAGNÓSTICO A presente invenção também proporciona uma composição de diagnóstico para a detecção de sequências polinucleotídicas de PDE_XIV. A composição de diagnóstico pode compreender qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, ou uma sequência capaz de hibridar com a totalidade ou com uma parte de qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa ou com uma sua variação alélica.

Para se estabelecer uma base para o diagnóstico de uma doença, deverão ser determinados os valores normais ou de referência para um polipeptido de PDE_XIV. Tal operação pode ser realizada por combinação de fluidos corporais ou extractos celulares recolhidos de pacientes normais, quer animais quer seres humanos, com um anticorpo para um polipeptido de PDE_XIV, em condições adequadas para a formação de complexos, as quais são bem conhecidas na especialidade. É possível quantificar a formação de complexo padrão, efectuando a sua comparação com uma diluição sequencial de contraprovas positivas nas quais se combinou uma quantidade conhecida de anticorpo com concentrações conhecidas de um polipeptido PDE XIV purificado. Depois é possível comparar os valores de referência obtidos a partir de amostras normais com os valores obtidos a partir de amostras provenientes de 89 pacientes potencialmente afectados por um distúrbio ou uma doença associada à expressão de um polipeptido de PDE_XIV. 0 desvio entre os valores de referência e os valores do paciente determinam a existência do estado patológico.

Um polinucleótido de PDE_XIV, ou qualquer porção sua, pode proporcionar a base para um composto de diagnóstico e/ou terapêutico. Para fins de diagnóstico, é possível utilizar sequências polinucleotidicas de PDE_XIV para detectar e quantificar a expressão de genes em estados patológicos, distúrbios ou doenças em que a actividade de pde_xiv pode estar implicada. A sequência polinucleotidica que codifica PDE_XIV pode ser utilizada para o diagnóstico de doenças resultantes da expressão de PDE_XIV. Por exemplo, as sequências polinucleotidicas que codificam PDE_xiv podem ser utilizadas em ensaios de hibridação ou PCR de tecidos provenientes de biópsias ou autópsias ou fluidos biológicos, tais como soro, fluído sinovial ou biópsias tumorais, para se detectar anomalias na expressão de PDE_XIV. Tais métodos qualitativos ou quantitativos podem assumir a forma de análises à Southern ou Northern, autorradiografias pontilhadas ou outras tecnologias de base membrana; tecnologias de PCR; tecnologias de imersão, pinos ou segmentos e ELISA ou outras tecnologias formais de amostras múltiplas. Todas estas técnicas são bem conhecidas na especialidade e constituem, com efeito, a base de muitos estojos de diagnóstico comercialmente disponíveis.

Tais ensaios podem ser personalizados para se avaliar a eficácia de um determinar regime de tratamento terapêutico e podem ser utilizados em estudos com animais, em ensaios clínicos ou para monitorizar o tratamento de um 90 paciente individual. Para se estabelecer a base para o diagnóstico da doença, dever-se-á determinar um perfil normal ou de referência para a expressão de PDE. Tal é efectuado por combinação de fluidos corporais ou extractos celulares recolhidos de pacientes normais, quer animais quer seres humanos, com PDE_XIV, ou uma sua porção, em condições adequadas para hibridação ou amplificação. É possível quantificar a hibridação padrão, efectuando a comparação dos valores obtidos a partir de pacientes normais com uma diluição sequencial de contraprovas positivas da mesma experiência, em que se utiliza uma quantidade conhecida de PDE_XIV purificada. Depois é possível comparar os valores de referência obtidos a partir de amostras normais com os valores obtidos a partir de amostras provenientes de pacientes potencialmente afectados por um distúrbio ou uma doença associada à expressão da sequência de codificação de PDE. O desvio entre os valores de referência e os valores do paciente determinam a existência do estado patológico. No caso de se determinar a presença uma doença, então administra-se um agente terapêutico existente e é possível gerar um perfil ou valores de tratamento. Finalmente, é possível repetir o ensaio regularmente para se avaliar se os valores progridem ou se regressam ao padrão normal ou de referência. É possível utilizar perfis de tratamento sucessivos para se demonstrar a eficácia do tratamento ao longo de um período de vários dias ou vários meses.

Assim, a presente invenção diz respeito à utilização de um polipeptido de PDE_XIV, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado, para se produzir anticorpos anti-PDE_XIV que podem, por exemplo, ser 91 utilizados em diagnóstico para detectar e quantificar os níveis de PDE_XIV em estados patológicos. A presente invenção proporciona ainda ensaios e estojos de diagnóstico para a detecção de PDE_XIV em células e tecidos, os quais compreendem uma PDE_XIV purificada, que pode ser utilizada como contraprova positiva, e anticorpos anti-PDE_XIV. Tais anticorpos podem ser utilizados em tecnologias à base de soluções, membranas ou tecidos para se detectar qualquer estado patológico ou doença associado à expressão de proteína PDE_ XIV ou à expressão de supressões, ou uma sua variante ou um seu homólogo, fragmento ou derivado.

SONDAS

De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona sondas de hibridação de ácidos nucleicos ou sondas de PCR que são capazes de detectar sequências polinucleotídicas, incluindo sequências genómicas, que codificam a região codificadora de PDE ou moléculas congéneres, tais como alelos. A especificidade da sonda, isto é, se é proveniente de uma região ou domínio altamente conservado, conservado ou não conservado, e o rigor da hibridação ou amplificação (elevado, intermédio ou reduzido) irão determinar se a sonda identifica apenas sequências codificadoras de PDE que ocorrem naturalmente ou também as sequências afins. As sondas para a detecção de sequências de ácidos nucleicos afins são seleccionadas entre regiões nucleotídicas conservadas ou altamente conservadas de membros da família de PDE de nucleótidos cíclicos, tais como a região 3', podendo tais sondas ser utilizadas num conjunto de sondas degeneradas. Para a 92 detecção de sequências de ácidos nucleicos idênticas, ou em que se deseja uma especificidade máxima, as sondas de ácidos nucleicos são seleccionadas entre as regiões nucleotidicas não conservadas ou regiões únicas dos polinucleótidos de PDE. Tal como aqui utilizada, a expressão "região nucleotidica não conservada" designa uma região nucleotidica que é exclusiva da sequência codificadora de PDE aqui descrita e não ocorre em membros congéneres da familia, tais como PDE de nucleótidos cíclicos conhecidas. A PCR, conforme descrita nos documentos US-A-4683195, US-A-4800195 e US-A-4965188, proporciona utilizações suplementares para os oligonucleótidos baseados na sequência de PDE_XIV. De um modo geral, tais oligómeros são sintetizados quimicamente, mas também podem ser gerados por via enzimática ou produzidos a partir de uma fonte recombinante. Geralmente, os oligómeros compreendem duas sequências nucleotidicas, uma de sentido codificador (5'—> 3') e outra anti-sentido (3 '<—5'), utilizadas em condições optimizadas para a identificação de um gene ou estado específico. É possível utilizar os mesmos dois oligómeros, conjuntos concatenados de oligómeros ou mesmo um conjunto degenerado de oligómeros, sob condições menos rigorosas, para detectar e/ou quantificar as sequências de ADN ou ARN congéneres. A sequência de ácidos nucleicos para PDE_XIV também pode ser utilizada para gerar sondas de hibridação, conforme descrito antes, para cartografar a sequência genómica endógena. A sequência pode ser cartografada até um determinado cromossoma ou até uma região específica do cromossoma, utilizando para tal técnicas bem conhecidas. 93

Tais técnicas compreendem a hibridação in situ com extensões cromossómicas (Verma et al. (1988), 'Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques', Pergamon Press, New York City), preparações cromossómicas classificadas por fluxos ou construções cromossómicas artificiais, tais como YAC, cromossomas artificiais bacterianos (BAC), construções Pi bacterianas ou bancos de adnc de um único cromossoma. A hibridação in situ de preparações cromossómicas e as técnicas de cartografia física, tais como a análise de ligação utilizando marcadores cromossómicos definidos, são inestimáveis para a ampliação dos mapas genéticos. É possível encontrar exemplos de mapas genéticos em 'Science' (1995; 270:410f e 1994; 265:1981f). Frequentemente, a colocação de um gene no cromossoma de outra espécie de mamífero pode revelar marcadores associados, mesmo no caso de não se conhecer o número ou braço de um determinado cromossoma humano. É possível atribuir novas sequências a braços de cromossomas, ou suas porções, por cartografia física. Isto proporciona informação valiosa aos investigadores que trabalham na pesquisa de genes de doenças utilizando técnicas de clonagem posicionai ou outras técnicas de pesquisa de genes. Depois de se conseguir localizar grosseiramente uma doença ou síndroma, tal como a ataxia telangiectasia (AT), por ligação genética a uma região genómica particular, por exemplo, AT a llq22-23 (Gatti et al. (1988), 'Nature', 336:577-580), quaisquer das sequências cartografadas nessa área podem representar genes associados ou regulatórios para subsequente investigação. A sequência nucleotídica da presente invenção também pode ser utilizada para detectar diferenças na localização de cromossomas devidas a translocação, 94 inversão, etc., entre indivíduos normais, indivíduos portadores ou indivíduos afectados.

PRODUTOS FARMACÊUTICOS A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica para tratar um indivíduo que necessite de tal tratamento devido à actividade de pde_xiv, em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que afecta (por exemplo, inibe) tal actividade e de um veículo, diluente, excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

Assim, a presente invenção também abrange as composições farmacêuticas que compreendem os agentes da presente invenção (um agente capaz de modular o padrão de expressão da sequência nucleotídica da presente invenção ou a actividade do produto da sua expressão e/ou um agente identificado por meio de um ensaio de acordo com a presente invenção). A este respeito e em particular para terapia humana, embora os agentes da presente invenção possam ser administrados por si sós, serão geralmente administrados em mistura com um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável seleccionado em função da via de administração pretendida e das práticas farmacêuticas consagradas. A título exemplificativo, nas composições farmacêuticas da presente invenção, os agentes da presente invenção podem ser misturados com um ou vários agentes aglutinantes, lubrificantes, de suspensão, de revestimento ou solubilizadores adequados.

De um modo geral, uma dose diária terapeuticamente eficaz, oral ou intravenosa, dos agentes da presente 95 invenção estará provavelmente compreendida entre 0,01 e 50 mg/kg de massa corporal do paciente que se pretende tratar e de preferência entre 0,1 e 20 mg/kg. Os agentes da presente invenção também podem ser administrados por infusão intravenosa, numa dose provavelmente compreendida entre 0,001 e 10 mg/kg/hora.

Os comprimidos ou cápsulas dos agentes podem ser administrados individualmente ou podem ser administrados dois ou mais em simultâneo, consoante adequado. Também é possível administrar os agentes da presente invenção em formulações de libertação prolongada.

Assim, a presente invenção também proporciona um método para tratar um indivíduo que necessite de tal tratamento devido à actividade de PDE_XIV, o qual consiste em administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da presente invenção.

Tipicamente, o médico assistente irá determinar a dosagem real que será mais adequada para um determinado paciente, dosagem essa que irá variar em função da idade, do peso e da resposta de cada paciente. As dosagens anteriores são exemplificativas do caso médio. Como é evidente, podem existir circunstâncias individuais em que sejam necessários intervalos de dosagem superiores ou inferiores, estando tais situações contempladas no âmbito da presente invenção.

Sempre que adequado, as composições farmacêuticas podem ser administradas por inalação, sob a forma de um supositório ou pessário, por via tópica sob a forma de uma loção, solução, creme, unguento ou pó para polvilhar, utilizando um emplastro dérmico, por via oral sob a forma de comprimidos que contêm excipientes, tais como amido ou 96 lactose, ou em cápsulas ou óvulos, por si sós ou em mistura com excipientes, ou sob a forma de elixires, soluções ou suspensões que contêm agentes aromatizantes ou corantes, ou então por injecção parentérica, por exemplo, intracavernosa, intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Para administração parentérica, a utilização óptima das composições terá lugar sob a forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou monossacaridos suficientes para fazer com que a solução fique isotónica em relação ao sangue. Para administração bucal ou sublingual, as composições podem assumir a forma de comprimidos ou pastilhas que podem ser formulados de um modo convencional.

Para determinadas aplicações, as composições são preferencialmente administradas por via oral, sob a forma de comprimidos que contêm excipientes, tais como amido ou lactose, ou de cápsulas ou óvulos, por si sós ou em mistura com excipientes, ou sob a forma de elixires, soluções ou suspensões que contêm agentes aromatizantes ou corantes.

Para administração parentérica, a utilização óptima das composições terá lugar sob a forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou monossacaridos suficientes para fazer com que a solução fique isotónica em relação ao sangue.

Para administração bucal ou sublingual, as composições podem assumir a forma de comprimidos ou pastilhas que podem ser formulados de um modo convencional.

Para administração oral, parentérica, bucal e sublingual a indivíduos (tais como pacientes), a dosagem diária dos agentes da presente invenção pode estar compreendido tipicamente entre 10 e 500 mg (em dose única 97 ou em doses divididas). Assim, a titulo exemplificativo, os comprimidos ou as cápsulas podem conter entre 5 e 100 mg de agente activo para administração individual ou para administração simultânea de dois ou mais, conforme for adequado. Tal como indicado antes, o médico irá determinar a dosagem real que será mais adequada para determinado paciente, dosagem essa que irá variar em função da idade, do peso e da resposta de cada paciente. Faz-se observar que, embora as dosagens supramencionadas sejam exemplificativas do caso médio, podem existir, evidentemente, situações individuais em que sejam necessários intervalos de dosagem superiores ou inferiores, estando tais casos contemplados no âmbito da presente invenção.

De um modo geral, em determinadas aplicações em seres humanos, a administração oral dos agentes da presente invenção constitui a via preferida, sendo a mais conveniente e podendo evitar, em alguns casos, as desvantagens associadas a outras vias de administração -tais como as associadas à administração intracavernosa (i.c.). Nos casos em que o paciente sofre de um problema de deglutição ou de uma deficiência ao nível da absorção do fármaco após a sua administração oral, é possível administrar o fármaco por via parentérica, v.g., sublingual ou bucal.

Para utilização veterinária, administra-se o agente da presente invenção, tipicamente, sob a forma de uma formulação conveniente aceitável, em conformidade com as práticas veterinárias consagradas, e o cirurgião veterinário irá determinar o regime de dosagem e a via de administração mais adequados para um determinado animal. No 98 entanto, tal como sucede no caso do tratamento de seres humanos, pode ser possível administrar o agente por si só para tratamentos veterinários.

De uma forma típica, as composições farmacêuticas -que podem ser utilizadas em seres humanos ou em animais -irão compreender qualquer um ou vários de um conjunto de diluentes, veículos, excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. 0 veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser seleccionado tendo em vista a via pretendida de administração e a prática farmacêutica consagrada. Tal como indicado antes, as composições farmacêuticas podem conter, enquanto veículo, excipiente ou diluente - ou para além do mesmo - um ou vários de quaisquer agentes aglutinantes, lubrificantes, de suspensão, de revestimento ou solubilizadores adequados.

De acordo com algumas variantes da presente invenção, as composições farmacêuticas irão conter um agente que tenha sido pesquisado por meio de um ensaio da presente invenção; um agente que é capaz de interagir com qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa, incluindo seus derivados, fragmentos, homólogos ou variantes, ou sequências capazes de hibridar com qualquer uma das sequências ilustradas na listagem de sequências anexa, ou vários destes elementos. A invenção abrange no seu âmbito as sequências oligonucleotídicas, moléculas de ARN e ADN anti-sentido e ribozimas cuja função é destabilizar o ARNm de PDE_XIV ou inibir a tradução de uma PDE_XIV. Tais sequências nucleotídicas podem ser utilizadas em estados patológicos em que seria preferível fazer aumentar os níveis de nucleótidos cíclicos, tais como uma inflamação. 99

Uma molécula anti-sentido de PDE_XIV pode proporcionar a base para o tratamento de diversas anomalias associadas, por exemplo, a uma actividade de PDE_XIV elevada. É possível utilizar uma molécula anti-sentido de ácidos nucleicos de PDE_XIV para bloquear a actividade da PDE_XIV em estados patológicos nos quais seria preferível fazer aumentar os níveis de nucleótidos cíclicos. É possível utilizar vectores de expressão obtidos a partir de retrovírus, adenovírus, vírus de herpes ou vaccinia ou de diversos plasmídeos bacterianos para administrar moléculas de PDE_xiv recombinante, de sentido codificador e anti-sentido, à população de células visada. É possível utilizar métodos conhecidos pelos especialistas na matéria para construir vectores recombinantes que contenham pde_xiv. Em alternativa, é possível fazer chegar a PDE_XIV recombinante às células visadas, em lipossomas. A sequência de ADNc de comprimento completo e/ou os seus elementos regulatórios permitem aos investigadores utilizar a PDE_XIV como uma ferramenta em investigações de sentido codificador (Youssoufian H. e H.F. Lodish 1993, 'Mol. Cell Biol.', 13:98-104) ou anti-sentido (Eguchi et ai. (1991), 'Annu. Rev. Brochem.', 60:631-652) da função dos genes. É possível utilizar oligonucleótidos, concebidos a partir de ADNc ou de sequências de controlo obtidas a partir do ADN genómico, in vitro ou in vivo para inibir a expressão. Actualmente, tal tecnologia é bem conhecida na especialidade e é possível conceber oligonucleótidos de sentido codificador ou anti-sentido ou fragmentos maiores a partir de diversas posições ao longo das regiões codificadoras ou de controlo. É possível utilizar oligonucleótidos adequados, os quais podem ter um 100 comprimento de 20 nucleótidos, para isolar sequências de PDE_XIV, ou moléculas congéneres, a partir de bancos humanos.

Além disso, é possível modular a expressão de PDE_XIV por meio da transfecção de uma célula ou de um tecido com vectores de expressão que exprimem níveis elevados de um fragmento de pde_xiv, em estados patológicos nos quais seria preferível bloquear a actividade de fosfodiesterase e assim aumentar os níveis de nucleótidos cíclicos. Tais arquétipos podem afundar as células com sequências de sentido codificador ou anti-sentido que não podem ser traduzidas. Mesmo não havendo integração no ADN, tais vectores podem continuar a transcrever moléculas de ARN até todas as cópias do vector serem incapacitadas pelas nucleases endógenas. Tal expressão transitória pode durar um mês ou mais com um vector não replicativo e pode durar mais tempo, no caso de o sistema vectorial ser constituído por elementos de replicação adequados. É possível modificar a expressão dos genes, concebendo para tal sequências anti-sentido para as regiões de controlo do gene de PDE, tais como os promotores, intensificadores e intrões.

Os oligonucleótidos obtidos a partir do local de início da transcrição, v.g., entre as regiões -10 e +10 da sequência líder, são preferidos. Também é possível conceber e projectar moléculas de ARN e ADN anti-sentido para bloquear a tradução de ARNm, impedindo que o transcrito se ligue aos ribossomas. De igual modo, é possível conseguir a inibição utilizando uma metodologia de emparelhamento de bases à Hogeboom, também designada por emparelhamento de bases de "hélice tripla". O emparelhamento de hélice tripla 101 compromete a aptidão da hélice dupla para se abrir o suficiente para a ligação de polimerases, factores de transcrição ou moléculas regulatórias.

Assim, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende um agente da presente invenção (ou mesmo um seu sal farmaceuticamente aceitável ou um seu solvato farmaceuticamente aceitável) em conjunto com um diluente, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser utilizada no campo da veterinária (isto é, em animais) ou em seres humanos.

Deste modo, a presente invenção também diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem quantidades eficazes de inibidores ou antagonistas da proteína PDE_ XIV (incluindo as sequências de ácidos nucleicos anti-sentido) em mistura com um diluente, veículo, excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável (incluindo as suas combinações). A presente invenção diz respeito a composições farmacêuticas que podem compreender, total ou parcialmente, as sequências polinucleotídicas de PDE_XIV, as moléculas anti-sentido de PDE_XIV, polipeptidos de PDE_XIV, proteínas, péptidos ou moduladores orgânicos da bioactividade de PDE_XIV, tais como inibidores, antagonistas (incluindo anticorpos) ou agonistas, por si sós ou em combinação pelo menos com outros agentes, tal como um composto estabilizador, e podem ser administradas em qualquer veículo estéril, biocompatível e farmaceuticamente aceitável, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, soluto salino, soluto salino tamponado, dextrose e água. 102

REFERÊNCIAS GERAIS DE METODOLOGIAS

Embora as técnicas aqui referidas sejam geralmente bem conhecidas na especialidade, podem surgir referências particulares a Sambrook et al.r 'Molecular Cloning, A Laboratory Manual' (1989) e Ausubel et al., 'Short Protocols in Molecular Biology' (1999) 4a Ed., John Wiley & Sons, Inc.. A PCR encontra-se descrita nos documentos US-A-4683195, US-A-4800195 e US-A-4965188.

DEPÓSITOS

As amostras seguintes foram depositadas, ao abrigo do Tratado de Budapeste, no depósito consagrado 'The National Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited (NCIMB)', 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Escócia, Reino

Unido, AB2 1RY, no dia 18 de Dezembro de 1998: pHS-PDE_XIVNCIMB de E. coli, número 40995 da NCIMB; pMM-PDE_XlV de E. colí, número 40996 da NCIMB. A amostra seguinte foi depositada, ao abrigo do Tratado de Budapeste, no depósito consagrado 'The National Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited (NCIMB)', 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Escócia, Reino Unido, AB2 1RY, no dia 9 de Setembro de 1999: o número 41027 da NCIMB é pHS-PDE_XlVhm de E. colí. A presente invenção também contempla as sequências que podem ser obtidas e/ou expressas a partir de tais depósitos e as variantes que os abrangem. A presente invenção também abrange as sequências parciais que podem ser obtidas e/ou expressas a partir de tais depósitos e as variantes que os 103 abrangem, em que as referidas sequências parciais codificam locais enzimáticos activos. A presente invenção também abrange proteínas que compreendem sequências que podem ser obtidas e/ou expressas a partir de tais depósitos e as variantes que os abrangem. A presente invenção também abrange proteínas que compreendem sequências parciais que podem ser obtidas e/ou expressas a partir de tais depósitos e as variantes que os abrangem, em que as referidas sequências parciais codificam locais enzimáticos activos. A presente invenção também contempla sequências que podem ser obtidas e/ou expressas a partir de tais depósitos e as variantes que os abrangem.

INTRODUÇÃO À SECÇÃO DE EXEMPLOS E ÀS FIGURAS

Seguidamente, descrever-se-á a presente invenção, com um intuito meramente exemplificativo, tomando como referência os desenhos anexos, em que: a figura 1 mostra uma imagem fotográfica, a figura 2 mostra uma imagem fotográfica, a figura 3 mostra um quadro e uma imagem fotográfica, a figura 4 mostra um alinhamento de sequências nucleotídicas (neste caso a sequência humana é uma sequência truncada); a figura 5 mostra um alinhamento de sequências proteicas (neste caso a sequência humana é uma sequência truncada) e a figura 6 mostra um gráfico.

EXEMPLOS

Hibridação à Northern e preparação de sondas 104

Submeteu-se as imagens pontilhadas à Northern, fornecidas por Clontech, a uma pré-hibridação durante 1 hora em solução de hibridação 'ExpressHyb' (Clontech) a 55 °C, antes de se adicionar um fragmento de PDE_XIV radiomarcado (o ADN foi marcado utilizando o sistema de marcação aleatória 'Megaprime' (Amersham), rigorosamente de acordo com as instruções do fabricante, com 50 pCi de 32P-dATP) a solução recente de 'Expresshyb' e de se manter a hibridar de um dia para o outro a 55°C, sob agitação suave. Depois lavou-se as imagens pontilhadas, à temperatura ambiente, 3X com SSC 2x (NaCl 150 mM, citrato de Na 30 mM) durante 10 minutos de cada uma das vezes, seguindo-se 2 lavagens com SSX 0,2x (NaCl 15 mM, citrato de Na 3 mM) a 55 °C, durante 20 minutos de cada uma das vezes. Depois expôs-se as imagens pontilhadas a uma película autorradiográfica.

Reacções em cadeia com polimerase (PCR)

As PCR foram efectuadas utilizando reagentes e condições convencionais. Resumidamente, todos os tampões e enzimas de reacção foram fornecidos, em estojos, pela Clontech (para reacções de amplificação rápida de extremidades de ADNc (RACE)) ou pela 'Life technologies' para a PCR convencional. Os oligonucleótidos foram fornecidos por um fornecedor comercial (OSWEL DNA Services') e utilizados numa concentração de 400 nM. As reacções tiveram lugar num dispositivo de execução de ciclos térmicos PTC-200 da yMJ Research', utilizando os parâmetros de ciclos recomendados pelo fabricante do estojo utilizado. 105

Identificação da PDE_XIV O clone (clone IMAGE, id. 1364394) foi fornecido por 'Research Genetics' (2130, Memorial Pkwy, SW Huntsville, AL 358801, E.U.A) sob a forma de uma cultura em faixas em L-gelose. Dispôs-se as bactérias da cultura em linhas sobre uma placa de L-gelose de 37 mm, na presença de ampicilina numa concentração de 100 mg/mL. Depois de se deixar crescer de um dia para o outro a 37°C, recolheu-se um único clone, utilizando uma técnica estéril, para dentro de 5 mL de caldo LB que continha ampicilina numa concentração de 100 mg/mL e deixou-se crescer a 37°C de um dia para o outro, sob agitação (220 r.p.m.)· Isolou-se ADN plasmidico a partir das bactérias, utilizando um estojo miniprep convencional que se encontra disponível nos circuitos comerciais (Qiagen™) e procedendo rigorosamente de acordo com as instruções do fabricante. Depois submeteu-se o ADN isolado a uma sequenciação de comprimento total, utilizando estojos e reagentes de marcas registadas convencionais e um sequenciador automático ABI (PE Applied Biosystems Incorporated).

Isolamento de um clone de ADNc de comprimento completo putativo para PDE_XIV

Para facilitar o isolamento de um ADNc de comprimento completo de murino para PDE_XIV que contém a região codificadora completa e um codão de terminação, determinou-se a expressão de PDE_XIV num conjunto de tecidos, recorrendo para tal a reacções de hibridação à Northern. Estes dados (figuras 1 e 2) demonstram que, embora o ARN mensageiro (comprimento de 5,5 kb), que híbrida com PDE_XIV, se encontre presente em vários tecidos, é expresso 106 de uma forma particularmente elevada no cérebro, no músculo esquelético e no fígado de murinos e nas fases de desenvolvimento embriónico correspondentes aos 10,5, 13,5 e 15,5 dias. Utilizou-se o banco de ADNc embriónico de murino com 13,5 dias num método de selecção positiva de ADNc (GeneTrapper, Life Technologies, Inc.) para se isolar a PDE_XIV. O método foi executado de acordo com as instruções do fabricante. A sequência EST original do clone 1364394, EMBL ID: A1006099, estava na orientação inversa e por esse motivo era necessário que o desenho do oligonucleótido de selecção fosse igual à cadeia codificadora de 5' para 3', sendo este passo crítico para o êxito a estratégia de clonagem. O oligonucleótido utilizado para a selecção e a reparação está descrito minuciosamente a seguir.

Oligo 1:

Selectl 5'- GGT CAC AGA ACT GCC ACT ATG GTT AAA TGT - 3'

Para se isolar o homólogo humano da PDE_XIV de murino, foram projectados iniciadores de PCR com base na sequência conhecida de EST 1364394, EMBL ID: A1006099 (iniciador 1 e iniciador 2) e utilizados para pesquisar um painel de bancos de ADNc. As PCR efectuadas com estes iniciadores (a PCR foi preparada utilizando reagentes de um estojo 'PCR Reagent System' (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante, com parâmetros convencionais de execução dos ciclos térmicos) tiveram como consequência a geração de um fragmento do tamanho previsto, 164 pb, obtido a partir do banco de ADNc da linhagem de células HELA humanas (Life Technologies, Inc.); utilizando o mesmo oligonucleótido de selecção/reparação (Oligo 1), isolou-se o clone humano.

Iniciador 1: 107 newPDEl 5' -ACC GCT CAG AGA TTT CAC AGC A - 3'

Iniciador 2: newPDE2 5' -CCC GTC TGA CCC CTT AGT CGT A -3'

Seleccionou-se os clones para fins de seguimento por pesquisa, recorrendo a PCR de colónias com os iniciadores anteriores e de acordo com o método seguinte. Utilizando um palito estéril, recolheu-se uma única colónia e adicionou-se a um tubo que continha 25 μ]_ι de '1*PCR supermix' (Life Technologies, Inc) e 200 nM de iniciadores. Centrifugou-se o tubo durante 1 segundo e depois centrifugou-se durante 2 segundos a 14 000 x g. A seguir colocou-se os tubos num dispositivo para a execução de ciclos térmicos previamente aquecido (dispositivo para a execução de ciclos térmicos PTC-200 da MJ Research) a 94°C. A PCR foi efectuada de acordo com o programa seguinte: 1 ciclo a 94°C, 1 minuto, seguindo-se 30 ciclos de: 94°C, 30 segundos, 55°C, 30 segundos, 72°C, 1 minuto. Analisou-se então os produtos da PCR por electroforese em gel, utilizando métodos convencionais. A análise do clone de murino isolado permitiu montar uma sequência contígua de 2823 pb que contém um ORF de 446 resíduos. A sequência de ADNc de comprimento completo para a PDE_XIV de murino está apresentada sob a forma de SEQ ID NO. 7, sendo a tradução do maior quadro de leitura ininterrupta dentro deste ADNc apresentada sob a forma de SEQ ID No. 1. A região codificadora é apresentada sob a forma de SEQ ID No. 2. A análise do clone humano isolado permitiu montar uma sequência contígua de 2992 pb que contém um ORF de 288 resíduos. A sequência de ADNc para a PDE_XIV humana está apresentada sob a forma de SEQ ID No. 8, sendo a tradução 108 do maior quadro de leitura ininterrupta dentro deste ADNc apresentada sob a forma de SEQ ID No. 3. A região codificadora é apresentada sob a forma de SEQ ID No. 4. Este clone foi utilizado para pesquisar uma mancha relevante de ARN (Clontech) utilizando os métodos convencionais de hibridação à Northern para se identificar a distribuição tecidual deste ADNc.

Os resultados (veja-se a figura 3) demonstram que o transcrito é altamente expresso no putâmen e no núcleo caudado cerebral, para além do lobo occipital cerebral, do coração, ovários, glândula pituitária, rim, figado, intestino delgado, timo e apêndice.

Tal como sucedeu com todas as fosfodiesterases de mamíferos sequenciadas até à data, a PDE_XIV contém uma sequência de domínio catalítico conservado aproximadamente com 250 aminoácidos na metade do terminal carboxilo da proteína, sobre a qual se admite que seja essencial para a actividade catalítica. Este segmento compreende os aminoácidos 108 a 413 da SEQ ID 1 e exibe uma conservação de sequências em relação à região correspondente de outras PDE. A partir do alinhamento de nucleótidos (ver a figura 4) e do alinhamento de proteínas (ver a figura 5), é evidente que o clone de PDE_XIV humano está truncado na extremidade 3' devido à existência de um codão de interrupção prematuro na posição 1102 pb.

Isolamento de um clone de ADNc humano de comprimento completo putativo para PDE_XIV

Adquiriu-se um banco de ADNc de cérebro fetal humano à empresa Life Technologies, inc (LTI). inoculou-se 100 mL de caldo de Luria (10 g de triptona, 5 g de extracto de 109 levedura, 5 g de NaCl/litro) + ampicilina à razão de 100 μς/ιη!,) com 2,5 x 109 u.f.c. de cada banco de ADNc. Deixou-se crescer e preparou-se cada um dos bancos individualmente. Deixou-se em cultura de um dia para o outro a 30°C e preparou-se ADN plasmidico, conforme descrito no protocolo 'GeneTrapper™' (LTI). Os pormenores dos métodos para a selecção positiva de clones de ADNc, utilizando 'GeneTrapper™' (LTI), estão descritos nos protocolos dos estojos, tendo estes sido cumpridos, com excepção das modificações a seguir indicadas. Combinou-se o banco de ADNc de cadeia simples com 20 ng de oligonucleótido de captura biotinilado e hibridou-se a 37°C durante 1 hora. Reparou-se o ADN de cadeia simples que foi eluido, utilizando para tal o oligonucleótido de captura enquanto iniciador para o prolongamento de polimerase de ADN. Os bancos de ADN reparados foram submetidos a electroporação na estirpe DH10B de E. coli (LTI), de acordo com o protocolo do fabricante.

Clonagem, distribuição tecidual e análise das sequências de PDE XIV humana

Para facilitar o isolamento de um ADNc de comprimento completo, determinou-se o perfil de expressão da PDE_XIV num conjunto de tecidos de murganho, recorrendo para tal às técnicas de hibridação à Northern. Assim foi identificado um transcrito de 5,0 kb que é expresso de uma forma particularmente elevada no embrião de murganho com 13,5 dias e no coração, no cérebro e no figado do murganho adulto. Este transcrito também se encontra presente em niveis baixos em embriões com 8,5, 10,5 e 15,5 dias e no músculo esquelético, no rim e no pulmão do adulto. Não se 110 detectou nenhum transcrito no baço ou nos testículos. Com base nos dados, utilizou-se um banco de ADNc de embriões com 13,5 dias (LTI) como padrão para isolar a sequência de comprimento completo, utilizando uma técnica de selecção de ADNc positiva, 'GeneTrapper' (LTI). Tal foi conseguido utilizando um oligonucleótido específico de PDE_XIV. Efectuou-se uma PCR e conseguiu-se assim identificar ADN que continham pelo menos o fragmento EST. Por digestão com enzimas de restrição identificou-se inúmeros clones que continham um fragmento de inserção de 2885 pb e a análise de sequência total demonstrou que estes clones codificavam um ORF de 446 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 51,3 kDA.

Além disso, isolou-se o ADNc humano de comprimento completo com o 'GeneTrapper', utilizando o mesmo oligonucleótido de captura específico e um banco de ADNc de cérebro fetal humano como padrão. Isolou-se diversos clones que continham um fragmento de inserção com 2653 pb e por análise de sequência completa identificou-se um ORF de 450 resíduos com uma massa molecular prevista de 51,8 kDA. Utilizando o ADNc de comprimento completo, pesquisou-se com sonda uma mancha principal de ARN. Assim se conseguiu identificar a elevada expressão do ARNm para a PDE_XIV humana no núcleo caudado, no putâmen e no lobo occipital cerebral e perifericamente no coração, ovário, glândula pituitária, rim, fígado, intestino delgado e timo. Foram observados níveis inferiores no músculo esquelético, cólon, bexiga, útero, próstata, estômago, glândula supra-renal e glândula tiróide. O transcrito não foi observado nos testículos, no baço, no pâncreas, nos leucócitos 111 periféricos, nos nódulos linfáticos, na medula óssea, na aorta nem no cerebelo. A comparação entre sequências de PDE_XIV humana e de murino demonstra que partilham 91% dos aminoácidos. 0 ORF humano previsto é prolongado em 4 aminoácidos, resultando isto da inserção de cinco aminoácidos na posição 428 e da supressão de um único aminoácido na posição 441 na sequência de murino. Além disso, os dois ADNc contêm um único local de fosforilação de proteínas cinases de cAMP na posição 45. Um alinhamento filogenético do domínio catalítico de 230 aminoácidos de pde_xiv (aminoácidos 172 a 420) com representantes de outras PDE demonstra que a maior homologia existe entre a PDE_XIV e a PDE7A (identidade de cerca de 70%) com a qual se vai aglomerar. Uma análise bioinformática suplementar demonstra que este domínio partilha uma identidade sequencial inferior a 50% com as regiões equivalentes nas outras nove subfamílias de PDE conhecidas, podendo isto indicar que a PDE_XIV pode ser um segundo representante da família PDE7. A sequência de PDE_XIV contém dois motivos putativos de ligação a catiões divalentes HXXXHX8-2oD (aminoácidos 173 a 180 e 213 a 270), sobre os quais se admite que sejam essenciais para a actividade hidrolítica. Obtemos assim mais provas de que a PDE_XIV codifica uma enzima fosfodiesterase funcional.

Ensaios de fosfodiesterase sobre lisados impuros de células de mamífero

Transfectou-se clones de ADNc de PDE_XIV humana e de murino para dentro de uma linhagem de células COS7 de mamíferos (ATCC), utilizando 'Lipofectamine' (Life 112

Technologies, Inc) e recorrendo a métodos convencionais. Efectuou-se a colheita das células C0S7 ao fim de 72 horas após a transfecção e testou-se quanto à actividade de PDE, utilizando a actividade de fosfodiesterase seguinte, um estojo SPA (ensaio de proximidade por cintilação) comercialmente disponível (Amersham) para o ensaio por SPA de cAMP (Amersham). Foram efectuadas diluições sequenciais dos lisados celulares em tampão de citólise (HEPES 50 mM, pH 7,2, MgCl2 1,92 mM, KCL 50 mM, EGTA 10 mM, 1 pastilha de inibidor de protease/50 mL) para se diluir quaisquer efeitos inibitórios endógenos. A 25 mL de lisado impuro diluído, adicionou-se 25 mL de tampão D (tampão C + ASB à razão de 2 mg/mL) e depois acrescentou-se 50 mL de tampão C (Tris.HCl 20 mM (pH 7,4), MgCl2.6H20 5 mM) que continha 500 nM de substrato de cAMP (20 pL de [3H]-cAMP (1 μΜ, 4 μϋί/πΛ) mais 423 μΒ de cAMP frio, 10 μΜ/5 mL). Manteve-se a mistura de reacção a incubar durante 30 minutos a 30°C. Depois adicionou-se 50 pL de esferas de SPA e centrifugou-se imediatamente a 2000 r.p.m. durante 5 minutos. Efectuou-se as leituras num contador de cintilação 'Topcount' (Wallac).

Os resultados (figura 6) demonstram que os clones humano e de murino de PDE_XIV são activos, 10 vezes mais activos do que a contraprova pseudotransfectada.

Expressão de fosfodiesterase em baculovírus A PDE_XIV foi expressa em baculovírus enquanto estava fundida com um identificador FLAG no terminal N - os pormenores serão apresentados mais adiante.

Actividade de fosfodiesterase de cAMP 113

Utilizando Ensaios de Proximidade por Cintilação com cAMP sobre PDE_XIV expressa purificada, para concentrações de cAMP compreendidas entre 0 e 10 μΜ, a PDE_XIV expressa exibiu uma forte actividade de cAMP com um valor Km de 0,08 μΜ (conforme determinado por meio de um gráfico de Hanes obtido a partir da curva cinética) . Os estudos também revelaram que a PDE_XIV não tem nenhuma actividade contra cGMP. Assim, a PDE_XIV pode ser especifica de cAMP.

Estudos de inibição de fosfodiesterase

Concluiu-se que a PDE_XIV não era sensível aos inibidores de PDE milrinona, rolipram e ariflo. No entanto, observou-se a inibição da actividade de PDE_XIV com dipiridamole e IBMX, para valores de CI50 respectivamente de 10,72 μΜ e 9,32 μΜ. Os dados para estes estudos estão apresentados no quadro seguinte. EFEITOS DOS INIBIDORES SOBRE PDEXIV COMPOSTO SELECTIVIDADE CI50 PARA PEDXIV (μΜ) (N=2) Dipiramidol PDE5/6/8 (0,9/0,38/1,5 μΜ) 10,72 ± 2,74 IBMX Não selectivo (2-50μΜ) 9,72 ± 0,32 Rolipram PDE4 (2,0 μΜ) >30 Milrinona PDE3/4 (3,2 μΜ /19 μΜ) >30 Ariflo PDE4D (40 ηΜ) >30 114

Expressão em baculovírus

Os estudos subsequentes demonstram que a enzima PDE da presente invenção - aqui designada abreviadamente por PDE -pode ser gerada utilizando um sistema de expressão em baculovírus.

Os estudos a seguir apresentados também demonstram que a PDE exibe actividade hidrolitica dos nucleótidos cíclicos quando é expressa no sistema de baculovírus. A enzima PDE foi gerada utilizando o sistema de expressão de baculovírus com base na infecção de células de insecto de Spodoptera frugiperda (células Sf9) com vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV).

Nestes estudos, efectuou-se a clonagem do ADNc que codifica a PDE dentro do plasmídeo dador pFASTBAC-FLAG que contém um elemento de transposição mini-Tn7. 0 plasmídeo recombinante foi transformado dentro de células qualificadas DH10BAC que contêm o bacmídeo original bMONl4272 (ADN infectado com AcNPV) e um plasmídeo auxiliar. 0 elemento mini-Tn7 no dador pFASTBAC pode ser transposto para o local de ligação attTn7 do bacmídeo, introduzindo assim o gene de PDE no genoma virai. As colónias que contêm bacmídeos recombinantes são identificadas por ruptura do gene lacz. 0 arquétipo de PDE/bacmídeo pode então ser isolado e infectado dentro de células de insecto (células Sf9), daí resultando a produção de partículas de baculovírus recombinantes infecciosas e a expressão da proteína de fusão PDE-FLAG recombinante.

Mediu-se a actividade de fosfodiesterase dos extractos celulares impuros.

Efectuou-se a colheita das células e preparou-se os extractos ao fim de 24, 48 e 72 horas após a transfecção. 115

Estes resultados confirmam que o ADNc de PDE codifica uma fosfodiesterase que é capaz de hidrolisar cAMP. 0 material de lisado impuro foi purificado por FPLC, utilizando uma coluna que continha esferas de agarose (gel de afinidade M2) com a qual se tinha conjugado um anticorpo monoclonal anti-FLAG de IgGl purificado por ligação com hidrazida (Eastman Kodak). isto permite a retenção específica do material recombinante na coluna (visto que está fundido com o epitopo FLAG), enquanto as proteínas endógenas de insecto são removidas por lavagem no produto de eluição. Depois remove-se o material recombinante por lavagem em condições de pH baixo. Este material purificado era mais adequado para estudos enzimáticos e de inibidores pormenorizados. Verifica-se a pureza do material por contrastação com azul-de-Coomassie após electroforese em gel de poliacrilamida e dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) ou por obtenção de imagens à Western sobre uma membrana de nitrocelulose de uma SDS-PAGE não contrastada (contendo PDE recombinante) e análise monoclonal de igG anti-epítopo FLAG. A proteína de fusão PDE-FLAG é detectada devido à interacção entre o anticorpo anti-FLAG e o epitopo FLAG que está fundido com a proteína PDE.

Testou-se a actividade de fosfodiesterase da proteína de fusão PDE-FLAG purificada, utilizando para tal um estojo comercialmente disponível de SPA (ensaio por proximidade de cintilação) (Amersham - Amersham place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA UK) para a actividade hidrolítica de cAMP e/ou cGMP. Isto pode ser utilizado para permitir a determinação do valor Km para a PDE na presença de cAMP, determinando-se a actividade enzimática num intervalo de 116 concentrações do substrato, o que permite calcular um valor Vmáx. aproximado para a enzima.

Os resultados destas experiências demonstram que o ADNc de PDE codifica uma fosfodiesterase que é capaz de hidrolisar cAMP.

RESUMO

Resumidamente, a presente invenção proporciona e os exemplos mostram, inter alia: 1. novos aminoácidos, 2. novas sequências nucleotídicas, 3. ensaios em que tais novas sequências são utilizadas, 4. compostos/composições identificados utilizando tais ensaios, 5. sistemas de expressão que compreendem ou expressam tais novas sequências, 6. métodos de tratamento com base em tais novas sequências, 7. composições farmacêuticas à base de tais novas sequências. 117

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS São apresentadas as sequências seguintes: SEQ ID NO: 1 = sequência de aminoácidos de murino; SEQ ID NO: 2 = sequência nucleotidica codificadora de murino; SEQ ID NO: 3 = sequência de aminoácidos humana truncada; SEQ ID NO: 4 = sequência nucleotidica codificadora humana truncada; SEQ ID NO: 5 = sequência de aminoácidos humana; SEQ ID NO: 6 = sequência nucleotidica codificadora humana; SEQ ID NO: 7 = sequência de ADNc de murino; SEQ ID NO: 8 = sequência de ADNc humana truncada; SEQ ID NO: 9 = fórmula I. (Faz-se observar que na descrição anterior. As referências à SEQ ID NO: 2 são igualmente aplicáveis à SEQ ID NO: 7. De igual modo, as referências a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 são igualmente aplicáveis a SEQ ID NO: 8). SEQ ID NO: 1 &USF0m$mS$:Umi 14 0 23.» 118 SEQ ID NO: 2 start

ATGTCTTGTTTAftTGGlTGAGAOGTOTGGCGAAGÍC-rTGTtTOAGAGCCCTGAACAGAGTGTCAAA

•rGTGTTTGCATGCTAGGAGATÕTACGACTAAGGGGTCASACGGGGSrrCCTGCCGAACGCCGTGGCTCCT

ACCCATTtATTGACTTCCGTGTACTTAACAATACAÂC&CACTCASGGGAAATTGGCACCAÂGAAAAÂGGT

GMACGACTGTTAASTTTCCAAAGATACTTCCATGCATCTAGÕCTtCÍCCGGGGGATTATACCGCAGGCC

CCTCTCCACCTGCTOGATGAAGACTACCrrGGACAAGCAAGGCACAXGCTCXCCAAAGTTGGAACGTGGG actttgacattttgttgttxgatcgcttgacaaatgggaacagtctggtaactctgttgtstcacctctt

CAACTCCCATGGaCTCATCCA-CCATITCAAGCTCGATATCGIXaACCTTGCACAGGTTTCTGGTTATGGTT

CAGGAAGATrACCACGOTCACAACCCATACCACAATGCTGTTCACGCAGCCGACGTCACCCAGGCCATGC

ACTGTTACCTGAAGGAGCCAAAGTTGGCAAGCTTCCrCACACCTCTGGACATCATGCrrGGACrACTGGC tgcagcagctcatgacgtggaccacccaggggtcaaccagccatttttgatcaaaactaaccaccatctt

GCCAACCTGTATCAGAATATGTCrGTACTGGAGAATCACCACTSGCGATCmCAATTGGC&TGCTTCGAG aatcacggctcctggctcacttgccaaagsaaatgacacaggatatcgaacagcagctgggctccctcat

CTTGGCCACSGATATCAACAGACAGAATGAGTTTCimCCCGCTTAAAAGCTCACCTCCACAATAAAaftT

tTGAGACTGGAGAATGTACAGGACAGACACTTTATGCTTCAGATCGCCTTGAAGTGTGCTGRCATTTGCA

ATCCTTGTCGTATCTG<^AGATGAGCAAGCAGTGGAGTaAAAGGGTCTGTGAGGAATTCTACAGACAAGG

TGACCTTGAACAGAAGTTTGAACTGGAAATCAGTCCTCrTTGTAATCAACAGAAAGATTCAATCCCTAGC

AmCAAATTGGTTTCATGACTTACATCSTGGASCCGCTGTTCCGGa&GTGGGCCCGGTTTACTGGGAACA gcacccxgtoggagaacatgctaagckatctçgcgcacaacaaagcccagtggaagagcctqctgtccaa tcagcacagacgcaggggcagcgsccaggacctggcgggccccgcacctgagaccctggagcagacagaa

GGXGCCACSCCCTAA

SfcQp SEQ ID NO: 3 MSCIAfVE&CSEIAFEIWDQNAKWCMmDIB^RGQTGV^P^SYFFIDFRAl^SmSGSIGTKKKVK 70 UMJSΨmYFHΆSRL·L·RaIXPQΆPlaL·LDSDYLGΰΆSmLSmΰmDrDIFL·FML·msmL·VT‘LLCm,m 140 THGijIHMFKXíDMVTLHRFAVMVGSDyHSCsííPYíBíAVHAADVT^AMHCYIíKEPKIASFLTPLDIMIjGltlíAA 210 AMDVTJHK*W0RFAIKTMRliANl#yQNMSVItEííHHWSSTIG3ÍLRESRLIiMíXiFKEMTGTÍ®FDIF]jFDR 280 l.TUGNSLV 2S8 SEQ ID NO: 4 starfc

A^GTCTTGTTTAATGGTrGAGAGGTGTGGCGAAATCTTGTTTGAGAACCCCGA

TCAGAATGCCAAATGTGTTTGCAtGCTGGGAGATATACGACXAAGGGGTCAGACGGGGGTTCGTGCfGAA

CGCCGTSGCrOCTACCCATTCATTGACTTCCGCCTACTTAÃCAGTACAACATACTCAGGSGAGATTGGCA ccaagaaaaaggtgaaaagactattaagctttc&aagatacttccatgcatgaagoctgcttcgtggaat

TATACCACAAGCCCCTCTGCACCTGCTGGATGAAGACrACCrrGGACAAGCAAGGCATATGCTCTCCAAA gtgggaatqtgggatttxgacattttcttgtttgatcgcttgacaaatggaaacagcctggtaacactgt TGTGCCACCTCTTCAATACCCATGGACTCATTCACCATTXCAAGTTAGATATGGTOACCTTACACCGATr

7“Tjs.GTC«TGQTTCAAGAAGÂTTACCACAGCCAAAACCCGTATCACAATGCTG:rrCACGCAGCCGACGTC acccaggccatgcactgctacctgaaasagccaaagcttgccagcttccxcacgcctctggacatcatgc ttggactgctggctgcagcag^cacgatgtggaccacccaggggtgaãccagccatxtttgataaaaac taaccaccatcttgcaaacctatatcagaatatgtctgtgctggag&atcatcacxggcgatctacaatt ggcatgcttcgagaatcaaggcttcttgctcatttgccaaaogaaatgacgtm SEQ ID NO: 5 A SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos apresentada sob a designação de HS_PDEXIV. Para fins de referência, a sequência MM_PDEXIV é a SEQ ID NO: 1. 119

Utilizou-se o programa de alinhamento de sequências múltiplas 'CLUSTAL W (1.74)'.

119 HS PDEXIV Μ&Γ PDRXIV

HS_PDEXIV m PDEXIV

HS PDEXIV

HS PKEXÍV wfppEJUV MSCtMVSHteEIIiFENPDQÍíRKCVCMIjGDIRIiRGQTSVHASRHGSYHPIDFRtLHSTTXS J-ISCX^VSRCSEVLFSSPEOSVKCVCMIiGDVSiRGQTSVPAESRGSyPFIDFRl.L-ÍWTTKS *-^*****1»*·** j *** **:* % ^ ♦*♦***=** »♦******♦ **♦*****♦»***** * *-*>* GEIGTKHKVKSIjIiSFQRXFKííSHXiIjRGI I HÇ^LHHZiOBB YlfSOÃRHMtS KVQMKDRQIF GE IG TKKKVKRLLS FÇRyPHAÊRX. ERC-11 POAPIAlASSDy rSOASHM L3 KVSTWIíFDI ? ****************** ******* *****+********************** ****** XíFX>8LTHQHStí\rriiC'HX>raTHGLXHH?HiI)KVtUÍRFt;VWQEDSHSGHPXHmVHAAD m>RGTHSHSOTUtCKLFNSHGLIHHFKLSMVTI^RFL,«l1WEDXi»3HJíH?HHM'HAM) * » * ***************** ; ************************** _ . ******* **** ^TQAMHCy HKKPK1AS F&TPLB I MXGLXAÃRfeHDVDHHSVHOPFLX KTKP3SIANLYQJSMS VTQANrsC YLKSPKIAS FLTPLDIHLGUAAAAHDVDH P3VNQF FLIKU«miANEYC!HMS ************************************************************

HS PCEXXV RfTPDEXIV BSJPDEXIV hm“pí>exiv HS PtEXIV KM>smv HS PISXXV wTp*>mv VIjSNHF^RSTI G^IJíESHIiIAHLHíCEíWQDI SQQLGSl!! ÍAXDXNRQHE PrTRLKAHIiHK VLENHHWRSXXOMtHESR^Í^tPKSWQDXEQQLGSLXJXftTíJIHRQHBFLXRLKAHyaí ****************** **************** ************************** KStREEDWRHFKtQXMiKCWJXa^CRíWHHSKQ-HSSRVCSBFyROGStíSQSíFEl^XS SSlJííjEWQDRHmOIALKCAOICííPCHIHEMSK^WSSÍÍVCSHFVaQGPHSSKFELEIS **»***. ******************************* ********** * **********

PGCNQQKOSIPSXQIGmSYIVEPHFH.BH^HFrSÍÍSTHSSMMLGHLÃHíncaOHKSLttHO

PSC^QKSSXPSiQXGFMTyiVEPtFREHAHFi^HSttSWLSHtWÍHK&OSíftSttSKQ ****************** ********** X ******* ***** ************* * HSSSGSSGSGPCHBKAGOSTBSEEQ-ESDS? HHRRGSG- - * «•'QSXAGPAPSTLEQTKGATF * * * * * . * * * +.****.* SEQ ID NO: 6 A SEQ ID NO: 6 é a sequência nucleotidica apresentada sob a designação de HS_PDEXIV. Para fins de referência, a sequência MM_PDEXIV é a SEQ ID NO: 2. Utilizou-se o programa de alinhamento de sequências múltiplas 'CLUSTAL W (1.74) '. 120 HS PDEXIV MftJ?DEXIV — -......ATGTCTTGTTTAATGGTTGAGAGGTGTGGCGAMTCTTGTTTGAGAACCCC .........ATGTCTTGTTTMTGGTTGAGAGGTGTGGCGAAGTCTTGTTTGAGAGCCCT ****** ***************** ********** ************ *** HS PDEXXV MfTPDEXIV gatgãgaatgccaaatgtgtttgcatgctgggagatatacgactaaggggtcagacgggg GAACAGAGtGTCAAATGTGT7TGCATGCTAGGAGATGTACSACTAAGGGGTCAGACGGGG *·» **** ** *♦*♦***<***·»*»*»*» ***·»** ***·>***»***»*·«****♦**** HS PDEXXV MK_PDSXIV gttcgtgctgaacgccgtggctcctacccattcattgacttccgcctacttaacagtaca GTTCCTGCCGAACGCCGTGGCTCCTACCCATTCATTGACTTCCGTCTACTTAACAATACA **** *** *********************************** ********** **** HS PDEXIV MM_PDEXIV ACATACTCAGGGGAGAXTGGCACCAAGAAAAAGGTGAAAAGACTATTAAGCTTTCAAAGA ACACACTCAGGQGAAATTGGCACCAAGAAAAAGGTGAAACGACTGTTAAGTrrCCAAAGA *** ********** ************************ **** ***** ** ****** HS PDEXXV MHJPDEXIV tacttccatgcatcaaggctgcttcgtggaattataccacaagcccctctgcacctgctg-TACTTCCATGCATCTAGGCTTCTCCGGGGGATTATACCGCAGGCCCCTCTCCACCTGCTG ************** ***** ** ** ** ******** ** ******** ********* HS PDEXXV MMJM5BXIV GATSAAGACTACCTTGGACAAGCAAGGCATATGCTCTCCAAAGTGGGAATGTGGGArrrt gatgaagactaccttggacaagcaaggcacatgctctccaaagttggaacgtgggacttt ***************************** ************** **** ****** *** HS PDEXXV MNJPDEXIV gacattttcttgtttgatcgcttgacaaatggasacagcctggtaacactgttgtgccac gacattttcttgtttgatcgcttgacaaatgggaacagtctggtaactctgttgtgtcac ******************************** ***** ******** ******** *** HS PDEXXV MM^PDBXIV ctcitcaatacccatggactcaitcaccatttcaagttagatatggtgaccttacaccga ctcttcaactcccatgggctcatccaccatttcaagcxogatatggtgaccttgcacagg ******** ******* ***** ************ * ************** *+* * HS PDEXXV 0©fpD£XIV tttttagxcatggttcaagaagattaccacagccaaaacccgtatcacaatgctgttcac TTTCTGGTTATGGTTCAGGAAGATTACCACGGTCACAACCCATACCACAATGCTGTrCAC *** * ** ******** ************ 4 ** ***** ** *************** HS PDEXXV MM~PDEXIV GCAGCCGACGTCACCCAGGCGATGCACTGCTACCTGAAAGàGCCAAAGCTTGCCAGCTTC aCAGCCGACGTCACCGÁGGCCATGCACTGTTACCTGAAGGAGCCAAAGTTGGCAAGCTTC ***************************** ******** ********* * ** ****** HS PDEXIV mmj?dexiv CrCAOSCCTCTGGACATCATGCTTGGACTGCTGGCTGCAGCAGCACACGATGTGOACCAC CTCACACCTCTGGACATCATGCTTGGACTACrTGGCTGCAGCAGCTCATGACGXGGACCAC ***** *********************** ************** ** ** ********* HS PDEXXV MM~PDEXIV CCAGGGGTGAACCAGCCATTrrTGATAAAAACTAACCACCATCXTGCAAACCTATATCAG CCAGGGGTCAACCAGCCATTTTTGATCAAAACTAHCCACCATCTTGCCAACCTGTATCAG ******** ***************** ******************** ***** ****** HS PDEXXV MM_PDEXtV AATATGTCTGTGCTGGAGAATCATCACTC-GCGATCTACAATTGGCATGCTTCGAGAATCA AATATGTCTGTACTGGAGAATCACCACTGGCGATCTACAATTGGCATGCT7CGAGAATCA *********** *********** ************************************ HS PDEXIV MM PDEXIV aggcttcttgctcatttgccaaaggaaatgacacaggatattgaacagcagctgggctcc CGGCTCCTGGCTCACTTGCCaAAGGAAATGACACAGGATAT^AACAGCAGCTGGGCTCC **** ** ***** ************************** ****************** KS PDEXXV MM~PDEXIV ttgatcttggcaacagacatcaacaggcagaatgaatttttgaccagattgaaagctcac ctçatcttggccacggatatcaacagacagaatgagtttctcsacccgcttaaaagctcac *' ******** ** ** ******** ******** *** ***** * ** ********* HS PDEXIV mm_pdexxv ctccacaataaagacttaagactggaggatgcacaggacaggcactttatgcttcagatc ctccacaataaagatttgagactggagaatgtacaggacagacactttatgcttcagatc ************** *+ ********* *** ********* ****************** 121 ks ?οεχιν Μ!·Γ?3ΗΧΐν SCCTt^SAAGTGTGCTGACA^rGCAATCCTTGTAGAATCTGGGAGATGAGCAAGCAGTGíí GCCTTQMGTGTGCTGACATTíGCAATCCTTGTCGTATCTCGÍJASATGAGCAAGCROTGG **********************+********** * *****>************· *** * * η sjpomiv »“P0SXIV AGTOMASSGtCTGTGAAGMTtCmGAGGCAASGTGAAOrrGAACAGAAATrTGAACTG AGTGAAAGGG7CTGTCXAGGAATTCTACA5ACAAGGT3ACCT?GAÃC».GAAGrTTGAACTG ***************** *********** **x**y·** *********** ********* KS PD3XXV M«'“?DSXIV GAAAfCAGTCCTCtXTGTMtCM'SA5AAA0ATtCCATCCCTAGTATACAAATi'SGXITC GAMTCAGTCCTCriTOTMTCAAC&GAMGàl^C&ÁTCCCTAiSCA.TACAAATTGGTTTC *♦**+*♦**********+***************** ******** *************** HS KDEXIV K>fpD£XIV ATGASCTACATCGTGGAGCCGCTCTTCCGGGAAXGGGCCCATTTCACGGGTAACAGCACC atgacttacatcgtggagccgctgtfccgggagtgggcccggtttactgggsacascacc ♦ à»* *♦**·* **·**♦**♦*♦: ♦* *♦♦*♦**** ♦ *♦**·** ♦ * * * ** *»***?**♦* m pqsxxv mjPBSxxv CTGTGGGAGAACATGCTGGSC^CCTCGCT.CACAACAASGCCCAGTGC-ARGAGCCTGTTG CTGTCGGAGRAC.ATGCTAAGCCATCT030GCACAACAAA5CCCRGTGGAAGAGCCTGCTG ***************** *+1·* ***** ******** ****************** ** KS POEXIV &MJ>0EXIV CCC®í3GCAGCACAGAAGCAQGGGCASCAGTGGCAGCG<>3CC?G-AÇCACGACCACGCAGGC TCCAATCAGCACAaACGGAGGGGGAGGGG...............CCAGGAGCTGGCGGGC ·***· * * ♦ *«* * ft # *"♦#*****♦** * *** ***-*1· #♦ *·*·* hs ροεχιν CM03GACTGAGAGCSAGGAGCAG-- -GAAGGCGACAGCGCCTAG CCCGCACGTGAGACCCTGGAGCAGACAGAAGGTGCCACGCCCXSA * ****** * ******* '*·*·♦*♦' * ** *****- 122 SEQ ID NO: 7

AQ(5TACeCCTSCÃGGT&CCG<3?CCGGA^tTCCC»<3CTCCàCCCA<XC(5TCC<5«CCS<íCCTCO=&GSCCGG

Ci-QCCtGCTO.CCCAGCCAGTOSCTAaCTClXJOGCACTSCAGCAGGCTCGGCTCTGTCCCACaJCTCGCr

TGCTTGCTCSCTCGCrCGGCTGGSaGAMAGTGGTGTCCTCGCCCAGAGAGCCXCÍCTCrCCCTTCC^C

rrTCrCGA3CTCTCTGA3TCC'TTTOGCGl^TCrrTTCTT?CTTTCCnTrTtTTITTTrTTTAAÍA-mt'C

rFTTTCTTrCTATAAAÁCl^<^TMTTATACTGCTAATCCrG0ATaAG0TTGCTGGATTaX5ÇSiSCACA

AAXCTtCATi3AACAAGCCGCACC3CTCAaAGArrTCACAGeAT?C^AAGSTCACAGAACT6CCACTATGG scart

TTAAATGTCTTGTTTAATGGTTíSíySAGGTGTGSCGAAGTCTTGTTTGAGAGCCCTSAACAGAÍÍTGTCAAA

TGTCl-TrGCATGCTA(53AGAXGTACGACtAA.GGC*>3tCAGACG5GGGrTCCrr3CCÔAACaCCfJtGGCTCCT

ACCCATTCATTGACTTCCGTCTACITAACAATACAACACACTCAGGGG&AATTGGCACCAAGAAAAAGGT

GAAACGACTGTTAAGlTTCCMAGATACTTCCATGCATCTAGGCTTCTCCGGGGGAlGTftTACCGCAGGCC

CCTCTCCACGTGCTGGATGAAGACTÁCC^GGACAAGCÁAGGCÁCÁl^CTC^CCrfíÁAGTtGSAAÇSTGGG ACt?TGACArriTC~TGTtTGATTOCTTGACAAAT<»GMGWTCTGGTAACTCTGTKiT5TCACCTCr'r CAACTCCCATGGG^CATCCACCATTTCAAGCTCGATATGGTGACCTTGCACAGGTTTCTGGTTATGGrt

CAGGAAGATTACCACilGTCACAACCCATACCACAATGCrGTTCACGCAGCCGACGTCACGCAGGCCÂTGC actsttacctga^^asccaaagttggc^agcttcctcacacctctggacatcaigcttggactactggc

TGCHGCA.GCTCArGACGTGGACCACCCAGGGGTCMCCAGCCATTTTTGATCAAAACTAACC&CCATCTT

CCCAACCTOTATÇAGÁATATGTCXGTACTGGAGAATCACCACTGOCGATCrACAATTGGCATGCTrCGAG

AATCAC'GGCl'CC'('GGCT'CACTTGCCAAAGGAA.1.TGACACAGGATATCGAACAGCAGCrtXGCTCCCrCAT

CCTSGCCAí^GATATGAACAGACAGAAmm^TCmCCCGCTtftAftAGCTCACefCÇACAATAAAGAT

TrGAGACTGGftGÁÁTOTÁCAGGACAGACACTTTATC-CTTCAGATCGCCTTGAAGTGTGOTGACATTTGCA

ATCCTTOTCGtArCTG&SAGATaAGCMGCAGTGGAGTGÍiAAGGGrCTGTGAGGAATrçTACAGACftAGG

TOACCTTSAACAõAASTTTGAACTGGAAAXCAGTCCTCTtTGTAAiCAACAC<AAAGATtCAATCCCTAGC

ATACAMTXCremCÍLTGACTTACATCGTCCAGCCGCTSTTCCGGGAGTGGGCCÇGGXTTAÇTGGGAACA GCACCCT3TCGGAGAACATGCTAAGCCATCTC3CeCACAACAAAGCCCAGT3ÔAAGAGCCXGCXGTCCiUl

TCAGC^C^ACSCAGGG3C^CG0CCAGGACCTGGCGGGCCXCGCACCTGAGACCCTGGAGC3VGACSiGAA seog

GGTO-CCACGCCCTAAGGTAGCCGTCTGCXGATGCACGCCCATCTGTCCC-TCCAOlGGAGCACGGCCAyCC

Ç:TCCGACTGCCCTCG'GAACAAGC0GA?CACGCTGGGTTTCGATGCCATCCGCCTGCCACTTACCGCCTGC

CTtCGTTGAXCCAAGTGTACAAAAGCCATrGTCACCTCAGCAXTAGCTGCCSAAATGGGCGGCTCTATCC

CGTCATmAGCrGATTCTGGGGCGGCTGCCCCAACCGAAACGCCtGGAACtTAAGAAAGGGGTGCTrCTG

CCGXGTXCGCCTCTGGCCCTTGGTCACGCTGACTGGCAGXAGCTCCTAAGTCCÀGASCATTITAACGTTT

GCCAXCGGACAGCTGACCTGCATGACÍACCAGCÃTACTTGGAãCTGCAAÃACÍGGXCTíGOSXGCCAGAGC ACAAACGAGAGTGtG^AGAAAGTACCTrCríATrrTAATAATAATTATtATTATAAAATAATAAATC-m

TXMCTfXTATAXTTCATGCACCAGACAATGGGXCtAAAACTXTGGÃCâAGtA&TACfCtGCGTACCCAA ACCTAAGAGGGGGTTCATTATTTTGCXàTXGACÍ^AXSGCACAXTGGGTCGGAGAXGXGGCACCATTGÇ

GATtTCTGAAACCACGCGTCGCCTCCCAXCTGGT&GAA^TGCTGTACAGCÇCGTCÇCTTTGCACCGtTA

GCCAAi^CGTÇTTTTACSGArrCRGTGACCTQXXTATAXXCACAAGXGTACATTTTCTGTAAATACCAAA CGCTACtGATtvCCCSTSCGAAAAmCAGGAGtA-i^AíGGGATTGCTXCCTGTArAAACM-fôGCACTGtG MCAGAATACtGmGTTtTAATACAAGAGAAXGCAXXtGTAíumXGGTAtAGASTnATTAATATACT GTTGtXC0CAOAíAAAÔGCOTAAOTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAASAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGG CGGCCGaCTACAGGATCCCfÇGAGGGGCCCAAGCrTACGCGTGCATGCGACffrCATAGCTCICTCCCfA TASTGAGTCSTAmTAAGCTAG 1S23 70 5.40 250 280 350 420 430 560 530 700 770 840 910 980 5050 1120 1190 1260 1330 1400 1470 1540 1610 1680 1790 1820 1890 1960 2030 2100 2170 2240 2310 2380 2450 2S20 2590 2660 2730 2800 123 SEQ ID NO: 8

CGGAATTCGATGCACXGCAGCAGGCrCGGCTCTGTCCCAGCACTTGTCTGGGAGAAAAGTGGTGTTACTC

ACCCAGGGAGAGTCTCTCTTtCTACCTTCCTTCTTTCTCGATCTCCITGTGTGCTTTTGTOíTTCrTTAT

TXCrrTTCCXTÍXTXTTCTTTTXTXT7XTFGTTACTTAA2TATATTCCTMTCCXCK3ATGAAGTT6CTGG

ArrCTGCAGCACAAGTCrirArGMCAAGCAGCACCGCfaiGAGATTTCACGGCATTOiAAGGrCACAGA sfcart &CTGCO.CTATGGTTAAATOTCTTGTrTAATGGTTOAGA5GTGTQGCOAAATCTTGTrrGAGAACCCa3A TCAGAATGCCAAAlOTGTmCAlGCTGGGA&mtACGACTMGGGGfCAGACGGGSGtTCGTGCTGAA CGCCCTGCCTCCTACCCATTCATTGACTTCCGCCTACTTMCàeTACA&CAirACTCAC-GGGAGA-rraGCA CCMGAAAAAGGTGAAAAGACTATTftAS CTTTCAAAGAXACTÍ^CATGCATCAAGGCTG CTTCGXGGAAT TATACCACAAGCCCCTCTGCACCTGCTQGATGAAQã.CTACCTT<3GACAAKCAAGGCATATGCTCTCCAAA STGGGAATGTGGGATTTTGAC.ATtlTCTTGTTrGATÇGCTTGACAM.TGGAAA.CAGCCTGGTAACACTGT TGTGCC^CCTCTTCAAXACCCATGGACTCATTCACCATTTCAAGTXAOATATGGTGACCTTACACCGATX TTTAGTCATGGTTCAAGAAGATrACCACAGCCAAAftCCCGTATCACAATGCTGTTCACGCAGCCGACGTC ACCCAGGCCATGCACTGCXAC<r^SAAÀGAGCCAAAGCTrGCCAGCXTCUCACGCCTCXGGACATCAXGÇ ttggactgctggctgcagcascacacgatgtsgaíkãccc&ggggtgmccagcc&.tttttgataaaaac

TAACCACCATCTXGCAAACCXATÀXCAGAATAXGTCTGTGCTGOAGhATCAXCACXGGCGATCTACAATT stop

GGCAXGCTTCGAGAATCAAGGCFFCTTGCTCATTTGCCAAAGGAAATGRCGTJ^TGCTGCCGAGATGAA ACATACTGATGTGrATGCAGTAAAGA?AAGCGACTÍ*rCTGTAGGGCAGGCrrGGGACCTrrTGC5TC>AAt

GGCAGAG&OCCCCCCGGCTGTACTTCCTSCCTGCACrGAGCTGTCTATCAGAGGAGATTTGGTGTCAGTT

ACAGCAACCCAGAAACCAAAATCTCrCTGTG-rGCTTTGAAAGGGCCrTGCAGAGTCAATGACCTACAGTC

AGGAAftAGGGATAATAAACAGCTerCACrrTTCACftCGaTCACTAtCftGTGCTCAACTTTGCCAAATTC

CCGACCTTTAGTTTAGCAAAATTGTCGTTCCA.TGTAGCTCCAAATAGTAAATATTTAXCAAGAAGGAACC

a>3GCATXCTAAAaCTAGAGTtCAAMAAGTATATTTTGTAATTGCTAGTC?CAGCAAAAATAGAAGTCA GAAATTCTTTTCTAAAATGTCTTITGCTAAGTAATTGAAATGGCCXTAGCATTXTTTXCACCAATtAATX'

TACCTXACGTCTCTTGCACTTTAAACAGAAGGGGAGACACXCAXTXTCTGGTXCACTATXTGAXAGCCAT ggxaxgxaggcxgasxcccacxaaatcxgaggcxaxxgxtxcaxttxcctggxggccccâagtxascxgc xa&tacxgtctxccaaggccaccaxxaattcxgatctgtttaatgaacacgtgcagaacccaagaaaççt

AC-GTOAAAAGAGTACAXÁSAtíCCXÍSXACCCtTCXrCAAGACAAGC&CAtAACXTaAGGTCAAGGACCAA

GTGCTGXCXCCCMCTGAACAAGCAOTAtACTCXGGGTTGTGaATlGAXXCCXGGCCCrCTGATTXGAXC

TCATSCTGTrTCCTAGCACCCAGÁGGMTGTGAAAXTTSCACSGAGGMTrXC^TTCTSATftA&XTXTXA

CTCCCXGGAACTAAATAAAACCAGrrCtCGTGCATGGAATAAAAACrrAtGCCXCTXACXAGAATAATAA AXXGCAAAGATTGAAAGAAUAAAXGCAÃAAAOA&CXAAAAACTAGAGCA&AA&ATCAAOXGAGAAGA&C; a&aagaggaggtsagwgasagacaaggaacíaa&gaaggagmggaaaggaasmtagtgaggacaggaa AGAASAAAAXGCMGGGAMTGGGAAAiSGACTCTGG.SStGACCAGA£rXTCXGCrGGXGftGTACCXGCATX CATCCXGXXXGTTACTCAATATXTCXWCCTAMAlA-rXCAmCACAXCTATaSArrCCM.imAAAAX AXA-m^XAXGXGXCTXTGTGGAACACASXÔmTAAA-TOTXlTXGCCAGAASAàTAAXXíSTXATACAA TAATAmTGTGAAAACrTTAXTACAAAAGCDATTATCAXMXCAX^ATXAXXCCTTCXATCACAGGTAAA XGCXrXAAXGTCAXTTXTCXGATTTTAAAACíTAGGGCAGGTTAAXXGTAGAAAGXAAGGAAAATTCAGGA AAGTGri:AGTTTGAACrATGiGAAGTTGCTCTTTTTAAGGC-CCAAAMC*GGAGACTTXTAGmCTTTCA XAXGTTTCAGCTTCAXAXGAAAGASAAAACTGAAACXGCXAGXAAXCCXGCCAXCCAeGXATAGTXCATG XTAACCXGOCrAGTÍXATTXtCTTXTAGTCTTTTfTCAATACAAACrrATTTTAACAAAAXAXGAXTATA rXXGGGGAACTTATTTrACAGTTTACGTCCTGAAAOTXTXXATrrACAAXAAAGACTmTTCCAAAXCA AAAAAAAAAAAAAAGGGOSGCCGCXCXAGAGGATCCCTCGAGGGGCCCAAGCXTACGCGTGGATGCGàCG XCATAGCXCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAXAAGCTAGGCACTGGCCGTC 2392 SEQ ID NO: 9

Veja-se a fórmula I.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Pfizer Limited Pfizer Inc. <120> Enzimas Fosfodiesterases 70 140 210 280 3S0 420 490 550 £30 700 770 840 no 980 1050 1120 USO 1260 1330 1400 1470 1S40 1610 1680 mo 1820 1S90 1950 2030 2100 2170 2240 2310 2380 2450 2520 25S0 2660 2730 2900 2370 3940 124

<13Ο> Ρ005894ΕΡ CTH <14Ο> ΕΡ 99308902.8 <141> 1999-11-09 <15Ο> GB 9828603.2 <151> 1998-12-23 <150> GB 9922123.6 <151> 1999-09-17 <16Ο> 34 <17Ο> Patent In Ver. 2.1 < 210 > 1 <211> 446 <212> PRT <213> Mus sp. < 4 Ο Ο > 1

Met Ser Cys teu Met Vai Glu ârg Cys Gly Glu Vai Leu Fhe Glu Ser 1 S 10 15

Fro Glu Gin Ser Vai Lys Cys Vai Cys Met Leu Gly Ãsp Vai ftrg Leu 20 2$ 30

Arg Gly Gin Yhr Gly Vai Frc Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Fro Fhe 35 40 45 125

Ile Asp Phe Arg Leu Leu Asn Asn Thr Thr His Ser Gly Glu lie Gly 50 55 60

Thr Lys Lya Lys Vai Lys Arg Leu Leu Ser Phe Gin Arg Xyr Phe His 65 70 75 80

Ala Ser Arg Leu Leu Arg Gly Ile Ile Pro Gin Ala Fro Leu His Leu 85 90 95

Leu Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin Ala Arg His Met Leu Ser Lys Vai 100 105 110

Gly Thr Trp Asp Phe Asp Ile Phe Leu Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly 115 120 125

Asn Ser Leu Vai Thr Leu Leu Cys His Leu Phe Asn Ser His Gly Leu 130 135 140

Ile His His Phe Lys Leu Asp Met Vai Thr Leu His Arg Phe Leu Vai 14S 150 155 160

Met Vai Gin Glu Asp Tyr His Gly His Asn Pro Tyr His Asn Ala Vai 165 170 175

His Ala Ala Asp Vai Thr Gin Ala Met His Cys Tyr Leu Lys Giu Pro 180 185 190

Lys Leu Ala Ser Phe Leu Thr Pro Leu Asp Ile Met Leu Gly Leu Leu 195 200 205

Ala Ala Ala Ala His Asp vai Asp His Pro Gly vai Asn Gin Pro Phe 210 215 220

Leu Ile Lys Thr Asn His His Leu Ala Asn Leu Tyr Gin Asn Met Ser 225 230 235 240

Vai Leu Glu Asn His His Trp Arg Ser Thr lie Gly Met Leu Arg Glu 245 250 255 126

Ser Arg Leu Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Met Thr Gin Asp Ile Glu 260 265 270

Gin Gin Leu Gly Ser Leu Ile Leu Ala Thr Asp Ile Asn Arg Gin Asn 275 230 265

Glu Phe Leu Thr Arg Leu Lys Ala His Leu His Asn Lys Asp Leu Arg 250 295 300 Lôu Glu Asn Vai Gin Asp Arg His Phe Met Leu Gin Ile Ala Leu Lys 305 310 315 320

Cys Ala Asp Ile Cys Asn Pró Cys Arg Ile Trp Glu Met Ser Lys Gin 325 330 335

Trp Ser Glu Arg Vai Cys Glu Glu Phe Tyr Arg Gin Gly Asp Leu Glu 340 345 35Q

Gin Lys Phe Glu Leu Glu Ile Ser Pro Leu Cys Asn Gin Gin Lys Asp 355 360 365

Ser Ile Pro ser Ile Gin Ile Gly Phe Met Thr Tyr Ile Vai Glu Pro 370 375 380

Leu Phe Arg Glu Trp Ala Arg Phe Thr Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu 385 390 395 400

Asn Met Leu Ser His Leu Ala His Asn Lys Ala Gin Trp Lys Ser Leu 405 410 415

Leu Ser Asn Gin His Arg Arg Arg Gly Ser Gly Gin Asp Leu Ala Gly 420 425 430

Pro Ala Pro Glu Thr Leu Glu Gin Thr Glu Gly Ala Thr Pro 435 440 445 127 <210> 2 <211> 1341 <212> ADN <213> Mus sp. < 4 Ο Ο > 2 atgtcttgfcfc taatggttga gaggtgtggc gtcaaafcgtg tttgcatgct aggagatgta gaacgeegtg gctcctacce attcattgac ggggaaattg gcaecaagaa aaaggtgaaa gçatctaggc ttctcegggg gattataccg taccttggac aagcaaggca eatgctctcc tfcgtttgatc gcttgacaaa tgggaãcagt tcccatgggc tcatccacca tttcaagctc atggttcagg aagattacca cggtcacaac gtcacccagg çeatgeactg ttaectgaag ctggacatca tgcttggact actggctgca aaccagccat ttttgatcaa aactaaccac gtactggaga atcaccactg gcgatctaca gctcacfcfcgc caasggaaat gacacaggat gccacggata tcaacagaca gaatgagttt aaagafcttga gactggagaa tgtacaggac tgtgctgaca tttgcaatcc ttgtcgtatc gt.ctgtgagg aattctacag aoaaggtgac cctstttgta attfâaeagaa agattcaatc atcgtggagc cgctgttccg ggagtgggcc aacatgctaa gccatctcgc geacaacaaa cacagacgca ggggcagcgg ccaggacctg acagaaggtg ceacgcccta a

<210> 3 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens gaagtcttgt ttgagagccc tgaacagagt 60 egactaaggg gfccagacggg ggetcctgcc 120 ttccgcctac ttaacaatae aacacâctca 180 cgactgttaa gtttccaaag atacttccat 240 caggcccctc tccacctgct ggatgaagac 300 aaagttggaa cgtgggactt tgacattttc 360 ctggtaactc tgttgtgtca cctcttcaac 420 gatatggtga ccttgcacag gttfcctggtt. 480 ccataccaca atgctgttca cgcagccgac $40 gagçeaaagt tggeaagctt cctcacacct 600 gcagcfccatg acgtggacca eceaggggtc 660 catcfctgcca açctgtatea gaatatgtct 720 afctggcatgc ttcgagaatc ãcgqctcctq 780 atcgaacagc agctgggctc cctcatcttg 840 ctgacccget taaaagctca cctccacaat 900 agaçacttta tgcttcagat cgccttgaag 960 tgggagatga gcaagcagtg gagtgaaagg 1020 cttgaacaga agtttgaact ggaaatcagt 1080 cctagcatac aaattggttt eatgacttac 1140 cggtttactg ggaacagcac cctgtcggag 1200 gcccagtgga agâgcotgct gtccaatcag 1280 gçgggccccg cacctgagac cctggagcag 1320 1341 <400> 3

Met Ser Cys Lm Met Vai Glu Arg Cys Gly Glu II® Leu Phe Glu Asn 1 S 10 IS 128

Pro Asp Gin Asn Ala Lys Cys Vai Cys Met Leu Gly Asp Ile Arg Leu 20 25 30

Arg Gly Gin Thr Gly Vai Arg Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Phe 35 40 45 lie Asp Phe Arg Leu Leu Asn Ser Thr Thr Tyr ser Gly Glu lie Gly 50 55 60

Thr Lys Lys Lys Vai Lys Arg Leu Leu Ser Phe Gin Arg Tyr Phe His 65 70 75 80

Ala Ser Arg Leu Leu Arg Gly lie 85

Leu Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin 100

Gly Met Trp Asp Phe Asp Ile Phe Π5 120

Asn Ser Leu Vai Thr Leu Leu Cys 130 135

Ile His His Phe Lys Leu Asp Met 145 150

Ile Pro Gin Ala Pro Leu His Leu 90 95

Ala Arg His Met Leu Ser Lys Vai 105 110

Leu Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly 125

His Leu Phe Asn Thr His Gly Leu 140

Vai Thr Leu His Arg Phe Leu Vai 155 ISO

Met Vai Gin Glu Asp Tyr His Ser Gin Asn Pro Tyr His Asn Ala vai 165 170 175

His Ala Ala Asp Val Thr Gin Ala Met His Cys Tyr Leu Lys Glu Pro 180 185 190

Lys Leu Ala Ser Phe Leu Thr Pro Leu Asp Ile Met Leu Gly Leu Leu 185 200 205

Ala Ala Ala Ala His Asp Val Asp His Pro Gly vai Asn Gin Pro Phe 210 215 220 129 129 Leu Ile Lys Thr Asn His His Leu Ala Asn Leu Tyr Gin Asn Met Ser 225 230 235 240 Vai Leu Glu Asn His His Trp Arg Ser Thr Ile Gly Met Leu Arg Glu 245 250 255 Ser Arg Leu Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Met Thr Gly Thr Trp Asp 260 265 270 Phe Asp Ile Phe Leu Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly Asn Ser Leu Val 275 280 285

<210> 4 <211> 807 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 4 atgtcttgtfc taatggfctga gaggtgtggc gaaatcttgt fctgagaaece egatcagaat 60 gcscaaafcgtg tttgcatgct gggagafcata cgactaaggg gtcagacggg ggttcgfcget 120 gaacgccgfcg gcfccctaece afctcattgac ttccgcctac ttaacagtac aaoatactca ISO ggggagattg gcaccaagaa aaaggtgaaa agactattaa gctttçaaag atacfctccat 240 gcatesaggç tgcttcgtgg aafetatacca caaçrcccete tgcacctgct ggatgaagac 200 taccfctggac aagcaaggca tatgctctcc aaagtgggaa tgtgggatfct tgac&ttttc 360 ttgtttgatc gcttgacaaã tggaaacagc ctggtaacac tgttgtgcca cctcttcaat 420 acccatggac tcsttcacea tttcasgtta gafeatggtga ccttacaeszg atttttagfcc 400 atggttcaag aagattacca cageeaaaao cogtatcaca atgetgttca cgcagccgac 540 gtcacccagg ccatgcactg ctacctgaaa gagecaaagc ttgccagctt cctcacgcct. 600 ctggacatca tgcttggact gctggctgca gcagcacacg atgtggacca cccaggggfcg 660 aaccagccat fctttgataaa aactaacoac catcttgcaa acctatatca gaatatgtct 720 gtgctggaga atcatcacfcg gcgatctaca atfcggcatgc ttcçagaatc aaggcttctt 780 gotcatttgc caaaggaaat gacgtaa 807

<210> 5 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 130

Met Ser Cys Leu Met Vai Glu Arg Cys Gly Glu Ile Leu Phe Glu Asn 15 10 15

Pro Asp Gin Asn Ala Lys Cys vai Cya Met Leu Gly Asp Ile Arg Leu 20 25 30

Arg Gly Gin Thr Gly Vai Arg Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Phe 35 40 45

Ile Asp Phe Arg Leu Leu Asn Ser Thr Ihr Tyr Ser Gly Glu Ile Gly 50 55 50

Thr Lys Lys Lys Vai Lys Arg Leu Leu Ser Phe Gin Arg Tyr Phe His 65 70 75 80

Ala Ser Arg Leu Leu Arg Gly Ile Ile Pro Gin Ala Pro Leu His Leu 85 90 95

Leu Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin Ala Arg His Met Leu Ser Lys Vai 100 105 no

Gly Met Trp Asp Phe Asp Ile Phe Leu Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly 115 120 125

Asn Ser Leu Vai Thr Leu Leu Cys His Leu Phe Asn Thr His Gly Leu 130 135 140 ile His His Phe Lys Leu Asp Met Vai Thr Leu His Arg Phe Leu Vai 145 ISO 155 160

Met Vai Gin Glu Asp Tyr His Ser Gin Asn Pro Tyr His Asn Ala Vai 165 170 175 131 ais Ma Ala Asp vai Thr Gin Ala Met His Cys Tyr Leu Lys Glu Pro ISO 18S 19°

Lys Leu Ala Ser Phe Leu Thr Pro Leu Asp He Met Leu Gly Leu Leu 195 200 205

Ala Ala Ala Ma His Asp Vai Asp His Pro Gly Vai Asn Gin Pro Phe 210 215 220

Leu Ile Lys Thr Asn His His Leu Ala Asn Leu Tyr Gin Asn Met Ser 225 230 235 240

Vai Leu Glu Asn His His Trp Arg Ser Thr lie Gly Met Leu Arg Glu 245 250 255

Ser Arg Leu Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Met Thr Gin Asp Ile Glu 260 265 270

Gin Gin Leu Gly Ser Leu Ile Leu Ala Thr Aap Ile Asn Arg Gin Asn 275 280 285

Glu Phe Leu Thr Arg Leu Lys Ala His Leu His Asn Lys Asp Leu Arg 290 295 300

Leu Glu Asp Ala Gin Asp Arg His Phe Met Leu Gin Ile Ala Leu Lys 305 310 315 320

Cys Ala Asp Ile Cys Asn Pro Cys Arg Ile Trp Glu Met Ser Lys Gin 325 330 335

Trp Ser Giu Arg Vai Cys Glu Glu Phe Tyr Arg Gin Gly Glu Leu Glu 340 345 3S0

Gin Ly3 Phe Glu Leu Glu Ile Ser Pro Leu Cys Asn Gin Gin Lys Asp 355 360 365

Ser Ile Pro Ser lie Cln Ile Gly Phe Met Ser Tyr Ile Vai Glu Pro 380 370 375 132

Leu Phe Arg Glu Trp Ala His Phe Thr Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu 385 390 395 40c

Asn Met Leu Gly His Leu Ala His Asn Lys Ala Gin Trp Lys Ser Leu 405 410 41S

Leu Pro Aro Gin His Ar<3 Ser Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Pro ftsp 420 42S 430

His Asp His Ala Gly Gin Gly Thr Glu Ser Glu Glu Gin Glu Gly Asp 435 440 445

Ser Pro 450

<210> 6 <211> 1353 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 133 atgtcttgtt taatggttga gaggtgtggc geçaaatgtg tttgcatgct gggagatata gaacgcegtg gctcctaccc attcafctgac ggggagattg gcaccaagaa aaaggtgaaa gcateaaggc tgcttcgtgg aattataeca fcaccttggac aageaaggea tatgctctcc fcfcgtttgatc gctfcgacaaa tggaaacagc acccatggac tcattcacca ttteaagtta atggttcaag aagattacea cagccaasaç gtcacecagg ccatgcactg otacctgaaa ctggacatca tgcttggact getggetgca aaccagecat ttttgataaa aactaaccac gfcgetggaga atcatcactg gcgatctaca gctcatfctgc caaaggaaat g&cacaggat gcaacãgaca tcaacaggca gaatgaattt aaagacttaa gactggagga tgcacaggac tgtgctgaca ttfcgcaat.cc fcfcgtagaatc gtctgfcgaag aattcfcacag gcaaggfcgaa cctctttgta atcaaeagaa agattccatc atcgtggagç cgcfcctteeg ggaatgggcc aacatgetgg gccacotcgc acacaacaag cacagaagca ggggcagcag tggcagcggg gagagcgagg agcaggaagg cgacagcccc <210> 7 <211> 2823

<212> ADN <213> Mus sp. gaaafccttgfc fcfcgagaaccc egafccagaat 60 cgactaaggg gfccagacggg ggttegtgct 120 ttçcgcctac fcfcaacagtac aacatacfcca 180 agactattaa gctfcfccaaag atactfcccat 240 caagcccctc tgcaccfcgct ggatgaagac 300 aaagtgggaa tgtgggattt tgacattfctc 360 ctggtaacac tgfctgtgcca cctcttcaat 420 gafcatggtga ccttacacçg atfctfcfcagte 480 ccgtafccaca afcgcfcgttca cgcagccgac 540 gagccaaagc tfcgecagcfct cetcaegecfc 600 geagcacaçg atgtggacca ceeaggggtg 660 catcfctgcãã acctatatca gaatafcgtct 720 attggcafcgc ttcgagaate aaggcttctt 780 attgaacagc agctgggctc cttgatcttg 840 ttgaccagat tgaaagctca cctccacaat 900 aggcacttfca tgcttcagat çgccttgaag 960 tgggagafcga gcaagcagfcg gagtgaaagg 1020 cfctgaacaga aatttgaact ggaaatcagt 1080 cctagtatae aaafctggtfct cafcgagcfcac 1140 cafcfctcacgg gfcaacagcac cctgtcggag 1200 gcççagfcgga agagcctgtt gccçaggcag 1260 cctgaccacg accacgeagg ccaagggact 1320 tag 1353 <400> 7 134 aggtacgcct geaggtaccg gtceggaatt cççgggtcga cccacgcgtc cggccagcet 50 cccaggccgg cfcgeetgctc aeccagecag tegctagctc tgggcactgc agcaggctcg 120 gctctgtcee agcgctccct tgcttgctcg ctcgctcggc tgggagaaaa gtggtgtCCt ISO cgcecagaga gcctçtctct ccctfeccttc tttctegagc tctctgagtc cttfcggcgtt 240 tctttctttc tfetccttttt tttttttttt taatatttfcc tttfetçfcttc tataaaactfe 300 gcataattat actgctaatc ctggatgagg ttgctggatt ctgcágcaca aatcttcatg 360 aacaagccgc accgctcagâ gatttcae&g cattcaaagg tcacaga&ct gccactatgg 420 ttaaatgtct fcgttt&atgg tfegagaggtg tggcgaagfcc ttgxttgaga qccctgaaca 480 gagtgtcaaa tgtgtttgca tgctaggaga tgtacgaeta aggggtcaga cgggggttce 840 tgccgaacgc cgtggeteefc aççcattcat tgacfcfceegt etacttaaca afcaeaacaca 600 ctcaggggaa att-ggcacca agaaaaaggt gaaacgactg ttaagtttce aaagatactt 660 eeatgeatct aggcttctcc gggggattat accgcaggcc cctctecacc tgctggatga 720 agactacctt ggaea&gcaa ggcacatgct ctccaaagtt ggaaegtggg actttgacat 780 tttettgfctt gatcgcttga caaatgggaa eagfcctggta actctgfctgt gtcacctett 840 caactcccat gggctcatcc accatttcaa gotcgatatg gtgaccttgc acaggtttct 900 ggttàtggtt caggaagatt accacggtta çaacccâtac cacâãtgctg ttcacgçagc 960 cgacgtcacc caggccatgc actgttacct gaaggagcca aagttggcaa gettectcae 2020 accfcctggac ateatgettg gactactggc tgcagcagct eatgacgtgg aceaccoagg 1080 ggtçaaccag cGatttttga tcaaaactaa ccaccatctt gccaacctgt atçagaatat 1140 gtctgt.acfcg gagaatcacc acfcggcgatc tacaafctggc atgcttcgag aatcacggct 1200 cctggctcâc ttgccaaagg aaatgacaea gg&tatcgaa cagcagctgg gctccetcat 1260 cttggccacg gatateaaca gacagaatga gtfctctgaec cgcttaaaag etcacctcca 1320 135 caafcaaagafc tfcgagactgg agaatgtaea gaagtgtgct gacatttgea âtgçttgtçg aagggtctgt gaggaafctet acaçacaagg cagtcetett tgtaatcaâc agaaagafetc fctacatcgtg gagccgctgt tccgggagtg ggagaacatg staagceatc tcgcgcacaa tcagcâcágà cgcaggggca geggecâgga gcagacagaa ggtgccacgc cctaaggtag ccacaggagc acggeeatce gtccgactgc gatgccatce gcctgccact taecgcctcc gfccaceteag cattagctgc cgaaatgggc gggcggctgc cccaaccgaa acgcctggaa ctçtggccefc tggtcacgct gactggcagt gccatcggae agctgacctg cafcgacacca gtgccagagc acaaacgaga gtgtgãgagâ ttataaaatâ átaaatçttt ttáaetttfca ctttggãcaa gtaatactct gcgtaeecaa gactetatgc cacattgggt ecgagatgtg ccctcccafec tggfeggaagg tgçtgtacag cttttaogga ttcagtgaco tgtttatatt egçtactgat teecatgcca aaatacacga tggcactgtg aacagaatac tgttagttfct atagagttta ttaatatact gttgttcgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagggg caagcttacg cgtgcatgeg acgtcatagc tag ggacagacac ttfcatgcttc agatcgcctt 13S0 tatctggçag afcgagcaage agtggagtga 1440 tgaccttgaa cagaagtttg aactggaaat 1500 aatccctagç afeacaaattg gtttcatgae 1560 ggcccggttt àctgggaacra gcacccfcgtc 1620 caaagsecag tggaagagcç tgetgtccaa 1680 cctggcgggc ccegcacctg agacecfcgga 1740 ctgtctgctg afcgcacggcc atgtçftcogt 1800 cctcgcaaca agccc&tcag gçtgggtttc 1860 cttcgttgat ccaagtgtac aaaageeafct 1920 ggctctatcc cgtcattgga gctgattctg 1980 gtaagaaagg ggtgcttctg ccgtgttcge 2040 agctcçtaag tecagagcafc tttaacgttt 2100 gcatacttgg aactgcaaaa ctggtcttgc 2160 aagtaccfctc tattttaata ataattatta 2220 tatttcatgc accagacaat gggtctaaaa 2280 acctaagagg gggttcatta ttttgctatt 2340 gcaccattgc gatttctgaa accaCgcgtc 2400 cccgtccctt tgeaçcgtta gcca&tccgt 2460 cacaagtgta cattttctgt aaataccaaa 2520 gtattatggg attgctacct gtataaacaa 2580 aataoaagag aatgcatttg taaatafcggt. 2640 gataaaggcc ttaaotttaa aaaaaaaaaa 2700 cggccgctct agaggatçcc tcgaggggcc 2760 tctcfccccta tagtgagtçg tattatãage 2820 2823 <210> 8 <211> 2992 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 136 cggaattcga tgcactgc&g caggctcggc tctgtcccag cacttgtctg ggagaaaagt 60 ggtgttacte acccagggag agfcctetcfct tctaccttec ttctttctcg atctcefctgt 120 gtgcttttgt gtttctttat ttcttttcct tttttttctt tfctttttttt gttacttaat 180 fcafcattccta atcctggafcg aagttgçtgg attctgcagc aeaagtettc atgaacaagc 240 137 agcaccgctc agagatttca cggcattcaa aggtcaeaga actgcCaCta tggttaaatg 300 tcttgtttaa tggttgagag gtgtggcgaa atcttgtttg agaaccccga tcagaatgcc 350 aaatgtgttt gcatgctggg agatatacga ctaaggggtc agacgggggt tcgtgcfcgaa 420 cgccgtggct cctacccatt cattgacttc cgcctactta acagtacaac atactcaggg 480 gagattggca ccaagaaaaa ggtgaaaaga ctattaagct ttcaaagata cttccatgca 540 tcaaggctgc ttcgtggaat tataccacaa gcccctctgc aectgetgga tgaagactae 600 cfctggacaag caaggeatat gctctccaaa gtgggaatgt gggattttga cattttcttg 660 tttgatcgct tgacaaatgg aaacagcctg gtaacactgt tgtgccacct cttcaatacc 720 catggactca ttcaccattt caagttagat atggtgacct tâcaccgatt tttagtcatg 780 gtteaagaag attaccacag ccaaaacccg tatçacaatg ctgttcacgc agccgacgtc 840 acceaggcca tgcactgeta cetgaaagag ccaaagcttg ccagcttcct cacgcctctg 900 gacatcatgc ttggactgct ggctgeagea gcacacgatg tggaccaccc aggggtgaac 960 cagccatttt tgataaaaac taaccaccat cttgcaaacc tatatcagaa tatgtetgtg 1020 ctggagaatc atcactggcg atctacaatt ggcatgcttc gagaafccaag gcttcttgct 1080 catttgccaa aggaaatgac gtaagtgctg ccgagatgaa acatactgat gtgcatgcag 1140 taaagataag ccactttctc tagggcaggc ttgggacctt ttgegtgaat ggcagagage 1200 cccccggctç tacttcsefcgc ctgeactgag ctgtctatca gaggagattt ggtgtcagtfc 1260 ac&gcaaccc agaaaccaaa atctctetgt gtgctttgaa agggccttgc agagtcaatg 1320 acctacagtc aggaaaaggg staataaaea gctctcagtt ttcacacgct tcagtatcag 1380 tgcteaaett tgccaaattc ccgaccttta gtttagcaaa attgtccttc catgtagctc 1440 caaatagtaa atatttatca agaaggaacc caggcattct aaagctagag ttcaaaaaag 1500 tatattttgt aattgctagfc ctcagcaaaa atagaagtca gaaafctcttt tctaaaatgt 1560 cttttgctaa gtaattgaaa tggccctagc atttttttca ccaattaatt taecttacgt 1620 ctcttgcact ttaaacagaa ggggagacac tcattttctg gttcactatt tgatagccat 1680 ggtatgtagg ctgagtccca ctaaatctga ggccattgtt tcattttcct ggtggcccea 174Q agttagctgc taatactgtc ttccaaggcc accattaatt ctgatctgtt taatgaacac 1800 gtgcagaacc caagaaacct aggtgaaaag agtacataga ttgctgtacc cttcttcaag 1860 acaagcacat aacfctgaggt caaggaccaa gtgctgtete ccaactgaac aagcagtata 1920 ctctgggttg tggattgatt ectggccctc tgatttgatc tcatgotgtt tcctagcacc 1980 cagaggaatg tgaaatttgc aggaggaatt tcagttctga taaattttta ctccctggaa 2040 ctaaataaaa ccagfctctcg tgcatggaat aaaaacttat gcotettact agaataataa 2100 âttgcaaaga ttgaaagaat taaatgcaaa aagaactaaa aactagagca aaagatcaag 2160 tgagaagaag aaaagaggag gtaaggagag agacaaggaa gaaagaagga gaaggaaagg 2220 aagaatagtg aggacaggaa agaagaaaat gcaagggaaa tgggaaagga ctctggggtg 2280 accagacttc tcctggtcag tacctgcatt cafccctgttt gttactcaat atttctttcc 2340 taaaatattc atttcacatc tatggattcc aatgaaaaat atatttttat gtgtctttgt 2400 ggaacaeagt gttataaatt gtttttgcca gaagaataat tgttatacaa taatatatgt 2460 gaaaacttta ttacaaaagc eattatcata atcattatta ttccttctat cacaggtaaa 2520 138 138 gtagggeagg traattgtâg «aagtaagga 2 $60 tgaagttgct ctttttaagg gocaaaaaca 2640 cttgatatga aagagaaaac cgaaactgct 2700 ttaaecfcgge tagttfcafcfct tcfctttagtc 2760 fcatgattata tttggggaae ttattttaca 2820 aaagaetttt ttccaaatca aaaaaaaaaa 2880 aggggcccaa gettaegcgt gcatgcgacg 2940 fcataagctag gcactggccg tc 2992 tgcfctfcaatg tcatfcfcttcst gattttaaaa aaattcagga aagtgfctagt ttgaactatg ggagaçfcttfc agcactttcâ tafcgtttcag agtaatcctg ccatçcaggt afcagtfccatg ttttttcaat acaaacfctat tttaacaaaa gtttacgteç tgaaattttt tatttacaat aaaagggcgg ccgctctaga ggatccctcg tcatagctct ctecctatag tgagtcgtat

<210> 9 <211> 413 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Qualquer sequência peptidica ou aminoácido Z1 - Z26 pode ser separado de outra de tais sequências peptídicas ou aminoácido Zl - Z26 por uma sequência peptidica ou um resíduo de aminoácido adequado. <220> <223> Fórmula I <220> <221> LOCAL <222> (1) . . (11) <223> Zl <220> <221> LOCAL <222> (12)..(14) <223> Z2 <220> <221> <222> <223> LOCAL (15) Z3 <220> 139

<221> LOCAL <222> (16) <223> Ζ4 <220> <221> LOCAL <222> (17) . . (24) <223> Ζ5 <220> <221> LOCAL <222> (25) . . (32) <223> Ζ6 <220> <221> LOCAL <222> (33) . . (48) <223> Ζ 7 <220> <221> LOCAL <222> (49) . . (50) <223> Ζ8 <220> <221> LOCAL <222> (51) . . (104) <223> Ζ9 <220> <221> LOCAL <222> (105) . . (130 <223> Ζ10 <220> <221> LOCAL <222> (131) . . (156 <223> Zll <220> <221> LOCAL <222> (157) . . (255 <223> Z12 <220> <221> LOCAL 140 <222> (256) . . .(293) <223> Ζ13 <220> <221> LOCAL <222> (294) . , .(334) <223> Ζ14 <220> <221> LOCAL <222> (335) . . (362) <223> Ζ15

<220> <221> LOCAL <222> (363) . . , (373) <223> Ζ16 <220> <221> LOCAL <222> (374) . . , (385) <223> Ζ17 <220> <221> LOCAL <222> (386) . . . (398) <223> Ζ18 <220> <221> LOCAL <222> (399) . . . (401) <223> Ζ19 <220> <221> LOCAL <222> (402) . . . (404) <223> Ζ20 <220> <221> LOCAL <222> (405) <223> Ζ21 <220> <221> LOCAL 141 <222> (406) <223> Ζ22 <220> <221> LOCAL <222> (408) <223> Ζ23 <220> <221> LOCAL <222> (409) <223> Ζ24 <220> <221> LOCAL <222> (411) <223> Ζ25 <220> <221> LOCAL <222> (413) <223> Z26 . (407) . (410) .(412) < 4 0 0 > 9 142 Môt Ser Cys teu Met Vai Glu Arg Cys Gly Glu Leu Phe Glu Pro Gin

! 5 10 IS

Lys cys Vai Cys Met Leu Gly Asp Arg Leu Arg Gly Glu Thr Gly Vai 20 25 30

Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Phe Xle Asp Phe Arg Leu Leu Asn 35 40 45

Thr Thr Ser Gly Glu li© Oiy Thr Lys Lys Lys Vai Lys Arg Leu Leu SQ 55 60

Ser Phe Gin Arg Tyr Ph© His Ala Ser Arg Leu Leu Arg Gly 11© II© 65 70 75 80

Pro Gin Ala Pro Leu His Leu Leu Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin Ala 85 00 95

Arg Bis Met teu Ser Lys Vai Gly Trp Asp Phe Asp Ile Phe Leu Phe 105 100 110 143

Asp Arg Leu Thr Asn Gly Asn Ser Leu Vai Thr Leu Leu Cys tíis Leu 115 120 125

Phe Asn His Gly Leu lie His Kis Phe Lys Leu Asp Met Vai Thr Leu 130 135 140

His Arg Phe leu Vai Met Vai Gin Glu Asp Tyr His Asn pro Tyr His 145 150 155 £go

Asn Ala Vai His Ala Ala Asp Vai Thr Gin Ala Met His Cys Tyr Leu 165 170 175

Lys Glu Pro Lys Leu Ala Ser Fhe Leu Thr Pro Leu Asp Ile Met Leu ISO 18$ 100

Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala His Asp Vai Asp His Pro Gly Vai Asn 195 200 205

Gin Pro Phe Leu Ile Lys Thr Asn His His Leu Ala Asn Leu Tyr Gin 210 215 220

Asn Met Ser Vai Leu Glu Asn His His Trp Arg Ser Thr Ile Gly Met 225 230 235 240

Leu Arg Glu Ser Arg Leu Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Met Thr Gin 245 250 255

Asp Ile Glu Gin Gin Leu Gly Ser Leu Ile Leu Ala Thr Asp Ile Asn 260 265 270

Arg Gin Asn Glu Phe Leu Thr Arg Leu Lys Ala His Leu His Asn Lye 275 280 285

Aap Leu Arg Leu Glu Gin Asp Arg His Phe Met Leu Gin Ile Ala Leu 290 295 300

Lys Cys Ala Asp Ile Cys Aan Pro Cys Arg Ile Trp Glu Met Ser Lys 315 320 305 310 144

Gin Trp Ser Glu Arg Vai Cys Glu Glu Phe Tyr Arg Gin Gly Leu δία 325 330 335

Gin Lys phe Glu Leu Glu He Ser Pro Leu cys Asn Gin Gin Lys Asp 340 345 350

Ser Xle Pro Ser Ile Gin lie Gly Phe Ket Tyr xle Vai Glu Pro Leu 355 360 365

Phe Arg Glu Trp Ala Phe Thr Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu Asn Met 370 375 380

Leu His Leu Ala His Asn Lys Ala Gin Trp Lys Ser Leu Leu Gin His 385 390 395 400

Arg Arg Gly Ser Asp Ala Gly Glu Glu Gin Glu Gly Pro 405 410

<210> 10 <211> 437 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220>

<221> LOCAL <222> (12, 16, 18, 20, 29, 38, 55, 58, 113, 140, 167, 305, 347) <223> Xaa é seleccionado independentemente entre uma sequência peptidica ou um aminoácido adequado. 145 <220>

<221> LOCAL 433, uma <222> (376,388, 401, 415, 419, 423, 425, 428, 430, 436) <223> Xaa é seleccionado independentemente entre sequência peptídica ou um aminoácido adequado. <220> <223> Fórmula II <400> 10 146

Met S®r Cys Leu Met Vai Glu Arg Cys Giy GXu Xaa Leu Pha Glu Xaa X S 10 15 pro Xaa Gin Xaa Lys Cys Vai Cys Met Leu Gly Asp Xaa Arg Leu Arg 20 25 30

Gly Gin Thr Gly Vai Xaa Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Pbe II® 35 40 45

Asp Pbe Arg Leu Leu Asn Xaa Thr 50 55

Lys Lys Lys Vai Lys Arg Leu Leu €5 70

Ser Arg Leu Leu Arg Gly íle 11® as

Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin Ala 100

Xaa Trp Asp Phe Aap lie Ph® Leu 115 120

Ser Leu Vai íhr Leu Leu Cys His 130 135

Thr Xaa Ser Gly Glu Ile Gly Thr GO

Ser Phe Sln Arg Tyr Phe His Ala 75 80

Pro Gin ala Pro Leu Ris Leu Leu 00 05

Arg His «et Leu Ser Lys Vai Gly 105 110

Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly Asn 125

Leu Phe Asn Xaa His Gly Leu Ile 140 147

Gly Gin Thr Gly Vai Xaa Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Pbe II® 35 40 45

Asp Pbe Arg Leu Leu Asn Xaa Thr 50 55

Lys Lys Lys Vai Lys Arg Leu Leu €5 70

Ser Arg Leu Leu Arg Gly íle 11® as

Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin Ala 100

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Pro Gin ala Pro Leu Ris Leu Leu 00 05

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Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly Asn 125

Leu Phe Asn Xaa His Gly Leu Ile 140 148

Pro Xaa Gin Xaa Lys cys Vai Cys Mete Leu Gly Asp Xaa Arg Leu Arg 20 25 30

Gly Gin Thr Gly Vai Xaa Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Phe ile 35 40 45

Asp Phe Arg Leu Leu Asn Xaa Thr Thr Xaa Ser Gly Glu Ile Gly Thr 50 55 60

Lya Lys Lys Vai Lys Arg Leu Leu Ser Phe Sln Arg Tyr Phe His Ala G5 20 75 80

Ser Arg Leu Leu Arg Gly Ile Xie Prct Gin Ala Pro Leu His Leu Leu 85 00 05

Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin Ala Arg His Met Leu Ser Lys vai Gly 100 105 110

Xaa Trp Asp Phe Asp lie Phe Leu Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly Asn 115 120 125

Ser Leu Vai Thr Leu Leu Cys His Leu Phe Asn Xaa His Gly Leu Ile Í30 135 140

<210> 11 <211> 445 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> sequência <223> Descrição da sequência artificial: sintética 149 <220> <223> Fórmula II <220> <221> LOCAL <222> (12) <223> Xaa = Vai ou Ile <220> <221> LOCAL <222> (16) <223> Xaa = Ser ou Asn <220> <221> LOCAL <222> (18) <223> Xaa = Glu ou Asp <220>

<221> LOCAL <222> (20)..(21) <223> Xaa = um péptido que compreende pelo menos dois ou mais resíduos Ser, Vai, Asn ou Ala <220> <221> LOCAL <222> (30) <223> Xaa = Vai ou Ile <220> <221> LOCAL <222> (39) <223> Xaa = Pro ou Arg <220> <221> LOCAL <222> (56) <223> Xaa = Asn ou Ser <220> <221> LOCAL <222> (59) <223> Xaa = His ou Tir <220>

<221> LOCAL 150 <222> (114) <223> Xaa = Thr ou Met <220> <221> LOCAL <222> (141) <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> LOCAL <222> (168)..(169) <223> Xaa = um péptido que compreende pelo menos dois ou mais resíduos Gli, His, Ser, Gin <220> <221> LOCAL <222> (307)..(308) <223> Xaa = um péptido que compreende pelo menos dois ou mais resíduos Asp, Ala, Asn, Vai <220> <221> LOCAL <222> (350) <223> Xaa = Glu ou Asp <220> <221> LOCAL <222> (379) <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> LOCAL <222> (391) <223> Xaa = His ou Arg <220> <221> LOCAL <222> (404) <223> Xaa = Gli ou Ser <220> <221> LOCAL <222> (418) . . (419) <223> Xaa = um péptido que compreende pelo menos dois ou mais resíduos Pro, Arg, Ser, Asn 151 <220> <221> LOCAL <222> (423) <223> Xaa = Ser ou Arg <220> <221> LOCAL <222> (427)..(428) <223> Xaa = um péptido que compreende pelo menos dois ou mais resíduos Ser, Gli, Pro, Asp, His, Gin <220> <221> LOCAL <222> (430) <223> Xaa = His ou Leu <220> <221> LOCAL <222> (433)..(434) <223> Xaa = um péptido que compreende pelo menos dois ou mais resíduos Gin, Gli, Thr, Pro, Ala <220> <221> LOCAL <222> (436) . . (437) <223> Xaa = um péptido que compreende pelo menos dois ou mais resíduos Ser, Glu, Thr, Leu <220> <221> LOCAL <222> (440) <223> Xaa = Thr facultativo <220> <221> LOCAL <222> (443)..(444) <223> Xaa = um péptido que compreende pelo menos dois ou mais resíduos Asp, Ser, Ala, Thr <400> 11 152

Met Ser Cys Leu Met Vai 0iu Ar9 C}'5 &iy 01» ^aa ^eu ®3u '^aa 152 1

S 10 15

Pro Xaâ c.lo Xaa Xaa Lys CVS Vai Oys Met Leu Gly Aup Xaa Arg teu 20 25 30 Ãrg Gly Gin Thr Gly Vai Xaa Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Phe 35 40 45 lie Asp Phe Arg Leu Leu Assn Xaa Thr Thr Xaa Ser Gly Glu lie Gly 50 55 60

Thr Lys LyS tys Vai Lys Arg teu teu Ser Phe Gin Arg Tyr Phe His 65 70 75 80

Ala Ser Arg teu teu Arg Gly Xle Ile Pro Gin Ala Pro teu His teu 85 90 95 teu Asp Glu Aap Tyr teu Gly Gin Ala Arg Bis Met teu $er tys Vai 100 105 110

Gly Xaa Trp Asp Phe Asp lie Phe teu Phe Aap Arg teu Thr Asn Gly 115 120 125 14Ô

Asm Ser teu Vai Thr teu Leu Cys Hia Leu Phe Aan xaa hís Gly teu 130 135 153 11« His His Phe Lys Leu Asp Met Vai Thr Leu His Arg Phe Leu Vai 145 ISO 155 160

Met Vai Gin Glu Asp Tyr His Xaa Xaa Asn Pro Tyr His Asn Ala Vai 165 170 175

His Ala Ala Asp Vai Thr Gin Ala Met His Cys Tyr Leu Lys Glu Pro ISO 185 190

Lys Leu Ala Ser Phe Leu Thr Pro Leu Asp Ile Met Leu Gly Leu Leu 135 200 205

Ala Ala Ala Ala His Asp Vai Asp His Pro Gly Vai Asn Gin Pro Phe 210 215 220

Leu Ile Lys Thr Asn His His Leu Ala Asn Leu Tyr Gin Asn Met Ser 225 230 235 240

Vai Leu Glu Asn His His Trp Arg Ser Thr Ile Gly Met Leu Arg Glu 245 250 255

Ser Arg Leu Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Met Thr Gin Asp Ile Glu 260 265 270

Gin Gin Leu Gly Ser Leu Ile Leu Ala Thr Asp Ile Asn Arg Gin Asn 275 280 285

Glu Phe Leu Thr Arg Leu Lys Ala His Leu His Asn Lys Asp Leu Arg 230 295 300

Leu Glu Xaa Xaa Gin Asp Arg His Phe Mét Leu Gin Ile Ala Leu Lys 305 310 31$ 320

Cys Ala Asp He Cys Aen Pro Cys Arg Ile Trp Glu Met Ser Lys Gin 325 330 335

Trp Ser Glu Arg Vai Cys Glu Glu Phe Tyr Arg Gin Gly Xaa Leu Glu 340 345 350 154

Sln lys Phe 01« Leu Glu Ile Ser Pro Leu Cys ftsn Gin Gin lys Asp 355 360 36S

Set: Ile Pro Ser Ile Gin lie Gly Phe Met Xaa Tyr lie Vai Glu Pr o 370 375 3$0 leu Phe Arg Glu Trp Ala Xaa Phe TAr Gly Rsn Ser Thr leu Ser Glu 365 360 365 400 ften Msfc leu Xaa Hls leu Ala His Asn lys Ala Gin Trp Lys ser Leu 405 410 415

Leu Xaa Xaa Gin His Arg Xaa Atg Gly Ser Xaa Xaa Asp Xaa Ala Gly 420 425 430

Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Glu Gin Xaa Glu Gly Xaa Xaa Pro 435 440 445

<210> 12 <2U> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <221> LOCAL <222> (12) <223> Xaa = Vai ou Ile <220> <221> LOCAL <222> (16) <223> Xaa = Ser ou Asn <220> <221> LOCAL <222> (18) 155 <223> Xaa = Glu ou Asp <220>

<221> LOCAL <222> (20)..(21) <223> Xaa Xaa = Ser, Vai ou Asn, Ala <220> <221> LOCAL <222> (30) <223> Xaa = Vai ou Ile <220> <221> LOCAL <222> (39) <223> Xaa = Pro ou Arg <220> <221> LOCAL <222> (56) <223> Xaa = Asn ou Ser <220> <221> LOCAL <222> (59) <223> Xaa = His ou Tir <220> <221> LOCAL <222> (114) <223> Xaa = Thr ou Met <220> <221> LOCAL <222> (141) <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> LOCAL <222> (168) . .(169) <223> Xaa Xaa = Gli, His ou Ser, Gin <220> <221> LOCAL <222> (307)..(308)

Ala ou Asn, Vai <223> Xaa Xaa = Asp, 156 <220> <221> <222> <223> LOCAL (350) Xaa = Glu ou Asp <220> <221> <222> <223> LOCAL (379) Xaa = Ser ou Thr <220> <221> <222> <223> LOCAL (391) Xaa = His ou Arg <220> <221> <222> <223> LOCAL (404) Xaa = Gli ou Ser <220> <221> <222> <223> LOCAL (418)..(419) Xaa Xaa = Pro, Arg <220> <221> <222> <223> LOCAL (423) Xaa Ser ou Arg <220> <221> <222> <223> ' (430) Xaa = His ou Leu <220> <221> <222> <223> LOCAL (433)..(435) Xaa Xaa Xaa = = Gin, <220> <221> <222> <223> LOCAL (437)..(438) Xaa Xaa = Ser, Glu

Ser, Asn i, Thr ou Pro, Ala Pro

Thr, Leu 157 <220> <221> LOCAL <222> (441) <223> Xaa = Thr facultativo <220> <221> LOCAL <222> (444)..(445) <223> Xaa Xaa = Asp, Ser ou Ala, Thr <220> <223> Fórmula IV <400> 12 158

Met Ser Cys Leu Met Vai Glu Arg Cys Gly Glu Xaa Leu Phe Glu Xaa

1 S 10 IS

Pro Xaa Gtn Xaa Xaa Lys Cys Vai Cys Met Leu Gly Asp xaa Arg Leu 20 25 30

Arg Gly Gin Thr Gly Vai Xaa Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Phe 35 40 45 lie Asp Phe Arg Leu Leu Asn Xaa Thr Thr Xaa Ser Gly Glu Ile Gly 50 55 60

Thr Lys Lys Lys Vai Lys Arg Leu Leu Ser Phe Gin Arg Tyr Phe His 65 70 75 $0

Ala Ser Arg Leu Leu Arg Gly Ile Ile Pro Gin Ala Pro Leu His Leu 85 90 95

Leu Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin Ala Arg His Met Leu Ser Lys Vai 100 105 110

Gly Xaa Trp Asp Phe Asp Ile Phe Leu Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly 125 120 12$

Asn Ser Leu Vai Thr Leu Leu Cys His Leu Phe Asn Xaa His Gly Leu 130 135 140

Ile His His Phe Lys Leu Asp Met Vai Thr Leu His Arg Phe Leu Vai 145 150 155 160

Met Vai Gin Glu Asp Tyr His Xaa Xaa Asn Pro Tyr His Asn Ala Vai 165 170 175 159

His Ala Ala Asp Vai Thr Gin Ala Met His Cys Tyr Leu Lys Glu Pro 180 185 190

Lys teu Ala Ser Phe teu Thr Pro teu Asp lie Met teu Gly Leu teu 195 200 205

Ala Ala Ala Ala His Asp vai Aep His Pto Gly Vai Asn Gin Pro Phe 210 215 220

Leu ile Lys Thr Asn His His teu Ala Asn teu Tyr Gin Asn Met Ser 225 230 235 240

Vai teu Glu Asn His His Trp Arg Ser Thr Ile ely Met teu Arg Glu 245 250 255

Ser Arg teu teu Ala His teu Pro Lys Glu Met Thr Gin Asp He Glu 260 265 270

Gin Gin teu Gly Ser teu Ile teu Ala Thr Asp Ile Asn Arg Gin Asn 275 280 285

Glu Phe teu Thr Arg Leu Lys Ala His Leu His Asn Lys Asp Leu Arg 290 295 300

Leu Glu Xaa Xaa Gin Asp Arg His Phe Met teu Gin Ile Ala teu Lys 305 310 315 320

Cys Ala Asp Ile Cys Asn Pro Cys Arg 11« Trp Glu Met Ser Lys Gin 325 330 335

Trp Ser Glu Arg Vai Cys Glu Glu Phe Tyr Arg Gin Gly xaa Leu Glu 340 345 350

Gin Lys Phe Glu teu Glu Ile Ser Pro teu cys Asn Gin Gin Lys Asp 355 360 365

Ser Ile Pro Ser Ile Gin ile Gly Phe Met Xaa Tyr Ile vai Glu Pro 370 375 330 160

Leu Phe Arg Glu Trp Ala Xaa Phe Thr Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu 335 390 395 400

Asn Met Leu Xaa His Leu Ala His Asn Lys Ala Gin Trp Lys Ser Leu 405 410 415

Leu Xaa Xaa Gin His Arg Xaa Arg Gly Ser Gly Gin Asp Xaa Ala Gly 420 425 430

Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Glu Gin Xaa Glu Gly Xaa Xaa Pro 435 440 445

<210> 13 <211> 451 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Fórmula IV <220> <221> LOCAL <222> (12) <223> Xaa = Vai ou Ile <220> <221> LOCAL <222> (16) <223> Xaa = Ser ou Asn <220> <221> LOCAL <222> (18) <223> Xaa = Glu ou Asp <220>

<221> LOCAL <222> (20)..(21) 161 <223> Xaa Xaa = Ser, Vai ou Asn, Ala <220> <221> LOCAL <222> (30) <223> Xaa = Vai ou lie <220> <221> LOCAL <222> (39) <223> Xaa = Pro ou Arg <220> <221> LOCAL <222> (56) <223> Xaa = Asn ou Ser <220> <221> LOCAL <222> (59) <223> Xaa = His ou Tir <220> <221> LOCAL <222> (114) <223> Xaa = Thr ou Met <220> <221> LOCAL <222> (141) <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> LOCAL <222> (168) . .(169) <223> Xaa Xaa = Gli, His ou Ser, Gin <220> <221> LOCAL <222> (307)..(308) <223> Xaa Xaa = Asp, Ala ou Asn, Vai <220> <221> LOCAL <222> (350) <223> Xaa = Glu ou Asp 162 <220> <221> LOCAL <222> (379) <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> LOCAL <222> (391) <223> Xaa = His ou Arg <220> <221> LOCAL <222> (404) <223> Xaa = Gli ou Ser <220> <221> LOCAL <222> (418)..(419) <223> Xaa Xaa = Pro, Arg ou Ser, Asn <220> <221> LOCAL <222> (423) <223> Xaa = Ser ou Arg <220> <221> LOCAL <222> (435) <223> Xaa = His ou Leu <220> <221> LOCAL <222> (438)..(440) <223> Xaa Xaa Xaa = Gin, Gli, Thr ou Pro, Ala Pro <220> <221> LOCAL <222> (442)..(443) <223> Xaa Xaa = Ser, Glu ou Thr, Leu <220> <221> LOCAL <222> (446) <223> Xaa = Thr facultativo 163 <220> <221> LOCAL <222> (449)..(450) <223> Xaa Xaa = Asp, Ser ou Ala, Thr <400> 13 Môt Ser Cys Leu Mefc Vai Glu Arg Cys Gly Glu Xaa Leu Phe Glu Xaa

1 S 10 IS 164

Pro Xaa Gin Xaa Xaa Lys Cys Vai Cys Met Leu Gly Asp Xaa Arg Leu 20 25 30

Arg Gly Gin Thr Gly Vai Xaa Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Phe 35 40 45

He Asp Phe Arg Leu Leu Asn Xaa Thr Thr Xaa Ser Gly Glu Ile Gly 50 55 60

Thr Lys Lys Lys Vai Lys Arg Leu Leu Ser Phe Gin Arg Tyr Phe His 65 70 75 80

Ala Ser Arg Leu Leu Arg Gly Ile Ile Pro Gin Ala Pro Leu His Leu 85 90 95

Leu Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin Ala Arg His Met Leu Ser Lys Vai 100 105 110

Gly Xaa Trp Asp Phe Asp He Phe Leu Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly 115 120 125

Asn Ser Leu Vai Thr Leu Leu Cys His Leu Phe Asn Xaa His Gly Leu 130 135 140

He His His Phe Lys Leu Asp Met Vai Thr Leu His Arg Phe Leu Vai 145 150 155 160

Met Val Gin Glu Asp Tyr His Xaa Xaa Asn Pro Tyr His Asn Ala Vai 165 170 175

His Ala Ala Asp Val Thr Gin Ala Met His Cys Tyr Leu Lys Glu Pro 180 185 190

Lys Leu Ala Ser Phe Leu Thr Pro Leu Asp Ile Met Leu Gly Leu Leu 195 200 205 220 215

Ala Ala Ala Ala His Asp Val Aap His Pro Gly Val Asn Gin Pro Phe 210 165

Leu Ile Lys Thr Asn His His Leu Ala Asn Leu Tyr Gin Asr» Met Ser 225 230 235 240

Vai Leu Glu Asn His Hís Trp Arg ser Thr lie Gly Met Leu Rrg Glu 245 250 255

Ser Arg Leu Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Met Thr Gin Asp Ile Glu 260 265 270

Gin Gin Leu Gly Ser Leu Ile Leu Ala Thr Asp ile Asn Arg Gin Asn 275 280 285

Glu Phe Leu Thr Arg Leu Lys Ala His Leu His Asn Lys Asp Leu Arg 290 295 300

Leu Glu Xaa Xaa Gin Asp Arg His Phe Met Leu Gin Ile Ala Leu Lys 305 310 315 320

Cye Ala Asp Ile Cys Asn Pro Cys Arg Ile Trp Glu Met Ser Lys Gin 325 330 335

Trp Ser Glu Arg Vai Cys Glu Glu Phe Tyr Arg Gin Gly Xaa Leu Glu 340 345 350

Gin Lys Phe Glu Leu Glu Ile Ser Pro Leu cys Asn Gin Gin Lys Asp 355 360 365

Ser Ile Pro Ser Ile Gin Ile Gly Phe Met Xaa Tyr Ile Vai olu pro 370 375 330

Leu Phe Arg Glu Trp Ala Xaa Phe Thr Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu 385 390 395 400

Asn Met Leu Xaa Hís Leu Ala His Asn Lys Ala Gin Trp Lys Ser Leu 405 410 415

Leu Xaa Xaa Gin His Arg Xaa Arg Gly Ser ser Gly Ser Gly Pro Asp 420 425 430 166

His Asp Xaa Al<a Gly X&a Xàa X&& Glu Xaa Xaa Glu Gin Xaa Glu Giy 435 440 44S Xâ& Xaa Pro 4SÕ

<210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <400> 14

Ser Gly Ser Giy Pro A3p His 1 5

<210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Zl nas fórmulas I a IV <400> 15

Met Ser Cya Leu Met Vai Glu Arg Cys Giy Glu 15 10

<210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 167 167 sequência <223> Descrição da sequência artificial: sintética <220> <223> Z5 nas fórmulas I a IV <400> 16

Lys Cys Vai Cys Het Leu Gly Asp 1 S

<210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> sequência <223> Descrição da sequência artificial: sintética <220> <223> Z6 nas fórmulas I a IV <400> 17

Arg Leu Arg Gly Gin fhr Gly Vai 1 5

<210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> sequência <223> Descrição da sequência artificial: sintética <220> <223> Z7 nas fórmulas I a IV <400> 18

Leu Asn IS

Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pra Phe ile Asp Phe Arg Leu 1 S 10 168

<210> 19 <211> 54 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Z9 nas fórmulas I a IV <400> 19

Ser Gly Glu lie Gly Thr Lys Lys Lys Vai Lys Arg teu teu Ser Phe 1 5 XO 15

Gin Arg fyr Phe His Ala Ser Arg Leu Leu Arg Gly Ile lie Pro Gin 20 25 30

Ala Pro Leu His Leu teu Asp Glu Asp Tyr teu Gly Gin Ala Arg Hís 3$ 40 45

Met Leu Ser Lys Vai Gly 50

<210> 20 <211> 26 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Z10 nas fórmulas I a IV <400> 20 169

Trp Asp Phe Asp Ile Phe Leu Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly Asn Ser 15 10 15

Leu Vai Thr Leu Leu Cys His Leu Phe Asn 20 25

<210> 21 <211> 26 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Zll nas fórmulas I a IV <400> 21

His Gly Leu Ile His His Phe Lys Leu Asp Met Vai Thr Leu Bis Arg 15 10 15

Phe Leu Vai Het vai Gin Glu Asp Tyr His 20 25

<210> 22 <211> 99 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Z12 nas fórmulas I a IV <400> 22 170

Asn Pro Tyr His Asn Ala Vai Hls Ala Ala Asp Vai Thr Gin Ala Het 15 10 15

Hls cys tyr Leu Lye Glu ?ro Lys Leu Ala Ser Phe Leu thr Pro Leu 20 25 30

Asp lie Met Leu Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala His Asp Vai Asp His 35 40 45

Pro Gly Vai Asn Oln Pro Phe Leu Ile Lys Thr Asn His His Leu Ala 50 55 60

Asn Leu Tyr Gin Asn Met Ser Vai Leu Glu Asn His His Trp Arg Ser 65 70 75 80

Thr Ile Gly Met Leu Arg Glu Ser Arg Leu Leu Ala His Leu Pro Lys 85 90 95

Glu Met Thr

<210> 23 <211> 38 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Z13 nas fórmulas I a IV <400> 23 171

Gin Asp lie Giu Gin Gin Leu Gly Ser Leu lie Leu Ala Thr Asp tie 1 5 10 15

Asn Arg Gin Asn Glu Phe Leu The Arg Leu Lys Ala His Leu His Asn 20 25 30

Lys Asp Leu Arg Leu Glu 35

<210> 24 <211> 41 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Z14 nas fórmulas I a IV <400> 24

Gin Asp Arg His Phe Met Leu Gin lie Ala Leu Lys Cys Aia Asp lis 1 5 10 15

Cys Asn Pr» Cys Arg Xle Trp Glu Kefc Ser Lys Gin Trp Ser Glu Arg 20 25 30

Vai Cys Glu Glu Phe Tyr Arg Gin Gly 35 40

<210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> 172 <223> Ζ15 nas fórmulas I a IV <400> 25

Leu Glu Gin Lys Phe Glu Leu Glu Xle Ser Pro Leu Cys Asn Gin Gin 15 lô 15

Lys ftsp $er lie Pro Ser lie Gin Ile Gly phe Met 20 25

<210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Z16 nas fórmulas I a IV <400> 26

Tyr lie Vai Glu Pro Leu Phe Arg Glu Trp Ala 15 10

<210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220> <223> Z17 nas fórmulas I a IV <400> 27 173

<210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <220>

<223> Z18 nas fórmulas I a IV <40Q> 28__

His Leu Ala His Asn Lys Ala Gin Trp Lys Ser Leu Leu 1 5 10

<210> 29 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequêu sintética <400> 29

His Phe Thr Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu Asn Ket Leu Gly His Leu 1 S 10 15

Ala His Asn Lys Ala Gin Trp Lys Ser Leu Leu Pro Arg Gin His Arg 20 25 30 <210> 30 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 174 <223> Descrição da sequência artificial: sequência sintética <400> 30

Arg Phe Thr Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu Asn Met Leu Ser His Leu 15 10 15

Ala His Asn Lys Ala Gin Trp Lys Ser Leu Leu Ser Asn Gin His Arg 20 25 30

<210> 31 <211> 268 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 175

Hefe Ser Cys Leu «et Vai Glu Arg Cya Gly Glu lie Leu Phe Glu Asn 15 10 js

Pro Asp Gin Asn Ala Lys cys Vai Cys «et Leu Gly Asp He ftrg Leu 20 25 30

Arg Gly Gin Thr Gly Vai Arg Ala Glu Arg Arg Gly ser Tyr Pro Phe 35 40 45 I ie Asp Phe Arg Leu Leu Asn Ser Thr Thr Tyr Ser Gly Glu He Gly 50 55 60 176

Thr Lys Lys Lys Vai Lys Arg Leu Leu Ser Phe Gin Arg Tyr Phe Hís 65 70 75 80

Alã Ser Arg Leu Leu Arg Gly lie Ile Pro Gin ftla Pro Leu His Leu 85 90 95

Leu Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Gin Ala Arg His Met Leu Ser Lys Vai 100 105 no

Gly Met Trp Asp Phe Asp lie Phe Leu Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly 115 120 125

Asn ser Leu Vai Thr Leu Leu Cys His Leu Phe Asn Thr His Gly Leu 130 135 140

Ile His His Phe Lys Leu Asp Met Vai Thr Leu Hís Arg Phe Leu Vai 145 150 155 160

Met Val Gin Glu Asp Tyr His Ser Gin Asn Pro Tyr His Asn Ala Vai 165 170 175

His Ala Ala Asp Val Thr Gin Ala Met His Cys Tyr Leu Lys Glu Pro 180 185 190

Lys Leu Ala Ser Phe Leu Thr Pro Leu Asp Ile Met Leu Gly Leu Leu 195 200 205

Ala Ala Ala Ala His Asp Val Asp His Pro Gly Val Asn Gin Pro Phe 210 215 220

Leu Ile Lys Thr Asn His His Leu Ala Asn Leu Tyr Gin Asn Met Ser 225 230 235 240

Val Leu Glu Asn His His Trp Arg Ser Thr Ile Gly Met Leu Arg Glu 245 2S0 255

Ser Arg Leu Leu Ala His Leu Pro Lys Giu Met Thr 265 260 177

<210> 32 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 32 ggteacagaa ctgcçacíat ggííaastgi 30

<210> 33 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <400> 33 seegctcagá gaíttoacay ca 22

<210> 34 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <400> 34 escgteígac occtíagteg ta 22 178

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado dt a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição us 5932423 A [0011] us 5932465 A [0011] wo 9735989 A [0012] [0012] [0014] [0015] wo 0077226 AI [0013] EP 0184438 A [0218] EP 0284603 A [0218] EP 0134048 A [0218] EP 0253455 A [0218] EP 0096430 A [0218] EP 0301670 A [0218] EP 0449375 A [0236] US 3817837 A [0249] US 3850752 A [0249] US 3939350 A [0249] US 3996345 A [0249] US 4277437 A [0249] US 4275149 A [0249] US 4366241 A [0249] US 4816567 A [0249] US 4946779 A [0256] EP 8403564 A [0280] 179 • WO 8403564 A [0282] • US 5738985 A [0283] • US 4683195 A [0295] [0324] • US 4800195 A [0295] [0324] • US 4965188 A [0295] [0324] • EP 99308902 A [0372] • GB 9828603 A [0372] • GB 9922123 A [0372]

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Lisboa, 22/10/2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Enzima PDE-XIV constituída pela sequência de aminoácidos ilustrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 ou que possui uma identidade pelo menos de 95% em relação a tal sequência.

2. Gene de PDE-XIV constituído pela sequência nucleotídica ilustrada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 ou que possui uma identidade pelo menos de 95% em relação a tal sequência.

3. Vector que compreende o gene de PDE-XIV de acordo com a reivindicação 2.

4. Célula hospedeira isolada na qual foi incorporado o gene de PDE-XIV de acordo com a reivindicação 2 ou com a revindicação 3.

5. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 4, em que a célula hospedeira está depositada sob o número 40995, 40996 ou 41027 de admissão à NCIMB.

6. Método de ensaio para identificar um agente que pode afectar a actividade ou a expressão da enzima PDE-XIV, consistindo o método de ensaio em: fazer contactar um agente com a enzima PDE-XIV de acordo com a reivindicação 1 ou o gene de PDE-XIV de acordo com a reivindicação 2, o vector de acordo com a reivindicação 3 ou a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 4 ou com a revindicação 5 e 2 medir a actividade ou a expressão da enzima PDE-XIV, em que a existência de uma diferença entre a) a actividade ou a expressão da enzima PDE-XIV na ausência do agente e b) a actividade ou a expressão da enzima PDE-XIV na presença do agente é indicativa de que o agente pode afectar a actividade ou a expressão da enzima PDE-XIV.

7. Utilização de um gene que codifica uma enzima PDE-XIV de acordo com a reivindicação 1, ou um produto da sua expressão, para a pesquisa de agentes que podem modular a actividade da enzima pde-xiv.

8. Anticorpo criado contra uma enzima PDE-XIV constituída pela sequência de aminoácidos ilustrada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou que possui uma identidade pelo menos de 95% em relação a tal sequência.

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia simples, um fragmento Fab ou um fragmento produzido por um banco de expressão de Fab.

10. Hibridoma que produz o anticorpo de acordo com a reivindicação 8 ou com a reivindicação 9. Lisboa, 22/10/2007