PT1019060E - Inibidores da síntese de adrogénio - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

INIBIDORES DA SÍNTESE DE ANDROGÉNIO

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Âmbito da Invenção

Esta invenção refere-se a novos inibidores da síntese de androgénio que são úteis no tratamento de cancro da próstata e hipertrofia prostática benigna. A presente invenção também proporciona métodos para sintetizar estes novos compostos, composições farmacêuticas contendo estes novos compostos, e métodos de tratar cancro da próstata e hipertrofia prostática benigna usando os inibidores da síntese de androgénio da presente invenção. 2. Descrição da Arte Relacionada 0 cancro da próstata é actualmente o cancro mais prevalecente nos homens. São anualmente diagnosticados cerca de 160000 novos casos; destes, 35000 morrerão de doença metastática. Nas mulheres, o cancro da mama mata 45000 mulheres por ano. Os presentes inventores propuseram previamente que inibidores selectivos da aromatase (estrogénio-sintetase) para controlar a produção de estrogénio, seriam agentes potencialmente úteis para o cancro da mama. Nos homens, os inibidores da aromatase podem ser úteis em condições associadas com excesso de estrogénio, tais como ginecomastia e oligospermia (Coen et al., 1991; Hsiang et al., 1987). Foi sugerido que inibidores da aromatase também pudessem ser de valor no cancro da próstata e hipertrofia prostática benigna (BPH) (Henderson et al., 1991) . 1

Em 1973, os presentes inventores divulgaram o primeiro de uma série de compostos que são inibidores potentes e selectivos da aromatase (Schwarzel et al., 1973). Constatou-se que o mais activo desses inibidores, 4-hidroxiandrosteno-3,17-diona (4-OHA) (Brodie et al., 1976), actuava por inibição competitiva rápida seguida por inactivação da enzima in vitro que parecia ser de longa-duração ou irreversível (Brodie et al. 1981). Pensa-se que os inibidores enzimáticos com estas propriedades ligam-se ao sitio activo da enzima, são provavelmente bastante específicos e devem ter efeitos de longa-duração in vivo devido à inactivação da enzima (Sjoerdsma, 1981) . Os presentes inventores demonstraram adicionalmente que o 4-OHA reduz o nível de estrogénio do plasma periférico e causa regressão significativa de cancros da mama em pacientes pós-menopáusicos com doença metastática avançada que recidivaram de outro tratamento hormonal, tal como ovariectomia e tamoxifeno. 0 composto tem actividade tanto oral como parentérica e não tem efeitos colaterais significativos nestes pacientes (Goss et al., 1986; Coombes et al. 1987). 0 4-OH-A (formastane) é actualmente aprovado para tratamento de cancro da mama em muitos países, incluindo a maioria dos países Europeus e o Canadá desde 1995. É o primeiro tratamento novo para o cancro da mama em 10 anos.

Nos homens, os estrogénios são produzidos pelos testículos e por aromatização periférica de androgénios das supra-renais. A testosterona é o produto principal do testículo e é convertida pela 5a-reductase no androgénio mais potente, di-hidrotestosterona (DHT), na próstata (Bruchovsky et al., 1968). Ao passo que os androgénios são de importância principal no crescimento da próstata normal, hipertrofia prostática benigna (BPH) e cancro da próstata, várias 2 evidências sugerem que os estrogénios também possam desempenhar um papel (Mawhinney et al., 1976). 0 4-OHA também inibe 5a-reductase in vitro, embora com menos potência com que inibe a aromatase (Brodie et al. 1989b). Devido a estas duas actividades, explorou-se a possibilidade de o 4-OHA ser eficaz em cancro da próstata num grupo pequeno de homens com doença avançada. Foram observadas respostas subjectivas em 80% destes pacientes, embora não houvesse evidência clara de remissões objectivas (Shearer et al., 1991). Os níveis de estrogénio foram reduzidos como esperado mas as concentrações de DHT não foram alteradas nos pacientes. A última constatação para além da fraca actividade androgénica do composto pode ter determinado a falta de respostas objectivas. A quimioterapia não é normalmente altamente eficaz e não é uma opção prática para a maioria dos pacientes com cancro da próstata devido aos efeitos colaterais adversos que são particularmente prejudiciais em pacientes mais idosos. Contudo, a maioria dos pacientes responde inicialmente a tratamento hormonal ablativo embora eventualmente recidivem, como é típico com todos os tratamentos de cancro. O tratamento actual por orquidectomia ou administração de agonistas da hormona de libertação de gonadotropina (GnRH) resulta em produção reduzida de androgénio pelo testículo mas não interfere com a síntese de androgénio pelas supra-renais. A seguir a 3 meses de tratamento com um agonista de GnRH, as concentrações de testosterona e DHT na próstata permaneceram a 25% e 10%, respectivamente, de níveis de pré-tratamento (Foti et al., 1989). Similarmente, cerca de 20% de pacientes castrados em recaída apresentavam níveis significativos de DHT no seu tecido prostático (Geller et al., 1984). Estas 3 constatações sugerem que as supra-renais contribuem como precursores de androgénio na próstata. Tal é suportado por estudos clínicos de pacientes que recebem tratamento combinado ou com GnRH ou orquidectomia e um anti-androgénio, tal como flutamida, para bloquear as acções de androgénios, incluindo androgénios supra-renais. Tais pacientes aumentaram o tempo de sobrevivência de progressão-livre comparado a pacientes tratados apenas com agonista de GnRH ou orquidectomia (Crawford et al., 1989; Labrie et al., 1993).

Embora os pacientes respondam inicialmente a terapia endócrina, frequentemente recidivam. Foi recentemente divulgado que em 30% de tumores recorrentes de pacientes tratados com terapia endócrina, observou-se amplificação de alto-nível do receptor de androgénio (AR) (Visakorpi et al., 1995) . Também, a flutamida tendeu a interagir com os AR mutantes e a estimular o crescimento celular prostático. Tal sugere que a amplificação de AR pode facilitar o crescimento celular tumoral em baixas concentrações de androgénio. Assim, o bloqueio do androgénio total como primeira linha de terapia pode ser mais eficaz que a privação de androgénio convencional alcançando supressão máxima de concentrações de androgénio que também pode prevenir a amplificação de AR (Kellens, 1993). Permanece presentemente obscuro se o tratamento sequencial com diferentes agentes pode prolongar os benefícios da terapia inicial. Novos agentes que actuam através de mecanismos diferentes podem produzir secundárias respostas numa porção de pacientes recaídos. Embora a percentagem de pacientes que respondem a terapia hormonal de segunda-linha pode ser relativamente baixa, um número substancial de pacientes pode beneficiar devido à elevada incidência de cancro da próstata. Além disso, existe potencial para desenvolver agentes mais potentes que as 4 terapias actuais, nenhuma das quais é completamente eficaz em bloquear os efeitos do androgénio. A 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase é uma enzima fundamental na

biosintese de androgénios e converte os esteróides C21 (pregnenolona e progesterona) nos androgénios C19, dehidroepiandrosterona (DHEA), 5-androstenodiol (A-diol), testosterona, e androstenodiona no testículo e supra-renais. Foram descritos alguns inibidores de 17a-hidroxilase/Ci7,2o~ liase (Barrie et al., 1989; McCague et al., 1990; Jarman et al., 1990; Ayub et al., 1987; Nakajin et al., 1988, 1989,; Angelastro et al., 1989; Potter et al., 1995). O cetoconazole, um fungicida do imidazole activo, é o único inibidor usado actualmente para reduzir a biosintese de testosterona no tratamento de pacientes com cancro da próstata avançado (Trachtenberg et al., 1984; Willimas et al., 1986). Contudo, o cetoconazole não é muito potente. Além disso, tem vários efeitos colaterais significativos, incluindo inibição de diversas enzimas esteroidogénicas do citocromo P45o, e redução de produção de cortisol. Outra droga usada para o cancro da próstata, a aminoglutetimida (AG), tem desvantagens semelhantes. Isto sugere que inibidores mais potentes e selectivos desta enzima podem proporcionar agentes úteis no tratamento desta doença. Além disso tais compostos podem ser eficazes no tratamento de pacientes com cancro da mama. A AG foi usada para este propósito, mas foi associado a efeitos colaterais adversos.

Na próstata, a 5a-reductase é a enzima que converte testosterona no androgénio mais potente, DHT, que estimula o crescimento prostático. Esta enzima ocorre em duas isoformas importantes, a isoforma do Tipo I expressa na pele humana 5 não-genital, e a isoforma do Tipo II presente na próstata humana (ver, Russell et al., 1994). 0 inibidor de 5a-reductase, N-[1, l-dimetil-3-oxo-4-aza-5aandrost-l-eno-17Pcarboxamida (finasteride; Merck) recentemente aprovado para tratamento de BPH (Stoner, 1990) é um inibidor mais potente da isoforma do Tipo II que do Tipo I. Contudo, a finasteride é principalmente eficaz em pacientes com BPH com doença minima, possivelmente por se te constatado que os niveis de DHT no soro estarem incompletamente reduzidos (65— 80%) . Como a isoenzima do Tipo I é provavelmente a fonte de muito do DHT residual do plasma, compostos que inibem o Tipo I bem como o Tipo II podem ser mais eficazes em pacientes. Mais recentemente, foi descrito outro azasteróide MK-434 que reduz niveis de DHT prostáticos em cães mais eficazmente que finasteride (Cohen et al., 1995). A vantagem principal deste composto, que tem actividade semelhante ao finasteride in vitro, parece ser a sua farmacocinética mais favorável. Contudo, a sua eficácia em humanos ainda não foi observada. Embora estes compostos reduzam o nivel de DHT, também aumentam os niveis de testosterona no soro. A conservação dos niveis de testosterona pode ser uma vantagem em pacientes com BPH. Contudo, os inibidores de 5a-reductase que aumentam os niveis de testosterona podem não ser suficientemente eficazes no tratamento do cancro da próstata. Enquanto o DHT liga-se ao receptor de androgénio com maior afinidade que a testosterona e dissocia-se mais lentamente, a testosterona pode ligar-se ao receptor quando os niveis de DHT forem reduzidos (Gormley, 1991) . Como acima indicado, apesar das reduções significativas nos niveis de DHT prostáticos durante o tratamento (Cohen et al., 1995), estes compostos não são tão eficazes quanto a castração. Mais importante, parece que são menos eficazes em desencadear a morte celular prostática. 6 0 gene androgénico-responsivo, TRPM-2 associado com apoptose é significativamente aumentado por castração mas não por tratamento com finasteride (Rittermaster et al., 1991; Shao et al., 1993). Tal foi atribuído aos menores níveis de androgénio após castração (Shao et al., 1993), que é principalmente uma consequência da redução em produção de testosterona. Constatou-se por estudos recentes em pacientes que receberam tratamento a longo prazo com finasteride que alguns pacientes desenvolveram ginecomastia que conduziu a cancro da mama em alguns casos (NEJM, Setembro, 1996, carta ao editor) . tal levanta preocupações acerca do uso de inibidores de 5a-reductase uma vez que o bloqueio deste passo aumenta a conversão de substratos de androgénio a estrogénios. Os compostos que reduzem a produção de testosterona e DHT bem como outros androgénios por inibição de 17-hidroxilase/liase não estariam associados com este problema e podem ser mais eficazes no tratamento de cancro da próstata.

Referências As referências seguintes são representativas do estado da arte relativamente a compostos esteróides e ao seu uso no tratamento de BPH e cancro da próstata.

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Assim, tendo em conta as deficiências acima mencionadas tratadas com inibidores da síntese de androgénio da arte prévia, incluindo a sua ineficácia relativa e os seus efeitos colaterais concomitantes, deve ser aparente que ainda existe uma necessidade na arte para novos tipos de inibidores enzimáticos que inibam potentemente 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase bem como 5a-reductase, para bloquear toda a síntese de androgénio e que podem ser benéficos no tratamento de cancro da próstata e hipertrofia prostática benigna.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em conformidade, um objecto principal da presente invenção consiste em proporcionar novos inibidores da biosíntese de androgénio para proporcionar tratamento mais adequado a pacientes com cancro da próstata e hipertrofia prostática benigna.

Em resumo, a presente invenção proporciona novos compostos que reduzem os níveis de testosterona e DHT por inibição tanto de 17a-hidroxilase/Ci7,2o_liase como 5a-reductase. Estes compostos proporcionam bloqueio de toda a síntese de androgénio (androstenodiona, testosterona, DHEA e os seus metabolitos estrogénicos, bem como DHT) e assim proporcionam tratamento mais eficaz de cancro da próstata. Vários destes compostos são inibidores potentes de 17a-hidroxilase/Ci7/2o_ liase e 5a-reductase, e também têm actividade antiandrogénica. Muitos são muito mais potente que o cetoconazole e quase tão potentes quanto o finasteride in 14 vitro. Devido às suas actividades duais, estes compostos podem ser mais eficazes que os agentes actuais no tratamento de cancro da próstata. Outros compostos que são inibidores moderados de 17a-hidroxilase/Ci7,2o_liase mas são mais potentes para a 5a-reductase podem ser úteis em manter um equilíbrio "normal" dos níveis de testosterona e estrogénio em pacientes com BPH. Estes compostos são o objecto da Patente U.S. 5 264 427, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

Um objecto adicional da presente invenção consiste em proporcionar composições farmacêuticas compreendendo um ou mais dos inibidores de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase e 5a-reductase da presente invenção, e um portador farmaceuticamente aceitável do mesmo. Estas composições farmacêuticas podem ser usadas no tratamento de condições que requerem a redução dos níveis de testosterona e DHT, tais como cancro da próstata e hipertrofia prostática benigna.

Um objecto adicional da presente invenção consiste em proporcionar um método de reduzir os níveis de testosterona e/ou DHT num paciente mamífero que necessite de tal tratamento compreendendo administrar um ou mais dos inibidores de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase e 5a-reductase da presente invenção numa quantidade suficiente para reduzir os níveis de testosterona e/ou DHT a uma quantidade desejada.

Com os objectos, vantagens e características da invenção anteriores e outros que tornar-se-ão aparentes em seguida, a natureza da invenção pode ser mais claramente compreendida por referência à descrição detalhada seguinte dos modos de execução preferidos da invenção e às reivindicações apensas. 15

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra o efeito de inibidores da sintese de androgénio da presente invenção na sintese de ADN em tecido BPH androgeno-estimulado em cultura A Figura ilustra o efeito de inibidores da sintese de androgénio da presente invenção no volume de tumores prostáticos humanos num modelo de ratinho.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇAO PREFERIDAS DA INVENÇÃO

Esta invenção surgiu de um desejo dos inventores em melhorar compostos previamente disponíveis usados na inibição da síntese de testosterona e DHT. Os inventores também tentaram proporcionar um tratamento seguro e eficaz para BPH e cancro da próstata. Os inventores constataram que a administração dos compostos da presente invenção bloqueia de modo eficaz a síntese de testosterona e DHT em mamíferos.

Os compostos esteróides de acordo com a presente invenção são 16-desidroprogesterona-20-oxima, e acetato do mesmo.

Sais farmacêuticos dos compostos esteróides da presente invenção adequados para administração por uma variedade de vias são conhecidos na arte e não necessitam de ser aqui descritos em detalhe. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos e derivados dos mesmos de acordo com a invenção, incluem sais básicos, e.g., derivados de uma base apropriada, tal como metal alcalino (e.g., sódio), metal alcalinoterroso (e.g., magnésio), amónio, e bases e sais NWnHm 16 em que cada umdenemé0a4e n+m é 4, e em que W é um alquilo(Ci-Cis). Sais farmaceuticamente aceitáveis de um grupo ácido ou um grupo amino incluem, mas não se encontram limitados a, sais de ácidos carboxilicos orgânicos tais como ácidos acético, láctico, tartárico, málico, isotiónico, lactobiónico e succínico; ácidos organossulfónicos tais como ácidos metanossulfónico, etanossulfónico, benzenossulfónico e de p-tolilsulfónico, e ácidos inorgânicos tais como ácidos clorídrico, sulfúrico, fosfórico e sulfâmico. Sais farmaceuticamente aceitáveis de um composto com um grupo hidroxilo incluem, mas não se encontram limitados a, o anião do composto em combinação com um catião adequado tal como Na+, e NWnHm, em que W é um grupo alquilo (Ci-Cie) , e n e m são de 0 a 4, e n+m é 4.

Uma parte adicional desta invenção consiste numa composição farmacêutica de interesse para reduzir os níveis de testosterona e/ou DHT num mamífero que necessite de tal tratamento. Tal composição farmacêutica de interesse compreende pelo menos um dos compostos esteróides acima descritos, misturas dos mesmos, e/ou sais farmacêuticos dos mesmos, e um portador farmaceuticamente-aceitável do mesmo. Tais composições são preparadas em conformidade com procedimentos farmacêuticos aceites, por exemplo, como descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences, décima sétima edição, ed. Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985).

Para uso terapêutico num método de inibir a síntese de testosterona e/ou DHT, um composto esteróide da presente invenção, ou o seu sal, pode ser convenientemente administrado na forma de uma composição farmacêutica contendo um composto esteróide de acordo com a presente invenção, ou o 17 seu sal, e um portador farmaceuticamente aceitável do mesmo. Os portadores adequados são bem conhecidos na arte e variam com a forma e modo de administração desejados da composição farmacêutica. Por exemplo, podem incluir diluentes ou excipientes tais como enchedores, ligantes, molhante, disintegrantes, agentes tensioactivos, lubrificantes, e semelhantes. Tipicamente, o portador pode ser um portador sólido, liquido, ou vaporizável, ou combinações dos mesmos. Num modo de execução preferido, a composição é uma composição terapêutica e o portador é um portador farmaceuticamente aceitável. 0 composto da invenção ou o seu sal pode ser formulado juntamente com o portador em qualquer forma de dosagem unitária desejada. Formas de dosagem unitárias típicas incluem comprimidos, pílulas, pós, soluções, suspensões, emulsões, grânulos, cápsulas, supositórios; são particularmente preferidas soluções e suspensões injectáveis.

Cada portador deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes na formulação e não prejudicial ao paciente. 0 portador deve ser biologicamente aceitável e inerte, i.e., deve permitir que a célula conduza as suas reacções metabólicas de modo a que o composto desta invenção possa efectuar a sua actividade inibidora.

As formulações incluem as adequadas para administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal e parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, e transdérmica), sendo preferidas as formulações apropriadas para administração oral, nasal, e parentérica. 18

Por exemplo, para preparar formulações adequadas para administração parentérica, as soluções e suspensões são esterilizadas e são de preferência isotónicas no sangue. Ao preparar preparações injectáveis, também podem ser usados portadores que são geralmente usados nesta área, por exemplo, água, álcool etílico, propilenoglicol, álcool isostearílico etoxilado, álcool isostearílico polioxilado, sorbitol de polioxietileno e ésteres de sorbitato. Nestes casos, podem ser adicionadas quantidades adequadas de ajustadores de isotonicidade tais como cloreto de sódio, glucose ou glicerina para tornar as preparações isotónicas. As soluções de injecção estéreis aquosas podem conter adicionalmente anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos, e tipo adições aceitáveis para formulações parentéricas.

As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer método conhecido na arte de farmácia. Tais métodos incluem o passo de associar o ingrediente activo com o portador que pode abranger um ou mais ingredientes adicionais. De um modo geral, as formulações são preparadas associando uniforme e infimamente o ingrediente activo com portadores líquidos ou portadores sólidos finamente divididos ou ambos, e em seguida se necessário modelar o produto. Podem ser usadas vários recipientes de dose unitárias e dose múltipla, e.g., ampolas e frascos lacrados, como é bem conhecido na arte.

Para além dos ingredientes particulares acima mencionados, as formulações desta invenção também podem incluir outros agentes convencionais na arte para este tipo de formulação farmacêutica. 19 0 composto da invenção pode estar presente na composição numa ampla proporção para o portador. Por exemplo, o composto pode estar presente na quantidade de 0,01 a 99,9 wt%, e mais preferivelmente em cerca de 0,1 a 99 wt%. Ainda mais preferencialmente, o composto pode estar presente numa quantidade de cerca de 1 a 70 wt% da composição.

Os compostos da presente invenção podem ser usados num método de tratar BPH ou cancro da próstata, ou inibir o crescimento de tecido prostático, num paciente que necessite de tal tratamento, tratando o paciente com uma quantidade eficaz de um composto esteróide da presente invenção, sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, ou misturas dos mesmos. Neste pedido, "tratar" abranqerá qualquer meio pelo qual o composto desta invenção entra em contacto com a maquinaria celular responsável pela síntese de testosterona e/ou DHT. Também, neste pedido "paciente" abrangerá qualquer mamífero que necessite de tal tratamento, particularmente um mamífero que padece de BPH ou cancro da próstata. A dosagem dos compostos esteróides, sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, ou misturas dos mesmos, nas composições da invenção administradas a um paciente variará dependendo de vários factores, incluindo, mas não limitados a, idade, peso, sexo, e espécies do paciente, da saúde geral do paciente, da gravidade dos sintomas, se a composição está a ser administrada sozinha ou em combinação com outros agentes terapêuticos, da incidência de efeitos colaterais e semelhantes.

De um modo geral, uma dose adequado para aplicação no tratamento de BPH é de cerca de 0,001 a 100 mg/kg massa corporal/dose, de preferência cerca de 0,01 a 60 mg/kg massa 20 corporal/dose, e ainda mais preferivelmente cerca de 0,1 a 40 mg/kg massa corporal/dose por dia. Uma dose adequada para aplicação no tratamento de cancro da próstata é de cerca de 0,001 a 100 mg/kg massa corporal/dose, de preferência cerca de 0,01 a 60 mg/kg massa corporal/dose, e ainda mais preferivelmente cerca de 0,1 a 40 mg/kg massa corporal/dose por dia. A dose desejada pode ser administrada como 1 a 6 ou mais sub-doses administrados a intervalos apropriados ao longo do dia. Os compostos podem ser administrados repetidamente ao longo de um período de meses ou anos, ou podem ser lenta e constantemente infundidos no paciente. Também podem ser administradas doses maiores e menores. A dose diária pode ser ajustada tendo em conta, por exemplo, a variedade de parâmetros acima identificados. Tipicamente, as composições presentes podem ser administradas numa quantidade de cerca de 0,001 a 100 mg/kg massa corporal/dia. Contudo, também podem ser administradas outras quantidades.

Para alcançar boas concentrações no plasma, os compostos activos podem ser administrados, por exemplo, por injecção intravenosa de uma solução de aproximadamente 0,1 a 1% do ingrediente activo, facultativamente em soluça salina, ou administrada oralmente como uma pílula. O ingrediente activo pode ser administrado para terapia por qualquer via adequada, incluindo vias tópica, oral, rectal, nasal, vaginal e parentérica (incluindo intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, e transdérmica). Será apreciado que a via preferida variará com a condição e idade do paciente, da natureza da desordem e do ingrediente activo escolhido incluindo outros agentes terapêuticos. Preferida é a via oral. Também preferida é a 21 via tópica. Contudo, também podem ser utilizadas outras vias dependendo das condições do paciente e da duração do tratamento.

Enquanto for possivel o ingrediente activo ser administrado sozinho, está de preferência presente como uma formulação farmacêutica. As formulações da presente invenção compreendem pelo menos um ingrediente activo, como acima definido, juntamente com um ou mais portadores aceitáveis do mesmo e facultativamente outros agentes terapêuticos. 0 método anterior pode ser praticado por administração dos próprios compostos ou em combinação com outros ingredientes activos, incluindo outros compostos esteróide e/ou agentes terapêuticos numa composição farmacêutica. Outros agentes terapêuticos adequados para uso aqui são quaisquer drogas compatíveis que sejam eficazes pelo mesmo ou outros mecanismos para o propósito pretendido, ou drogas que sejam complementares às dos agentes presentes. Estas incluem agentes que são eficazes para a inibição de síntese de testosterona e/ou DHT, e no tratamento de cancro da próstata, agentes anti-cancro. Exemplos são cetoconazole, finasteride, e 4MA, entre outros.

Os compostos utilizados em terapia de combinação podem ser administrados simultaneamente, ou em formulações separadas ou combinadas, ou a tempos diferentes que os compostos presentes, e.g., consecutivamente, tal que seja alcançado um efeito combinado. As quantidades e regime de administração serão ajustados pelo médico, de preferência baixando inicialmente as doses padrão e em seguida titular os resultados obtidos. 0 método terapêutico da invenção pode ser 22 usado juntamente com outras terapias como determinado pelo médico.

Tendo descrito de um modo geral esta invenção, a mesma será melhor entendida por referência a certos exemplos específicos, que são aqui incluídos apenas para fins ilustrativos e não se pretende que sejam limitantes da invenção ou qualquer modo de execução, a menos que especificado. exemplo 1: Síntese e avaliação de novos 20-pregneno e outros derivados esteróides como inibidores de 17a-Hidroxilase/Ci7,2o-liase testicular e 5a-Reductase prostática in vitro

Mais de 70 20-substituidos e outros derivados de pregneno foram sintetizados e avaliados como inibidores de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase e 5a-reductase humana (Tabelas 1 e 2) . A conversão de pregnenolona radiomarcada a 17a- hidroxipregnenolona e DHEA por 17a-hidroxilase/Ci7,2o_liase foi medida por incubação de microssomas testiculares humanos com concentrações diferentes de compostos de teste. Usou-se HPLC de fase inversa para separar e quantificar com precisão a quantidade de substrato e metabolitos. As actividades de 17a-hidroxilase e Ci7,2o_liase foram calculadas separadamente. A actividade de 17a-hidroxilase foi calculado da conversão de pregnenolona a 17a-hidroxipregnenolona e DHEA e a actividade de Ci7,2o_liase foi baseado na conversão de pregnenolona a DHEA. Embora 17a-hidroxipregnenolona seja o substrato convertido a DHEA pela Ci7,2o-liase, foi divulgado que este intermediário 17a-hidroxi não é libertado do sítio de ligação 23 da enzima durante a conversão (Nakajin et al., 1981a,b). Além disso, existem diferenças nas espécies relativamente a necessidades de substrato. A pregnenolona é o substrato natural em lugar da progesterona para 17a-hidroxilase e Ci7,2o_ liase testicular humana. Assim, a pregnenolona foi usada como substrato para medir a actividade deste complexo enzimático. 0 ensaio da 5a-reductase é executado por incubação de microssomas prostáticos humanos (approx. 0,6 proteína em 0,5 ml de tampão fosfato) com [7—3H] testosterona (ΙΟηΜ, 6X105 dpm) com um sistema gerador de NADPH (NADP 0,65 mM; glucose-6-fosfato 7,1 mM; glucose-6-fosfato desidrogenase 2,5 IU em 100 μΐ de tampão fosfato) e inibidores candidato a concentrações de 10 nM e 100 nM sob oxigénio durante 30 min a 37 °c. Esteróides [14C]-marcados (T, A e DHT) e marcadores autênticos (T, A, DHT, 5a-androstano-3a-diol e 3p-diol, os 3 dióis) são adicionados após a incubação. Os esteróides são extraídos com éter e separados por cromatografia em TLC (clorofórmio:éter 80:20). O DHT e os 3-dióis são localizados através dos seus marcadores após exposição da placa a vapor de iodo. Os esteróides são raspados da placa e medidos por radioactividade. Os resultados são calculados da percentagem de conversão de [73 H] testosterona a DHT e os 3-dióis.

Como mostrado na Tabela 1, compostos contendo 20-oxima (I—1, 1-5), e 20β-ο1 (1-20, 1-34) demonstraram inibição potente de 17a-hidroxilase e de Ci7,2o-liase. Os 20p-carboxaldeídos (1—16; Li et al., 1992) e 20S-20,22-epóxido (1-8) exibem inibição significativa deste complexo enzimático. As 22-oximas (1-23) também apresentaram inibição potente de 5a-reductase e foi a base da Patente U.S. n°. 5 264 427. As 20-hidrazona (1-12) e 20-amina (1-9, 1-10) apresentaram inibição insuficiente, ao 24 passo que as N,N dimetil-hidrazonas na posição-20 (1-14) ou posição-22 (1-15) estavam destituídas de actividade inibidora. Este resultado implica que as interacções hidrofóbicas entre estes substituintes e o sítio activo da enzima não estão favorecidas. Podem ser observados efeitos semelhantes em 20-eno (1-28) e 20-ino (1-29) .

Modificando o anel-D, constatámos que o factor mais importante que contribui para a inibição deste complexo enzimático é o 16,17-eno quando associado com 20-oxima (1-5). Assim, comparado com as 20-oxima (I—1), o 16-eno-20 oxima (I-5) apresentou inibição mais potente 35-vezes superior. Outros compostos, tal como 16a,17a-epóxido (1-17) tinham potência diminuída. A introdução do 17,20-eno não contribuiu para a inibição (comparar (1-26) a (1-32)), 17a-bromo (1-11) apresentou inibição insuficiente e o 3-acetato (1-37) teve menos actividade que o composto 3-hidroxi (1-36).

Ao introduzir uma característica 20-azo no inibidor 1-16 como uma modificação "bioisostere" era esperado aumentar potência. Contudo, o composto 20-azo (1-40) apresentou aproximadamente uma inibição 4-vezes inferior ao 1-16. A metade imidazole foi introduzida em inibidores de várias enzimas do citocromo P-450, notavelmente aromatase (Schieweck et al., 1993). A metade imidazole pode actuar como um ligando para ligar ao átomo de ferro do grupo prostético hemo da enzima do citocromo P-450 e formar um complexo coordenado. Embora o mecanismo detalhado da 17a-hidroxilação e clivagem da cadeia lateral de Ci7,2o- por 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase permanece presentemente obscuro, com base nos nossos estudos de inibição, parece que o grupo hemo da enzima deve estar 25 perto das posições C17 e C20 do substrato. Assim, a introdução de um grupo imidazole nestas posições colocará este grupo perto do hemo. Usando este fundamento, projectámos e sintetizámos uma série de derivados de pregnano com grupos imidazole substituídos nas posições 17β- ou 20-. Esta modificação mostrou-se ser a estratégia mais eficaz para produzir inibidores potentes. O composto 1-47, contendo 17β-(anel 4' imidazolil) demonstrou inibição potente de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase (IC5o 11/7 nM) . Tal sugere que o par de electrões do azoto do imidazolil nesta posição pode coordenar ao átomo de ferro do cofactor hemo no sítio activo da enzima. A introdução de 16,17a-epóxido (1-51, IC50 431/98 nM) ou o grupo 17a-hidroxilo (1-44, IC50 1 200/1000 nM) diminuiu esta inibição dramaticamente. Contudo, a introdução de ligação dupla 16,17 (1-49, IC5o 4/4 nM) aumentou a inibição 2- vezes. Potter et al. (1995) também constataram que substituintes 17-(3'-piridil) juntamente com uma ligação dupla-16,17 apresentou actividade potente.

Relativamente à modificação do anel imidazole, constatámos que a introdução do grupo metilo nas posições 2' (L—4, IC50 400 nM) diminuiu esta actividade, ao passo que o grupo 2'-fenilo grande causou perda quase total de actividade. Ο 17β-(2'-imidazolil)L-l) no qual o esteróide está ligado à posição-2' de imidazole, apresentou inibição insuficiente de 17a-hidroxilase/ci7,2o-liase. O 20β— [4'-imidazolil] - (1-45) também não apresentou qualquer actividade. Estes resultados sugeriram que a justaposição entre o anel imidazole e o anel D de esteróide é importante. Ο 17β-[2'-metil-4'oxazolil] (L-5), o análogo "bioisostere" de L-4 no qual o átomo Ν' é substituído por átomo de O, causou menos inibição. O derivado 3- acetoxi (L-12) teve menor potência que 1-49, o que pode 26 reflectir uma tolerância de tamanho limitada na posição-3. Contudo, o L-12 ainda reteve actividade razoável (IC50 75/25 nM) e pode ser útil como pró-farmaco de 1-49 in vivo.

Os derivados anteriores são baseados na estrutura 5-βηο-3β-ο1 e são semelhantes ao substrato natural pregnenolona. Contudo, 0 substrato para 5a-reductase é 4-eno-3-ona, i.e., testosterona. Como esperado, os 1-47 e 1-49 não inibiram 5a-reductase. Por outro lado, 1-41 e L-6, que são os derivados 4- eno-3-ona de 1-47 e 1-49, respectivamente, apresentaram actividade contra 5a-reductase (IC50 = 122 nM e 522 nM) mantendo ao esmo tempo a sua forte potência contra 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase (IC50, 59/5 nM e 16/2, respectivamente). Assim, para alcançar inibição total da síntese de androgénio, os 1-41 e L-6 parecem ser candidatos promissores.

As actividades inibidoras dos epímeros das séries de pregnano 20-hidroxi em 5-eno-3-ol, 4-eno-3-ona, 5,16-dieno-3-ol e 4,16-dieno-3-ona foram investigadas. Nas séries 5-pregneno-3-ol, ο 20β-ο1 (1-20) apresentou inibição mais forte de 17a-hidroxilase/Ci7,2o_liase (IC50 m 180/190 nM) que o epímero 20a- 01 (1-19, IC50 720/510 nM), embora nenhum apresentou actividade contra 5a-reductase, como esperado. A conversão de 5- eno-3-ol em 4-eno-3-ona diminuiu a inibição de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase mas aumentou grandemente a inibição de 5a-reductase. Assim, 20a-ol (1-33) é um inibidor potente de 5a-reductase (IC50 13 nM) e é mais forte que o seu 20β-ο1-epímero (1-34, IC5o 90 nM) . Como acima indicado, a introdução da ligação dupla-16,17 aumentou a inibição de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase. Assim, o L-8 (20a-hidroxi-5,16- 27 pregnadieno-20-ona) é mais forte (IC50 =100 nM) que 1-20, enquanto 20β-ο1)1-9) foi menos activo. O L-10, 20p-hidroxi-4,16 pregnadieno-3-ol é um inibidor potente de 5a-reductase (IC5o = 20 nM) comparável a finasteride (IC5o = 14 nM), ao passo que o seu epímero 20a-ol (L-ll) não apresentou qualquer actividade. Como os 20β-ο1 de L-10 podem ser metabolizados a 20-ona in vivo, a 16-desidroprogesterona (L—13) também foi testada e constatada ser um inibidor potente tanto de 17a-hidroxilase (IC5o = 73/24 nM) como de 5a-reductase (IC5o = 22 nM) . A progesterona também é conhecido por ser um inibidor potente de 5a-reductase, mas o seu rápido metabolismo no corpo e falta de actividade oral, diminui o seu valor como agente terapêutico (Petrow et al., 1983). Contudo, como o L-10 e L-13 têm ambos uma ligação dupla-16,17, a sua cadeia lateral 17β-30β^1 deve ser difícil de degradar in vivo.

Como indicado, a introdução do grupo 20-oxima geralmente aumenta a inibição de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase. O pregnenolon-20-oxima (1-5) é um inibidor mais potente de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase (IC5o = 16 nM /16 nM) . O derivado 4-eno-3-ona de 1-5, L-2, não só apresentou actividade duas vezes mais forte contra 17a-hidroxilase/Ci7,2o_liase (IC5o = 6/5 nM), como também apresentou actividade potente para 5a-reductase (IC5o = 52,5 nM) . A introdução do grupo 3-oxima (I-42, 1-43) diminuiu a actividade contra 17a-hidroxilase/Ci7,20-liase e 5a-reductase.

Em resumo, foram sintetizados e avaliados mais de 70 compostos para inibição enzimática. Os inibidores mais potentes encontram-se resumidos na Tabela 3. Os 1-47, 1-49 e L-6 são inibidores potentes de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase e 28 5a-reductase. 0 L-12 é um inibidor mais fraco que o 1-49, mas pode actuar como um pró-farmaco de 1-49 in vivo. Acreditamos que alguns dos nossos candidatos são também inibidores muito potentes de 17a-hidroxilase/Ci7,2o_liase. 0 17β- (ciclopropilamino)androst-5-eno-3-ol foi reportado ter um Ki de 90 nM. O esteróide 17p-ureido-substituido foi descrito com actividade potente para a 17a-hidroxilase/liase de ratinho (Goldman et al., 1976). Recentemente, Potter et ai. (1995) reportou o inibidor mais potente, 17-(3'-piridil)androsta-5,16-dieno-3-ol (CB7598) com um IC5o de 4 nM /2,9 nM. Contudo, este foi testado contra [3H]-progesterona em vez do substrato natural [3H]-pregnenolona. Como o IC50 do cetoconazole no seu ensaio foi de 65 nM /26 nM, o CB7598 teve potência semelhante a L-2 e 1-49. A maioria dos nossos candidatos, acima descritos, são 10-50 vezes mais activos que o cetoconazole. Contudo, os L-2, L-6, e L-13 também apresentaram inibição potente de 5a-reductase, ao passo que o CB7598 não apresentou actividade contra esta enzima (Potter et al., 1995). Os inibidores aqui apresentados parecem ter maior potencial. EXEMPLO 2: Inibição de Esteróides Supra-renais

Estes estudos foram levados a cabo usando supra-renais de cobaia. Contrariamente ao ratinho, a cobaia sintetiza cortisol, tal como o humano. Foram levadas a cabo incubações com muitos dos inibidores testiculares mais potentes de 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase para determinar se também afectam a supra-renal 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase necessária para produção de cortisol. Vários derivados de pregn-4-en-3-ona pareceram inibir a enzima supra-renal, ao passo que a maioria dos compostos pregn-5-eno-3p-ol tiveram muito pouco efeito, e.g., 1-47 e 1-49. Os 1-5 e 1-7 foram de interesse, pois 29 tiveram relativamente pouco (4%) ou nenhum efeito na 17a-hidroxilase supra-renal necessária para a síntese de cortisol mas apresentaram efeitos moderadamente fortes em Ci7,2o-liase causando redução na síntese de androgénio supra-renal (77% e 63%, respectivamente). exemplo 3: 0 Efeito de inibidores em receptores de androgénio

Foram levados a cabo estudos com 1-16, 1-23, e 1-47 até à data para determinar se os inibidores interagem com receptores de androgénio. Foi determinada a capacidade destes compostos em antagonizar o efeito estimulador de DHT na transcrição de gene mediada pelo receptor de androgénio. Além disso, também foram investigadas as propriedades agonisticas dos compostos. Células CV1 foram transitoriamente transfectadas com um gene que codifica ou o receptor de androgénio humano (AR) ou um AR mutante que é expresso em células LNCaP. Um vector repórter de luciferase também foi transfectado sob controlo do elemento de resposta de androgénio do promotor do vírus tumoral mamário de ratinho. Tratamentos que activaram AR resultaram em actividade de luciferase aumentada. Tal foi quantificado por lise das células, adicionando ATP e luciferina, e medindo a luminescência gerada num luminómetro. Na ausência de inibidores, o DHT (1 nM) estimulou 105-117-vezes a actividade de luciferase em células transfectadas com AR do tipo-selvagem. 1-16, 1-23, e 1-47 todos exibiram um antagonismo dependente da dose do receptor do tipo-selvagem. Em células transfectadas com o receptor mutante de células LNCaP, o 1-47 comportou-se novamente como um antagonista, ao passo que ο I-16 e 1-23 agiram como agonistas. 30 EXEMPLO 4: O Efeito de inibidores em crescimento androgenio-dependente da próstata in vitro Células humanas de Cancro da próstata (LNCaP)

Testou-se a capacidade de vários inibidores em inverter o efeito estimulador da testosterona no crescimento da linhagem celular humana do cancro da próstata LNCaP comparando o número de células tratadas em poços durante 9 dias apenas com veiculo de droga (controlo), apenas testosterona 0,1 nM, ou testosterona 0,1 nM com inibidor a 0,3, 1, 2,5, ou 5, μΜ. A testosterona estimulou o crescimento de células LNCaP 2-vezes mais comparado com culturas de controlo tratadas apenas com veiculo de droga. Os 1-47, 1-49, L-10 e os compostos de referência finasteride e 4-MA exibiram uma reversão dependente da dose do efeito estimulador de testosterona. Os 1-23, 1-33, 1-34 e hidroxiflutamida (0,3-1, μΜ) estimularam a proliferação celular. Este efeito é provavelmente atribuível a mutação do receptor de androgénio de células LNCaP que aumentam a sua sensibilidade a progestinas. Os compostos mais eficazes foram 1-47, 4MA e finasteride, e todos reduziram o efeito estimulador de testosterona 0,1 nM em 50% a uma concentração de 1 μΜ ou menos e inverteram quase completamente o efeito da testosterona a 5 μΜ. As células também foram incubadas com DHT 0,03 nM que estimularam o crescimento de células LNCaP 2,8-vezes. Todos de entre 1-47, 1-49, 4-MA e finasteride produziram uma reversão dependente da dose do efeito estimulador de DHT, com 1-47 e 1-49 produzindo reversão quase completa a 5 μΜ. O efeito inibidor de L-10 não foi dependente da dose ao longo da gama de concentração testada. Os inibidores 1-23 e 1-34 produziram estímulo de crescimento acima do nível produzido por DHT. 31

Tecido prostático em Histocultura

Desenvolvemos recentemente um método de histocultura para avaliar as propriedades inibidoras de crescimento dos compostos em tecido prostático humano. Biópsias cirúrgicas de BPH ou tecido humano de cancro da próstata de pacientes foram cortados em pedaços pequenos e incubados em esponjas de gelatina em lml de MEM da Eagle (sem fenol vermelho) com soro bovino fetal privado de carvão activo a 5% e testosterona ou substrato de DHT com/sem inibidores em placas de 24-poços durante 7 dias a 37°C. As amostras de tecido foram então incubadas durante 3 dias em meio fresco/tratamento contendo [3H]-timidina 2 yCi/ml. 0 tecido foi então digerido e o ADN extraído. Para cada amostra, a captação de [3H]-timidina foi normalizada a teor de ADN. A síntese de ADN estimulada por testosterona (1 μΜ) e DHT (10 nM) foi de aproximadamente 2-vezes e 3-vezes, respectivamente, por comparação com amostras não tratadas. Os 1-33, 1-34, 1-47, 4MA e flutamida (1 μΜ) produziram reversão quase completa do efeito estimulador de testosterona (Fig. 1), ao passo que 1-49 foi parcialmente eficaz, e 1-41 e 1-43 não tiveram efeito (dados não mostrados). Os 1-33 e 4-MA também foram altamente eficazes a 0,3 μΜ, ao passo que o 1-34 foi parcialmente eficaz sugerindo que a inibição de 5a-reductase por estes compostos foi suficiente para inibir o crescimento. O efeito estimulador de DHT foi quase completamente invertido por 1-47 1 μΜ. Esta constatação é consistente com o composto a actuar como um antiandrogénio. Nenhum dos compostos produziu um efeito independente na síntese de ADN na ausência de androgénios adicionados. 32

Conclusões

Os resultados até à data mostram que os compostos 1-47, 1-49, L-2, L-6 e L-13 são 10-50 vezes mais potente que o cetoconazole para a 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase humana. Além disso, o L-2 também é um inibidor potente de 5a-reductase humana e apenas ligeiramente menos potente (4-6 vezes) que o finasteride, ao passo que os L-10 e L-13 são praticamente equipotentes com finasteride. Os dados até à data indicam que L-2 e L-13 são os melhores compostos pois são inibidores potentes de ambas as enzimas. A capacidade de 1-33 e 4MA em inibirem a síntese de ADN estimulada por testosterona em histoculturas de tecido prostático pode ser pelo menos parcialmente atribuída aos seus efeitos inibidores em 5a-reductase. Contudo, o composto 1-47 não tem actividade contra 5a-reductase, e ainda assim foi capaz de inibir o efeito estimulador do crescimento não apenas da testosterona, mas também de DHT, ambos em histoculturas de tecido prostático e em culturas celulares da linhagem celular LNCaP. Tal sugere que o 1-47 actua como um antagonista do receptor de androgénio bem como inibidor potente de 17a-hidroxilase/Ci7/2o~ liase. Ensaios transcripcionais confirmaram esta hipótese. Ao contrário de hidroxiflutamida, que se constatou ter actividade agonista para o receptor de androgénio mutante de células LNCaP (Veldscholte et al., 1992), o 1-47 não é um agonista do receptor mutante. Assim, o 1-47 pode ter uma vantagem sobre o antiandrogénio actualmente usado, hidroxiflutamida para o tratamento de cancro da próstata, uma vez que a mutação LNCaP foi frequentemente encontrada nos receptores de androgénio de biópsias de tumor da próstata (Gaddipati et al., 1994). Os efeitos inibidores de antiandrogénio-17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase duais de 1-47 33 aumentam a sua utilidade potencial no tratamento de cancro da próstata. EXEMPLO 5: Estudos in vivo em ratinhos normais

Foram levados a cabo estudos em ratinhos macho normais com 4-pregnen-3-ona-20p-carboxaldeído (1-16) (Li et al., 1992) e com o seu 20-carboxaldoxima (1-23) (Li et al., 1995). Ambos os compostos inibem 17a-hidroxilase/Ci7,2o-liase de ratinho bem como 5a-reductase e foram eficazes em reduzir significativamente os níveis de testosterona e DHT nos soro, e tecidos testicular e prostático no ratinho. A 3-oxo-4-pregneno-20p-carboxaldeído oxima (1-23) demonstrou inibição moderada da 17a-hidroxilase (Ki 74 nM vs Km 29 nM) com progesterona como substrato e inibição potente (Ki 18 nM vs Km 7 6 nM) da actividade de Ci7(2o-liase com 17a- hidroxiprogesterona como substrato. Investigação adicional desta enzima com progesterona como substrato demonstrou que a inibição ocorreu principalmente no passo de 17a-hidroxilação. 0 1-23 também demonstrou inibição potente e competitiva de 5a-reductase em microssomas prostáticos humanos (K7 1,4 nM vs Km 14 nM) . Quando ratinhos macho adultos foram diariamente injectados sc com 1-23 (50 mg/kg/dia) durante 21 dias, as concentrações de testosterona no soro e testicular foram significativamente reduzidas em 65% e 59%, respectivamente, em comparação com controlos tratados com veículo. Além disso, ambas as concentrações de testosterona e DHT em tecido prostático de ratinho foram significativamente diminuídas em 60% e 44% comparado a tecido de controlo. As concentrações de LH no soro permaneceram inalteradas no grupo tratado com 1-23 comparado ao grupo de controlo. Tal indica que a redução em concentrações de androgénio em animais tratados com este 34 composto não é devida à sua influência em mecanismos de "feedback" pituitários que resultam em secreção reduzida de LH. Estes resultados sugerem que o 1-23 é eficaz em reduzir a síntese de androgénio pela inibição de 17a-hidroxilase/Ci7,2o_ liase e 5a-reductase tanto in vitro como in vivo (Li et ai., 1995). EXEMPLO 6: Estudos em modelo de xenoenxertos de cancro da próstata humano

Reportámos que a inoculação de células do cancro da mama MCF-7 em Matrigel aumenta a formação de tumor mamária em ratinhos (Yue et al., 1994). 0 mesmo procedimento foi então utilizado para desenvolver tumores de células humanas do cancro da próstata (LNCaP) em ratinhos macho. Ratinhos atímicos macho BALB/c, com 4-6 semanas, foram inoculados sc com células LNCaP suspensas em Matrigel (10 mg/ml). Foram injectados quatro locais por ratinho com 1,8 x 106 células em 0,1 ml de Matrigel. O tratamento começou quando o tumor alcançou cerca de 100 mm3 em volume. Os tumores foram medidos antes do tratamento começar e uma vez por semana durante o tratamento. O volume de tumor foi calculado pela fórmula 4/3jiri2r2 (r7 < r2) . No fim do tratamento, os ratinhos foram sacrificados e tumores individuais pesados. A latência do desenvolvimento tumoral foi de 30-40 dias e a tumorigenicidade global 82%.

Numa experiência adicional, dois ratinhos foram tratados com 1-16 (1 mg/mouse/dia, s.c.) começando 45 dias após inoculação celular. Dois ratinhos receberam veículo como controlos. Após 3 semanas de tratamento, o volume de tumor total dos ratinhos de controlo tinham aumentado 281% do seu volume inicial, ao passo que em ratinhos tratados com Ι-β o volume de tumor 35 total foi de 173,6%. A massa tumoral média foi de 198,78 ± 72 mg em ratinhos tratados com 1-16 comparado a 386,3 ± 147,2 mg no grupo de controlo. Noutras experiências, 1-47 e 1-49 foram eficazes em controlar o crescimento tumoral. 0 volume tumoral total dos ratinhos de controlo aumentou a 884,0% do volume inicial. Em cinco semanas, a taxa de crescimento tumoral de 4 ratinhos por grupo foi reduzida por tratamento com 1-47 e I-49 (525,8% e 315,3% dos seus volumes iniciais, respectivamente (Fig. 2)). A massa tumoral média foi de 1310,5 ± 1125,9 mg nos ratinhos de controlo, 607,0 + 142,4 mg no grupo tratado com 1-47 e 255, 9 ± 76,9 mg (p < 0,05 comparado ao controle) no grupo tratado com 1-49.

Nas tabelas 1-3 seguintes, os compostos de acordo com a invenção encontram-se marcados com "t". Todos os outros compostos nestas tabelas são apenas para fins comparativos. 36 TABELA 1: Inibição de 17a-Hidroxilase/Ci7,2o-liase Testicular Humana por Derivados Esteróides

Estrutura % Inibição IC5o (μΜ) L· ε Básica f Substituintes [I]=100 nM [I]=400 nM Πα-OHase Ci7,2o_liase Pregn-5-eno-3p-ol 1-1 20-ona oxima 0,53 0,57 1-5* 16-eno-20-ona oxima 0,016 0,016 1-7 (20R)-20,22-epóxido 0,72 0,72 1-8 (20S)-20,22-epóxido 0,11 0,14 1-11* 17a-bromo-20-ona 1,30 0,97 εε 1—1 20p-amina co ¢33 co 43,9 HO 20a-amina 9,8 8,0 1-12 20-ona hidrazona CO C33 ¢33 4,90 1-13 20-onaN,N-dimetil-hidrazona NI NI 1-14 16-eno-20-ona N,N-dimetil- 43,7 35,0 hidrazona 1-17* 16a, 17a-epoxi-20-ona 0,44 0,68 1-19* 20a-ol 0,72 0,51 1-20* 20p-ol 0,18 0,19 (Continuação)

Estrutura I Inibição IC50 (μΜ) 38 Básica f Substituintes [I]=100 nM [I]=400 nM 17a-OHase Ci7,2o_liase 1-28 20-eno 2,88 3,71 1-29 20-ino 3,56 3,95 1-31 20p-carboxialdeido 0,08 0,08 1-36* 16-eno-20-ona 0,51 0,49 1-37* 16-eno-20-ona 3-acetato 1,89 1,71 L-8 20p-hidroxi-16-eno 53,97/66,18 82,71/83, 32 L-9 20a-hidroxi-16-eno NT HT L-18 20,20p-aziridinil- 21,81/42,95 56,12/81, 09 L-21 17a,30a-azirdinil- 8,47/29,15 23,73/52, 04 L-22 17p,20p-aziridinil- 0,0/3,33 0,0/9,99 (Continuação)

Estrutura I Inibição IC50 (μΜ) Básica f Substituintes [i]=100 nM [I]=400 nM Πα-OHase Cn,2o-liase 3 9

Pregn-4-3n-3-ona 1-15 20p-carboxaldeido N,N-di- NI NI metil-hidrazona 1-16* 20p-carboxaldeido 0,23 0,16 1-18* 16a,17a-epoxi-20-ona 0,48 0,80 1-23 20p-carboxaldoxima 5,98 6,97 os] 1—1 17 (20)-eno-20-ciano 1,22 0,89 1-32 20p-ciano 1,10 0,75 1-33* 20a-ol 2,84 1,43 1-34* 20p-ol 0,49 0,24 1-35 16-eno-20-ona 1,77 1,70 1—1 r^o 3 (Z),20-dioxima 0,21 0,22 1-43 3(E),20-dioxirna 0,09 0,07 1-45 20p-[4' -imidazolil]- >30 >30 (continuação)

Estrutura I Inibição IC50 (μΜ) 4 Ο Básica f Substituintes [I]=100 nM [I]=400 nM 17a-OHase Cl7,20" liase L-2 20-oxima 0,0087 Cl L-13 20-ona 0,073 0,024 L-10 20p-hidroxi 14,90/2,28 8,19/8,48 L-ll 20a-hidroxi NI Androst-5-eno-3p-ol 1-2 17-ona oxima 13,5 10,7 1-3 17-ona hidrazona 6,48 3,78 1-39 N-metil-17p-fomamida 0,29 0,28 1-47 17p-imidazole 0,025 0,023 1-49 16-eno-17p-imidazole 0,008 0,009 1-51 16,17a-epoxi-17p-[4f - 0,43 0,10 imidazolil]- 1-53 Éster 16-eno-17-carboxilico 3,04 2,45 etil 1-56 17-ona N,N-dimetil-hidrazona 4,20 2,40 (continuação)

Estrutura I Inibição IC50 (μΜ) τ ^ Básica f Substituintes [I]=100 nM [I]=400 nM 17a-0Hase Cl7,20" liase L-l 17β-[2' -imidazolil]- 22,84/73,89 23,69/100 L-4 17β-[5' -metil-4-imidazolil] 13,83/70,16 41,88/100 L-5 17β-[2' -metil-4'-imidazolil] 22,42/71,23 oo co C\1 l-l 17β-[5' -fenil-4'-imidazolil] 10,30/9,50 20,93/33,83 L-12 16-eno-17-[4' -imidazolil]-3p- 62,36/82,06 89,31/97,03 0,075 0,025 o-acetato Androst-4-eno-3-ona H* 17a-etinil-17p-ol NI NI HO M-metil-17p-formamida 0,76 0,68 Hl 17β-[4' -imidazolil]- 0,059 0,005 (continuação)

Estrutura I Inibição IC50 (μΜ) 4 2 Básica f Substituintes [I]=100 nM [I]=400 nM 17a-OHase Cl7,20" liase 1-44 17a-hidroxi-17p-[4'- 1,2 1,0 imidazolil] L-3 17β-[2' -imidazolil] 20,33/62,88 43,52/100 L-6 16-eno-17p-[4' -imidazolil] 0,016 Cl L-15 5,19p-cicloandrost-l-eno- 7,25/28,78 NT 3,17-diona Cetoconazole 0,44 0,15 IC5o refere-se à concentração de inibidor que produziu 50¾ de inibição da actividade enzimática. NI = não inibição; Cl = inibição completa; NT = não testado. TABELA 2: Inibição de 5a-Reductase Prostática Humana por Derivados Esteróides 4 3

Estrutura Base Composto t Substituintes 10 nM Pregn-5-eno-3p-ol 0 1-5* 16-eno-20-ona oxima 1-7 (20R)-20,22-epóxido 13,64 1-8 (20S)-20,22-epóxido 11,85 b_8 20p-hidroxi-16-eno 87,13 20a-hidroxi-16-eno 83,22 Pregn-4-3n-3-ona % Inibição [I] 100 nM 400 nM IC50 (μΜ) ”5^92 12,08 16,26 1_18 20p-carboxaldeído N,N-dimetil- 18,41 hidrazona 1_18 20p-carboxaldeído 80,54 1_18 16a,17a-epoxi-20-ona 18,10 l-23 20p-carboxaldoxima 1M6 17(20)-eno-20-ciano 5,21 1-26 74,93 87.15 76.16 85,82 71,76 0,106 (continuação) 4 4 Estrutura Base Composto t Substituintes 10 nM 1 Inibição [I] 100 nM 400 nM 1-32 20p-ciano OO C\] 79,15 1-33* 20a-ol 28,51 87,59 1-34* 20P-O1 16,13 64,54 1-40 M-metil-17p-formamida 1-41 17p-[4' -imidazolil] L-13 16-eno-20-ona 87,77 96,39 iL-2 16-eno-20-oxima 45,47 L-10 16-eno-20p-hidroxi 96,97 90,7 L-ll 16-eno-20a-hidroxi Androst-4-eno-3-ona 1-42 3(E),20-dioxima 1-43 3 (Z),20-dioxima L-3 17P~[2' -imidazolil] 31,70 61,69 L-6 16-eno-17p-[4'-imidazolil] 25,22 IC50 (μΜ) 0,522 0,013 0,09 0,15

NT 0,022 0,052 0,021

NI 2,06 1,27 (continuação)

Estrutura Base % Inibição [I]

Composto t Substituintes 10 nM 100 nM 400 nM IC5o (μΜ) 4 5

Androst-4-eno-3-ona L-15 5,19p-cicloandrost-l-eno- 23,31 60,93 L-14 3,17-diona 17p-Acetoxi-6-metileno-5a- 5,77 11,39 L-19 androst-3-ona 17P,19(S)-diidroxi 5,19- 8,70 14,77 L-20 cicloandrost-3-ona 19(R)-Hidroxi-5,19-p-ciclo- 5,89 12,24 L-23 androst-3,17-diona 4a-metil-19-(S)-metoxi- 0,0 16,06 5,19p-cicloandrost-3,17- diona 12,35 52,72 L-24 19-Bromo-androst-4-eno-3,17- diona (continuação) 4 6

Estrutura Base % Inibição [I] Composto t Substituintes 10 nM 100 nM 400 nM ICso (μΜ) Androst-5-βηο-3β-ο1 1-49 16-βηο-17β-[4' - 26,27 imidazolil] 1-47 17β-[4' -imidazolil] NT Finasteride 41,19 88,28 93,01 0,014 4 MA 71,91 92,01 0,01 NI = não inibição; NT = não testado. TABELA 3: Resumo do Inibidores Mais Potentes L·

Estrutura Básica Composto t Substituintes IC50 (nM) 17a-hidroxilase/liase 5a-reductase Androst-5-eno-3p-ol 1-47 17β-[4' -imidazolil]- 25,18/22,61 NI 1-49 16-eno-17-[4' -imidazolil]- 8,82/9/48 NI L-12 3-acetoxi-16-eno-17p- 74,63/24,85 NT [4f imidazolil]- Androst-4-eno-3-ona L-41 17β-[4' imidazolil]- 59,35/5,61 122,0 L-6 16-eno-17-[4' imidazolil]- 15,63/CI 522,0 Pregn-4,16-dieno-3-ona tL-2 20-oxima 8,65/CI 52,49 L-10 20p-hidroxi- NI 21 L-13 20-ona 72,68/23,74 21,79 (Continuação)

Estrutura Básica Composto t Substituintes IC50 17a-hidroxilase/liase (nM) 5a-reductase Compostos conhecidos Finasteride HI 14,4 Cetoconazole «7/150 NI 4 8 NI = não inibição; Cl = Inibição Completa; NT = não testado. 21-09-2007 49

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto seleccionado do grupo que consiste em 16-desidroprogesterona-20-oxima, e acetatos do mesmo.
2. 2. Composição farmacêutica compreendendo um ou mais compostos de acordo com a reivindicação 1 e um portador farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 para uso como medicamento.
4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 1 para uso como medicamento para reduzir testosterona e DHT no plasma num animal que necessite de tal tratamento.
5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 1 para uso como medicamento para tratar hipertrofia prostática benigna num animal que necessite de tal tratamento.
6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 1 para uso como medicamento para tratar cancro da próstata num animal que necessite de tal tratamento. 21-09-2007 1